Aplicaciones de las Técnicas de Detección de

Ácidos Nucléicos en Medicina Transfusional

BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI

FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO

lilianadt2003@yahoo.com.ar

HIV: screening y diagnóstico de laboratorio, Breve repaso…

Los métodos de screening se basan principalmente en labúsqueda de anticuerpos anti-HIV (O,1,2). (ELISA o EIA:1°, 2°, 3° generación)

Existe el test de detección del antígeno HIV: detección delAg p24 (ELISA 4° generación)

Ensayos combinados antígeno-anticuerpo.

Al igual que con otros retrovirus, los portadores deanticuerpos son portadores del virus.

Los anticuerpos anti-HIV y ag p24 aparecen de maneratemprana: existe un período de ventana serológico de 21días hasta la seroconversión.

Los anticuerpos permanecen durante toda la vida.

El diagnóstico comprende 2 etapas: tamizaje y confirmaciónpor Inmunoblot (Western Blot)

Screening/ Diagnóstico molecular: NAT: TMA o PCR;CV;genotipificación; test de resistencia

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Recomendaciones de la OMS para ITT en donantes de Sangre (1)

……”Los métodos utilizados para identificar la presencia HIV emplearán los siguientes targets”…

Marcadores Serológicos

1. Anticuerpos anti-HIV-1, incluyendo grupo O, + anti-HIV-2 (EIA, CLIA)

2. Antígeno del HIV p24 (p24 Ag) (EIA, CLIA)

Ácido nucléico viral: HIV RNA.

Fuente:Screening Donated Blood for Transfusion Transmissible Infections. Recommendations. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data 2009

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HIVEvolución clínica de la Infección

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Período VentanaModel Testing Data

Fuente: -Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.

-Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29

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NAT REACTIVO

Tiempo

Infección

Reactividad Serológica

HIV-1 : 19 días

Virus

Detección más temprana

HIV-1 : 5-6 días

OBJETIVO DE NAT:

Disminución del período de ventana

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Reacción inmunePeríodo Ventana

Eclipse

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Ácidos Nucléicos Definiciones

DNA y RNA son polímeros que almacenan ytransmiten información del código genético

Nucleótidos son subunidades de DNA o RNA queconsisten en un azúcar, un grupo fosfato y unabase A, G, C, T or U

Las Bases se aparean y se mantienen unidas porpuentes de hidrógeno

C se une a GA se une a T (sólo DNA) A se une a U (sólo RNA)

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Ácidos Nucléicos Definiciones

Oligonucleótidos:

Polímeros sintéticos Simple hebra Dos o más nucleótidos De Captura, Cebadores (Primers), o Sondas

(target)

Target

Oligonucleotide

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Ácidos Nucléicos Definiciones

Sondas:

Oligonucleótidos con un molécula detectora acoplada

Detector: molécula de Éster de Acridinio (AE), SYBRGreen, Molecular Beacons , etc.

Sonda de oligonucleótidos

Blanco (Target) Molécula Detectora

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Ácidos Nucléicos Definiciones

Amplicones:

Copia sintética de una secuencia de DNA o RNA

Durante la amplificación, hay un incremento exponencial

del número de copias hecho a partir de un fragmento de

RNA o DNA

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TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Involucran tres etapas:

1. Extracción o captura del genoma viral

2. Amplificación

3. Detección

Ejemplos:

PCR(Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR (Real Time PCR)

NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)

TMA (Transcriptional Mediated Amplification)

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

PCR es un proceso enzimático en el que unaregión específica del DNA se replica paraproducir muchas copias de una secuenciaparticular. Utiliza ciclos repetidos, cada uno delos cuales consiste de tres pasos:

1. Extracción y purificación de los ácidos nucléicos delmicroorganismo de la muestra biológica.

2. Amplificación de un segmento seleccionado del genomadel microorganismo mediante reacción en cadena de lapolimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha.

3. Detección de los fragmentos amplificados en la PCR(amplicones) por electroforesis en gel de agarosa ytinción con bromuro de etidio

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PCR - Conceptos básicos

Especificidad

Generación de un único producto de amplificación

EficienciaMáxima producción de amplificación en función del número de ciclos.

