UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DETECCIÓN MOLECULAR DE ...

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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

DETECCIÓN MOLECULAR DE RICKETTSIAS DEL GRUPO DE LAS FIEBRES MANCHADAS EN GARRAPATAS RECOLECTADAS EN EL MUNICIPIO DE

VILLETA, CUNDINAMARCA - COLOMBIA

TESIS DE MAESTRIA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS FACULTAD DE INGENIERÍA MECÁNICA

LEONORA OREJUELA ARISTIZÁBAL

BOGOTÁ, JUNIO DE 2008

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A mis padres, por su apoyo incondicional en cada paso del camino.

A Alejandro, por acompañarme con amor en la vida

y en la lucha por lograr nuestros sueños.

A Tomás

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CONTENIDOS CONTENIDOS ...................................................3 PREFACIO .....................................................4 AGRADECIMIENTOS ..............................................5 RESUMEN ......................................................6 CAPITULO 1 ...................................................8 INTRODUCCIÓN ...............................................8 Garrapatas................................................8 Enfermedades causadas o transmitidas por garrapatas.....11 Rickettsiosis............................................16 Rickettsias..............................................20

CAPITULO 2 ..................................................23 OBJETIVOS DEL ESTUDIO .....................................23 Objetivo principal: .....................................23 Objetivos específicos del trabajo: ......................23

CAPITULO 3 ..................................................24 MATERIALES Y METODOS ......................................24

CAPITULO 4 ..................................................28 RESULTADOS ................................................28

CAPITULO 5 ..................................................31 CONCLUSIONES Y DISCUSIONES ................................31

Anexos ......................................................33 Tabla de especies de garrapatas reportadas en Colombia ...33 Tabla de rickettsiosis humanas y sus vectores ............37 Tabla de distribución de especies por vereda .............37 Tabla de resumen ..........................................38 Tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas de análisis de hemolinfa.........................38 Tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas moleculares ......................................38 Tabla de las secuencias obtenidas.........................39

REFERENCIAS .................................................41

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PREFACIO Este trabajo resume los resultados y conclusiones de la investigación conducente al título de Maestría en Ciencias Biomédicas, titulado Detección molecular de rickettsias del grupo de las fiebres manchadas en garrapatas recolectadas en el municipio de Villeta, Cundinamarca – Colombia. Este trabajo desarrolló parte de los objetivos del proyecto titulado Las rickettsias como agentes etiológicos de entidades febriles no diagnosticadas en Colombia, dirigido por el Doctor Gustavo Valbuena, realizado en colaboración entre la Universidad de los Andes, el Instituto Nacional de Salud, la Secretaría de Salud de Cundinamarca y el Hospital Salazar de Villeta, bajo el auspicio de Colciencias (Código. 1204-04-16332).

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AGRADECIMIENTOS Al Doctor Gustavo Valbuena, por ser mi tutor, mi amigo y mi guía en la incursión en el mundo de las rickettsias. A la Doctora Elizabeth Castañeda, por darme la oportunidad de trabajar en su grupo y enseñarme la disciplina y la rigurosidad científica. Al Doctor Marcelo Labruna, por brindarme generosamente las herramientas para conocer, entender y apreciar a las garrapatas. Al Doctor Felipe Guhl, por su apoyo incondicional y crítico en mi proceso académico. A la Doctora Cristina Ferro, por colaborar desinteresadamente en la evaluación y análisis de mis conclusiones. A Pilar Carrillo, por enseñarme de su experiencia en el campo y hacer de las salidas ocasiones muy agradables. A Marylin, por compartir conmigo sus conocimientos y por ser mi amiga y compañera. A Patricia, por mostrarme como la tranquilidad y la calma colaboran para alcanzar los objetivos. A Adrianita, por enseñarme la constancia y la disciplina en el trabajo. A todo el grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud, por permitirme trabajar con ellos y hacer de mi estadía un período de aprendizaje y de adquisición de nuevos amigos.

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RESUMEN

Las garrapatas están consideradas como el segundo grupo vector de importancia en la transmisión de enfermedades infecciosas en el mundo 1-3. Estos artrópodos pertenecen taxonómicamente a la clase Arácnida, suborden Ixodida, en el cual se reconocen tres familias: Ixodidae o de las garrapatas duras; Argasidae o de las garrapatas blandas; y Nuttalliellidae 1-4. En Colombia, a pesar del poco trabajo que se le ha dedicado a la identificación taxonómica de estos organismos, se han reportado varias especies de las familias Argasidae e Ixodidae 5,6, incluyendo aquellas consideradas vectores para varias enfermedades 7-12. Varias especies de patógenos han sido reportadas como presentes en garrapatas, de las cuales estas pueden ser no sólo reservorios sino además vectores primarios 2. Entre estas enfermedades se encuentran la tularemia, la enfermedad de Lyme y otras borreliosis, la babesiosis, las ehrlichiosis, la anaplasmosis, la bartonellosis y varias rickettsiosis y enfermedades causadas por virus 13-17. La transmisión, en el caso de las rickettsiosis, es una transmisión biológica directa por regurgitación de saliva infectada, durante el proceso de ingesta de sangre 18. Las rickettsiosis son enfermedades provocadas por la infección con bacterias del género Rickettsia 19,20. Han sido reportadas en prácticamente todos los continentes, pero su incidencia en Centro y Sur América ha sido pobremente documentada 19. Su importancia epidemiológica reside en la gravedad de la enfermedad, en la dificultad que presenta su diagnóstico, y en el hecho de que son fácilmente tratables con antibióticos. Las rickettsias son proteobacterias Gram negativas altamente especializadas, intracelulares obligadas con una gran preferencia por células endoteliales 19-21. Pertenecen a la familia Rickettsiaceae, Orden Rickettsiales, Genero Rickettsia 19, que han sido divididas en dos grandes grupos: el grupo del Tifo y el grupo de las Fiebres Manchadas 19,21. El grupo de las fiebres manchadas está compuesto de 17 especies, en su mayoría transmitidas exclusivamente por

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garrapatas. La identificación de estas especies se logra mediante el uso de métodos moleculares de análisis de secuencias de porciones específicas de ADN 2. Los blancos mas comunes son fragmentos de los genes rOmpA, rOmpB, gltA y del antígeno 17kDa 19,21-27. El objetivo principal de este estudio fue lograr identificar la presencia de rickettsias del grupo de las fiebres manchadas, particularmente Rickettsia rickettsii, en garrapatas recolectadas en el municipio de Villeta. Se recolectaron en total 676 garrapatas representadas en 4 especies: Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Amblyomma cajennense y Boophilus microplus. A excepción de la última, todas las especies encontradas han sido reportadas previamente como vectores de rickettsiosis. De las 676 garrapatas, 160 muestras fueron analizadas mediante técnicas moleculares (23,66% del total). De estas, 152 muestras fueron positivas por amplificación de cualquiera de los dos genes (95%), aunque sólo 8 fueron positivas por ambos (5%). Se logró la identificación de la especie de Rickettsia en 5 de estas muestras. Una de ellas, perteneciente a una garrapata de la especie Rhipicephalus sanguineus, fue identificada como Rickettsia rickettsii. Sorprendentemente, las otras 4 muestras fueron identificadas como Rickettsia prowazekii, especie de rickettsia del grupo del tifo, no reportada hasta el momento infectando garrapatas. En conclusión, en el presente estudio no sólo logramos corroborar que en Colombia se encuentran los especies de garrapatas reportadas como vectores de rickettsias, sino que además confirmamos la presencia de rickettsias del grupo de las fiebres manchadas (Rickettsia ricketsii) en dichos vectores. Este hallazgo representa el primero de este tipo en Colombia, según nuestro conocimiento. Adicionalmente, nuestros hallazgos abren las puertas para el estudio de la transmisión por garrapatas de otras especies de rickettsias no reportadas hasta el momento en estos vectores.

