92 ÓRGANO OFICIAL DEL COLEGIO DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA DE BOLIVIA

Aplicaciones de la Epidemiología Molecular en la detección de brotes deenfermedades transmitidas por alimentos. Avances en Latinoamérica

Molecular Epidemiology applications to detect illnesses transmitted by food.Latinamerican advances.

Vesna Boric Bonifaz

Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Instituto Nacional de Laboratorios INLASA, Ministerio de Salud yDeportes. La Paz, Bolivia.

Dirección para correspondencia: Vesna Boric Bonifaz MSc. Laboratorio de Microbiología de Alimentos, InstitutoNacional de Laboratorios. c/ Rafael Zubieta N° 1889. Miraflores.Tel: 2226670, Fax. 591-2-228254E mail: ves_boric@yahoo.com.

RESUMEN

Las enfermedades causadas por el consumo dealimentos contaminados han surgido como una causaimportante de morbimortalidad a nivel mundial. Lospatógenos bacterianos que clásicamente estánimplicados en las ETA son Salmonella, Shigella,Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Escherichiacoli O157, Listeria monocytogenes y Campylobacter.En América Latina las ETA representan alrededor del70 % de los casos de enfermedad diarreica aguda,según estimaciones de la Organización Mundial de laSalud En Bolivia, el SNIS reporta en la semanaepidemiológica N° 20 al 31 de Mayo de 2007, 12.849episodios de EDAs, 23% corresponden a Santa Cruz(Dpto. de mayor notificación), las atenciones porEDA tienen un acumulado nacional de 544 224atenciones (5773 x 103 hab.) principalmente enmenores de 5 años.Las ETA, a menudo ocurren como “brotes” y lasherramientas para realizar estos análisis requieren unametodología de biología molecular que se denominaSubtipificación molecular y es la base de la“epidemiología molecular”. La electroforesis encampo pulsado (PFGE), ha sido aplicada con muybuenos resultados para la Subtipificación de muchasbacterias patógenas. Existen dos redes mundiales devigilancia de patógenos de transmisión alimentaria:WHO Global Salmonella Surveillance WHO GSS yla Red de Subtipificación Molecular de PatógenosTransmitidos por Alimentos PulseNet, de las cualesBolivia participa activamente, permitiendo al paísincursionar en los nuevos adelantos tecnológicos ysus beneficios.Los resultados de América Latina han permitidoidentificar brotes de ETA desde el año 2004,pudiendo utilizar la electroforesis en campo pulsado

PFGE como un método altamente discriminatorio,sensible y universal que contribuye a la detección debrotes de manifestación dispersa, detectar la fuente deorigen y la vía de transmisión del brote, así como lacirculación de cepas nuevas. Permite anticipar laaparición de brotes y esta información contribuye a latoma de decisiones. Finalmente permite generaracciones que mejoren el control e inocuidad de losalimentos, lo que favorece la Salud Pública, elcomercio y el turismo.Palabras Clave: Epidemiologia molecular, PFGE,brotes, ETA, WHO GSS y PulseNet

ABSTRACT

Illnesses caused by contaminated food consuminghave been marked as an important cause of mortalityat a world wide level. The pathogenic organismsimplicated in this illnesses are Salmonella, Shigella,Vibrio cholerae, Clostridium botulinum, Escherichiacoli O157, Listeria monocytogenes andCampylobacter.In Latin America, these illnesses representapproximately 70% of the cases belonging todiarrhea, according to data provided by WHO. InBolivia, the SNIS reports that in the epidemiologicalweek number 20, starting on May,31st 2007, 12.849cases were detected, and 23% belong to Santa CruzDepartment (the one with the most notification), andthe medical attentions have a national accumulatednumber is 544244 (with an average of 5773 perlaboratory), principally in people younger than 5years old.These illnesses often occur in the form of soft, casualappearances, and the tools to carry out the analysisrequire molecular biology based techniques that arenamed “Molecular subtypification”, which is the key

