Biomarcadores: Pronóstico / Diagnóstico Fisiológico en Carya illinoensis

Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas, PhDBIOTEKSA-LIGHTBOURN

RESEARCHCorreo electrónico: lalr@bioteksa.com

Biomarcadores y Fisiología de la Membrana Celular

Respuesta de las Plantas a Estímulos ExternosDado que las plantas son sésiles, deben ser capaces de percibir su entorno natural y experimentar cambios en su fisiología en respuesta a esas señales ambientales. En este proceso la membrana plasmática es fundamental

1) Disrupción osmótica por afectaciones a la membrana plasmática

2) Activación de la señalización mediada por kinasas y segundos mensajeros

3) Síntesis de factores de transcripción

4) Activación de genes

Luz UV

Calor

Frío

Sequía

SalinidadMANEJO

Primero no hacer daño…Segundo no estorbar…

Estructura y Función de la Membrana Plasmática

Rol de la Membrana en Respuesta a Estrés

Activación Osmosensores, enzimas, segundos mensajeros y

proteínas kinasas

SíntesisMúltiples factores de

transcripción

Expresión de genes que codifican

Osmoprotectores, proteínas fibrosas, transportadoers de iones y acuaporinas

Restauración de la homeostasis a través del establecimiento del sistema de

resistencia adaptativa

Estrés Abiótico

Estrés BióticoGeneran disrupción osmótica, con posibles

alteraciones en membrana celular y sus proteínas, lo que desencadena:

Inicio de la Señalización en Membrana PlasmáticaLas señales externas usualmente son reconocidas por receptores en la membrana plasmática que son capaces de controlar procesos moleculares de la activación de la señalización intercelular coordinada durante las respuestas de crecimiento, desarrollo y estrés

Estas señales son recibidas inicialmente por las proteínas de membrana y se transmiten secuencialmente para activar elementos de señalización

Receptores en Membrana PlasmáticaExisten diferentes receptores de membrana que actúan como reguladores en la percepción de señales ambientales. Los receptores de tipo quinasas (RLK) son considerados como moléculas claves en la regulación del crecimiento y desarrollo de la planta bajo diferentes condiciones de estrés. La transcripción de los genes RLK es regulada y modulada en respuesta al estrés a nivel individual o en grupos de genes

Activación de

quinasas

SalinidadEstrés

Osmótico Sequía Frío

Biomarcadores

Factores Ambientales

Activación de factores de transcripción, canales y otros mecanismos de transporte

Mantenimiento de la Homeostasis

Red de Señalización Los receptores de tipo kinasas (RLK) e histidin kinasas (HK) de la membrana celular regulan los mecanismos de homeostasis en respuesta al estrés abiótico y biótico, a través de la activación génica

Tipo 1Predecir las respuestas a las intervenciones terapéuticas

Tipo 0Se utiliza para estimar la aparición o el desarrollo de una enfermedad

Tipo 2En principio se podría utilizar como criterios

de valoración clínicos de sustitución en los curso de ensayos clínicos

Un biomarcador es una característica que puede ser medida objetivamente y puede utilizarse como indicador de los procesos biológicos normales y/o procesos patológicos y/o respuesta farmacológica a un agente terapéutico y/o factor nutricional

Biomarcadores

Los metabolitos son un conjunto de sustancias bioquímicas producidas por la célula durante procesos metabólicos: azúcares,

lípidos, aminoácidos, etc, que pueden se usados como marcadores

En los estudios de la variabilidad genética la clave es el análisis de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)

La principal fuente de datos moleculares para descubrir biomarcadores son los estudios de ADN basados en variaciones, la

expresión de genes (transcriptómica), expresión de proteínas y la medición de los metabolitos (metabolómica)

Algunos de los biomarcadores son ortogonales, es decir biomarcadores con relativamente baja dependencia

estadística, biológica o clínica entre ellos.