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CAPITULO 1

INTRODUCCIÓN

Garrapatas

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos no permanentes, altamente especializados que actúan como vectores de enfermedades al alimentarse de mamíferos, aves, reptiles y en ocasiones también en anfibios 1,3. Se caracterizan por tener un tamaño corporal relativamente grande dentro del grupo de los Acarina, por ingerir grandes cantidades de sangre, linfa o tejidos digeridos, por tener una capacidad reproductiva y de muda regulada por la ingesta de sangre, y por colocar un gran numero de huevos (entre 200 y 23,000 según la especie) 3. Taxonómicamente pertenecen a la clase Arácnida, al suborden Ixodida, en el cual se reconocen tres familias: la Ixodidae o de las garrapatas duras, llamadas así por la presencia de un escudo dorsal queratinizado; Argasidae o de las garrapatas blandas, llamadas así por la presencia de una cutícula blanda que les permite expandirse en tamaño; y Nuttalliellidae, que incluye una sola especie confinada geográficamente a África 1-4. Las especies de las dos familias principales tienen 3 estadios en el ciclo de vida: larva, ninfa y adulto 2,3. Las tres familias agrupan alrededor de 850 especies distribuidas mundialmente 2-4, aunque tan sólo un 10% de estas presentan importancia en la medicina por su papel como vectores 1. En Colombia, a pesar del poco trabajo que se le ha dedicado a la identificación taxonómica de estos organismos, se han reportado varias especies de las familias Argasidae e Ixodidae 5,6, incluyendo aquellas consideradas vectores para varias enfermedades 7-12. Ver tabla de especies de garrapatas reportadas en Colombia. Las garrapatas que transmiten las enfermedades rickettsiales del grupo de las fiebres manchadas, son aquellas pertenecientes a la familia Ixodidae 28-31. Estas garrapatas duras pueden tener un tamaño que varia entre los 2mm y 30mm,

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dependiendo de la especie, estadio, sexo y estado de alimentación 1. Típicamente tienen 3 estadios de desarrollo: larva, de seis patas, ninfa, de ocho patas, y adulto sexualmente maduro, también de ocho patas 1,2. Su ciclo se puede completar en dos o más años, durante los cuales hacen una sola ingesta de sangre en cada estadio, en un huésped vertebrado diferente cada vez, antes de la metamorfosis al siguiente estadio 1. La mayoría de las garrapatas Ixodidae prefieren hábitats expuestos, de vegetación mediana, aunque también se pueden encontrar escondidas bajo piedras o tierra 1, en especial durante el periodo de oviposición (REF). La búsqueda de posibles huéspedes se basa en el uso de un sistema sensorial muy eficiente que percibe estímulos físicos o químicos, en especial las vibraciones y la emanación de CO2 por parte del huésped 1,2,32. Así, las garrapatas se ubican en la punta de la vegetación baja, con las patas anteriores abiertas, a la espera de que pase un posible huésped, o al percibirlo, lo buscan directamente 1. También se ha mencionado que la ausencia o presencia de ojos influye en el método de búsqueda de huésped utilizado por cada especie 32. Una vez sobre el huésped, las garrapatas Ixodidae usan sus quelíceros (porción bucal distal afilada) para hacer una incisión en la piel, penetrar la epidermis e insertar la porción bucal media o hipostoma dentro de la incisión. La ruptura de los vasos de la dermis crea una reserva de alimentación de donde la garrapata toma la sangre y otros fluidos 1. Algunas garrapatas secretan una especie de cemento dentro y sobre la herida, para mantenerse adheridas más firmemente 1. A medida que se alimentan, las garrapatas eliminan el exceso de líquido filtrando de la sangre que ingieren, y devuelven el exceso al huésped 1,3. Es durante este proceso que se puede dar la transmisión de las rickettsias y otros patógenos (REF). El periodo de alimentación es de varios días a varias semanas, durante el cual las garrapatas pueden aumentar hasta 100 veces su peso 1.

Amblyomma Garrapata de 3 huéspedes que ocasionalmente pueden cambiar a 2 huéspedes 6. Presenta 106 especies en el mundo y 57 en la

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región Neotropical donde ha sido reportada desde Argentina hasta el sur de México 6,33. En Colombia se han identificado 22 especies 6. Entre las especies que se han observado infectadas con rickettsias están A. cajennense, A. cooperi 12, A. americanum 34, A. maculatumn 19

Amblyomma cajennense Esta garrapata es considerada una peste del ganado silvestre, doméstico y de los humanos de ciertas regiones 33. Es una garrapata cazadora agresiva que frecuentemente ataca en grupos 20, lo que se puede observar en los patrones de picaduras de los pacientes. Su papel como vector de la fiebre de las Montañas Rocosas ha sido ampliamente documentado 20,33, en especial en sur América 35. Esta especie prefiere biomas tropicales o subtropicales porque carece de resistencia al frío, aunque tolera ambientes semiáridos 33. Estas características limitan su distribución geográfica, que va desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de Argentina 33. En toda esta región se observa una abundancia relativa de adultos en los meses más cálidos del año (aquellos de la época lluviosa), y de larvas y ninfas durante los meses fríos 33.

Rhipicephalus sanguineus Esta garrapata está distribuida mundialmente, aunque todavía resulta incierto si su presencia en la región neotropical se refiere a una sola especie o a varias, ya que se evidencian diferencias entre especimenes en varios países, que permanecen en investigación 6. Tiene la habilidad de completar su ciclo de vida dentro de viviendas humanas, lo que ha favorecido su distribución en la región neotropical 6. Ha sido documentado como vector de R. rickettsii 2,36,37.

Anocentor nitens Esta especie es la única asociada al género Anocentor, aunque es incluida por varios autores dentro del género Dermacentor 6. Se encuentra únicamente en las regiones neotropical y neártica 6. Ha sido documentado como vector de R. rickettsii 19.

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Enfermedades causadas o transmitidas por garrapatas Las garrapatas, como vectores de enfermedades están consideradas como el segundo grupo vector de importancia, después de los mosquitos, en la transmisión de enfermedades infecciosas en el mundo, y en especial en los animales domésticos 1-3. Además de su capacidad de transmisión de patógenos y hemoparásitos, la picadura de las garrapatas causa daño directo a la piel, y patologías neurológicas tales como parálisis, relacionadas con las toxinas que inyectan ciertas especies 1-3. Su capacidad vectorial se ve favorecida por varias características propias de la familia Ixodidae. Se alimentan por períodos relativamente largos durante los cuales permanecen firmemente adheridas al huésped; su mordedura, usualmente indolora, las hace pasar desapercibidas hasta lograr saciarse 2. El ambiente de la garganta de las garrapatas es menos hostil que en los insectos hematófagos, ya que estas poseen proteasas intracelulares; en consecuencia, los patógenos ingeridos no están expuestos directamente a la acción proteolítica de estas enzimas 3. Esta característica les da ventaja como transmisores de patógenos y ubica a las garrapatas en los artrópodos que mayor cantidad de organismos transmiten 1,2. Además, la inyección de la saliva para lograr el equilibrio hídrico también sirve para suprimir el sistema inflamatorio del huésped, reduciendo sus defensas 3. Así, las garrapatas han evolucionado hasta ser uno de los grupos más importantes de vectores artrópodos de patógenos humanos 3. Varias especies de patógenos han sido reportadas como presentes en garrapatas, de las cuales estas pueden ser no sólo reservorios sino además vectores primarios 2. Desde 1982 cuando se identificó el agente causal de la enfermedad de Lyme (Borrelia burgdorferi) se han identificado más de 15 especies de patógenos que pueden ser transmitidos por las garrapatas a los humanos 2. Entre las enfermedades que transmiten como vectores primarios 18, se encuentran la tularemia, la enfermedad de Lyme y otras borreliosis, la babesiosis, las ehrlichiosis, la anaplasmosis, la bartonellosis y varias patologías causadas por rickettsias, como son el tifo o las fiebres manchadas, además de varias enfermedades causadas por virus 13-17. Estas

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enfermedades pueden llegar a ser muy severas, e incluso fatales, a pesar de que varias de ellas son fácilmente tratables cuando el diagnóstico es hecho a tiempo 1,38,39. Las garrapatas se infectan con bacterias al alimentarse de animales bacterémicos, que sirven como reservorios, o mediante transmisión transestadial o transovárica 2. También se ha reportado la transmisión sexual desde machos infectados a hembras, aunque sólo para ciertas rickettsias y borrelias 2. La transmisión, en el caso de las rickettsias, es una transmisión biológica directa por regurgitación de saliva infectada, durante el proceso de ingesta de sangre 18. Hay varios aspectos que se deben tomar en cuenta para entender los mecanismos de transmisión de bacterias por parte de las garrapatas: 1)Las rickettsias se multiplican en casi todos los órganos y fluidos de las garrapatas, en particular glándulas salivares y ovarios, lo que facilita la transmisión durante la alimentación y durante la formación de los huevos 2,23 y 2)al ser transmitidas de manera vertical (transovárica), las garrapatas actúan a manera de reservorios de las rickettsias, y la distribución de la enfermedad causada por estas bacterias será idéntica a la distribución de sus vectores 2. Así, la tasa de infección de los reservorios, la tasa de infestación de las garrapatas, y la densidad del huésped, son las principales variables que determinan la epidemiología de las enfermedades transmitidas por garrapatas 2,20. Por eso, las garrapatas que son vectores de enfermedades suelen estar en zonas geográficas limitadas, como caseríos o vecindarios, en focos con condiciones óptimas para las garrapatas y asociadas a los animales involucrados en la circulación de los agentes patógenos 2,35.

