Para Francesca

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Tema 1: Introducción a las técnicas de manipulación genética

animal

Los animales transgénicos sirven para entender aspectos de la biología ya que permiten

conocer las funciones, hasta entonces desconocidas, de muchos genes. Así, las diferentes

secuencias de los genes tendrán una función que se detectara mediante modelos animales.

La idea es crear 20.000 ratones (tantos como número de genes humanos), cada uno con una

mutación en un gen diferente de manera que se cubran todos. Después, se observaría que les

pasa a los ratones en ausencia del gen concreto y se podría, entonces, determinar la función

del gen. En la actualidad se tienen 8.000 stem cells con una mutación en un gen diferente.

Para determinar el fenotipo del ratón mutado, este tendrá que pasar por una serie de pruebas

que evalúan diferentes capacidades, para así determinar con exactitud que parte se ve

alterada por la ausencia del gen.

Estos ratones se denominan mouse clinics.

En el mundo existe un gran número de enfermedades raras en las que no se sabe que genes se

encuentran alterados. Mediante esta tecnología se podrían estudiar estos genes, como afecta

su alteración a los pacientes y, finalmente, establecer una terapia adecuada para su cura.

La sustitución génica, nos permite crear estos modelos animales. Otra manera es hacer

animales transgénicos en los que se aumenta la dotación génica.

Microinyección de DNA

Los animales transgénicos se pueden obtener por microinyección de óvulos fecundados. Para

microinyectar a un animal se necesitan meses de entrenamiento.

Los óvulos fecundados se deben microinyectar en estadio de una célula con los dos pronúcleos

formados. Se puede inyectar el DNA de interés directamente en el núcleo. Para ello, la pipeta

debe entrar dentro del núcleo pero sin tocar el nucléolo.

Durante este proceso el embrión está sujeto mediante una pipeta más grande que crea el

vacío. La pipeta de microinyección tiene extremos romos que sirven para sujetar el embrión

sin dañarlo.

El sistema en si es muy complejo. Un paso clave en él es la obtención de micropipetas, deben

estar bien hechas ya que es imprescindible inyectar muy rápido. Hay modelos de máquinas

que hacen micropipetas con un tamaño determinado. En estas máquinas el diámetro de las

pipetas se puede especificar por ordenador.

Con el uso las micropipetas se obturan. Se deben hacer muchas. Una microforja permite dar

un ángulo determinado a las micropipetas, esta curvatura permite pinchar bien los embriones.

En el proceso de microinyección se usa el microscopio invertido. Tiene un sistema lleno de

parafina, también hay un microinyector que se puede regular.

Dentro del núcleo, se microinyecta una cantidad de DNA muy pequeña, es un sistema muy

artesanal.

Los embriones se obtienen fecundando un macho con una hembra que se ha estimulado. De

este modo se obtienen muchos embriones.

Cuando los embriones están listos se ponen en un receptáculo del microscopio invertido. Estos

receptáculos son portas perforados en los que se engancha un cubre:

La parafina sirve para que las gotas

que contienen el DNA y los

embriones no se unan.

Las micropipetas se unen a una

barra metálica. Como el espacio

entre el porta y el cubre están

llenos de parafina se consigue ejercer una presión. Entonces la pipeta ya se puede cargar de

DNA y se van pinchando los embriones desde arriba.

La gestación tiene lugar en hembras pseudogestantes. Estas hembras han sido previamente

cruzadas con machos vasectomizados para inducir la producción de hormonas. Esta monta le

provoca a la hembra un paro en su ciclo estral cosa que las prepara hormonalmente para

gestar. Se sabe las hembras pseudogestantes que hay por el tapón vaginal

Por lo tanto se han dado dos cruces, uno entre una hembra y un macho para obtener los

embriones en los que se les inyecta el DNA, y el otro que se realiza entre la hembra a la que

transferiremos los embriones y un macho vasectomizado.

Se debe tener en cuenta que para este proceso es muy importante utilizar hembras de una

cepa pacífica para que gesten los embriones. El motivo es que las cepas normales tienden a

comerse a las crías si estas son muchas o tienen alguna anomalía.

La transferencia a hembras receptoras se hace por detrás mediante cirugia, metiendo la pipeta

por el infundibulum. Se hacen dos operaciones, una en cada lado; de modo que se inyectan 20

Imagen: Punta de micropipeta curvada

embriones por lado. De este número, no todos se implantan, pero así se garantiza que el

número de implantados sea elevado.

Los blastocistos se transfieren preferentemente al útero de la hembra. La transferencia a útero

se hace 2,5 dpc (días post coitum, que se cuentan a partir del tapón vaginal), en cambio si la

transferencia es en oviducto se hace 0,5 dpc.

La microinyección del DNA se ha realizado en el pronúcleo masculino.

Se debe tener en cuenta que la incorporación del DNA es al azar en el genoma y en un mismo

embrión el DNA se puede incorporar en varios puntos. Solo se microinyecta el gen que, cuando

se incorpora, normalmente lo hace cabeza-cola:

De todos los ratones que nazcan no todos serán transgénicos. Habrá algunos que no habrán

incorporado el transgen. Los que lo hayan incorporado serán o mosaicos o transgénicos.

El animal transgénico se caracterizará por tener el gen incorporado en todas sus células, esto

es porque la incorporación se ha dado en estadio de una cél·lula.

Se puede saber si una cría tiene el transgen o no, o si es mosaico o transgénica a las tres

semanas de vida. Es el momento en que los ratones se destetan. Entonces, se corta una parte

de la cola y se hace un Southern-Blot.

A continuación se muestra un ejemplo de Southern-Blot para este fin:

Para saber si los animales que han incorporado el transgen son transgénicos o no, se cruzan

con un wild type. Es más beneficioso que los ratones sean machos porque se va más rápido. Un

un transgénico verdadero y un wild type dará en la F1 el 50% de las crías transgénicas y el otro

50 no transgénicas.

Si es mosaico la proporción será distinta y, aproximadamente un 10% será transgénico y un

90% no transgénico.

Este cruce se debe hacer con tres líneas de transgénicos para comprobar que el fenotipo es el

esperado y que no presenta variaciones. Los ratones que componen la F1 obtenida del cruce

se utilizan de sementales y se van cruzando con hembras.

Todo este proceso es muy caro. Se debe tener en cuenta los animales que se necesitan para el

experimento. Los ratones tienen que mantenerse, controlar los que nazcan…

Lo más importante es el diseño del animal que debe expresar el gen en el sitio que queremos.

Además de eso el gen ha de funcionar in vivo. Queremos que el gen se exprese dando lugar a

la actividad que queremos, al crear animales transgénicos es muy posible que el fenotipo sea

inesperado.

Ejemplo de animal transgénico con fenotipo inesperado:

Ratones que sobreexpresan la hormona del crecimiento (IGF-1, factor de crecimiento

insulínico), tienen tamaño más grande del normal. Se utilizó el promotor de la insulina.

Se quiso poner la hormona de crecimiento en el páncreas, pero la insulina además de

expresarse en el páncreas lo hace en el ojo. El resultado son animales con retinopatía

similar a la que padecen los diabéticos humanos. El fenotipo inesperado sirvió como

modelo de ceguera y así se pudo avanzar en el intento de crear tratamientos que les

devolvieran la visión a los pacientes.

Los animales transgénicos son herramientas para mejorar la medicina. Si se manipula un gen

de un embrión y este tiene una gran expresión en el desarrollo embrionario, la alteración

puede llegar a ser letal, de manera que no nazcan transgénicos sin ese gen. Para estos casos es

interesante inducir la expresión del transgen cuando interese.

Se necesita un vector para introducir el DNA de interés en el DNA del huésped. Muchas veces

es un plásmido en el que se han eliminado las secuencias bacterianas y se ha puesto el gen de

interés.

El proceso de creación de un transgénico es largo, de al menos un año. Una equivocación

implica una gran pérdida de tiempo y dinero.

El diseño y la construcción del gen quimérico es la parte más importante del diseño. Esta parte

dependerá de la pericia de los trabajadores teniendo en cuenta que, a veces, se ha de hacer

subclonaciones.

Antes de colocarlo en un animal, el constructo se ha de probar en células in vitro, de esta

manera se garantiza su funcionamiento. Si no funciona in vitro, se debe diseñar otro

constructo. Si funciona es muy buena señal para continuar con el proyecto.

Para probar el constructo se debe utilizar las células en las que in vivo se expresaría. Por

ejemplo, si se va a trabajar con hígado, probar en hepatocitos.

Del primer al segundo paso se tardan unos seis meses. Luego va la etapa de microinyección,

nacerá la Fo y se determinarán los transgénicos y los no transgénicos. La microinyección tarda,

como mínimo, tres meses. Contando todo el proceso, entre unas cosas y otras se tarda un año

en obtener el animal transgénico.

Economicamente, el proceso desde que se diseña hasta que se obtienen el animal cuesta

12000 euros.

Es importante tener en cuenta que la mayoría de transgénicos no se distinguen de los

controles. Se deberá hacer, pues, un Southern-Blot con un trozo de la cola.

Fenotipo buscado

Se debe tener claro la naturaleza del gen que se va a introducir o truncar (si se trata de un

receptor, de una hormona del cerebro, de un oncogen…).

Otra cosa importante es determinar el tamaño del gen ya que influenciará en la elección del

vector a utilizar. En principio, interesa que el gen sea pequeño. De todos modos, si es muy

grande se puede utilizar un YAC o un BAC. En caso de usar BAC o YAC, estos no se integran en

el genoma sino que quedan sueltos como si de un cromosoma más se trataran. Otra opción es

realizar un minigen:

Esta posibilidad quita tiempo.

También se puede obtener el cDNA del gen, que no tiene intrones. El problema es que los

cDNA in vivo no funcionan bien. Se tiene que crear un gen artificial.

El vector de expresión se realiza poniendo colas poliA, fragmentos de otro gen (como

promotores…) al lado de nuestro gen de interés. Si este es pequeño se puede enganchar

directamente al promotor sin necesidad de crear un gen artificial.