Fuentes de Biomarcadores

Biomarcadores Relacionados a Membrana Los receptores tipo kinasa (RLK) modulan la expresión de genes que puede ser utilizados como marcadores del estado fisiológico de la planta

Tipo de RLK

Gen Función

LRR GHR1 Regula la activación de canales iónicos

SRLK Previene el desarrollo de la raíz en condiciones de salinidad

RLK7 Regula la velocidad de germinación y tolerancia al estrés oxidativo

OsSIK1 Permite el incremento de superóxido dismutasa que brinda tolerancia a la sequía y salinidad

RPK1 Resistencia a sequía

PERK PERK4 Inhibe la elongación de la raíz ante perturbaciones de la homeostasis de Ca+2

CRK/DUF26 CRK36 Media la señalización vinculada al estrés osmótico

RLCK CRLK1 Relacionada a la respuesta ante bajas temperaturas

•Grupo de proteínasSe encuentran asociadas a membrana

•EstructuralmenteConstituídas por las subunidades α, β y γ

• Función Participan en la transducción de señales

Proteínas G Heterotriméricas-Biomarcadores Las proteínas G son un grupo de proteínas asociadas a la membrana plasmática, consideradas como moléculas de señalización

Respuesta a Estrés • Hídrico• Salino• Térmico

Respuesta a Hormonas• Auxinas• Giberelinas• Ácido Absícico

Eventos de Desarrollo• Formación de raíces• Elongación del hipocótilo

Diversas• Activación de Canales• Respuesta a Patógenos• Respuesta a la Luz

Proteínas G Heterotriméricas-Biomarcadores • Estas proteínas estan

implicadas en la respuesta mediada por

la membrana plasmática ante

diversos factores, y puede ser utilizados como biomarcadores

del estado fisiológico de la planta

Biomarcadores y Señalización Intrónica-Exónica en Células Meristemáticas

Vegetales

Células Meristemáticas

• Las plantas mantienen poblaciones de células

madre en los tejidos jóvenes no diferenciados llamados

“meristemos”, que conservan su organización a

través de la señalización célula-célula. Los

meristemos mantienen poblaciones de células no

diferenciadas y son esenciales para la

producción de tejidos especializados

Células Meristemáticas

• El crecimiento y desarrollo de las plantas depende de los procesos continuos que

ocurren en las células meristemáticas. A partir de los meristemos se originan

todos lo organos post-embrionarios, como hojas,

tallos y flores

Señalización en Células Meristemáticas

• Las poblaciones de células madre en los meristemos son mantenidas a través de la vía

de señalización CLAVATA (CLV), la cuál se constituye por un pequeño péptido secretado (CLV3), los receptores tipo

quinasa CLV1 y CRN, así como por el receptor CLV2

Señalización en Células Meristemáticas

• El modelo para la vía de señalización CLAVATA sugiere que

CLV1, CLV2 y CRN reconocen el péptido CLV3 produciendo la activación del receptor que conduce a la represión de la

expresión del factor de transcripción del homodominio Wuschel (WUS), el cual es un

pequeño péptido que actúa como un centro de organización

requerido para el control de la población de células madre. En

ausencia de este péptido se produce un aumento en dicha

población

Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas

• Estudios de mutagenesis dirigida hacia la región exónica de los genes CLV1, CLV2 y CLV3,

ocasiona un aumento en la población de células madres, lo que se debe a que las células que recientemente se habían

diferenciado, se reconvierten en células madre

El factor de transcripción SHOOTMERISTEMLESS (STM) en conjunto con WUS se requieren para controlar los procesos de diferenciación celular en el meristemo

WUS y STM han sido consideradas como moléculas

biomarcadores para determinar el estado fisiológico de las

células meristemáticas, ya que WUS actúa para mantener la

función de células madre, mientras que STM es necesaria para el mantenimiento de un

estado indiferenciado

Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas

Marcadores Moleculares en Células Meristemáticas

El gen LOG, recientemente reportado, es requerido para mantener las funciones del meristemo, este gen codifica un tipo de citoquina que se encarga de bioactivar la síntesis de nuevas citoquinas que inducen la proliferación y diferenciación celular

Región exónica-intrónica del gen

LOG

Ubicación del gen LOG

Deleción del gen LOG

Expresión normal del gen LOG

Biomarcadores y Transcriptómica a Nivel de Retículo Endoplásmico en Células

Parenquimatosas

Retículo endoplásmicoEl retículo endoplásmico (RE) es un organelo involucarado en:

Síntesis de Proteínas

Plegamiento de Proteínas

Ensamble de Proteínas

Degradación de Proteínas

Reciclaje de Proteínas

Permite el mantenimiento de

la Homeostasis

Retículo Endoplásmico

EnzimasQue permiten degradar proteínas defectuosas

ChaperonasQue permiten el correcto plegamiento de proteínas

InducciónDe genes que codifican para chaperonas y enzimas

A B C

Esto se logra a través de:

Transcriptoma y Biomarcadores

En un estudio realizado en nogal por Lightbourn et al (2014), según metodología Wakasa en el cual se analizó su transcriptoma, el trabajo incluyó el análisis de 38,076 genes mediante “RNA-seq”

Después del análisis bioinformático se determino que un total de 374 estaban involucradas en la respuesta a estrés del RE

2 % transporte transmembrana

5% proteolisis

2% metabolismo lipídico

3% plegamiento de proteínas4% regulador de transcripción

9% respuesta a estrés oxidativo

7% metabolismo de carbohidratos

20% a procesos de óxido-reducción

48% funciones diversas

De los 374 genes vinculados al retículo endoplásmico, esta es la distribución con base a su función

Transcriptoma y el Retículo Endoplásmico

Posibles Biomarcadores del Retículo Endoplásmico

• Una chaperona del retículo endoplasmíco, denominada GRP94, regula el desarrollo del meristemo a través del correto plegamiento de las proteínas de la vía CLAVATA

• Apróximadamente la tercera parte del total de las proteínas a la membrana sufren alguna modificación postraduccional en el retículo.

• Esto se logra a través de la inducción de genes que codifican

chaperonas y enzimas relacionadas con el plegamiento de proteínas. Si el estrés es demasiado severo en la

célula el RE induce la muerte celular programada.

Biomarcadores Relacionados al RE• La participación del RE en la

fisiología celular vegetal involucra varias vías de

señalización. En nogal, las proteínas OsbZIP39 y

OsbZIP60 actúan como reguladores transcripcionaels

de ATF6, una proteína transmembrana que

desencadena un tipo de respuesta que conduce a la

proteolisis de algunas proteínas mal plegadas

• Mientras que AtbZIP17 y AtbZIP28 tienen un mecanismo de acción similar al anterior en Arabidopsis.

Biomarcadores Relacionados al RE

• Por otro lado, la proteína IRE1 actúa como sensor que es altamente conservado en plantas, es una

proteína transmembrana que tiene un dominio tipo kinasa y un

dominio tipo ribonuleasa, este último dominio permite realizar el splicing del ARNm que codifican

para diversos factores transcripcionales (HAC1, XBP1,

AtbZIP60 y OsbZIP50) resultando en la activación de una señal que

concluirá en la degradación de ARNm que codifican proteínas durante el período de estrés.

El Instituto de Investigación Lightbourn A.C. “LIGHTBOURN RESEARCH”

Proyecto permanente de Investigación

“Validación de la nutrición coloidal según M.B.L.* e I.M.L.* para maximizar productividad de cultivos, reducir impacto

ambiental y crear nueva metrología de diagnóstico nutricional basada en correlacionar indicadores moleculares y la

respuesta productiva”

Respaldo científico de los beneficios productivos y ambientales de la tecnología

Genes N, P, K,B, Ca, Zn RT-PCR

Biomarcadores Déficit Nutrimental Método de Detección

Resumen Ejecutivo del Proyecto

Objetivo General del Proyecto

Maximizar la productividad de cultivos de manera sustentable mediante un sistema de nutrición coloidal de bajo impacto ambiental y una nueva metrología basada en biomarcadores de deficiencia nutricional.