Tularemia Enfermedad también conocida como fiebre del conejo, es causada por la bacteria Francisella tularensis. La infección se puede dar por ingestión o contaminación de alimentos con tejidos contaminados, inoculación por parte de vectores como garrapatas o moscas, o por inhalación. Su sintomatología se puede dividir en varios síndromes que incluyen tularemia ulceroglandular (la más común), oculoglandular, orofaríngea o del tracto gastrointestinal, pulmonar o tifoidal. La enfermedad se inicia 3 a 5 días después de la inoculación, y se inicia con fiebre, escalofríos, dolor de cabeza, fatiga y

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mialgias. El diagnóstico se basa en la presencia de factores epidemiológicos de riesgo como son el contacto previo con conejos, roedores silvestres o garrapatas, y la presencia de una lesión pustular en las extremidades. El aislamiento del organismo a partir de las lesiones es posible pero no recomendable ya que el patógeno es altamente infeccioso. Es considerado como posible arma biológica. El tratamiento se debe iniciar ante la presunción epidemiológica y consiste en estreptomicina intramuscular aunque la gentamicina intramuscular o intravenosa también es efectiva. El uso de cloramfenicol o tetraciclinas se asocia con relapso en la enfermedad 38.

Enfermedad de Lyme Es la enfermedad transmitida por vectores más común en los Estados Unidos. Es causada por la espiroqueta Borrelia burgdorferi. Su principal vector es la garrapata Ixodes scapularis y sus principales reservorios son mamíferos pequeños tales como roedores. La transmisión desde las garrapatas requiere que estas se encuentren adheridas por un mínimo de 36 horas para que la tasa de infección sea significativa. No existe evidencia de que esta enfermedad pueda ser transmitida por otros artrópodos o por otros medios distintos a la inoculación. La enfermedad se desarrolla en tres estadíos. El primer estadío ocurre de 7 a 10 días después de la inoculación y se caracteriza por un eritema característico llamado eritema migrans y por sintomatología de influenza (fiebre baja, fatiga, artralgia, dolor de cabeza, tos y linfadenopatia regional). Durante el segundo estadío se ven síntomas que incluyen lesiones anulares cutáneas, fiebre, adenopatia y síntomas del sistema nervioso central. Durante la fase crónica de la enfermedad, estadío 3, los síntomas incluyen artritis crónica, impedimento del sistema nerviosos central, dermatitis y queratitis. El diagnóstico no requiere confirmación por laboratorio clínico, sin embargo la prueba de ELISA tiene una sensibilidad del 89 por ciento y una especificidad del 72 por ciento. Los resultados deben ser confirmados por Western Blot. El aislamiento de la bacteria y su posterior cultivo es posible pero requiere de varias semanas de crecimiento. El tratamiento recomendado incluye doxiciclina o amoxicilina oral durante un mínimo de 21 días, o cefuroxime o eritromicina en caso de alergia a la penicilina o inhabilidad de tomar tetraciclinas 38.

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Otras borreliosis La fiebre recurrente es una enfermedad causada por otras especies del género Borrelia (diferentes a B. burgdorferi), que son transmitidas por garrapatas del género Ornithodoros. Sus hospederos son roedores, conejos y liebres. Sus síntomas incluyen artralgia, mareos, náusea y vómito, con fiebre alta y de patrón irregular, en ocasiones asociada con delirio. El diagnóstico se da por detección de las espiroquetas en sangre, médula ósea o líquido cefalorraquídeo durante un episodio febril. El tratamiento de elección es la doxiciclina o la eritromicina 38.

Babesiosis Es la única enfermedad transmitida por garrapatas en los Estados Unidos que es transmitida por un protozoo (Babesia microti o B. divergens). La transmisión ocurre por inoculación desde el vector garrapata (varias especies de Ixodes). La sintomatología es parecida a la de otras enfermedades transmitidas por garrapatas e incluye fiebre, sudoración, mialgias y dolor de cabeza, pudiendo simular una malaria. También se presentan infecciones asintomáticas que pueden persistir por varios años. El diagnóstico se basa en historia de exposición previa a garrapatas, y en la detección del hemoprotozoo en extendidos de sangre. El tratamiento para los casos moderados es únicamente sintomático, pero en los casos severos se debe prescribir quinina junto con clindamicina 38.

Ehrlichiosis Las ehrlichiosis humanas han sido identificadas en dos subtipos: Aquellas causadas por bacterias del género Ehrlichia (como E. chaffeensis) y que provocan Ehrlichiosis monocítica humana, y aquellas causadas por Anaplasma phagocytophilum (anteriormente llamada Ehrlichia equi o E. phagocytophila) y que provocan Ehrlichiosis granulocítica humana. Estos dos subtipos son indistinguibles clínicamente. Los síntomas inician 7 días después de la inoculación por picadura de garrapata, e incluyen fiebre, escalofríos, tos, dolor de cabeza y mialgia. Los hallazgos de laboratorio incluyen leucopenia, trombocitopenia y niveles elevados de transaminasas que, junto con la sintomatología, justifican un

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tratamiento empírico con doxiciclina, tetraciclina o cloramfenicol por un mínimo de 7 días 38.

Virales La enfermedad conocida como Fiebre de la garrapata es causada por un orbivirus de ARN transmitido por garrapatas del género Dermacentor. Tiene una presentación benigna por lo que puede pasar sin ser detectada. Se pueden presentar complicaciones en pacientes inmunocomprometidos. Los síntomas se inician una semana después de la inoculación y duran de 7 a 10 días. El diagnóstico se hace por detección del virus mediante inmunofluorescencia en extendisos sanguíneos. El tratamiento no es específico y se recomienda el tratamiento empírico con tetraciclina, doxiciclina o cloramfenicol para cubrir el espectro de todas las enfermedades transmitidas por garrapatas 38.

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Rickettsiosis

Las rickettsiosis son enfermedades provocadas por la infección con bacterias del género Rickettsia, y que resultan en presentaciones clínicas diversas que pueden variar de asintomáticas a severas, según la especie de rickettsias involucradas 19,20. Las manifestaciones de estas infecciones rickettsiales se caracterizan por un estado febril agudo acompañado de síntomas inespecíficos que incluyen un exantema que se generaliza a pies y manos 19. Infecciones múltiples, como las reportadas con R. rickettsii y Ehrlichia chaffeensis 35, pueden resultar en manifestaciones atípicas en las enfermedades transmitidas por garrapatas 2. La infección se adquiere por inoculación directa de la bacteria mediante picaduras de garrapatas, pulgas o piojos 20. Ver tabla de rickettsiosis humanas y sus vectores. Las rickettsiosis han sido reportadas en prácticamente todos los continentes, pero su incidencia en Centro y Sur América ha sido pobremente documentada 19. Su importancia epidemiológica reside en la gravedad de la enfermedad, en la dificultad que presenta su diagnóstico, que es fácilmente confundido con el de otras enfermedades febriles, y en el hecho de que son fácilmente tratables con antibióticos. Las enfermedades rickettsiales se clasifican por su agente causal (especie de Rickettsia), por la localización geográfica del lugar de aparición inicial, o por el huésped donde se alimentan los vectores en la naturaleza. Son una de las enfermedades transmitidas por garrapatas conocidas más antiguamente 2. Varias bacterias (ejemplo: R. slovaca y R. africae) fueron inicialmente aisladas y consideradas como rickettsias no patógenas, hasta que se demostró su potencial patogénico en humanos, por lo tanto, todas las bacterias aisladas de garrapatas antropofílicas deben ser consideradas como potenciales patógenos para humanos 2. La sintomatología puede variar según la especie de Rickettsia 2. El principal aspecto fisiopatológico es el tropismo que presentan estos microorganismos hacia las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos 40, a excepción de R. akari que infecta preferencialmente monocitos y macrófagos 20,22,41. La internalización en las células huésped