Un ejemplo de gen artificial es el que se crea uniendo el segundo y el tercer exón de la -

globina. Este gen da lugar a un mRNA muy estable. Así pues, el gen de la -globina solo sirve

para estabilizar el mRNA mensajero. En cambio, la región promotora será la de nuestro gen de

interés u otra que interese.

El fenotipo buscado vendrá determinado en gran medida por el promotor que utilicemos:

Cuando: en qué momento del desarrollo queremos que se exprese.

PROMOTOR Cómo: si se quiere de manera regulada o no…

Dónde: específico de un lugar o no…

Codones optimizados

En la célula hay tRNAs más comunes que otros. Lo ideal es ajustar las bases de manera que den

el mismo aa pero para el tRNA mayoritario de la especie que utilicemos. Esto permite obtener

más proteína ya que el sistema no se colapsa.

Tema 2: Transgénesis sustitutiva, Knock-out/ in

Transgénesis por Adición: se añaden nuevos genes al genoma. El constructo se insertará al

azar. Permitió descubrir múltiples genes con función desconocida.

Transgénesis Sustitutiva: se introduce una mutación en un lugar concreto del genoma, no al

azar. Si esta mutación corresponde a la supresión del gen hablaremos de animales knock-out.

Si se elimina la secuencia interesante del genoma podemos ver la función que falta. Si no se

elimina el gen hablaremos de knock-in.

La modificación específica se hace por un proceso de recombinación homóloga. La

recombinación se dará entre el targeting vector i el genoma.

No se puede hacer directamente inyectando el vector en el genoma.

Primero se debe modificar el genoma de unas células madre embrionarias. Se aprovecha para

generar un animal que lleve la mutación genética en todas sus células. La invención de este

proceso supuso que tres investigadores recibieran el premio Nobel.

El Dr. Evans descubrió como cultivar células madre y como obtenerlas de un blastocisto sin que

perdieran pluripotencialidad. La pluripotencialidad define a las células que pueden

diferenciarse dando lugar a todos los tipos celulares. Una vez en las placas de Petri, se podían

reintroducir en otro blastocisto sin que perdieran la función generando animales quimera.

Otro investigador descubrió que a través de la recombinación homóloga se podía crear

variabilidad y mutaciones en células de mamífero.

En el año 1981 se demostró que podía existir recombinación homóloga entre un DNA exógeno

y el genoma de una célula de mamífero. Hasta entonces se desconocía su existencia en

mamíferos.

Las investigaciones de unos investigadores que se pusieron de acuerdo permitieron el

surgimiento de los animales knock-out (KO).

La modificación que se hace del genoma puede estar presente en todas las células del animal,

desde que este se genera.

Si se escoge en que tejido específico i en que momento de la vida se hace la mutación, se habla

de knock-out y knock-in condicionales. La metodología para obtener knock-out y knock-in

totales o condicionales es diferente, pero se da siempre mediante mutaciones dirigidas.

Knock-out/ -in total

Primero se modifica el gen en el genoma de las células madre embrionarias. Después se utiliza

estas células para generar un animal en el que todas sus células presenten la mutación. Se

hace mediante un vector llamado targeting vector. Hay dos tipos de targeting vector: los

vectores de inserción y los de sustitución.

Los vectores de inserción tienen las siguientes características:

En nuestro gen de interés, pues, se introduce todo el vector. De esta manera, el gen queda

roto. También se puede dar el caso de duplicaciones del gen de interés y perderse el knock-

out. Normalmente esto no pasa y da como resultado proteínas no funcionales (lo que

queríamos al truncar el gen). De todos modos se ha dejado de usar por la posibilidad de

reversión del knock-out.

El vector de sustitución se caracteriza por tener la siguiente estructura:

En este caso, el targeting vector se usa para sustituir una parte esencial del gen o el gen de

interés entero por secuencias del vector. El vector de sustitución ahora se utiliza más. Consiste

en:

Dos brazos homólogos (es decir, con dos secuencias homólogas al gen que queremos

introducir. Las secuencias de vector y DNA han de ser, pues, isogénicas)

La longitud de los brazos de homología es crítica para el mayor grado de

recombinación homóloga. Deben ser de como mínimo 2kb. Si son más cortos se

producirá menos recombinación homóloga.

Un casete de selección positiva (normalmente resistencia a neomicina, neo).

El gen de resistencia a neomicina está situado entre los brazos de homología, de

manera que si se sustituye el gen por el vector, se pueda detectar mediante este

antibiótico.

Un casete de selección negativa (TK).

El gen de selección negativa normalmente se añade en un extremo del vector, fuera de

las secuencias de homología. Se suele utilizar el gen de la Timidina Kinasa.

Se debe tener en cuenta que el fragmento a delecionar es mejor que sea pequeño para

obtener una frecuencia de éxito mayor pero siempre asegurándonos que se pierde totalmente

la función de la proteína que codifica ni se toca ninguna secuencia reguladora. Así pues, el

fragmento a delecionar mejor que sean unos cuantos exones en lugar del gen entero.

Para conseguir que las stem cells en las que se quiere introducir el gen recombinante estén

receptivas se utiliza la electroporación. La electroporación consiste en inducir la formación de

poros en la membrana de las células mediante choques que se dan por la aplicación de un

campo magnético externo. Así se consigue introducir el gen recombinante de forma lineal y, en

algunos casos, se producirá la recombinación homóloga en el núcleo.

Entonces se sembrará en placas de Petri. Ahora interesa seleccionar los casos en los que el

targeting vector reconozca el gen de la célula madre y se dé la recombinación homóloga entre

el vector y el gen de interés. El resultado de la recombinación será la sustitución de exones por

secuencias de nuestro vector (normalmente un gen de resistencia). En el genoma de la célula

madre el gen queda roto ya que se han introducido secuencias externas.

En el momento de seleccionar las stem cells de interés, se debe tener en cuenta que al

introducir el vector de recombinación pueden pasar varias cosas:

Degradación del vector (no hay modificación)

Inserción en cualquier punto del genoma no homólogo. Si esto ocurre, se suele

introducir todo el vector.

Integración del vector en el gen de interés (lo que interesa)

En la placa de cultivo hay, pues, estos tres tipos de células. Para seleccionar las que han

integrado el vector en el gen de interés se debe añadir neomicina y danciclovir al cultivo. Así,

las células con resistencia a neomicina vivirán en presencia de este antibiótico y las células con

actividad timidina-quinasa (TK) morirán en presencia de danciclovir. Solo quedaran las células

con resistencia a neomicina pero sin actividad TK:

Cuando no hay inserción las células no resistirán la neomicina y si esta ha sido al azar tendrán

actividad TK. Las únicas que sobrevivirán serán las que hayan hecho recombinación homóloga

ya que resisten a los dos antibióticos. Esta prueba se debe realizar siempre para obtener los

clones recombinantes.

Después de la selección se usan estas células para microinyectar. Las colonias interesantes se

pescan de las placas de Petri. La microinyección es en blastocisto (en KO condicionales).

Las células de la masa celular interna son células madre embrionarias o embrionic stem cells.

Las células madre se introducen en la

cavidad. Aquí se encontraran con otras

células madre no recombinantes. Después de fomar la cavidad el blastocisto eclosiona.

Al desarrollarse el ratón, los dos tipos de células participaran. Los embriones microinyectados

se transferirán a una hembra receptora. Estos ratones son llamados quimera.

Un animal quimera es aquel que está formado por dos tipos de células madre.

Un ejemplo de animal quimera seria el obtenido a partir de unos blastocitos de una cepa de

color blanco en los que se ha introducido el gen recombinante mediante blastocitos de una

cepa negra. Podremos ver en función del color del pelaje si el animal es quimérico o no.

Tal como se observa en la imagen inferior, para obtener animales quimera se puede utilizar la

microinyección de stem cells a blastocisto, la agregación o inyección a mórula, o la

agregación o microinyección a embriones tetraploides.

La mórula es una fase embrionaria compacta y sin cavidad en el interior. También se puede

utilizar para obtener animales quimera. En la microinyección en mórula se dejan entre 5 y 6

stem cells.

La zona pelúcida protege el embrión durante periodos preimplantacionales. Se tendrá que

tratar para poder microinyectar en estos estadios. Podemos trabajar con una agregación, esto

se realiza cultivando embriones sin ZP con cúmulos de stem cells durante un over-night. Al día

siguiente el cúmulo se habrá convertido en blastocisto con una masa molecular interna que

contendrá las stem cells inyectadas. Con la agregación algunas veces no se obtienen quimeras

sino un animal que proviene totalmente de la inyección de stem cells.

Otra manera de obtener animales que derivan únicamente de las stem cells es partiendo de

dos células 2n. Se induce la fusión de las dos membranas plasmáticas y, así, se obtiene un

embrión de una célula tetraploide. Se pueden mantener en cultivo hasta es estadio de mórula

o blastocisto.

De esta manera se pueden obtener mórulas tetraploides y agregar stem cells diploides.

Entonces el trofoectodermo será tetraploide pero la massa molecular interna será diplode. El

animal deriva completamente de las células 2n recombinantes. Las células tetraploides darán

lugar a tejidos extracelulares como la placenta. Con esta técnica se pueden llegar a obtener

knock-out totales.

Mórula oviducto

Localización de los embriones

Blastocisto útero

Al inyectar DNA en blastocisto se produce un colapso (colapso en blastocisto). Este colapso es

imprescindible para que haya contacto íntimo para que se forme el animal quimera. Después

el blastocisto comenzará a cavitar.

Interesará que un animal quimérico haya incorporado la mutación sobretodo en células

germinales ya que se conseguiría que pasaran a la descendencia. El blastocito que se utiliza es

de macho.

Entonces se coge el macho quimera y se cruza con una hembra control. Para ello, se utiliza una

hembra de color blanco (recesivo). Si obtenemos en la primera generación ratones negros es

que han heredado la mutación. Es decir, pueden llevar el knock-out. En cambio, si fueran

blancos provendrían del genoma no mutado.