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to “molecular epidemiology”. The pulsed-fieldelectroforesis has been applied with very good resultsfor the subtypification of many pathogenic bacteries.There are two world wide networks that surveilillnesses of food transmission: The WHO and theGSS (Global Salmonella Surveillance). Along withthis, there exist the Molecular Subtipification ofpathogenic organisms network, of PulseNet. Boliviais an active participant, and this allows the country toget into new technological advances and theirbenefits.The results for Latin America have allowed thislaboratorios to identify new appearances since 2004,being able to use the oulsed – field electroforesis as ahighly discriminatory method, sensible and universal,that contributes to the detection of appearances of thisillnesses of disperse manifestation, and thus,detecting the possible source of the illness. Thisinformation contributes to decision-making policies,action-generation processes, that will better the foodcontrol, which favors Public Health procedures andtourism.Key Words: molecular epidemiology, illnessesappearances, WHO, GSS, PULSENET.

INTRODUCCIÓN

Como consecuencia de los cambios en el sistema devida y en los hábitos alimentarios, las enfermedadescausadas por el consumo de alimentos contaminados,han surgido como una causa importante demorbimortalidad a nivel mundial. Han sido descritosalrededor de 250 agentes causantes de enfermedadestransmitidas por alimentos (ETA), entre los que seincluyen bacterias, virus, hongos, parásitos, priones,toxinas y metales1,2,3.Las enfermedades transmitidas por alimentos son unproblema cada vez mas importante a nivelinternacional y en cada uno de los países, debidoentre otras cosas, al intercambio comercial y a losintensos movimientos de las personas. Los patógenosbacterianos que clásicamente están implicados en lasETA son Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,Clostridium botulinum y los “nuevos” o emergentes,como Escherichia coli O157, Listeria monocytogenesy Campylobacter4.En América Latina las infecciones transmitidas poralimentos representan alrededor del 70 % de los casosde enfermedad diarreica aguda, según estimacionesde la Organización Mundial de la Salud. Según datosreportados al SIRVETA, durante los últimos 9 añoshan habido 6332 reportes de brotes de ETA,provenientes de 22 países de la región, 6% del áreaandina, 63% del Caribe (aportando un país más de58,71% del total de reportes), 4% de Centro América,

10% de Norte América y 17% del Cono Sur. Se hanafectado en estos brotes, 230.141 personas y hanfallecido 317. La frecuencia más observada deenfermos es de 2 personas por brote, lo cual escoherente con el hallazgo de que el 32% de los brotestotales ocurrieron en el hogar. El 26% de los brotesno tuvieron diagnóstico de laboratorio para identificarlos agentes etiológicos. De los brotes con informaciónde laboratorio (4686) el 45% fue por bacterias, el21% por virus y 20% por toxinas marinas. El restante14%, se distribuye entre parásitos, contaminantesquímicos y toxinas de productos vegetales. Los tresalimentos que se asociaron con mayor frecuencia alos brotes reportados son: el agua con un 23% de loscasos, los pescados con el 18% y las carnes rojas con12%4.Las enfermedades diarreicas agudas (EDAs) en paísesen vías de desarrollo, tienen una tasa de morbilidaden niños menores de 5 años de 39 %, con 5 millonesde muertes por año.En Bolivia, el SNIS reporta en la semanaepidemiológica N° 20 al 31 de Mayo de 2007, 12.849episodios de EDAs, 23% corresponden a Santa Cruz(departamento de mayor notificación), en el 2005 lasatenciones por EDA tienen un acumulado nacionalde 544 224 atenciones (5773 x 103 hab.)principalmente en menores de 5 años5.El patógeno de transmisión alimentaria más estudiadoa nivel clínico y alimentario, es Salmonella. Entre elaño 2001 al 2007 se ha reportado un total de 221casos de Salmonella aisladas a partir de muestrasclínicas y muestras de alimentos. Las serovariedadesprevalentes en el periodo 2005 al 2007 fueron:Salmonella spp (33,3 %), Salmonella Enteritidis(13,04 %), S. Typhi (5,79 %) y en menor proporciónS. Oranienburg, S. Montevideo y S. Saintpaul (2, 89%), S. Agona, S.Typhimurium, S. Newport (4,34 %),S. Panama, S. Bredney, S. Edinburg, S. Goeteborg, S.Ebera, S. Muenster, S. Anatum, S. Paratyphi B, S.Infantis, S. Jamaica (1,45%)6.En el área veterinaria se realizaron aislamientos deSalmonella a partir de gallinas, las serovariedadesprevalentes fueron: Salmonella Gallinarum (69,4 %)y Salmonella Enteritidis (20,6%)6 .Todos los aislamientos realizados a partir dealimentos demostraron un perfil de sensibilidad aCloranfenicol, Ampicilina, Ciprofloxacina yCotrimoxazol y no se identificaron cepas resistentes.Excepto 4 cepas: 1 cepa de S. Agona resistente aampicilina y 2 cepas resistentes a Trimetoprim-sulfametoxasol y 1 cepa de S. Enteritidis resistente aAcido Nalidíxico, el resto de las cepas aisladas dehumanos fueron sensibles a Ampicilina,Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Gentamicina, Acido