Identificar y validar la expresión de

biomarcardores candidatos de la

deficiencia de nutrientes1

Estandarizar una técnica

de cuantificación múltiple y simultánea

de los biomarcador

es

2

Objetivos Específicos del Proyecto

Estimar las recomendaciones correctivas

necesarias para maximizar

los rendimientos

de manera sustentable

5

Validar el efecto benéfico de la

nutrición coloidal en la ecología microbiana y

estructura del suelo

4

Demostrar la disminución del

impacto ambiental de la

nutrición coloidal

3

Muestras

Datos Omic

Diferencias Entre tipos de Muestras

Modelado Integral-Predictivo

Potencial Biomarcador: Modelos Predictivos

Validación Independiente

Diagnóstico Pronóstico

Los principales resultados esperados desde la perspectiva de investigación, podrían ser (desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico y pronóstico =

biochip) y predicción computacional para la detección y diagnóstico

Muestra de Plantas

Integración de los Datos

Expresión Génica

Acumulación de Metabolitos

Genes

Metabolitos

Análisis Multivariado

de Datos

Procesamiento de Datos

Análisis del Metaboloma

Análisis del Transcritoma

MBLIML

Datos de la matriz de

metabolitos

Datos de la expresión de los

genes

Extracción y pre-Tratamiento

Los modelos de clasificación de enfermedades y predicción de riesgo se basan en modelos estadísticos multivariantes. Este modelo puede ser

implementado con funciones matemáticas

S (t) = = f (x) = x1 + x-2

11 + e-t

11 + e-t

= 1 + x-2

x

Plan General de Operación

PGO

DiseñoMultifactorial

Hipótesis Científica

ExperimentaciónBiológica

Muestreo y Preparación de la Muestra

Interpretación Biológica

Quimiometría Estadística

Medidas Procesamiento de Datos

2e-t + 1 ≠ 0, et + 1 ≠ 0

X = et

2et + 1

et

2et + 1X = -

4

Formación y capacitación de recursos humanos altamente calificados

5

Expresión de biomarcardores candidatos de la deficiencia de nitrógeno, fósforo y potasio, boro, calcio, zinc y actividad fotosintética.

Resultados Esperados del Proyecto

6

Registro patentes posibles identificadas

sobre las áreas de investigación

mencionadas

Programas de nutrición coloidal validados científicamente

1

Identificación de biomarcadores de

desbalances nutricionales 3

Maximización de la productividad de cultivos

2

“La ciencia será siempre una búsqueda, jamás un descubrimiento real. Es un viaje, nunca

una llegada”

Karl Popper

Gracias

Marcadores Moleculares: Indicadores de la Aparición y Progresión de Enfermedad

Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas, PhD

BIOTEKSA-LIGHTBOURN RESEARCHCorreo electrónico:

lalr@bioteksa.com

5Para ello se requiere la apropiada

colección de las muestras biológicas (líquidos y sólidos)

4

Confiriendo la capacidad de predecir los acontecimiento, en lugar de tan sólo describirlos

3

Esto requiere la visualización del análsis, modelado e integración adecuada de los diferentes tipos de datos

disponibles

2

La bioinformática y la investigación para el diseño, implementación y aplicación de

tecnología computacional, métodos y herramientas para optener datos significativos

“OMICS”

Indicadores

1El mayor reto es el

demostrar su eficacia en un entorno clínico

Tipo 1Predecir las respuestas a las intervenciones terapéuticas

Tipo 0Se utiliza para estimar la aparición o el desarrollo de una enfermedad

Tipo 2En principio se podría utilizar como criterios

de valoración clínicos de sustitución en los curso de ensayos clínicos

Un biomarcador es una característica que puede ser medida objetivamente y puede utilizarse como indicador de los procesos biológicos normales y/o procesos patológicos y/o respuesta farmacológica a un agente terapéutico (factor nutricional)

Biomarcadores

CLÍNICA• Cuestionamientos y requerimientos clínicos• Extracción de la muestra• Adquisición de datos fenotípicos

COMPUTACIONAL• Procesamiento de datos• Selección de la característica• Análsis estadístico• Modelo predictivo• Refinamiento / Nueva hipótesis

LABORATORIO• Procesamiento de la muestra• Generación de datos moleculares “omics”• Hipótesis

DIAGNÓSTICO• Evaluación de los individuos sospechosos de sufrir la

enfermedad

PRONÓSTICO• Predicción del estado

del que sufre la enfermedad

Adquisición de Datos

Los metabolitos son un conjunto de sustancias bioquímicas producidas por la célula durante procesos metabólicos: azúcares,

lípidos, aminoácidos, etc, que pueden se usados como marcadores

En los estudios de la variabilidad genética la clave es el análisis de polimorfismos de nucleótido simple (SNPs)

La principal fuente de datos moleculares para descubrir biomarcadores son los estudios de ADN basados en variaciones, la

expresión de genes (transcriptómica), expresión de proteínas y la medición de los metabolitos (metabolómica)

Algunos de los biomarcadores son ortogonales, es decir biomarcadores con relativamente baja dependencia

estadística, biológica o clínica entre ellos.