Se debe tener en cuenta que los knock-out obtenidos serán heterocigóticos ya que la hembra

es blanca (recessiva). Así pues, siempre se procura que domine el gen que nos interesa. Estos

knock-out no serán totales.

Para obtener knock-out totales, se debe cruzar 2 heterocigóticos para el knock-out:

De esta manera se obtendrían los animales en la siguiente proporción:

- 25% homocigóticos

(knock-out totales)

- 50% heterocigóticos.

- 25% wild type (control)

Un knock-out total es un

animal knockeado en

todos los sentidos desde

que se genera y en todas

sus células.

Las células madre

embrionarias provienen de

la masa celular interna de

un blastocito. Son células pluripotentes ya que pueden dar lugar a cualquier tipo celular. Es

importante mantener la pluripotencialidad in vitro. Así que se deben cultivar, modificar,

hacerles inserciones… sin que hayan perdido esta característica.

Para este fin se utilizan cepas: 129Sv Agutí (Ag)

C57B16 Blanco (Bl)

Las madres receptoras pacíficas son de las cepas CD-1 y ICR.

Las quimeras que se obtienen con la cepa Agutí (cepa negra), tendrán manchas marrones

sobre un fondo negro. Las stem cells marrones tendrán la recombinación homóloga en

heterozigosi (el otro alelo no está recombinado).

Podemos encontrar muchos fenotipos: negros, marrón con modificación genética, marrón sin

modificación genética…

De la F1 se tendrán que fenotipar los marrones para saber cuáles son knock-outs

heterozigóticos. Después se cruzan dos heterocigóticos para el knock-out y así se obtendrán,

aproximadamente, el 25% de knock-out totales. El código de color solo se utiliza para la F1.

Otra cosa a tener en cuenta es que cuando se trata de fibroblastos embrionarios murinos la

mayoría de stem cells tienen que ser cultivadas encima de una monocapa de MEF. Las capas

de MEF confieren un contacto entre células. Además, los MEF secretan factores que impiden la

diferenciación (p.ej. LIF, leukemia inhibitory factor). Es importante que los clones no lleguen a

tocarse. Demasiada confluencia puede hacer que se diferencien.

La única prueba para saber si la stem cell se ha diferenciado o no es mirando la morfología. Las

stem cells se ven muy delimitadas. En cambio, si la diferenciación se ha dado el clon pierde la

delimitación y se aplana.

Si no nos damos cuenta de que se han empezado a diferenciar, al introducirlas en un

blastocisto no darán lugar a todos los tipos celulares. Muchas veces en los animales quimera

falla la línea germinal. Esto supone una pérdida tanto de tiempo como de dinero.

Las stem cells que se utilizan para microinyectar son normalmente de macho, pero al inyectar

no se sabe si el blastocisto será macho o hembra. Así pues se pueden dar varias opciones:

Machos quimera fértiles: si se inyectan a un blastocisto macho.

Conversión de sexo

Hermafroditismo si se inyectan a un bastocisto hembra.

Hembra quimera

Conversión de sexo: se da cuando las células XY colonizan muchas porciones de tejido.

Siempre puede quedar algunas células XX. Estos machos tienen la gran ventaja que solo darán

espermatogénesi sus células XY. Así solo se transmitirá a la descendencia el genotipo XY

(células recombinantes).

Conversión de sexo incompleta: obtenemos animales hermafroditas infértiles, no sirven.

Hembra quimera: estas hembras no transmitirán a la descendencia el genotipo XY. Hay células

XY inestables que pierden el cromosoma Y. Serán XO. Estas células pueden dar ovogénesis.

Induced Pluripotencial Stem Cells (iPS)

Antes no se sabía el camino para obtener células embrionarias de una célula normal. Las iPS

son parecidas a las células madre y provienen de células ya diferenciadas. Por ejemplo, a partir

de fibroblastos y añadiendo diversos factores se pudo obtener células madre iPS. Los factores

utilizados en este caso fueron: Oct4, Sox2, Mye, Klf4.

Las células iPS se parecen mucho a las células madre embrionarias pero hacía falta ver si eran

pluripotentes. Para ello se microinyectaron en embriones y se obtuvieron animales quimera.

Se vio que las iPS se pueden diferenciar en cualquier célula así que, efectivamente, son

pluripotentes. Ahora se pueden aplicar las iPS en terapia génica o en transplantes para evitar el

rechazo.

Limitaciones de los animales KO

Al sustituir la secuencia de interés por el gen neo podemos afectar a locus cercanos. Lo que se

quiere es estudiar la función del gen que falta, no las alteraciones que se producen en genes

cercanos por su ausencia.

Si se elimina un gen endógeno puede que el animal no llegue a superar la fase embrionaria.

En este caso, no se puede estudiar ni sus acciones ni su función.

También puede haber problemas de adaptación y compensación. Por ejemplo, se muta un gen

y el resto de genes (background genético) compensan su ausencia. Por tanto, al no notarse su

ausencia no se puede estudiar la función. Si la compensación se da en fase embrionaria,

además, no se puede realizar un seguimiento.

Si se knockean todas las células y la expresión se da en varios tejidos, puede que tengamos un

efecto global difícil de estudiar. Por ejemplo, el gen se expresa en hígado, riñón y tejido

adiposo. En hígado y riñón tiene la misma función pero en tejido adiposo esta es distinta. De

esta manera, al observar el fenotipo global no se puede discernir que tejido expresa cada

función.

Ventajas de los animales KO totales

Animales KO/KI condicionales o inducibles

En este caso se modifica un gen concreto del genoma en un tejido concreto y/o en un

momento concreto. Hablaremos de KO y KI condicionales o inducibles. Se utilizaran

tecnologías como el sistema de recombinasa específico de secuencia y técnicas de gene

targeting para hacer KO/KI.

Sistema de la CRE-loxP

Se parte de una secuencia de DNA específica que reconoce la CRE y otra que reconoce el loxP.

La CRE cataliza la recombinasa conservativa (sin pérdida de nt) entre dos loxP.

LoxP: son dos fragmentos de 13 pb invertidos, en su centro hay un core que define su

orientación. La orientación de los loxP vendrá definida por un triángulo:

Dependiendo de la orientación de los loxP, CRE hará una función u otra.

Las dos secuencias loxP junto con las dos moléculas de CRE que se unen a loxP forman un

tetrámero.

Cuando los dos loxP están en la misma orientación se da una deleción del ADN que se lleva los

dos loxP. Esta reacción de recombinación suele ser unidireccional, es decir no se puede

recuperar. Normalmente se utiliza este sistema.

Si los loxP se encuentran en la dirección opuesta, las secuencias que se encontraban entre los

loxP se invertirán produciéndose una inversión.

DELECIÓN

INVERSIÓN

Hay otro mecanismo de recombinación llamado Flp-FRT que procede del plásmido 2m de

Saccharomyces Cerevisiae. Es similar al sistema Cre-LoxP, pero presenta una baja eficiencia en

células animales (37ºC). Por ello, se utiliza preferentemente el sistema Cre-LoxP. Se debe tener

en cuenta que recientemente se han obtenido otras variantes (Flpe, FlpL) que aumentan su

actividad in vitro e in vivo.

Propiedades que hacen útiles estos sistemas para la transgénesis animal

No se encuentran normalmente en el genoma

Se puede transmitir a la descendencia

Aplicaciones de las recombinasas

- La CRE se puede utilizar para eliminar el gen neo del genoma.

- En transgénesi por adición se puede hacer que el gen de interés no se exprese hasta

que se quiera. Se ponen secuencias STOP que después se delecionan con CRE (gene

repair).

- Poner un gen marcador que solo se expresará cuando se delecione un STOP (indicator

mice).

- En alteraciones cromosómicas los dos loxP pueden estar muy separados, incluso estar

en cromosomas diferentes. Por ello se pueden dar translocaciones.

- Knock out específico de tejido.

Knock out específico de tejido

Si se quiere hacer un KO con mutación específica de tejido (por ejemplo solo en hígado), se

hacen dos tipos de transgénicos para, después, cruzarlos:

- Un ratón floxado que por recombinación homóloga en stem cells tiene introducido

dos loxP en zonas intrónicas rodeando secuencias importantes del gen del que se

quiere producir el KO. Será pues un KI ya que el gen seguirá siendo activo porque los

loxP están en intrones.

- Un transgénico convencional generado por adición. Expresará la recombinasa CRE

junto a un promotor específico de hígado. Así, aunque el gen esté en todas las células

se expresará solo en hígado.

Al cruzar los dos animales se obtiene un doble transgénico con el gen que se quiere integrar

floxado en todo el organismo, pero la recombinasa CRE solo se expresará en hígado. De esta

forma el gen floxado se expresará en el resto de tejidos. Se deben hacer suficientes cruces

para obtener el gen floxado en homocigosis y la recombinasa CRE, al menos, en heterocigosi.

Una vez se tiene el gen floxado, se cruza el transgénico con animales que expresan la CRE en

diferentes tejidos. Así se obtienen KO específicos del tejido donde se expresa CRE.

El targeting vector que se utiliza para obtener un animal floxado (conditional gene targeting)

es:

Se ha diseñado para que después de la recombinación homóloga se introduzcan los

loxP en intrones.

Tiene dos brazos de homología con la secuencia que se quiere floxar.

A menudo se añade un tercer loxP (también en una región intrónica), con un gen de

resistencia a neomicina rodeado de dos loxP.

En uno de los extremos se introduce un gen de selección negativa (por ejemplo TK).

Cuando se da la recombinación se sustituye el intrón por el vector. Como se ha mencionado

anteriormente, la mutación se ha introducido en secuencias intrónicas. Se pueden inyectar

estas células directamente a un animal o hacer una transfección transitoria con CRE en las

células in vitro. Hay tres tipos de deleción:

- Recombinasa 1 y 3: se obtiene el KO total sin neo (gen de resistencia a neomicina).

- Recombinasa 2 y 3: se obtiene el KO equivalente al de antes, no sirve.

- Recombinasa 1 y 2: se obtiene el gen de interés floxado en las stem cells. Se deben

seleccionar estas. La selección se puede hacer mediante PCR y por Southern-blot

(biología molecular).