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Nalidíxico, Trimetoprim- sulfametoxazol. Ningunode los aislamientos fue relacionado con brotes6.Las infecciones a menudo ocurren como “brotes”, sinembargo las nuevas tendencias en América es ladetección clínica de casos aislados y no siempreconfirmados por el laboratorio y comúnmentedesignados como “esporádicos”. Si dichos casospudieran relacionarse entre sí, se lograría un mejorcontrol y prevención de las ETA4.El alerta clínico-epidemiológico y de laboratorio debeser sistemático a fin de detectar aislamientosrelacionados que, indiquen sospecha de brote y porende el inicio de su investigación para encontrar lafuente de contaminación y tomar las acciones decontrol.Un elemento clave para el reconocimiento y controlde brotes es la capacidad de análisis de los patógenosaislados de humanos y su identificación en lasprobables fuentes de contaminación, hasta llegar, enlo posible a su reservorio y las vías de transmisión.Las herramientas para realizar estos análisistrascienden el diagnóstico clásico del laboratorio yaque requieren metodologías de biología molecularque permitan establecer las relaciones del DNA entrelas bacterias aisladas y determinar el grado deidentidad genética entre ellas para identificar elagente infeccioso causal de la patología y la fuente deinfección. Esta metodología se denominagenéricamente Subtipificación molecular y es la basede una de las nuevas disciplinas: la “epidemiologíamolecular”4.El Centro para el Control de las Enfermedades (CDC)de USA, ha desarrollado una Red Nacional de Sub-tipificación Molecular para la vigilancia de las ETA,que se denomina PulseNet. PulseNet se basa en lautilización de un proceso denominado electroforesisen campo pulsado (PFGE) que facilita la migraciónde fragmentos de DNA a través del gel de agarosacomo consecuencia de un cambio constante delcampo eléctrico durante la electroforesis4.El PFGE ha sido aplicado con muy buenos resultadospara la Subtipificación de muchas bacteriaspatógenas. La Subtipificación molecular realizadautilizando PFGE, tiene un protocolo básico queconsiste en la lisis de las células bacterianas, laliberación del DNA cromosomal, el corte de DNAgenómico con una enzima de restricción apropiada, laelectroforesis de esos fragmentos de DNA, seguidosde su tinción y visualización y el análisis posteriorpara establecer las relaciones genéticas entre losaislamientos. Los perfiles de los fragmentos de DNAgenerados por PFGE son altamente discriminatorios(comparados con otros métodos basados en laReacción en Cadena de la Polimerasa-PCR) establesy reproducibles, es por esto que se considera al PFGE

