Detección y caracterización molecular de microorganismos

Aplicaciones de las técnicas moleculares

Detección e identificación (cuantitativa) del microorganismo (especialmente útil en aquellos de crecimiento “fastidioso” o que se encuentren en pequeñas cantidades en la muestra).

• Gran estabilidad del ADN • Posibilidad de determinar la presencia/ ausencia de gran número

de microorganismos (simultáneamente).• Muy rádido. Muy eficaz. Alta sensibilidad. Alta especificidad.

PCR CUANTITATIVAA T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C

T A G C C G T A A A G C G GT A C G T T A G T T T T C A GG T A C T G

94ºC

T C C A T G A C

A G G T A C T G

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56ºC

A T C G G C A T T T C G C C A T G C A A T C A A A A G T C C A TG A C

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T C C A TC A T G C A A T C A

FQ

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72ºC

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PP

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P

P

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A G C C G T A A A G C G G T A C

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CURVAS PATRÓN Y REAL TIME C. COLI (FAM)

10-1

muestra 1 +

1

muestra 2+

10-2

muestra 3+

10-4

10-3

muestra NEGATIVA

10-5

10-6

blanco

PCR Quantification Spreadsheet Data for FAM-490 Well Identifier Ct

A01A02A03A04A05A06B01B02B03B04B05B06C01C02C03C04C05C06D01D02D03D04D05D06E01E02E03F01F02F03G01G02G03H01H02H03

N/AN/AN/A

N/AN/AN/A

23,422,922,824,424,624,126,626,526,919,219,219,43030,730,431,631,631,33433,633,3

37,33737,2N/AN/AN/AN/AN/AN/A

Blanco

muestra 1 +

muestra 2 +

muestra 3 +

muestra NEGATIVA

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

• Serotipificación por PCR• MLST (multi locus sequence typing)• VNTRs (variable number tandem repeats)• microarrays

Permite la identificación del microorganismo.Permite diferenciar cepas. Aplicación en estudios de distribución, epidemiología, etc.Permite conocer las características del microorganismo (virulencia, resistencia a antibióticos, etc).

ANTIGENO O SALMONELLA MULTIPLEX PCR

C1 C1

C1

C1

1. marcador2. C13. D1 + sdf4. D1 + sdf5. C16. E1/47. D1 + sdf enteriti8. B typhimurium9. E1/4 meleagridis10. C1 Mbandaka11. C2 Hadar12. D1 panama13. C1 virchow14. C1 infantis

D1 + sdf D1 + sdf

E1 E1

B

D1

C2

C1 341 pbD1/A 624 pbsdf 293 pbE1/4 283 pbB 561 pbC2 397 pb

SEROTIPIFICACIÓN MOLECULAR DE SALMONELLA (antígeno O)

MLST: comparación de secuencias de genes conservados (housekeeping)

CEPA 1

TTCTGTTACGCGTAATGGTCATGGTCATGGTCATGGTCATGGTCGATCCATTGCATT

CEPA 2

TTCTGTTACGCGTAATGGTCATGGTCATGGTCGATCCATTGCATT

VNTRs (variable number tandem repeats)

MICROARRAYS

ADN bacteria crecida en medio no estresanteADN bacteria crecida en medio estresante

TTG

TTC

ATG

AAT

TGG

CG

GC

GEN VIR1 GEN VIR2 GEN VIR3 GEN VIR4 GEN VIR5 GEN VIR6

AA

CA

AG

TAC

TTA

AC

CG

CC

G