KO/KI inducible

El sistema inducible sirve para determinar el lugar y el momento de la activación de la

recombinasa CRE.

Como ya se ha mencionado se debe producir un animal transgénico floxado rodeando los

genes que se quieren floxar. El gen debe ser activo en todas las células.

También hace falta generar un animal transgénico con un constructo que exprese la

recombinasa CRE en un sistema inducible. Así, CRE se expresará en presencia de la droga.

Al cruzar ambos transgénicos se obtiene un doble transgénico que solo expresará CRE con la

droga. Si el KO se expresa solo en un tejido será específico de tejido. Si no, se expresará en

todas las células.

Control de la actividad de CRE

A. Nivel transcripcional: bajo promotores inducibles (por ejemplo, metalotioneina con metales

pesados; ecdisoma que es una hormona de Drosophila…). El que más se utiliza es la

tetraciclina:

- Clásico o Tet-Off

- Reverso o Tet-On

Sistema Tetraciclina Clásico o Tet-Off:

En ausencia de tetraciclina, el transactivador queda libre y se une al operador que está junto al

promotor que dirigirá la expresión de CRE.

Se puede usar el mismo sistema con doxiciclina (Dox) dando el mismo resultado.

En estos casos, el inductor inhibe la transcripción de CRE y se debe administrar el antibiótico

durante las fases embrionarias si no se quiere que se exprese CRE. Esto tiene efectos

secundarios.

Por estos inconvenientes se desarrolló el sistema reverso o Tet-On.

Sistema Tetraciclina reverso o Tet-On:

En este sistema al administrar tetraciclina se activa la recombinasa CRE.

Aquí, el transactivador está modificado (reverso) de manera que es incapaz de unirse al

operador si no hay antibiótico. Si se quiere expresar el KO, tan solo debe administrarse el

antibiótico. El sistema Tet-On también se puede utilizar con doxiciclina.

B. Nivel post-transcripcional: Se utiliza una CRE como proteína quimérica (CRE ER-LBD). El

resultado es una proteína quimérica que en ausencia de promotor se une a HS protein.

Así, cuando se administra el inductor este compite con las hit-shot proteins por la proteína

quimérica. El complejo con el inductor es capaz de activar el KO llegando al núcleo.

Limitaciones de los KO condicionales

Además, se generan dos tipos de transgénicos y se debe obtener un elevado número de

transgénicos que expresan la recombinasa CRE de tejidos específicos y con promotor inducible.

Aun así se tienen que hacer muchos cruces.

Otro inconveniente es que el producto génico de la proteína que se quiere knockear, a veces,

tiene una vida media muy larga. Entonces se tarda mucho en ver los efectos. Cuando se

knockea un gen aún se puede encontrar actividad suya al cabo de un tiempo de expresión.

Se han hecho variantes de la proteína quimérica que con poco inductor funcionan.

En los animales con mosaicismo, CRE no siempre se expresa o se expresa de la misma manera.

Esto implica que no en todas las células se da la recombinación y, por tanto, el knock-out. Si es

el caso se podría enmascarar el fenotipo ya que se debe tener en cuenta que, a veces, con

poco tanto por ciento de proteína de interés el fenotipo original se puede mantener.

Se pueden hacer dos cosas:

Hibridación in situ: para ver qué tanto por ciento de células tienen el mensajero

mutado. Para ello es mejor hacer deleciones grandes.

Poner un gen marcador que se active cuando CRE recombine. Se activa cuando el gen

se escinde.

El inconveniente es que estos estudios se realizan básicamente en ratón. Las stem cells de

ratón son las únicas que superan las gene targeting. Hay un estudio con stem cells de rata pero

no es muy eficiente. Actualmente se estudia la manera de cultivar stem cells para que sean

más estables en cultivo. Hay inhibidores como el fibroblast grouth factor (FGF), ERK, GSK3…

Tecnología KO/KI. Aplicaciones en estudio de la función génica, estudio de

enfermedades y xenotransplantes.

Básicamente los KO se utilizan para analizar la función génica. Una vez se sabe qué gen está

relacionado con una enfermedad, se puede crear animales modelos en los que probar terapias

que inhiben la enfermedad. Por ejemplo, las enfermedades de base monogénica serian más

fáciles de estudiar.

En xenotransplantes básicamente se utilizan transgénicos con un gen concreto inyectado.

También se intenta alterar genéticamente un animal modificando sus antígenos de superficie.

Los estudios más avanzados son del corazón, riñones…

Transgénesis en stem cells dirigida

Se conoce a priori el gen que se quiere modificar.

Transgénesis en stem cells al azar. Se producen animales Gene-Trap.

Cuando se habla de gen endógeno se hace referencia al gen mutado.

La primera parte del vector no tiene promotor, la segunda sí. Así, el primer gen no lleva

promotor y el segundo gen (gen de resistencia) sí.

Esto da lugar a dos posibilidades:

- Condiciones normales (1): el gen endógeno se expresa y da una proteína funcional.

- Gene-Trap (2): se inserta en el gen. El gen deja de producir el mensajero y se hace el

KO. LacZ se producirá solo en los tejidos en los que se produce el gen de interés,

tejidos en los que lacZ estará activo.

Para introducir el Gene-Trap se utiliza la electroporación en células madre embrionarias. Las

células con el Gene-Trap serán resistentes a neomicina y expresarán lacZ. Se puede hacer

clonación y secuenciación y así saber el gen que se ha mutado (a priori no se sabe). De esta

manera se puede obtener un animal quimera y saber en qué tejido expresará el gen.

Consorcios

Todas las tecnologías de KO que se están haciendo aquí siguen consorcios europeos (por

ejemplo EUCOM).

EUCOM utiliza un vector para hacer el KO que es un híbrido entre el KO y el Gene-Trap. El

vector tiene dos brazos de homología con el gen de interés, que queda floxado. El vector tiene

el gen marcador con el de resistencia a neomicina.

Cuando se da la recombinación homóloga se obtiene un KI. El gen está knockeado porque se

ha activado el aceptor de splicing y el gen -gal. Si además lleva CRE, se puede lograr una

expresión específica de tejido. En un solo casete se tiene todo.

Tema 3: Métodos de transferencia genética en animales grandes

La obtención de animales grandes es, inicialmente, como en ratón. Es decir, por

microinyección de DNA. Este sistema no es muy eficaz, es complicado y caro.

Se intentó mejorar el sistema usando esperma como vector, pero ninguno de los dos sistemas

era perfecto.

Más tarde se realizó la transferencia de núcleos para crear animales clónicos. Antes era lo que

se utilizaba.

Por último, también está la introducción de vectores virales (retrovirus RV o lentirus LV). Esto

nos permite formar cualquier animal.

Hay por tanto cuatro métodos que seguidamente se explicaran.

Microinyección de DNA

El ratón tiene madurez sexual muy

pronto (a las seis semanas ya se

puede trabajar). Al superovular, se

puede obtener de 20 a 30

embriones. Además el periodo de

gestación de los embriones es corto.

Solían nacer entre 15-10 ratones de

los embriones transferidos. Esto

disminuye en animales grandes.

Por ejemplo, con cerdo es bastante complicado aunque al superovular se puede obtener de 15

a 20 embriones (números similares a ratones). El inconveniente, en parte, viene dado porque

se necesita mucho más tiempo para gestar (15 semanas). Se puede saber si los cerdos recién

nacidos son transgénicos cogiendo una muestra y haciendo un transfer.

En las ovejas, la madurez sexual es alrededor de las 35 semanas y al superovular se puede

obtener de 4 a 10 embriones. Al transferir no se pueden transferir los 10 embriones, tendrá

que ser uno o dos. Por ello, el rendimiento baja mucho (1%). Para obtener un animal

transgénico será necesario transferir a alrededor de 100 ovejas. La obtención de animales

grandes transgénicos requiere pues de grandes granjas, mantener los animales… Es un proceso

muy caro. En Australia y Nueva Zelanda se hacen ovejas transgénicas para optimizar el

comercio de la lana.

En las vacas la madurez sexual es de 52 a 65 semanas. Las vacas se fecundaran in vitro. El

periodo de gestación son 39 semanas y solo se puede gestar un animal. La obtención de vacas

transgénicas se hacía en Alemania y Canadá, pero ahora la producción está bastante parada. El

rendimiento es también del 1%.

El proceso de microinyección es el mismo:

Los embriones de ratón son muy transparentes. Los de conejo, por ejemplo, son muy elásticos.

Los embriones de animales más grandes son opacos debido a que tienen una capa de mucina a

un lado. Esto baja mucho el rendimiento.

La microinyección, en sí, es relativamente simple. Ahora se fecunda in vitro o se inseminan las

hembras. Se necesita un equipo de gente muy grande y la transferencia a hembras receptoras

se debe realizar en hospital (esto es mucho más complicado en cuanto a equipamiento).

El número de transgénicos que nacerán será muy bajo. Para obtener una cabra transgénica

tendrían que nacer 100 animales y, de ellos, uno será transgénico (rendimiento del 1%). Para

microinyectar, además, se necesita mucha práctica.

Se introduce en el embrión un gen quimérico que lleva un vector con un promotor. Los

animales ya nacen con este gen. En terapia génica, el gen debe ser de la misma especie (el

animal ya tiene SI). Así, en transgénicos el gen ya se detecta como propio. El constructo se

prueba en ratón o en animales pequeños, para estar seguros de que funcionarán in vivo. Si el

transgénico sale mal, dado al bajo rendimiento de la técnica, aún se pierde más dinero.

Por ejemplo, se hicieron cerdos con menos grasa que dieran mejores hamburguesas (años 90)

o mejores costillas. La empresa quebró porque los cerdos tuvieron muchos problemas de salud

(más hormona del crecimiento, acromegalia). Ahora la gente no quiere comer animales

transgénicos.

También se hacían animales resistentes a plagas. En una granja cuando el animal tiene una

enfermedad lo puede pasar a toda la granja y morir todos.