FidelidadNúmero de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia.

SensibilidadMínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias

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Ciclos de la PCR

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Perfil básico de la PCR

Los ciclos (30-35) comprenden tres etapas:

Desnaturalización

Alineamiento (annealing)

Extensión

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PCR Real Time

Los procesos de amplificación y detección deuna PCR convencional se producen demanera simultánea en un mismo vialcerrado.

Mediante detección por fluorescencia sepuede medir durante la amplificación lacantidad de ADN sintetizado en cadamomento.

La emisión de fluorescencia producida en lareacción es proporcional a la cantidad deADN formado. Esto permite registrar lacinética de la reacción de amplificación.

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PCR Real Time

Los termocicladores para llevar a cabo la PCR atiempo real incorporan un lector de fluorescenciay están diseñados para poder medir, en cualquiermomento, la fluorescencia emitida en cada unode los viales donde se realice la amplificación.

Los sistemas de detección por fluorescenciaempleados en la PCR a tiempo real pueden ser dedos tipos:

agentes intercalantes

sondas específicas marcadas con fluorocromos

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TMA: Transcription Mediated Amplification

El ensayo de TMA comprende tres etapas principales que tienen lugar en un sólo tubo:

1. Preparación de la muestra: capturaselectiva del target

2. Amplificación selectiva del ARN del HIV-1 ydel HCV así como del ADN del HBV poramplificación mediante transcripción (TMA)

3. Detección de los productos de laamplificación (amplicón) por el ensayo deprotección de la hibridación.

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Pasos Principales del Ensayo

Detección

Captura del blancoo diana (target)

Amplificación

Paso de Amplificación- TMA

Transcripción-mediadapor amplificación (TMA):produce amplicones RNA

Transcriptasa Reversahace copias de DNAc delIC y del ácido nucléicoviral

RNA Polimerasa inicia latranscripción paraproducir productos deamplificación(amplicones)

Transcription-mediated amplification (TMA)

Promoter-primer

Target

DNARNA

DNA

Primer 2

DNA TemplatePromoter-

primer

RNAse H activities

RNAse H activities

RNA polymerase

100-1000copies RNA amplicon

Primer 2

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(12)

(11)

(10)

IVD Technology. Volume 6, No. 7, Nov/Dec 2000.

Detección - Ensayo de Cinética Dual (DKA)

RLU

(Relative

Light Units)

Interval 25

0/0 1 Sec/25 readings 2 Sec/50 readings

La emisión de luz es capturada y medidaen Relative Light Units (RLU)

TMA:ProcesodeEnsayoe Instrumentación

Amplificación

(TMA)

Rvo. Amp,

Aceite, y

Enzima

Captura

del Blanco

Lisis Viral

Captura del

blanco

Lavados,

Detección

(HPA)

Hibridización de

sondas

Selección

Resultados

(DKA)

Lectura

automática

URL

Pipeteo

wTCR

Calibradores,

Muestras,

Controles

PIPETEOMANUAL

TECAN

BAÑOS DE

AGUA,

SISTEMA DE

CAPTURA DEL

BLANCO

PIPETAS DE

REPETICIÓN,

BAÑOS DE

AGUA

BAÑOS DE

AGUA

LUMINOMETRO

HC+

Semi-Automación

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SEMI-

AUTOMATIZACIÓN

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AUTOMATIZACIÓN

Algoritmo de trabajo para el screening molecular de donantes

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Estudios complementarios para muestras RR HIV-NAT

Si es MP-NAT, abrir pool y resolverindividualmente, luego dHIV-NAT (ensayodiscriminatorio)

Si es ID-NAT ejecutar ensayosdiscriminatorios

Test BM cualitativos

Genotipificación

Test BM cuantitativos (Carga Viral meq/ml oCopias/ml)

Test de Resistencia Viral (TTO)

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Comparación entre el rendimiento de NAT-HIV esperado (gris) vs. observado (blanco) por millón de donaciones testeadas.Laperche et al. Vox Sanguinis (2007) 2, 78-84

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Gracias por su atención!!!

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