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requiere de la adherencia a un receptor de la membrana plasmática de la célula receptora 42,43. Este receptor, identificado como la subunidad Ku70 de una proteina quinasa dependiente de ADN (DNA-PK) fue reportado por primera vez en la infección de Rickettsia conorii a celulas de mamiferos, y mostró ser indispensable para la invasión y el establecimiento de la infección 44. Una vez dentro, las rickettsias del grupo de las fiebres manchadas escapan rápidamente del fagosoma, y se multiplican en el citoplasma 20,43, posteriormente invaden células vecinas, movilizándose mediante su capacidad de polimerización direccional de actina 20,22,43, mecanismo que difiere de los otros sistemas de movilidad bacteriana 22,41. Los procesos inmunes que se dan en respuesta a esta colonización provocan un cambio en la permeabilidad del tejido endotelial, lo que a su vez lleva a un edema en la zona perivascular 40,41. También se puede dar desprendimiento de las células endoteliales por cambios en la adhesión celular. Estas células endoteliales circulantes, viables e infectadas, pueden servir de vehículo para las rickettsias, que así pueden establecer nuevos focos de infección en los capilares 43. Los primeros síntomas se reportan dentro de los 14 días de recibida la picadura 1. Durante el curso de la enfermedad se distinguen cuatro etapas: inicio, ataque, exantema y recuperación. El periodo de inicio dura 5 a 10 días durante los cuales se presenta malestar general, debilidad, sopor, anorexia, dolor de cabeza, etc. En el periodo de ataque se da un estado agudo de fiebre que dura de 4 a 6 días y que es seguido por la aparición de un exantema extendido que puede llegar a ser hemorrágico 20,35,40. Sin embargo, se ha reportado que el exantema puede estar ausente en un 10 a 60% de los pacientes 35,45. En el caso de las enfermedades rickettsiales transmitidas por garrapatas, el punto de inoculación puede ser visible como una lesión necrótica negra rodeada de un halo de color rojo oscuro (tache noire) 1,40. Como se mencionó anteriormente, el diagnóstico de estas entidades se complica ya que su sintomatología se asemeja a la de otras entidades febriles de aparición más común. Así, su diagnóstico se debe apoyar en técnicas de laboratorio que se basan en el aislamiento directo del patógeno desde el tejido afectado o su detección mediante técnicas de inmunofluorescencia Indirecta (IFI) 40 o PCR 20. Debido a que las Rickettsias son intracelulares obligadas, muy pocas se encuentran en estado libre en la sangre del paciente, por lo que las técnicas de detección molecular, como el PCR, a

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partir de esta fuente podrían no dar buenos resultados 46 sin embargo su utilidad sigue en discusión 20. El tratamiento de elección es la doxiciclina {7122, REF}, aunque el cloramfenicol también es activo contra R. rickettsii 45. Incluso se ha sugerido el uso profiláctico de la doxiciclina para prevenir la infección en zonas donde predominan los vectores 47.

FIEBRE DE LAS MONTAÑAS ROCOSAS (ROCKY MOUNTAIN SPOTTED FEVER, RMSF) Es una rickettsiosis provocada por la infección con Rickettsia rickettsii, y que provoca una alta morbilidad y mortalidad 1,48. Fue reconocida por primera vez en Idaho, Estados Unidos a mediados de 1870 20, aunque el primer reporte data de 1899 1. En 1906, Ricketts estableció la naturaleza infecciosa de la enfermedad, de ahí el nombre de la especie, y demostró el papel de las garrapatas como su vector 20. En 1919, Wolbach identificó claramente a las bacterias del género Rickettsia dentro de las células endoteliales 20. Desde su descubrimiento en 1870 hasta 1932, se creyó existente únicamente en la porción occidental de los Estados Unidos 20. Actualmente se reconoce su presencia también en Canadá, México, Centroamérica, Brasil y Colombia 1,35,47, donde se la conoce más comúnmente como Enfermedad de Tobia. Sin embargo, en los últimos 20años, la RMSF se ha visto opacada por el descubrimiento y la atención dedicada a otras enfermedades transmitidas por garrapatas, como la enfermedad de Lyme, la ehrlichiosis o la babesiosis 45. A pesar de que la causa, la epidemiología y las características clínicas de esta enfermedad están bien entendidas, y que su tratamiento adecuado con antibióticos es exitoso, todavía siguen ocurriendo casos fatales a nivel mundial cada año, y un pequeño porcentaje de los pacientes infectados ocasionalmente experimentan morbilidad severa o a largo plazo 35. Estudios recientes en Colombia, utilizando reacciones cruzadas contra antígenos de R. conorii han reportado seroprevalencias hasta del 49% en trabajadores del campo 49. Aunque este estudio, conducido en Córdoba, Montería, no tenía como objetivo la identificación directa de las rickettsiosis en la zona, sirve como estimativo indirecto de la presencia de las rickettsias en esa población 49.

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La garrapata transmite la enfermedad a los humanos durante períodos prolongados de alimentación, ya que la rickettsia requiere de 6 a 10horas de unión de la garrapata al hospedero para reactivarse y ser inyectada junto con la saliva del vector 1,20. Así, la RMSF tiene un período de incubación de 7 días después de la picadura de la garrapata infectada 45.

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Rickettsias Son proteobacterias Gram negativas altamente especializadas, intracelulares obligadas con una gran preferencia por células endoteliales, donde viven libremente en el citosol 19,21, o menos frecuentemente en el núcleo, en el caso de las pertenecientes al grupo de las fiebres manchadas 20. Su tamaño varía entre las 0,4 y 0,9micras 20,50. Pertenecen a la familia Rickettsiaceae, Orden Rickettsiales, Genero Rickettsia 19, que han sido divididas en dos grandes grupos: el grupo del Tifo (TG por sus siglas en ingles: Typhus Group) y el grupo de las Fiebres Manchadas (SFG por sus siglas en ingles: Spotted Fever Group) 19, según sus características antigénicas y secuencias genéticas 19,21. El grupo de las fiebres manchadas se denomina de esta manera debido a la presentación clínica de las enfermedades que provoca. Está compuesto de 17 especies que, a excepción de Rickettsia akari y Rickettsia felis, son transmitidas exclusivamente por garrapatas. Dentro de estas, las bacterias presentan transmisión transovárica y transestadial, lo que le asegura una supervivencia limitada a estos vectores 2,19-21. Las 15 especies restantes han sido asociadas con rickettsiosis humanas 19. Presentan un ciclo zoonótico dentro de su huésped natural, las garrapatas de la familia Ixodidae, donde se multiplican, especialmente en las glándulas salivares y ovarios 23,43; existe además transmisión horizontal hacia sus huéspedes vertebrados 22. En las garrapatas pueden ser ligeramente virulentas, lo que explica el hecho de la baja proporción de garrapatas infectadas halladas en la naturaleza 20,46. La detección de la infección en garrapatas se puede hacer a partir de barrido de órganos o de hemolinfa, donde se pueden observar las bacterias por inmunofluorescencia directa 2. Las rickettsias tiñen pobremente con tinción Gram, pero pueden ser observadas como pequeños cocos con tinciones de Giménez y Giemsa, puede retienen fucsina 2. Actualmente están disponibles métodos moleculares tales como el análisis de secuencias de ADN, que permiten la detección rápida y la identificación de los patógenos transmitidos por garrapatas 2.

Rickettsia rickettsii Es una de las rickettsias más patogénicas del grupo de las fiebres manchadas y se ha identificado en garrapatas de los

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géneros Dermacentor, Amblyomma, Rhipicephalus, Haemaphysalis e Ixodes 2,45. La demostrada virulencia contra sus vectores podría explicar la baja proporción de garrapatas infectadas en la naturaleza 46.

EL GENOMA DE Rickettsia Los organismos rickettsiales tienen genomas relativamente pequeños (1,1 a 1,3Mb) que han surgido a través de una evolución reductiva a medida que las bacterias iban desarrollando dependencia de las células hospederas, para sus funciones vitales. Como resultado, sus genomas están llenos de pseudogenes 20,50. Hasta el año 2005 se contaba con el genoma completo de 3 especies de rickettsias: R. prowazekii (grupo del tifo, número de acceso Genbank AJ235269), R.typhi (grupo del tifo, número de acceso Genbank AE017197) y R. conorii (grupo de las fiebres manchadas, número de acceso Genbank AE006914) 42,50. Actualmente se cuenta con las secuencias completas en revisión de varias otras especies: R. bellii (número de acceso Genbank CP000087), R. felis (número de acceso Genbank CP000053), R. typhi (número de acceso Genbank AE017197), R. sibirica (número de acceso Genbank AABW00000000) y R. rickettsii (número de acceso Genbank AADJ00000000), también se cuenta con la secuencia parcial de varios genes de otras especies. El análisis comparativo de las secuencias obtenidas ha permitido observar que las variaciones genéticas en los repertorios de las diferentes especies de rickettsias están asociadas a su capacidad de sobrevivir bajo circunstancias diferentes durante la infección a largo plazo en huéspedes también genéticamente diferentes, como garrapatas (R. conorii) y piojos (R. prowazekii) 42,50. En el caso de R. typhi se han podido identificar 42 genes involucrados en procesos de virulencia lo que ha permitido establecer hipótesis sobre los mecanismos de virulencia utilizados por estas bacterias. 50. Entre los genes encontrados se encuentran hemolisinas que permiten la supervivencia intracelular, fosfoliasas que permiten el escape de la bacteria desde el fagolisosoma, superóxido dismutasas que participan en los procesos de estrés oxidativo y varias proteínas de membrana que participan en la adhesión a la célula huésped o actúan como hemolisinas 50.