Aplicaciones de la ingeniería genética

Para la ciencia biomédica

Actualmente se hacen animales transgénicos como modelos de enfermedades humanas. Los

ensayos se hacen en animales grandes (por ejemplo, la diabetes se puede inducir en perro).

Aun así, no hay modelos animales de todas las enfermedades humanas. Faltan modelos

animales que se tienen que crear. Los animales grandes de granja también se han utilizado

para la producción de biofármacos. Hay proteínas que para ser activadas necesitan

determinadas glicosilaciones. Han de producirlas células eucariotas.

Los animales transgénicos también se utilizan para desarrollar nuevas terapias y

xenotransplantes. Los transgénicos para xenotransplantes trabajan mucho con el sistema

immunológico.

La FDA no aprobaba muchos protocolos ya que transferir un órgano de cerdo a humano puede

ser un vehículo de zoonosis (transfección de enfermedades de animal a humanos). Ahora las

las investigaciones se están desplazando al mundo de las stem cells.

Para diabéticos se están transfiriendo islotes de cerdo. Los transplantes duran un año y se

tienen que renovar. Los restos provocan fibrosis en el estómago. Cada vez se hacen menos

xenotransplantes.

Para mejorar la lana se modifican las proteínas de esta. Otra cosa es aumentar la eficiencia de

las ligninas (productos más baratos para alimentar). También se puede augmentar la calidad

de las carnes (con menos colesterol, mejor leche…).

Se hicieron conejos transgénicos que crecían más rápido. Uno de ellos se convirtió en un

modelo de acromegalia (cabeza muy grande y patas largas). El problema es que los ovarios

eran inmaduros y como consecuencia los animales eran estériles. El animal no sirvió como

modelo de estudio. No hay modelos animales de acromegalia. Estos animales no se pueden

reproducir.

Otros ejemplos:

Animales clónicos

Los animales que provienen de una misma célula animal (por ejemplo, de vaca) provienen de

un mismo embrión y, por tanto, son idénticos genéticamente. Las manchas que tendrán sí que

serán diferentes.

Obtención a partir de la manipulación del esperma

Todo el mundo probó esta técnica pero no funcionó bien. En realidad el gen no entra en el

espermatozoide sino que se engancha a él y el esperma actúa como vehículo (al entrar dentro

del óvulo). El medio se ha de tratar para eliminar la membrana externa del espermatozoide

(congelando o descongelando, con detergentes…). Luego se ponen en un medio con la

solución y se hace inseminación artificial o FIV. No es la técnica más utilizada ya que se suelen

obtener mosaicos.

Vectores lentivirales

Es una técnica sencilla que permite manipular cualquier especie animal. Se debe tener en

cuenta que hay una capa que cubre el óvulo (ZP).

Resumen de vectores virales:

Vectores retrovirales (infectan células murinas, no afectan a humanos). Solo infectan

cuando el embrión se está dividiendo. Es muy fácil que se obtengan mosaicos. Los

retrovirus son vectores integrativos que pueden entrar e incorporarse en el

cromosoma. Cuando las células se dividen, las dos contendrán el transgen. Son virus

de RNA pero al insertarse en el genoma lo hacen en DNA. Su cápside está envuelta de

una capa lipídica, infecta muy bien las células en división.

Vectores lentivirales. Derivan del virus del SIDA, se ha eliminado la parte patogénica.

Tienen la ventaja de que pueden infectar células que no se dividen. Antes que el

ovocito sea fecundado, el lentivirus lo podrá infectar (ya tenemos transgénico). En el

vector podemos poner genes grandes, al haber eliminado la parte patogénica.

MLV: murinos

HIV-1: muchos más genes,

pero se eliminan todos y se

introduce el gen de interés.

Ciclo normal del lentivirus

La cápside está envuelta de fosfolípidos con moléculas que reconocen la membrana

plasmática. Al salir de la célula el virus se lleva parte de la membrana plasmática.

El RNA entra dentro de la célula y la retrotranscriptasa inversa lo transforma en dsDNA y ya se

puede insertar en el cromosoma. Luego el material del virus se replica en la célula y sale

encapsidado (en un ciclo normal). En nuestro vector hay que mantener unas secuencias que

son importantes para la transferencia del gen (secuencias en cys). También se tiene que

mantener el gen de la retrotranscriptasa inversa.

Replicación:

Un ejemplo de animal transgénico es el que utiliza un vector FUGW:

Se caracteriza por tener:

- 5’LTR-CMV Enhancer/Promotor.

- El elemento flap del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) insertado entre la

repetición terminal larga (LTR, long terminal repeat) del extremo 5’ y el promotor

interno de la ubiquitina-C humana.

- Un promotor interno que lleva el gen reporter de la GFP (Green Fluorescent Protein). El

promotor de la ubiquitina-C humana hace que la expresión sea en diferentes tipos

celulares.

- Enhanced GFP (EGFP)

- Augmento de transcripción ya que el elemento regulador post-transcripcional del virus

woodchuck de la hepatitis (WRE) está en downstream a GFP.

Así, el transgénico tendrá en todas las células el gen, pero solo se expresará allá donde indique

el promotor. También se pueden inyectar secuencias que estabilizan el mRNA.

Metodos de infección

Normalmente se inyecta en el espacio perivitelino:

El problema es que este espacio tiene un volumen reducido y, además, la zona pelúcida

protege el embrión.

Después de inyectar en el espacio perivitelino los embriones se dejan en cultivo 72 horas. La

expresión de la GFP es evidente en blástula y mórula en los cigotos infectados. Después, los

embriones se implantan en el útero de hembras pseudogestantes.

También se puede destruir la ZP de manera que el óvulo queda limpio.

Entonces, los embriones desnudos se ponen en contacto con una suspensión de

lentivirus. El problema es que los embriones son más lábiles.

Los embriones desnudos se dejan en cultivo 3 días hasta el estadio de mórula o blastocisto.

Cuando se elimina la ZP los embriones se arrugan. Después del cultivo los embriones se

implantan en el útero de hembras pseudogestantes. Hay que decir que los embriones

desnudos tienen un desarrollo retrasado in vitro y una menor tasa de implantación que los que

mantienen la zona pelúcida intacta.

Se vio que el 82% de los animales incorporaba el transgen con almenos una copia (rendimiento

muy alto).El 76% mostraba fluorescencia en patas, cola y cara. Los animales GFP positivos

llevaban un provirus integrado. Los que tenían más de dos copias expresaban el transgen en

niveles detectables por la visualización directa de la fluorescencia emitida por la GFP. Los

animales tenían tejido verde fluorescente en los tejidos donde se había incorporado el

transgen. El problema del método es que no se sabe las copias que se insertan.

En estas imagenes se puede ver la fluorescencia verde en un ratón, detectable con luz UVA:

Se ha comprobado que pesé al alto rendimiento de la inyección de lentivirus en espacio

perivitelino el número de copias integradas podía variar de 0 a 20. La fuente de esta variación

viene dada por la dificultad de controlar el volumen de los virus que se dejan en el espacio

perivitelino durante la inyección. Esto es algo a tener en cuenta.

También se han realizado monos transgénicos que se obtuvieron por inyección en espacio

perivitelino. El problema del mono verde que se obtuvo es que no se sabía si era mosaico. Para

averiguarlo se tuvo que cruzar.

Posibilidades de los lentivirus

Resuelven muchas de las limitaciones de la inyección pronuclear:

Mayor eficiencia

Menos invasiva para los embriones

Menor relación coste-efectividad

Requiere menos técnica

La incubación de embriones desnudos facilita la manipulación posterior

Se puede extender a otras especies animales

La proteína VSVG media la entrada viral: encuentra receptores en células de todos los

vertebrados incluyendo primates e incluso pájaros (animales sin métodos

satisfactorios para crear transgénicos).

Limitaciones

Hay secuencias que pueden disminuir el título viral. Por ejemplo, secuencias de

splicing o de polyadenilación en el transgen. También disminuye el título la inserción

de transgenes de más de 10 kilobases entre las LTRs.

En los casos en que son necesarias inserciones virales múltiples para obtener un gran

nivel de expresión puede ser complicado establecer líneas puras de transgénicos

debido a la segregación independiente de los provirus.

La rutina utilizada debe pasar el Comité de Bioética.

Utilizando lentivirus se pueden infectar stem cells pero no es un método tan eficiente

como la electroporación.

Para hacer terapia génica se necesita modelos animales. El hecho de pasar de ratón a hombre

es un gran paso. La UE pide probar la terapia en un animal grande. En muchos casos sería

interesante obtener animales grandes modelos de enfermedad.

Por ejemplo, se consiguió crear un mono con la enfermedad de Huntington pero el animal no

era transgénico al no pasar el fenotipo a la descendencia.

Transferencia de genes a stem cells de ratón utilizando vectores lentivirales

Tema 4: Transgénesis en pez

En los años ochenta hubo resultados en diferentes familias. Las piscifactorías estaban muy

interesadas en estos hallazgos. Se intentaron mejorar factores que aumentan la producción

(mejor crecimiento, mayor resistencia…). Por ejemplo, se hicieron estudios con salmón y

hormona del crecimiento.

En Canadá, por ejemplo, las aguas de los mares son muy frías. Interesa que los salmones

superen esta temperatura.

Las mejoras obtenidas en la carne aún no se aceptan para el consumo humano.

Se hacen plantas transgénicas para cultivar en el tercer mundo. El problema es que se ha de

comprar la semilla cada vez que se siembra ya que las plantas no son fértiles. Aquí aparece un

gran negocio para las productoras de plantas transgénicas.

Si se busca un mayor crecimiento se puede utilizar hormona de crecimiento o anticongelantes.

También se pueden modificar para que crezcan en agua con pocos niveles de oxígeno.

Los peces transgénicos también se utilizan para ciencia (estudio de promotores, localización

con proteínas fluorescentes…). Tiene una importancia económica muy grande.

Las proteínas fluorescentes permiten hacer estudios de expresión in vivo (con la GFP). Así se

puede hacer un seguimiento sin la necesidad de sacrificar.