el método de elección para la epidemiologíamolecular de bacterias patógenas. Esta metodologíaconvenientemente estandarizada y con adecuadoscontroles de calidad, tiene la gran ventaja de poderser realizada en diferentes laboratorios al mismotiempo, las fotografías de los fragmentos de DNAobtenidos pueden ser analizados en el o loslaboratorios que lo generan y enviadoselectrónicamente a una base de datos habilitada paracomparar los perfiles de las cepas aisladas endiferentes países y regiones en tiempo real. Estasecuencia de eventos organizados en una redregional-internacional, con participación de lossectores de salud humana, animal y de alimentos,posibilita la detección temprana del brote, enparticular en brotes dispersos, y la respuesta rápida yoportuna a las infecciones por patógenos bacterianostransmitidos por alimentos4.La utilización de esta herramienta epidemiológica contécnicas moleculares ha permitido en los últimosaños, establecer una Vigilancia EpidemiológicaMolecular que ha demostrado mejorar la rapidez en ladetección de brotes y por tanto, mejorar laintervención oportuna de medidas de control yprevención.Bolivia participa activamente de dos redes mundiales

de vigilancia de patógenos de transmisiónalimentaria. La Red PulseNet establecida Europa,Estados Unidos, Oriente Medio, Asia, Canadá,América Latina y el Caribe (en América Latina con13 países participantes 14 Laboratorios de referencianacional), ha permitido obtener información entiempo real de los diferentes brotes de ETA7 y laWHO GSS Red de Vigilancia de Salmonella.Bolivia, gracias a su participación activa desde el2004 en PulseNet América Latina ha podido capacitara recursos humanos en el país para conocer losnuevos adelantos tecnológicos y sus beneficios. Enese contexto, Bolivia a través del Laboratorio deMicrobiología de Alimentos del Instituto Nacional deLaboratorios de Salud INLASA, elaboró la propuestaInicial de Subtipificación Molecular porElectroforesis de Campo Pulsado (PFGE) para laVigilancia de Enfermedades Transmitidas porAlimentos en Bolivia, cuyo objetivo es el de obtenerla primera base genética de datos de Salmonellaaisladas a partir de muestras clínicas, alimentos y deorigen veterinario en los diferentes departamentos delpaís.La vigilancia de enfermedades transmitidas poralimentos, a cargo de la Unidad de Epidemiologíadel Ministerio de Salud, investiga la presencia debrotes de ETA en el país, y debera articular lainformación generada en los laboratorios tanto delárea clínica como de alimentos, para realizar una

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vigilancia integrada que permita mejorar el sistemade control.Investigación de brotes de enfermedadestransmitidas por alimentosEn el proceso de investigación del brote, lasherramientas con técnicas moleculares permiten ,subtipificar para detectar, investigar y controlar brotesde ETA, con la finalidad de: identificar al patógeno,determinar el origen/fuente, demostrar que elpatógeno proviene de la fuente, describir latransmisión, relacionar casos “aparentemente”esporádicos a brotes y por tanto, dar informaciónsegura y a tiempo para desarrollar estrategias deintervención, reducir y controlar la presencia ydiseminación del patógeno.

Un ejemplo de la utilidad de las técnicas molecularesen la investigación epidemiológica, se puedeevidenciar en diversos brotes de ETA que porasociación estadística llegan a ser significantescuando se utilizan estas técnicas. Como es el caso delbrote por consumo de hamburguesas el año 2000 enU.S.A, en el cual la probabilidad de la ocurrencia delevento fue significante solo utilizando laelectroforesis en campo pulsado (PFGE) y no así,mediante la investigación por métodos tradicionalesen la cual la probabilidad no es significante,haciendo que se descarte el evento como un brote deETA (Grafico 1).

Gráfico 1. Asociación Estadística con el consumo de Hamburguesa; 2000

Fuente. Peter Gerner-Smidt. CDC. Atlanta

Por tanto, la epidemiología molecular ha tenido unimportante impacto en la Salud Pública relacionada ala investigación de brotes de ETA, ya que hapermitido reducir prácticamente a la mitad deltiempo la conclusión en las investigaciones. Porejemplo, un brote producido el año 1993 por E. colien U.S.A. fue detectado por métodos convencionalesen 39 días, con un elevado costo para la Salud Pública

de 726 casos y 4 muertes, a diferencia del año 2002que se produjo un brote por E. coli 1057 en Colorado,U.S.A. el cual, utilizando técnicas moleculares comoPFGE es detectado en 18 días, permitiendo a lasautoridades en salud, hacer las intervencionesoportunas y evitar mayor cantidad de afectados(Grafico 2).