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Fragmentos de los genes rOmpA, rOmpB, gltA (Citrato sintasa) y del antígeno 17kDa son las secuencias blanco mas comúnmente usadas para la identificación de las rickettsias, y en especial de aquellas del grupo de las fiebres manchadas 19,21-

27. Los genes rOmpA y rOmpB codifican para dos proteínas de membrana. La proteína OmpA es de alto peso molecular, altamente antigénica, altamente conservada 20,42, y específica para las rickettsias del grupo de las fiebres manchadas 21. Además está involucrada en la adhesión de R. rickettsii a las células huéspedes 21. La citrato sintasa, codificada por el gen gltA, es una enzima que está presente en todas las células vivas, y forma parte del ciclo del ácido cítrico, jugando un papel muy importante en la producción energética de las células. Se han identificado dos tipos de esta enzima: Una forma dimérica presente en los eucariotes y las bacterias gram positivas, y una forma multimérica presente en proteobacterias 27. Su uso en el estudio filogenético de Rickettsia se deriva del hecho de que se ha demostrado su presencia en todas las especies de este género, en el que es altamente conservado 27.

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CAPITULO 2

OBJETIVOS DEL ESTUDIO

Objetivo principal: Identificar la presencia de rickettsias del grupo de las fiebre manchadas, particularmente R. rickettsii, en garrapatas recolectadas en el municipio de Villeta. Hipótesis: La población de garrapatas de esta zona es portadora de rickettsias patógenas y no patógenas para el hombre.

Objetivos específicos del trabajo: 1) Recolectar garrapatas en la zona de Villeta, especialmente en localidades cuyos habitantes hayan presentado seropositividad para rickettsias. Hipótesis: La frecuencia de garrapatas infectadas con rickettsias patógenas en Villeta es similar a la de áreas endémicas de otros países. 2) Identificar taxonómicamente las garrapatas colectadas. Hipótesis: La especie de garrapata en la que más frecuentemente se detectan rickettsias patógenas (Amblyomma spp.) es una especie común en el Municipio de Villeta. 3) Detectar la presencia de rickettsias en las garrapatas, mediante técnicas moleculares. Hipótesis: En las garrapatas colectadas en la zona de Villeta circulan varias especies de rickettsias, que pueden ser tanto patógenas como no patógenas para humanos. 4) Identificar las especies de rickettsias detectadas. Hipótesis: Existen rickettsias en la zona, que no han sido reportadas previamente.

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CAPITULO 3

MATERIALES Y METODOS Según los objetivos: 1) Recolectar garrapatas en la zona de Villeta, especialmente en localidades cuyos habitantes hayan presentado seropositividad para rickettsias. Se realizaron visitas programadas al Municipio de Villeta, donde se visitaron varias fincas por vereda, poniendo especial énfasis en aquellas fincas donde se habían dado casos de fiebre manchada o donde la seropositividad para esta patología había sido confirmada. Se realizó la recolección directa de las garrapatas sobre los posibles huéspedes presentes en cada finca (principalmente perros y caballos), y mediante el método de arrastre con tela sobre potreros y zonas abiertas. Las garrapatas capturadas se colocaban en frascos con ventilación y humedad para mantenerlas vivas, siendo agrupadas según huésped y localidad, hasta su traslado al laboratorio. Se hizo énfasis especial en la recolección de estadíos adultos, lo que facilita la identificación taxonómica y la obtención de hemolinfa. 2) Identificar taxonómicamente las garrapatas colectadas. Una vez en el laboratorio, cada garrapata fue colocada en un tubo individual al cual se le asignó una identificación en la base de datos. La identificación taxonómica se realizó usando claves taxonómicas que fueron previamente validadas con especimenes conocidos. Una vez la garrapata era asignada como perteneciente a una especie, se recurrió a la descripción de dicha especie para comprobar que la asignación fuera correcta. En caso de duda, se consultó con el Dr. Marcelo Labruna de la Universidad de Sao Paulo, Brasil, quién actuó como experto para la identificación de estos organismos y que brindó su colaboración en un ejercicio de calidad en la identificación. 3) Detectar la presencia de rickettsias en las garrapatas, mediante técnicas moleculares.

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Se utilizaron dos estrategias de búsqueda, como medio para la optimización de los recursos: A) En la primera etapa de recolección, y una vez identificadas, las garrapatas fueron procesadas para obtención de hemolinfa. Para esto, a cada garrapata se le seccionó la porción distal de una de las patas delanteras, y se fijó la gota de hemolinfa que se obtenía en una lámina portaobjetos. Este procedimiento se realizó por duplicado, y las garrapatas procesadas fueron almacenadas en tubos individuales a -20°C. Una de las láminas obtenidas fue teñida con tinción de Giménez y examinada al microscopio para la visualización de rickettsias dentro de los hemocitos. La otra placa fue procesada para inmunofluorescencia directa. En esta técnica, la placa que contiene los hemocitos fijados es expuesta a anticuerpo policlonal de conejo IgG anti-rickettsia. El anticuerpo reacciona fijándose a los hemocitos que están infectados con rickettsias, y es detectado mediante la exposición a anticuerpo IgG anti-conejo marcado con fluoresceína, que emite una fluorescencia detectable al observar la placa bajo un microscopio de fluorescencia. Las garrapatas positivas según los resultados de estos dos métodos de tamizaje fueron utilizadas en la extracción de ADN según se describe a continuación. B) En la segunda etapa de recolección, las garrapatas identificadas fueron sumergidas en alcohol al 70% para ser desinfectadas y posteriormente fueron seccionadas en dos porciones. Cada una de estas porciones fue almacenada en un tubo individual, y fue almacenada a -20°C y -80°C hasta su procesamiento. Para la extracción de ADN las garrapatas fueron procesadas de manera individual en caso de haber mostrado evidencia por el análisis de hemolinfa, o en grupos según huésped en caso de haber sido seccionadas en mitades. La mitad almacenada a -80°C se mantiene almacenada para ser usada en caso de errores técnicos, repeticiones o ensayos futuros de cultivo de las bacterias. Se utilizó el estuche comercial Accuprep Genomic DNA Extraction Kit (Cat#. K-3032, Bioneer, Korea) siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad y la concentración del ADN obtenido fueron evaluadas mediante espectrofotometría. EL ADN fue almacenado a -20°C hasta su uso.

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Para la identificación del ADN rickettsial, se recurrió a la amplificación mediante PCR en tiempo real de porciones de los genes gltA, y rOmpA. Las condiciones de PCR para cada uno de los genes son las siguientes: Gen gltA: Se utilizaron los iniciadores CS-5 (GAG AGA AAA TTA TAT CCA AAT GTT GAT) y CS-6 (AGG GTC TTC GTG CAT TTC TT). La detección de la amplificación en PCR en tiempo real se dio mediante el uso de una sonda fluorogénica tipo Taqman marcada con FAM (6-FAM d(CAT TGT GCC ATC CAG CCT ACG GT) BHQ-1), según lo descrito por Labruna y colaboradores. Los ciclos de amplificación, ajustados al protocolo de PCR en tiempo real consistieron en una denaturación inicial a 95°C por 2min, seguida de 50 ciclos de 95°C por 15seg, 50°C por 30seg y 60°C por 30seg, para la obtención de un fragmento de 147pb. Para confirmar la amplificación de este gen y obtener un producto de tamaño suficiente para la secuenciación, se recurrió a la amplificación de un fragmento de 245pb del gen gltA utilizando los iniciadores CS-78 (GCA AGT ATC GGT G AG GAT GTA AT) y CS-323 (GCT TCC TTA AAA TTC AAT AAA TCA GGAT) descritos por Labruna y colaboradores. La detección de la amplificación de este fragmento se hizo mediante el uso de Sybr Green presente en la mezcla de reacción. Los ciclos de amplificación, ajustados al protocolo de PCR en tiempo real consistieron en una denaturación inicial a 95°C por 3min, seguida de 40 ciclos de 95°C por 15seg, 48°C por 30seg y 72°C por 30seg, seguidos de una curva de melting. Gen rOmpA: Se utilizaron los iniciadores RR190.547F (CCT GCC GAT AAT TAT ACA GGT TTA) y RR190.701F (GTT CCG TTA ATG GCA GCA T) con los siguientes ciclos de amplificación: 95°C por 3min, seguidos de 35 ciclos de 95°C por 20seg, 46°C por 30seg y 63°C por 1min, lo que dio como resultado un fragmento de 254pb detectado con Sybr Green. Estos iniciadores fueron reportados por Roux y colaboradores. Para confirmar la amplificación de este gen y obtener un producto de tamaño suficiente para la secuenciación se utilizaron los iniciadores Rr190.70p (ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA) y Rr190.602n (AGT GCA GCA TTC GCT CCC CCT) descritos por Regnery y colaboradores, utilizando 35 ciclos de 95°C por 20seg, 48°C por 30seg y 60°C por 2min. Se obtuvo un fragmento de 532pb del gen rOmpA, detectado por Sybr Green. En todos los casos se incluyeron 2 controles negativos, una muestra con ADN de una garrapata control libre de contaminación por rickettsias y una muestra sin ADN, y un

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control positivo que corresponde a una muestra con ADN de un plásmido que posee una inserción de 1170bp del gen gltA. 4) Identificar las especies de rickettsias detectadas. Los fragmentos obtenidos para cada gen, fueron enviados para secuenciación comercial. Las secuencias proporcionadas por este servicio fueron analizadas mediante la alineación con secuencias conocidas de varias especies, usando la interfase BLAST del National Center for Biotechnology Information en Estados Unidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn, acceso libre). Los resultados de este análisis se dieron en forma de porcentajes de similitud con especies de Rickettsia.