Liposomas

Se utilizaron para intentar introducir DNA en huevos. Consistía en el bombeo de las pequeñas

partículas de metal en el huevo.

Microinyección

El DNA inyectado puede llegar a entrar en contacto con el DNA del embrión. Se ha de atravesar

la cáscara y el corion del huevo. Aquí se obtienen mucho más mosaicos que en ratón. A

menudo se integra en estadio de 2-4 células aunque el punto de integración también es

diferente.

La aguja que microinyecta rompe las cáscaras.

Se hacen servir placas de Petri con silicona donde se inyectan nanolitros de la concentración

de DNA. En ratones se inyecta entre 2-4 ng/l en peces entre 4-500ng/l. Para ello se utilizan

pipetas de orden superior a las de ratón que son de 1m.

En peces se puede inyectar DNA circular aún con poca eficiencia. En ratones esto no se puede

hacer.

Se intenta que tanto el promotor como la secuencia codificante vengan del pez:

Electroporación

La microinyección es muy lenta (1 por uno). Funciona bien con huevos fertilizados ya que sino

el ovocito se podría activar con el pulso y no podrían fecundarse.

Lo que se hace es sumergir los huevos con el DNA y se aplica un campo eléctrico que hace que

se agujereen. Lo más importante es que el DNA se integre. Así, se detecta el DNA, se expresa y

se transmite a la descendencia. Es una buena técnica.

Según la especie se necesita más o menos pulso. Normalmente se electroporan huevos de una

célula para reducir el mosaicismo.

Se incubaba DNA y esperma y, después, se electroporaba. El DNA se enganchaba al esperma y

servía de vehículo para después fecundar y obtener transgénicos.

No se han conseguido buenos resultados.

Integración

El DNA se integra en forma de tándem. En ratones se integra en tándem cabeza-cola

(promotor + zona codificante):

En peces se integra al azar:

En Southern-blot se puede detectar estructuras secundárias.

Se ha intentado la recombinación homóloga pero hasta ahora no se han obtenido resultados.

Transmisión a la descendencia

Hasta la F2 no se puede tener las líneas bien establecidas debido al mosaicismo. El mosaico al

tener descendencia puede dar F1 heterocigotos. Estos F1 de la descendencia normalmente son

diferentes (no como pasaba en ratón). Se han de seleccionar animales de la F1 para tener un

animal en F2 con un transgen determinado.

Constructos y vectores:

A lo largo de los estudios de transgénesis en peces es esencial la integración. En los peces

dependen mucho de los constructos utilizados.

Se puede utilizar promotor y cDNA de la especie, de otra especie de pez o de otro animal. Se

han utilizado promotores víricos, de mamífero, de pez…

Funciona mucho mejor utilizando secuencias de la propia especie ya que sino a menudo se

inactiva el transgen.

Administrando hormona del crecimiento al salmón se puede obtener animales más grandes.

Se hizo el experimento y los salmones que expresaban hormona del crecimiento de mamífero

morían. El problema era que el gen de la GH era de humano.

Constructo all fish

Era el que funcionaba mejor. El resultado era un incremento normal del tamaño.

El problema fue que además de obtener un incremento del tamaño afectaba otras cosas como

a la pigmentación del salmón, acromegalias (cráneo y mandíbula más grande). Esto daba

problemas de viabilidad. Los salmones, además, se adaptaban más precozmente al agua del

mar (abaratamiento del coste).

En mamíferos, el crecimiento para cuando el animal ha madurado. En salmones, en cambio, los

animales van creciendo.

Comparación con otras especies

Debido al mosaicismo la selección de líneas lleva mucha faena. Se deben controlar las

piscifactorías para que no se expanda el animal. Si se hace en el mar, se debe asegurar la

esterilización de los peces; por ello es mejor hacerlo en tierra.

Tema 5: Clonación por transferencia de núcleos

En Marzo del 1997 se publica que es posible clonar un mamífero a partir de una célulasomática

diferenciada. No hay ninguna barrera biológica que lo impida. Sería posible clonar una

persona.

Problemas a superar

Bajos porcentajes de desarrollo y gestación.

Anormalidades físicas en los animales que sobreviven.

Alta mortalidad perinatal y pérdida de embriones. Los problemas surgían sobretodo en

pulmones y riñones, y eran incompatibles con la vida.

Estos problemas son debidos a una reprogramación insuficiente.

Manipulación mecánica del embrión:

Enucleación del recipiente y transferencia del núcleo.

Activación del recipiente.

El embrión es fijado con una pipeta de fijación. Se microinyecta con una pipeta de

microinyección. El orificio de contacto entre el ovocito y la pipeta de fijación tiene unas 15-20

micras. Al aspirar se sujeta el ovocito y con la otra pipeta se manipula.

En el año 1984 se descubrió que era mejor usar ovocitos como recipientes. El defecto que esto

tiene es la incapacidad de ver el núcleo ya que está en meiosis. La ovulación se produce poco

antes de la extrusión del primer corpúsculo polar (excepto los perros, en los que la ovulación

es en vesícula germinal).

Más tarde se describió un método para ver los cromosomas en metafase. Se tratan los

ovocitos con host y se miran con luz UVA. Así se aprecia dónde están los cromosomas. Esto

tiene dos inconvenientes: la luz UVA, en sí, destruye el DNA y los cromosomas; además, con

este método también se tiñe el DNA mitocondrial. Si se estropea el DNA nuclear no importa ya

que lo que se quiere es enuclear el ovocito. El problema viene si se estropea el DNA

mitocondrial, en cuyo caso el óvocito ya no serviría. Para evitar esto la exposición con luz

ultravioleta debe ser mínima (un minuto).

Enucleación

La ZP es elástica pero más rígida que la membrana nuclear. A parte tendríamos el citoplasma

rodeado de la membrana. Esta membrana en mamíferos es muy frágil. La punción aquí

provoca en un 95% lisis. Entonces, se inventó una técnica para solucionar esto que consistía en

desestructurar el citoesqueleto.

Se cultivan los ovocitos con inhibidores del huso mitótico y los microtúbulos. Entonces la

membrana es más elástica. Igualmente, no se penetra al citoplasma, se aspira antes. Una vez

dentro se aspira una parte del citoplasma del ovocito llevándose los cromosomas. Hay que ir

con cuidado porque siempre se aspira una parte de ovocito junto con los cromosomas.

Interacciones entre el citoplasma recipiente y el núcleo transferido.

Reprogramación del núcleo transferido.

Se debe tener en cuenta que en una célula no manda el núcleo. El núcleo es tan solo una base

de datos, información. Quien manda es el citoplasma, es el que decide qué información se

necesita.

Ahora que se ha sacado la base de datos se debe poner una nueva. Este trabajo lo hará el

citoplasma.

Por ejemplo, están los núcleos de células de ratón que se utilizaban para clonar. Tienen unos

cuatro nucléolos. Al transferirse el núcleo, es muy difícil que con él no se transfiera una parte

más. De hecho, es tan difícil aislar núcleos viables, que en la mayoría de casos hay que

llevárselo junto con el retículo endoplasmático (casi media célula). Así, lo que se transfiere es

el núcleo, una parte de citoplasma y la membrana de la célula.

Si se trabaja con células somáticas se transfiere la célula entera (15-20 micras de diámetro).

Los núcleos se rebozan en una solución viral. Al cabo de 10-15 minutos de contacto con

solución viral se produce la fusión de la membrana. Luego se aspiran todos los núcleos y se

mantienen en la pipeta. Entonces se atraviesa la ZP (capa externa) y se deja el núcleo en el

espacio perivitelino. Ahora se obtienen dos células cada una de ellas envuelta en su membrana

citoplasmática rodeada de la ZP.

Esta técnica es buena en ratones pero no en otros animales. En estos animales (ovejas…) se

hace electroporación. De modo que en una placa de Petri se pone el óvulo entre dos barras

que se pasan corriente (dos polos). Esto produce una desestabilización.

Se debe tener en cuenta que si el corriente es demasiado leve no se producirá la fusión. Si por

el contrario el corriente es muy elevado, tampoco funcionará. Lo ideal es aplicar el corriente

suficiente para que se fusionen membrana celular y membrana del núcleo.

Ahora falta activar el programa de desarrollo. Este papel lo realiza in vivo el espermatozoide

que al fecundar deja carga 2n y activa el programa de desarrollo. Cuando se da esta activación

ya no se tiene un ovocito sino un nuevo individuo. Dicha activación la produce, más

concretamente, una proteína del esperma.

Para reproducir la activación si no hay fecundación se puede poner alcohol al 7% y realizar

electroporación (campo eléctrico en un medio con calcio y magnesio, o poner iones como el

estroncio). Lo más utilizado, sin embargo, es la electroactivación, de este modo se incrementa

la concentración de calcio.

En ratones (94-95) se utilizaba el medio rico en estroncio (Sn) ya que hacía que el óvulo

liberase sus reservas internas de Ca 2+.

Cuando se manipula el ovocito este está en metafase (se está dividiendo). Luego se mete en el

ovocito (que está en mitosis) un núcleo en interfase. En el citoplasma, pues, hay factores

promotores de la mitosis activos. Estos factores pasaran la membrana nuclear y activaran la

condensación de los cromosomas. El problema es que estos cromosomas no están preparados

para dividirse. Hay un núcleo, cromatinas y cromosomas que se han obligado a condensar.

Pérdida de genes

Diferenciación celular

Modulación de la expresión génica

Se han paralizado muchas investigaciones porque se tenía una verdad como dogma. En 1938

aún no se había conectado las idease discutía como se producía la diferenciación celular.

Teorías que se barajaban:

La célula va perdiendo genes y se diferencia

Solo se expresan los genes necesarios en cada situación (modulación génica)

Para descubrir la realidad Spemann realizó el experimento de transferencia de núcleos. El

experimento permitía evaluar la totipotencia del núcleo.

El hecho de que el embrión se desarrolle indica que todos los genes del zigoto están en la

célula del adulto.

En 1952 se hacen experimentos con amfíbios. Se consiguen individuos adultos fértiles a partir

de renacuajos (1982).