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2 0 0 2 C o lo r a d o E . c o l i O 1 5 7 b r o t e

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1 8 1 5 2 2 2 9 3 6 4 3 5 0 5 7 6 4 7 1D a y o f O u tb r e a k

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Brote detectado2002

18 d

CL-PHL: 0-7 d

PHL: 4-7 d

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1 8 1 5 2 2 2 9 3 6 4 3 5 0 5 7 6 4 7 1D a y o f O u tb re a k

Nu

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of

Ca

se

s Brotedetectado1993

Carne

1993 Western States E. coli O157 Outbreak

726 casos4 muertes

39 d

Efrain M. Ribot, Ph.D. CDC. Atlanta

Gráfico 2. Impacto en la Salud Pública

Fuente. Efrain M. Ribot, Ph.D. CDC. Atlanta

Importancia de la Redes Internacionales deinvestigación de brotes de ETA

Red de Vigilancia para Salmonella WHO GSS

Desde el año 2000, WHO GSS (Red de Vigilancia deSalmonella) extendida practicamente en todos loscontimentes, con su Centro regional paraLatinoamérica en Argentina (Instituto de ReferenciaNacional INEI-ANLIS “Carlos G. Malbran”), hafortalecido las capacidades en la Región, a nivel delaboratorio mejorando el asilamiento y lacaracterización de Salmonella y Campylobacter, másrecientemente Shigella y E. coli O157. En el áreaepidemiológica se ha fortalecido con herramientaspara la vigilancia e investigación en ETA (estudio debrotes, carga de enfermedad) y en la vigilanciaintegrada de las ETA. Se ha estimulado la interacciónentre las áreas de laboratorio (clínica, alimentos yepidemiológica).Red de Subtipificacion Molecular deEnfermedades Transmitidas por Alimentos PulseNetDesde el año 2004, la Red de Subtipificacion

Molecular de ETAs (PulseNet) ha fortalecido lascapacidades en la región aportando con laSubtipificación de patógenos de transmisiónalimentaria, una nueva herramienta para aumentar laespecificidad y oportunidad en la vigilancia y elestudio de brotes de ETA como es el PFGE. En lavigilancia integrada de las ETA, se han incorporadodatos de epidemiología molecular.

Logros en América Latina

Los resultados en América Latina, gracias a WHOGSS y PulseNet, han permitido identificar brotes deETA desde el año 2004, pudiendo asociar los agentesetiológicos con mayor precisión con la utilización dela electroforesis en campo pulsado PFGE.PulseNet América Latina ha permitido obtenerresultados de la Vigilancia y brotes de ETA entre el2004 y 2006 identificando 134 brotes producidos porSalmonella Typhi, S. Typhimurium, S. Enteritidis yotras, de los cuales 64 (48%) fueron confirmadosmediante PFGE y 39 brotes producidos por Shigellaflexneri, S. sonnei y S. boydii de los cuales 11(28%)se identificaron con PFGE. Entre los años 2006 y2007 se realizaron 745 aislamientos de Salmonella dediferentes etiologías, 619 aislamientos de Escherichiacoli tanto O157 como no-O157 y213 aislamientos deotros patógenos transmitidos por alimentos comoCampylobacter y otros7.

Metas de las Redes WHO GSS y PulseNet

El objetivo es lograr que todos los países puedanprevenir y controlar estas enfermedades. Además,promueve la vigilancia integral basada en laboratorioy la coordinación intersectorial de las áreas humana,veterinaria y de alimentos, fortaleciendo la capacidadde los países de detectar, dar respuesta y prevenir lasETA y otras enfermedades entéricas infecciosas.Para la Red PulseNet, la meta es reducir lasEnfermedades de Transmisión Alimentaria

CL-PHL:0-7dPHL:4-7d

Brote detectado 2002

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promoviendo la utilización de Técnicas Molecularespara el diagnóstico y tipificación de patógenos a finde fortalecer la vigilancia y el sistema de respuestaen tiempo real.Para Bolivia, las metas son:

- Fortalecer el sistema de VigilanciaEpidemiológica de Enfermedades transmitidaspor alimentos (VETA) integrado, unificando elárea clínica, microbiología de alimentos,veterinaria, Organismos Oficiales de Control yVigilancia, Servicios de epidemiología yestadística, para obtener, recolectar y analizarla información necesaria y actualizada de lasnotificaciones de ETAs,

- Incursionar en la electroforesis en campopulsado.