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CAPITULO 4

RESULTADOS Según los objetivos: 1) Recolectar garrapatas en la zona de Villeta, especialmente en localidades cuyos habitantes hayan presentado seropositividad para rickettsias. 2) Identificar taxonómicamente las garrapatas colectadas. Se realizaron 4 salidas de campo en los meses de enero, julio y octubre de 2005, y marzo de 2006, en las que se visitaron 5 veredas del municipio de Villeta: Cune, Chorrillo, Mazata, Naranjal y San Isidro. Se recolectaron en total 676 garrapatas representadas en 4 especies: Rhipicephalus sanguineus, Anocentor nitens, Amblyomma cajennense y Boophilus microplus. La especie más representada fue Rhipicephalus sanguineus con 268 individuos (39,64%), seguida de Anocentor nitens con 169 individuos (25%), Amblyomma cajennense con 151 individuos (22,34%) y finalmente Boophilus microplus con 88 individuos (13,02%). Ver tabla de distribución de especies por veredas. De las 676 garrapatas un 50,74% (n=343) fueron hembras, 42,6% (n=288) fueron machos, 6,07% (n=41) fueron ninfas y 0,59% (n=4) fueron larvas. Ver tabla de distribución de estadios por especie. El número de garrapatas recolectadas en cada vereda fue el siguiente: Cune 184 (27,22%), Chorrillo 33 (4,88%), Mazata 267 (39,5%), Naranjal 125 (18,49%) y San Isidro 67 (9,91%). Ver tabla de resumen. 3) Detectar la presencia de rickettsias en las garrapatas, mediante técnicas moleculares. A) Durante la primera etapa de recolección se procesaron 161 garrapatas mediante la tinción de Giménez. De estas, 29 muestras resultaron positivas o sospechosas, lo que corresponde a un 18,01%. Las muestras procesadas mediante Inmunofluorescencia Directa fueron 65 de las cuales 15 mostraron ser positivas o sospechosas, lo que corresponde al

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23,07%. En combinación se procesaron 161 muestras de las cuales 41 dieron positividad por cualquiera de las dos técnicas (25,46%), mientras que sólo 3 muestras dieron positivas por ambas técnicas (1,86%). Ver tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas de análisis de hemolinfa. B) La amplificación por PCR de los genes gltA y rOmpA mostró los siguientes resultados: gltA: Se analizaron 26 muestras, de las cuales 9 mostraron ser positivas (34,6%). rOmpA: Se analizaron 152 muestras de las cuales 151 mostraron ser positivas (99,348%). En combinación 160 muestras fueron analizadas mediante técnicas moleculares (23,66% del total). De estas, 152 muestras fueron positivas por amplificación de cualquiera de los dos genes (95%), aunque sólo 8 fueron positivas por ambos (5%). Ver tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas moleculares. Al combinar los resultados de las pruebas de hemolinfa y de detección molecular, se ve que sólo 15 de las 676 muestras recolectadas mostraron positividad tanto por las técnicas de análisis de hemolinfa como por las técnicas de detección molecular de ADN rickettsial. Estas 15 muestras se dividen según especie y género de la siguiente manera: 5 hembras de Amblyomma cajennense, 5 machos de A. cajennense, 4 hembras de Boophilus microplus y 1 macho de Rhipicephalus sanguineus. 4) Identificar las especies de rickettsias detectadas. La calidad de las secuencias obtenidas permitió el análisis de 5 muestras. El detalle de las secuencias analizadas y la correspondiente identificación se describe a continuación: Ver tabla de las secuencias obtenidas en cada caso

a) Pool de garrapatas compuesto por individuos de Rhipicephalus sanguineus recolectados sobre un canino en la vereda La Mazata. Se obtuvo una secuencia de 335 pares de bases del gen gltA, que mostró una similitud del 94% (Valor E: 2e-125) con Rickettsia rickettsii (Sheila Smith). Tambien se obtuvo una secuencia de 505 pares de bases del gen rompB, que mostró una similitud del 94% (Valor E: 2e-125) con Rickettsia rickettsii (Sheila Smith).

b) Individuo de Rhipicephalus sanguineus recolectado sobre una canino en la vereda Naranjal. Se obtuvo una secuencia de 400 pares de bases del gen gltA, que

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mostró una similitud del 96% (Valor E: 1e-68) con Rickettsia prowazekii (cepas Madrid E y Cairo 3).

c) Pool de garrapatas compuesto por individuos de Amblyomma cajennense recolectados sobre un equino en la vereda San Isidro. Se obtuvo una secuencia de 400 pares de bases del gen gltA, que mostró una similitud del 90% (Valor E: 4e-38) con Rickettsia prowazekii (Madrid E).

d) Individuo de Amblyomma cajennense recolectado sobre un equino en la vereda Naranjal. Se obtuvo una secuencia de 400 pares de bases del gen gltA, que mostró una similitud del 92% (Valor E: 2e-36) con Rickettsia prowazekii (cepas Madrid E y Cairo 3).

e) Individuo de Boophilus microplus recolectado sobre un bovino en la vereda La Mazata. Se obtuvo una secuencia de 396 pares de bases del gen gltA, que mostró una similitud del 97% (Valor E: 0.0) con Rickettsia prowazekii (cepas Madrid E y Cairo 3).

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CAPITULO 5

CONCLUSIONES Y DISCUSIONES Las especies de garrapatas encontradas en la zona corresponden con las previamente reportadas como presentes en Colombia. Es interesante que hallamos encontrado individuos de la especie Rhipicephalus sanguineus ya que como se expuso anteriormente, esta especie es considerada de importancia para la transmisión de rickettsias a seres humanos dada su preferencia por los caninos y su capacidad de infestar humanos. Es adicionalmente interesante que hallamos podido identificar individuos de esta especie infectados con Rickettsia rickettsii. Este hallazgo no solo confirma la presencia del vector en la zona, sino que reporta por primera vez la presencia de vectores infectados para una enfermedad hasta ahora ignorada en Colombia y por lo general considerada como no existente. La presencia de Amblyomma cajennense infestando equinos fue un hallazgo esperado, al igual que la identificación de la infección de estos vectores con Rickettsia. Lo que llama especial atención es que la especie de Rickettsia identificada (Rickettsia prowazekii) ha sido considerada hasta el momento como transmitida exclusivamente por piojos y no ha sido reportada su presencia en garrapatas. Nuestro hallazgo abre las puertas para posteriores investigaciones en relación a la capacidad de las garrapatas de transmitir esta especie de Rickettsia o de mantenerla en el ciclo biológico actuando como reservorio. La identificación de especies de Rickettsias infectando garrapatas del genero Boophilus microplus es otro de los hallazgos interesantes en este estudio. Hasta la fecha, y en nuestro conocimiento, esta especie de garrapatas no ha sido relacionada con la transmisión o con la infección por Rickettsias. Nuestro hallazgo en este caso fue debido al uso de garrapatas de esta especie como individuos de entrenamiento en las metodologías aplicadas, y aunque es interesante, su relación con las rickettsiosis humanas no se espera que sea de mayor importancia dada las características ecológicas de esta especie de garrapata (infesta únicamente bovinos). Una posible explicación de la identificación de ADN