En 1992 con células sanguíneas como eritrocitos y transfiriendo queratinocitos a anfibios se

consiguió el desarrollo hasta renacuajo.

Al no conseguir desarrollo de adulto a adulto se concluye que no es posible conseguir

individuos fértiles a partir de células somáticas de un individuo adulto. Sin embargo, se

observa que utilizando ovocitos los resultados son mejores.

Briggs y King en 1952 trabajaron con ratones. Los embriones de mamífero son más frágiles y

más pequeños (unas mil veces más pequeños que los anfibios). Al atravesar la membrana

citoplasmática se provocaba la lisis del ovocito.

Con inhibidores del citoesqueleto y con un método que no atraviesa la membrana plasmática

se consiguieron mejores resultados.

Avances metodológicos de los experimentos con amfíbios:

En 1986 se descubrió que aunque es mejor usar ovocitos como recipientes en lugar de cigotos,

es más difícil enuclearlos. Por suerte, más tarde se describió el método de visualización de

cromosomas.

El problema del Imprinting se descubrió incubando dos pronúcleos que derivaban de

espermatozoides y asimismo dos pronúcleos que derivaban de ovocitos. Ninguno de los dos

llega a término, acaban muriendo. Se debe recibir la mitad de la carga por vía materna y la otra

por vía paterna. Se recibe lo mismo pero en algunos casos se expresará el gen de la vía

materna y por otro el de la vía paterna. Esto es una barrera biológica de primer orden.

En realidad existía una barrera metodológica.

El núcleo es información debe contener toda la información. La información tiene que ser

accesible.

Reprogramación del núcleo

Al realizar la transferencia del núcleo, si debido a la manipulación se lisa el ovocito no se podrá

obtener un embrión. Se deben evitar los daños por transferencia de núcleos. Al transferir se

provoca la condensación prematura de los cromosomas.

La reprogramación del núcleo consiste en colocarlo en el estadio de desarrollo que se necesita.

Se deben silenciar los genes característicos de la célula de origen. También hay que

caracterizar los genes de la célula que se usa como recipiente. Por último, es importante

mantener la capacidad de progresar, silenciando y activando genes, en el desarrollo a un

individuo adulto fértil.

“Rebobinar” el programa de diferenciación

La barrera biológica del Imprinting condicionó mucho estos experimentos.

Hay que saber que en el mundo de la clonación entró un grupo de gente que estaba interesado

en ella desde el punto de vista animal. Esta gente quería clonar los animales con mejores

características. Así, se podría incrementar la eficacia de obtener animales transgénicos (2-5%

de rendimiento). La transferencia de núcleos era una posibilidad de reducir costes.

La barrera biológica quedaba invalidada utilizando ovocitos como recipientes, ya que se podía

reprogramar el núcleo. Había factores en el ovocito que permitían la reprogramación del

núcleo.

La fase del ciclo celular en que se hacía la transferencia tenía que ver con el futuro desarrollo

del núcleo. Lo que se hace es coger un núcleo en plena fase de síntesis (condensado) y

transferirlo a un citoplasma que se está dividiendo. Esto es un cambio muy brusco.

Se ha visto que según el estado del ciclo celular en el que se encuentra el núcleo, habrá más o

menos éxito:

Célula en G1 desarrollo a blastocisto 45%

Célula en síntesis o G2 desarrollo a blastocisto 0%

La durada en un embrión de cuatro células es de 10 minutos para G1, 4 horas la síntesis y

menos de 1 hora G2.

Se puede evitar la condensación prematura de los cromosomas, activando el citoplasma y así

transferir un núcleo en interfase a un citoplasma en interfase. Las estadísticas entonces son

mejores:

Célula en G1 desarrollo a blastocisto 60%

Célula en síntesis o G2 desarrollo a blastocisto 15%

G1 se define como el tiempo que tarda desde la división celular hasta que se condensan los

cromosomas (los núcleos aún no están del todo condensados). Abarca el tiempo desde que se

forma la membrana nuclear y el núcleo crece (vuelven los factores de transcripción que

durante la mitosis “saltan” de la cromatina).

Así, el núcleo se divide, se vuelve a formar la membrana nuclear y entonces estos factores

vuelven al núcleo y se pegan donde les toca. De una célula pasamos a dos, también

pluripotentes.

En G1 los factores de transcripción aún no se han pegado totalmente. El ovocito tiene los

factores de reprogramación. Se puede formar algo parecido a dos PN.

Es difícil sincronizar un cultivo celular en G1 ya que si se bloquea una parte del proceso el otro

avanza (descompensaciones). Una alternativa mejor, es provocar la quiescencia.

La quiescencia se consigue quitando el suero de los cultivos de las células. Las células entran

en stand-by y se elimina todo aquello que no es necesario.

De esta manera se consiguió clonar la oveja Dolly.

Se vio entonces que la clonación por transferencia de núcleos puede llegar

a generar un nuevo individuo. Dolly era fértil.

En este momento aumentaron los intereses para obtener animales

clonados.

Los investigadores que estudian el ciclo celular creen que se ha llegado a un callejón sin salida.

Los que están interesados en obtener animales clónicos, en cambio, no se rinden.

Después de Dolly se clonan ratas, conejos, cerdos…

El embrión en el ratón se activa en el estadio de ocho células. Esto da ventaja a los rumiantes

(2 o 3 ciclos de más). Esto permitía un tiempo muerto para reparar los daños obtenidos.

El perro se consigue clonar en 2005 con problemas. El problema de los cánidos surgió porque

los medios de cultivo eran subóptimos. Se sacaban ovocitos de ovarios de perros de

mataderos.

La rata también da problemas (se clona sobre el 2004). Sólo un laboratorio lo ha conseguido. El

problema también está en los medios de cultivo de los ovocitos.

Más tarde un veterinario sudcoreano publicó un artículo sobre obtención de stem cells de

embriones humanos. Resultó ser falso.

Aplicaciones de la clonación.

La clonación permite investigar los mecanismos moleculares profundos que rigen la

transferencia celular que permiten la reprogramación.

También permite incrementar la eficiencia de las técnicas de clonación en estas especies.

La transferencia de núcleos permite la recombinación homóloga. También permite una

mejora en xenotransplantes y abre un camino hacia la clonación humana.

Investigación

Intentar saber el porqué de las cosas. Si se entiende la reprogramación se pueden entender

muchos mecanismos moleculares. Lo que provoca la muerte mayoritariamente es el cáncer y

la degeneración neurológica. Este grupo de enfermedades se rigen por la diferenciación

celular, si se entiende se pueden mejorar las terapias.

La longitud de los telómeros es algo a tener en cuenta. Cuando Dolly nace, sus telómeros

corresponden a una oveja de seis años (la edad que tenía la oveja original).

En ratones es a partir de la quinta generación de animales sin telomerasa cuando se empieza a

tener problemas, los ratones suelen ser infértiles.

En ratones con telomerasa no se han observado problemas de acortamiento de telómeros,

incluso hasta la sexta generación. Se cree que los ratones tienen más actividad telomerasa.

Animales de granja transgénicos

Se creó una empresa que quebró al año siguiente (1991- 1992) para obtener animales

transgénicos en granjas. Había una serie de personas que utilizaban los animales como

bioreactores (obtención de leche con proteínas…). El problema es que el método de

microinyección en embriones era muy poco eficiente.

Por ejemplo, si se pinchan 200 embriones vacunos. Se transfieren 3 embriones por vaca y

nacen al final 50 terneros de los cuales 1 o 2 son transgénicos. Los terneros no transgénicos se

matan y se incineran. Es un coste económico muy elevado.

En el mismo año que nace Dolly nace el primer cordero obtenido de células manipuladas

genéticamente in vitro por transferencia de núcleo. Así, todos los terneros que nazcan serán

transgénicos. Si se ha hecho caracterización previa ya se sabe que esa proteína va a ser

funcional. Una vez se tiene la proteína funcional se puede tener un rebaño con 200-300

animales en menos de un año (utilizando transferencia de núcleos).

Así se consigue:

Recombinación homóloga

En ratones se obtuvieron stem cells con una cepa que se seleccionó por su capacidad de

producir teratomas (cáncer de ovarios). Esta cepa se genera para estudiar esta patología

humana.

La recombinación homóloga se daba solo en ratones, pero con transferencia nuclear y

fibroblastos se puede conseguir en otros animales. Así, se pueden obtener células en cultivo

con la recombinación, allí donde se quiere. A partir de aquí se puede obtener KO sin pasar por

quimeras. Cupido y Diana fueron los dos primeros corderos.

Clonación terapéutica

La clonación es biológicamente posible y puede ser un método reproductivo (conseguir de una

célula un individuo con la misma carga genética).

Aquí hay que mencionar una carga ética: la mayoría de los animales clonados no llegan a nacer

y los que nacen mueren a las 48 horas.

La clonación también puede ser terapéutica. Por ejemplo, cuando un paciente necesita un

trasplante se puede realizar un embrión clónico al cual se le extraen stem cells que se

diferencian hacia el tejido que interesa.

Problemas de la clonación: Aspectos técnicos y éticos

Algunas de las preguntas que surgen al hablar de clonación son:

¿Es bueno clonar humanos?

El embrión clónico es un nuevo individuo, ¿se está matando?

La transferencia de núcleos utiliza herramientas parecidas al joystick.

Se desconoce gran parte de la reprogramación nuclear. No se sabe gran cosa sobre las bases

moleculares de la reprogramación.

Los factores de reprogramación son las moléculas responsables de la formación de los PN

masculino y femenino. Se investiga la relación con el silenciamiento del DNA (metilaciones…).

En la cepa 129 (estudio de queritocarcinomas) de 100 embriones entre un 10 y un 30 % darán

stem cells. Otras cepas, solo el 5%. Las gónadas de los embriones se están formando en

blastocisto.

En el resto de especies no hay stem cells, sino stem-cells like. Se han conseguido quimeras en

muchas especies pero no se han conseguido descendencia que dé estas stem cells.