- Continuar participando activamente de ambasredes bajo un programa integrado conServicios de Epidemiología y estadística querecolecten datos relevantes y factoresasociados.

- Integrarnos en proyectos regionales paraAmérica Latina acorde a las políticas ynecesidades detectadas en el país.

- Obtener nuestra primera base de datosgenética de Salmonella circulantes en el país,en el año 2009, en colaboración con elInstituto Nacional Carlos G. Malbran de laArgentina como Laboratorio CoordinadorRegional para América Latina.

Potencialidades

EL PFGE es un método altamentediscriminatorio, sensible y universal quecontribuye a la detección de brotes demanifestación dispersa, poco evidentes y permitetrabajar con una técnica estandariza para detectarla fuente de origen y la vía de transmisión delbrote, así como la circulación de cepas nuevas.

PFGE es una técnica usada por casi todos loslaboratorios de de la red Pulse Net internacional yestablece la ventaja de conectar a los paísesparticipantes porque:

- Permite comparar las cepas circulantes en losdistintos países y entre los estados de unmismo país.

- Permite mapeo de cepas por grandes regiones.- Permite anticipar la aparición de brotes.- Aumenta la posibilidad de trazar e identificar

los factores de riesgo.- La información contribuye a generar acciones

que mejoren el control e inocuidad de losalimentos, lo que favorece la Salud Pública, elcomercio y el turismo.

- Permite fortalecer la interacción entre las áreasde epidemiología y laboratorios intra einterpaíses.

- Contribuye al desarrollo tecnológico.- Promueve la investigación y la difusión.- La información puede ser transmitida por

Internet con lo cual se agiliza la comunicaciónentre laboratorios y entre la aparición de unbrote.

- La red PulseNet permitirá desarrollarevidencia del impacto en salud pública y enbienestar social derivado de la implementaciónde técnicas moleculares como apoyo delsistema de vigilancia epidemiológica de lasETA4.

- Actualmente, los países participantesreconocen que existe información preliminarpara el inicio de estudio de carga deenfermedad en ETA.

- Solicitan al programa GSS apoyo en eldesarrollo e implementación de protocolos.

- Proponen el desarrollo de la vigilanciaintegrada en enfermedades transmitidas por losalimentos7.

REFERENCIAS

1. Mead P, Slutsker L, Dietz V, McCaig LF, BreseeJS, Shapiro C et al. Food-related illness and deathin the United States. Emerg Infect Dis. 1999; 5:607-25.

2. Archer DL, Kvenberg JE. Incidence and cost offoodborne diarrheal diseases in the United States.J Food Protect. 1985; 48: 887-94.

3. Todd ECD. Preliminary estimates of costs offoodborne disease in the United States. J FoodProtect. 1989; 52: 595-601.

4. Grupo de trabajo de la Red PulseNet, OMS, CDC,INEI. Reunión Exploratoria para la Creación de laRed Pulse-Net en Sub-tipificación Molecular enAmérica Latina para la Vigilancia deEnfermedades Transmitidas por los Alimentos;2003.

5. Servicio Nacional de Información SNIS.6. Red Oficial de Laboratorios de Análisis de

Alimentos RELOAA. Informe de los Laboratoriosde Microbiología de Alimentos INLASA, RedNacional de bacteriología Clínica. LaboratorioReferencia Nacional de bacteriología Clínica.INLASA, Laboratorio de Investigación yDiagnóstico Veterinario de CochabambaLIDIVECO; 2008.

7. Pichel M. II Curso Avanzado WHO GlobalSalmonella Surveillance (WHO-GSS) PrimerTaller WHO-GSS / PulseNet.ServicioEnterobacterias.INEI – ANLIS “Carlos G” .Malbr