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de Rickettsia en esta garrapata es la presencia de sangre tomada de un animal infectado en las garrapatas analizadas. Es necesario aclarar que en todos los casos, la identificación de ADN de Rickettsia no implica la capacidad vectorial de la garrapata en la transmisión de dicha bacteria, sino la presencia de organismos de Rickettsia en el organismo de la garrapata al momento de la captura. Esas bacterias podrían estar en la sangre no digerida en el caso de garrapatas ingurgitadas o infectando previamente órganos de la garrapata. El objetivo de este estudio no comprende estimar la relación vectorial de las especies de garrapatas analizadas, sino la presencia en el ciclo biológico de estas garrapatas de bacterias de las cuales se ha comprobado una relación vectorial anteriormente. Una comprobación de la presencia de rickettsias vivas en estas garrapatas se puede lograr al cultivar las mitades congeladas a -80C de las garrapatas analizadas en este estudio. El porcentaje de individuos identificados como positivos para Rickettsia es inferior al porcentaje reportado en otros estudios (5 de 626 garrapatas recolectadas corresponde al 0.7%), aunque cabe aclarar que 2 de los resultados corresponden a grupos de garrapatas compuestos respectivamente de 8 y 9 individuos, lo que elevaría el porcentaje a 3.51% si asumimos que todos los individuos del grupo son positivos. Como se puede observar del número de muestras identificadas inicialmente como sospechosas y de la confirmación posterior mediante amplificación molecular y secuenciación, las metodologías utilizadas varían ampliamente en su sensibilidad. La tinción de Giménez y de inmunofluorescencia arrojaron un porcentaje de positividad combinado del 25%, mientras que el porcentaje de positividad por PCR, ajustado al número de muestras analizadas, fue del 46%. Una limitación observada durante el análisis, fue la dificultad de obtener secuencias de buena calidad en todos los casos. Así, muchas de las muestras que mostraron un fragmento amplificado específico para genes de identificación de rickettsias, no pudieron ser secuenciadas. La dificultad en la reacción de secuenciación puede deberse a la baja concentración de ADN rickettsial en la muestra en comparación con el ADN co-extraído de la garrapata y del huésped, o al diseño de los primers utilizados.

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Anexos

Tabla de especies de garrapatas reportadas en Colombia

Género Especie Distribución geográfica

Huéspedes

Amblyomma: Garrapatas de 3 huéspedes (pueden cambiar a 2 huéspedes). 106 especies en el mundo, 57 en la región Neotropical, 22 especies en Colombia.

Amblyomma auricularium

Argentina, Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Guyana Francesa, Guatemala, Honduras, Sur de México, Nicaragua, Panamá, Trinidad & Tobago, Uruguay, Venezuela, región neártica.

Xenarthra (armadillos, hormigueros, perezosos)

Amblyomma cajennense Desde Argentina hasta el sur de México

Varios, tanto para adultos como para los estadios inmaduros

Amblyomma calcaratum

Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guyana Francesa, Panamá, Paraguay, Trinidad & Tobago, Venezuela, Argentina, Surinam


Amblyomma coelebs

Surinam, Bolivia, Brasil, Guyana, Argentina, Guyana Francesa, Paraguay, Belice, Sur de México, Nicaragua, Panamá, Guatemala, Honduras, Colombia, Costa Rica, Perú, Venezuela

Perissodactyla (pezuñas impares: Tapires, caballos)

Amblyomma crassum Colombia, Perú, Venezuela Reptilia (Reptiles)

Amblyomma dissimile Desde Argentina hasta el sur de México

Reptilia (Reptiles)

Amblyomma geayi

Brasil, Colombia, Guyana, Panamá, Perú, Surinam, Guyana Francesa


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Huéspedes

Amblyomma humerale

Brasil, Uruguay (?), Guyana Francesa, Guyana, Surinam, Trinidad & Tobago, Venezuela, Bolivia, Colombia, Ecuador

Reptilia (Reptiles)

Amblyomma maculatum

Belice, Colombia, Sur de México, Venezuela, Ecuador, Honduras, Nicaragua, Perú

Varios

Amblyomma multipunctum Venezuela, Bolivia, Ecuador, Colombia


Amblyomma naponense

Brasil, Colombia, Guyana Francesa, Guyana, Panamá, Perú, Surinam, Venezuela, Costa Rica, Ecuador

Xenarthra (armadillos, hormigueros, perezosos), Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados)

Amblyomma neumanni Argentina, Colombia, Uruguay

Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados)

Amblyomma nodosum

Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Guatemala, Nicaragua, Panamá, Trinidad & Tobago, Argentina, sur de México, Venezuela


Amblyomma oblongoguttatum

Surinam, Bolivia, Brasil, Guyana, Panamá, Guyana Francesa, sur de México, Venezuela, Belice, Guatemala, Colombia, Costa Rica, Nicaragua

Varios

Amblyomma ovale Desde Argentina hasta México

Varios, para adultos (especialmente Carnivora (carnívoros); los estadios inmaduros parasitan principalmente Rodentia (roedores)

Amblyomma pacae

Guyana, Surinam, Belice, Brasil, Colombia, Panamá, Paraguay, Venezuela

Varios

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Huéspedes

Amblyomma rotundatum Desde Argentina hasta México

Amphibia (anfibios) y Reptilia (reptiles)

Amblyomma sabanerae

Belice, Colombia, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, sur de México, Panamá, Honduras, Nicaragua, Surinam

Reptilia (Reptiles)

Amblyomma scalpturatum

Bolivia, Brasil, Colombia, Guyana Francesa, Guyana, Perú, Surinam, Venezuela, Ecuador


Amblyomma tapirellum Colombia, Nicaragua, Panamá, Venezuela, Belice


Amblyomma triste

Brasil, Colombia, Argentina, Ecuador, Venezuela, Uruguay, Perú

Carnivora (carnívoros), para adultos}{ los estadios inmaduros se encuentran en Rodentia (roedores) y Didelphimorphia (marsupiales americanos: zarigüeyas, chuchas)

Amblyomma varium

Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Costa Rica, Guyana Francesa, Guatemala, Nicaragua, Panamá, Perú, Venezuela


Haemaphysalis: Segundo genero de garrapatas mas abundante del mundo. 160 especies en el mundo, 2 en la región Neotropical, ambas en Colombia

Haemaphysalis juxtakochi

Argentina, Brasil, Colombia, Guyana Francesa, Guyana, Surinam, Trinidad & Tobago, Uruguay, Venezuela, Costa Rica, Ecuador, Panamá, Paraguay, sur de México

Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados), para adultos}{ los estadios inmaduros parasitan varios Huéspedes

Haemaphysalis leporispalustris

Argentina, Brasil, Panamá, Paraguay, Bolivia, Colombia, Guatemala, Perú, Venezuela, sur de México, Costa Rica

Lagomorpha (conejos, liebres), para adultos}{ los estadios inmaduros parasitan varios Huéspedes

Ixodes: Garrapatas de 3 Huéspedes. 240 especies en el mundo, 45 especies en la región Neotropical, 10 en Colombia

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Huéspedes

Ixodes boliviensis

Bolivia, Colombia, Costa Rica, Guatemala, Honduras, sur de México, Panamá

Carnivora (carnívoros)

Ixodes brunneus

Argentina, Colombia, Panamá, Venezuela (?). El rango de distribución de esta especie no esta claro

Aves

Ixodes fuscipes Brasil, Perú, Colombia Rodentia (roedores)

Ixodes lasallei Colombia, Panamá, Venezuela Rodentia (roedores)

Ixodes luciae Desde Argentina hasta el sur de México

Didelphimorphia (marsupiales americanos: zarigüeyas, chuchas), para adultos}{ los estadios inmaduros parasitan Rodentia (roedores)

Ixodes montoyanus Colombia, Venezuela Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados)

Ixodes pararicinus Argentina, Colombia, Uruguay, Brasil (?), Perú (?)

Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados), para adultos}{ los estadios inmaduros parasitan Aves y Rodentia (roedores)

Ixodes tapirus Colombia, Panamá Perissodactyla (pezuñas impares: Tapires, caballos)

Ixodes tropicalis Colombia, Perú Rodentia (roedores)

Ixodes venezuelensis Costa Rica, Colombia, Panamá, Venezuela

Didelphimorphia (marsupiales americanos: zarigüeyas, chuchas), Rodentia (roedores)

Anocentor: Una sola especie, con ciclo sobre 1 Huésped

Anocentor nitens Desde Argentina hasta el sur de México

Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados), Perissodactyla (pezuñas impares: Tapires, caballos)

Boophilus: Garrapatas de 1 Huésped. 5 especies en el mundo, 1 en la región Neotropical, presente en Colombia

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Huéspedes

Boophilus microplus Todos los países de la región Neotropical, excepto Chile

Artiodactyla (pezuñas pares: vacas, ungulados)

Rhipicephalus: Garrapatas de 3 Huéspedes. 70 especies en el mundo, 1 en la región Neotropical, presente en Colombia

Rhipicephalus sanguineus Mundial Carnivora (carnívoros) 6

Tabla de rickettsiosis humanas y sus vectores

Rickettsias Vector Reservorio Enfermedad que causa Grupo de las fiebres manchadas R. rickettsii

Garrapatas Garrapatas, roedores silvestres

Fiebre manchada de las montañas rocosas

R. felis Pulgas

R. akari Ácaros o pulgas

Roedores silvestres Rickettsialpox

R. conorii Garrapatas Garrapatas, roedores silvestres

Fiebre Boutonneuse

R. sibirica Garrapatas Garrapatas, roedores silvestres

Tifo siberiano de garrapatas

R. australis Garrapatas Garrapatas, roedores silvestres

Tifo australiano de garrapatas

R. japonica Garrapatas Garrapatas, roedores silvestres

Fiebre manchada oriental

R. slovaca R. africae R. honei R. aeschlimanii R. helvetica R. parkeri R. amblyommii R. rhipicephali

Garrapatas Garrapatas Patogenicidad no

determinada

Grupo del tifo R. prowazekii Piojos Humanos, ardillas Tifo epidémico R. typhi Pulgas Roedores silvestres Tifo murino o endémico 47,51,52

Tabla de distribución de especies por vereda

Rhipicephalus sanguineus

Anocentor nitens

Amblyomma cajennense

Boophilus microplus TOTAL

Cune 0 162 22 0 184 Chorrillo 33 0 0 0 33 Mazata 183 7 55 22 267 Naranjal 22 0 59 44 125 San Isidro 30 0 15 22 67 TOTAL 268 169 151 88 676

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Tabla de resumen

TOTAL

macho

hembra

ninfa

larva

macho

hembra

ninfa

larva

macho

hembra

ninfa

larva

macho

hembra

ninfa

larva

Cune 75 86 1 17 1 4 184Chorrillo 15 18 33Mazata 81 95 7 7 21 25 9 22 267Naranjal 10 12 21 26 8 4 1 41 2 125San Isidro 23 6 1 11 4 6 7 9 67TOTAL 129 131 8 0 82 86 1 0 70 56 21 4 7 70 11 0 676

Boophilus microplus


Anocentor nitens


Tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas de análisis de hemolinfa

Positivas por tinción de Giménez

Positivas por Inmunofluorescencia

Positivas por

cualquiera de las 2 técnicas

Positivas por ambas técnicas

Rhipicephalus sanguineus 3 - 3 - Anocentor nitens - - - - Amblyomma cajennense 19 8 25 2 Boophilus microplus 7 7 13 1 TOTAL 29 15 41 3

Tabla de distribución de especies positivas mediante técnicas moleculares

Positivas por amplificación

de gltA


de rOmpA

Positivas por amplificación de cualquiera

de los 2 genes


de ambos genes


1 77 77 1

Anocentor nitens - 20 20 - Amblyomma cajennense

7 44 45 6

Boophilus microplus 1 10 10 1 TOTAL 9 151 152 8

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Tabla de las secuencias obtenidas Especie de garrapata

Secuencia Similitud Especie de Rickettsia

Rhipicepahlus sanguineus

gltA: >P23.CS78 TCAGGAATGCTACGGCGTCTCTTGCTAGCTTCATCTACCGTCTTGACGGTGACTAGTGGAATCTTCGGCATCGAGGATATGATAGTTAAACGACGTTAGCTGAGAGAAGTGATTTTTTAGAAGTAGCATATTTACTGATTTATGGGGAACTACCAAGTGGCGAGCAGTATAATAATTTCACTAAACAGGTTCTCATCATTCATTAGTGAATGAAAGATTACACTAGTTTATTTCAGACCTTTTGTAGCTCTTCTCATCCTATGGCGTATTATGCTTGCGGCATGTCGGTTCTCTTGCGGCATTTTATCCTGATTTATTATTTTTAAGGGAAGCAA

94% Rickettsia rickettsii

rompB: >P23.120-807 TCCTACTAGTCTACCGTCGGTGCTGCTGTTATCTGGTAGCGTTAGCTGTTCGTCCTCCTCTGCATTGTCCTTCCCAGCCTTCGCAATTACTTAGCATCAGTCTTGAATTATGACTACACGTTGACCGTCAGCGATATTAATTGCCATTAACAGTAGCAAAACTTTTATTTGAAACTTGAATAAATCCATTAGTAACATTTAATGTACCGGTTAACACCATTAGCTATTACAGCATTATCTCCAAGTATAAGAGGAGCTTTTTGAGTTGTAGGATTTGCTAAATTAAATACTAATGTAGAAGCCGGAGCACCGAAGTCTATTCTTCCTACACCTTTAAGATCATTAATTGTCAATAGCAGCACCATTATTAAATTGTCCACCACCATTTTGAGGATTTTTTGGAGCAGCAGCTTGGTGCATTAGTAACACCTTGACCTGGTAATGTAAGAGGTTTACCGGCATTAAGCGTATAGGTTAAGGGAGTGCGCTTTCTACACACTTTGTG

94% Rickettsia rickettsii

Rhipicepahlus sanguineus

gltA: >T275.CS-78 CGATAGaGGGTATCTGCGGAAGCCGATTACTTTACTTATGATCCGGGTTTTATGTCTacTGCTTCttGtCaAtCTACTATCACATATATAGACGGTGATAGaGGCATATTATGGTATCGAGGATATGATATTAAAGACTTAGGCTGAGATAAtGtGTattTTtgaNAaCttTNATATCtNTTtGatCTAtgaGGGACGGTAtACaAAGTnTgggTCaCaAATagttaTgATTgATtTAtaNNcCanCaaCCtcANCAaTaaTaAAaNANaCtTCgTgNTantATAgCtCtTNgCaNTtaTCattAaaaNtCtgagGtCTTttatAtANtaANtATtgGTgtCgTTcTATGGatctaCAAAGgtgGGGGGgTNaTatAgtNGttatGACTtCttaTaANtt

96% Rickettsia prowazekii


gltA: >P8.CS-78 CTGCGGAAGCCGATtACTTTACTTATGATCCGGGTTTTATGtCTacTGcttGcGaGtcAAtCAtACTATCAcATATATAGACGGTGATagaGGgcAtaGGTtAtGGGgaTCgAtGTATaTgatATCTAGNtgACtTTAGGAGGAacGCAATgGTAGGTgGGGTGGtGGGAATCtTNACAaTCtacaacaCaGAaTAtAGAcAagCGaGgTTTtcTtACTCtTcTTgtCTgTTgTTTgTGAgGagcggTAggGaGggcggTCaTaTTgGgGtATgCAgTAGtTaggAcGtgcgCgAG


40

GNGcGatTggggACcggagAgAAGTNAAgGGGGgAAggGGGGaTgtAATAATAaAAaAaATTacTaAGgggaTATTATAaaacccGCAATACtATCgTTtggTa


gltA: >T266.CS-78 GCGGAtGCCgaTTaCTTTACTTATGATCCGGGTTTtACtGTctactGCTTcttgtcaatctACTATCaCATCTATAGACGGTGATcgCgGcTtATTTaTGGtAtCGacGCGACcTgctCccTctccTtCTTtAtctTGncCGTTCttActtcTctTCTGtNACctCccCCGCCCCGAtcCCTccTcTtTTtCcgcTTGATtCcTTCAtNCgTcGcGGGgcTNAAGAAATccCCCcCCtcTTcccttTctCCCAcCTtntttttGAgtctTgTtcNTGNGGctTcCTCccCccGtcccTTcctAtccTtttcTttTtcAcAttAAATcGtAccAtgTTtGttacNCcCcGCTTtCcTGtGCgCccCccctACctctTccCgTCtcGTTTTccTcGctCNcT


Boophilus microplus

gltA: >Tick191.gltA TTGCTTCCCTAAAATTCAATAAATCAGGATAGAATGCTGAAAGAGAACCAACAGCTGCAAGCATAATAGCCATAGGATGAGAAGAACTACAAAAGGTTTGAAATAGATAGTGTAATCTTTCATTCACTAATGAATGATGAGCAGCCTTTTTAGTAAAATTACAATACTGATCACTACTTGGTAGCTCCCCATAAATCATCAAATATGCCACTTCTAAAAAATCACTTTTCTCAGCTAAGTCTTTAATATCATATCCTCGATACCATAATATGCCTTTATCACCGTCTATATATGTGATAGTAGATTGACAAGAAGCAGTAGACATAAAACCCGGATCATAAGTAAAGTATCTGTTCCGCAGATACCCTACTTATATCGATTACATCCTCACCGATA


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