Fuentes de Biomarcadores

ProspectivoRetrospectivo

Estrategias para la Obtención de Datos

Basado en muestras clínicas recolectadas antes del estudio diseñado y antes de cualquier comparación con muestras

control. Se efectúa con una mira atrás en los datos de registrados anteriormente

para encontrar evidencia de las relaciones marcador-enfermedad.

Requiere de covariables (otros cofactores predictivos)

El modelo se aplica al mismo tiempo en el que ocurre un fenómeno o proceso,

con una mirada hacia el futuro. La información se adquiere y analiza para evaluar la capacidad de predicción o la

discriminación que poseen los biomarcadores

Descubrimiento de Biomarcadores

El objetivo principal es detectar una respuesta a una enfermedad o complicación durante una etapa en la que se pueda ayudar a la selección del tratamiento

La identificación basada en umbrales de referencia,

umbrales de discriminación o umbrales de riesgo

3

La comparación de estados fisiológicos, fenotípicos o cambios a

través de casos y controles

1

A nivel molecular; la actividad diferencial de genes,

concentración de proteínas, metabolitos y vías de señalización

2

Las fuentes potenciales de variabilidad experimental están relacionados con la extracción de la muestra, almacenamiento y procesamiento de datos. Provocando variabilidad inter laboratorio debido a diferencias en reactivos y protocolos experimentales

Se vislumbra como un poderoso complemento a nivel molecular para la célula en un determinado momento

Un desafío clave en el desarrollo de biomarcadores es la reducción de la variabilidad experimental y ruido en los datos, así como asegurar la reproducibilidad de la toma de muestra, análisis y evaluación de datos

Adquisición de la Muestra y Análsis de Datos

Muestras

Datos Omic

Diferencias Entre tipos de Muestras

Modelado Integral-Predictivo

Potencial Biomarcador: Modelos Predictivos

Validación Independiente

Diagnóstico Pronóstico

Los principales resultados esperados desde la perspectiva de investigación, podrían ser (desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico y pronóstico =

biochip) y predicción computacional para la detección y diagnóstico

Muestra de Plantas

Integración de los Datos

Expresión Génica

Acumulación de Metabolitos

Genes

Metabolitos

Análisis Multivariado

de Datos

Procesamiento de Datos

Análisis del Metaboloma

Análisis del Transcritoma

MBLIML

Datos de la matriz de

metabolitos

Datos de la expresión de los

genes

Extracción y pre-Tratamiento

Los modelos de clasificación de enfermedades y predicción de riesgo se basan en modelos estadísticos multivariantes. Este modelo puede ser

implementado con funciones matemáticas

S (t) = = f (x) = x1 + x-2

11 + e-t

11 + e-t

= 1 + x-2

x

Plan General de Operación

PGO

DiseñoMultifactorial

Hipótesis Científica

ExperimentaciónBiológica

Muestreo y Preparación de la Muestra

Interpretación Biológica

Quimiometría Estadística

Medidas Procesamiento de Datos

2e-t + 1 ≠ 0, et + 1 ≠ 0

X = et

2et + 1

et

2et + 1X = -

STAT ML GNT IV KE SD SMActividad

Acceso a datos e información

Análisis de datos para predicciónInformación de laboratorio

Biomarcadores

Búsqueda

Información aportada por los datos

Búsqueda en la literatura

Selección del marcador óptimo

Clasificación y valoración del riesgo

Estimación de la significacía

STAT: Análisis estadísticoML: Estadística y aprendizaje GNT: Teoría de redesIV: Información, visualizaciónKE: Ingeniería de aprendizajeSD: Desarrollo de software SM: Modelado de sistemas complejos

“La ciencia será siempre una búsqueda, jamás un descubrimiento real. Es un viaje, nunca

una llegada”

Karl Popper

Gracias