Para conseguir stem cells se tienen que conseguir sobre 100 embriones. Cuando no se

consigue descendencia directa desde quimera es porque no llegan a colonizar del todo la línea

germinal.

Se transformaron las células diferenciadas en stem cells like (iPS). Así, se provoca una

reprogramación nuclear rápida. Con un solo gen era posible reactivar el sistema de desarrollo.

La célula tiene mucha plasticidad.

Líneas prioritarias de la investigación

Para terminar:

Dolly fue un hito científico, marcó un antes y un después.

La investigación de la reprogramación ha dado lugar a las iPS.

La clonación facilita la manipulación en animales de granjas y el avance en técnicas de

xenotransplantes.

En la clonación humana no hay barrera biológica, esto abre las puertas.

Tema 6: Manipulación génica animal. Impacto social. Legislación

y patentes

Aspectos que tienen que ver con el impacto de los animales para experimentación. Legislación

del tratamiento de la manipulación genética.

La percepción social de la experimentación animal le da mala fama.

Además, la sociedad es contradictoria, quiere la ciencia pero no es una sociedad científica (va a

astrólogos…)

Por ejemplo, un medicamento que cura una enfermedad pero que mata a uno de cada 10000

personas recibe muchas críticas de la gente. Los herbolarios, en cambio, no están controlados

pero la gente se fía más.

La sociedad pide a los científicos que cada vez sean más eficientes pero la sociedad se opone

cada vez más a que se experimente con animales, cosa que es necesaria para el progreso.

En la actualidad, la vivencia con los animales se ha perdido, se ha dejado de matarlos

personalmente. Existe un conflicto moral: rechazo al sufrimiento animal vs. ganas de saber

más.

El estudio de los animales KO ha permitido avanzar mucho en la genética.

En Catalunya

Es competencia del Parlament de Catalunya. Está la ley del 1995 y un decreto del 97. La

legislación cambiará pronto.

El Real Decreto de Madrid cierra un agujero que había en Catalunya.

En España

Depende del Parlamento de Madrid. La ley del 2003 y el Real Decreto del 2004. La legislación

está muy enfocada a lo que es plantas transgénicas.

Ley 5/1995, de 21 de junio

Ley de protección de los animales utilizados para la experimentación y para otras finalidades

científicas.

Define que se considera un animal de experimentación.

Prohíbe la utilización de ciertos animales como los perros y gatos recogidos en la calle.

Establece las condiciones generales de mantenimiento y transporte de los animales, así como

las condiciones generales del centro.

Obliga a realizar un registro de los centros y de control de los animales.

Se deba indicar el procedimiento de la experimentación: porque, para que, como… luego se

tiene que enviar al comité de ética que decide que hacer. Hay tanto una Comisión de

Experimentación Animal como Comités éticos de experimentación animal.

Se debe eliminar el dolor.

Se establece un régimen disciplinario con penas de multa, cárcel…

Decreto 214/1997, de 30 de julio

Por el que se regula la utilización de animales para experimentación y para otras finalidades

científicas.

Esto se realiza para minimizar el sufrimiento animal y que no se hagan experimentos que no

sean absolutamente necesarios.

Real decreto 178/2004, de 30 de enero

Por el que se aprueba el Reglamento general para el desarrollo y ejecución de la Ley 9/2003,

de 25 de abril.

Algunas cosas han cambiado a peor.

La evaluación del riesgo se hace según el daño que puede producir un organismo si este se

escapa al medio.

1. Leve

2. Curable

3. Grave (por ejemplo, genera una peste. Hay uno en la UAB, otro en Madrid)

4. Muy grave (hay uno en Francia, otro en Estados Unidos)

Los animales de los que se habla son de tipo 1 o algún vector viral de tipo 2. Hay que trabajar

bajo el Comité de Ética, el apartado de Seguridad de la UAB.

Valoración del dolor

El animal sufre. Se knockea un gen y en una determinada edad se eutanasian para ver los

órganos.

Hay modelos dolorosos, como el estudio del cáncer que provoca el desplazamiento de tejidos

y dolor. También son dolorosos los estudios de analgesia, en los que se provoca dolor a los

animales para ver si este se va al subministrar el fármaco.

En el resto de procedimientos se debe minimizar o eliminar el dolor.

Los animales sienten, la diferencia está en la manera de expresar el dolor. Los humanos al

sentir dolor gritan, los perros también. La oveja en cambio no ya que si chillara un depredador

se la podría comer.

Se debe conocer la especie animal con que se trabaja. Lo que duele a los humanos, asumir (a

priori) que también les dolerá al resto de animales.

Así, las presas normalmente disimulan el dolor. Los predadores se quejan más. La expresión

del dolor no es igual.

Predecible: se puede evitar con analgesia o, como mínimo, aliviar. Después de una

gran operación se puede dar un régimen analgésico.

Inesperado: se puede intentar detectar sobretodo conociendo la especie con que se

trabaja (conociendo su normalidad). Entonces se puede evitar o aliviar.

Limpieza: cuando se ve a un animal sucio o se está criando en un sitio sucio, algo no va bien

(estrés…).

Lo primero que afecta es a la reproducción.

Fijarse en la interacción del animal con nosotros. Si es agresivo normalmente y luego es dócil,

o viceversa.

En los procedimientos quirúrgicos se puede eliminar el dolor. En una enfermedad inducida se

puede intentar aliviar.

Tipos de dolor:

El dolor agudo es bueno. Por ejemplo, si apoyas la mano en un sitio caliente, te duele y te

apartas.

El dolor crónico es patológico y una fuente de estrés. Lo primero que se notan son problemas

reproductivos, disminución del apetito y letargia (disminución de la actividad).

Por ejemplo, en un estudio de supervivencia se puede considerar que un tratamiento ha

fallado cuando el tumor tiene una cierta medida. Entonces el animal se retira (criterio de

punto y final). Esto ya se contempla en el protocolo inicial.

Se debe presentar el procedimiento de experimentación en el Comité de Ética.

La justificación averigua si la experimentación es realmente necesaria. El Comité se asegura de

lo que les va a pasar a los animales.

Si no se saben todos estos términos se hace un pequeño experimento para saberlo (con 2 o 3

animales).

- ¿Cuándo termina el proyecto?

- ¿Quién es el responsable?

- ¿Qué síntomas inesperados pueden surgir?

Patentes

Tema 7: Estabulación y manipulación de animales transgénicos

La utilización de animales en experimentación debe cumplir unas condiciones. Primero, se ha

de evitar que la experimentación que se hace no sirva para nada. Así, se minimizan los

trastornos.

Hay veces en las que los resultados se pueden ver alterados, por ejemplo, si se tiene estrés o

una enfermedad subclínica.

La legislación se deriva de la directiva del 86. Está a punto de entrar en vigor una nueva ley en

junio del 12/13.

La legislación sobre estabulación nos indica varios parámetros como por ejemplo el espacio del

que pueden disponer los animales que deben poder hacer todo lo que fisiológicamente harían.

Todo esto, en una jaula es complicado.

Cuanto más pequeños son los animales que se tienen, más se pueden tener en un mismo

espacio. En ratones y ratas, los animales se deben poder poner en pie. Además hay que pensar

que los ratones tienen una vida de experimentación muy corta.

Al subir de escala y tener animales en grupo su vida suele ser más larga (por ejemplo en

perros). Con estos animales se pueden hacer experimentos. Normalmente se les da un

medicamento y se observa cómo se elimina. Interesa que los animales estén acostumbrados al

manejo. Contra mejor estén los animales (hábitat sin estrés, condiciones similares a la

naturaleza…) más reales serán los resultados obtenidos.

Por ejemplo cuando se pincha en el brazo a monos si se les acostumbra a estirar el brazo justo

en el momento previo a pinchar, verán minimizado su estrés. Otro ejemplo que reduce el

estrés, sería acostumbrar a los ratones a ser cogidos.

La legislación pone las dimensiones mínimas para tener animales (en jaulas, recintos…). La

directiva, además, regula la temperatura (en ratones 22ºC ±2). En Barcelona, por ejemplo, el

principal problema es el calor del verano. Esto implica instalaciones más caras. En vacas el

rango se amplía (y en animales grandes) siendo de entre 15 y 26 º.

Otra cosa que se regula es la humedad relativa. En ratón es del 54% ±10. Si cae por debajo del

20% se pueden tener problemas en las crías (son más sensibles a ambientes secos).

La orina, al evaporarse produce vapores de amoníaco que son irritantes. Se debe hacer 20

cambios de aire por hora.

También se regula la intensidad de la luz. Los roedores son animales nocturnos. Un exceso de

luz es dañino, no les gusta. Así pues, se debe llegar a un compromiso entre la intensidad de luz

que necesitan los trabajadores y los ratones.

Es interesante controlar los ciclos circadianos. Es más fácil hacerlo con animales en un sitio

cerrado. Los animales grandes lo tienen más complicado al tener una época de reproducción.

En ratones es más fácil de controlar.

Otras cosas que pueden interferir son las fuentes de alimentación y las de agua.

Las fuentes de alimentación pueden contener residuos tóxicos, metales pesados, restos de

insecticidas, citoesteroides… La soja es una fuente muy barata de proteína vegetal, tiene

moléculas parecidas a los citoesteroides que pueden reducir la fertilidad de los animales.

El agua puede contener posibles contaminantes físico-químicos.

Se debe controlar el estado sanitario de los animales. Es decir, si hay animales con alguna

enfermedad contagiosa (por ejemplo gripe) se pueden ver alterados los resultados. Se ha

encontrado el caso de una cepa de ratón en que las hembras al cabo de nueve semanas

desarrollan diabetes tipo 1. Si esta cepa tiene el virus de la hepatitis murina (que en ratones

normales se elimina a las dos semanas) el porcentaje de diabéticos pasa del 90% al 10%. El

virus hace que la diabetes en proceso se cure y desaparece el fenotipo de estudio.

Otro ejemplo es la colitis ulcerosa en un modelo de ratón. Si se ponía al animal en un

estabulario se obtenían muchos idénticos y estos no desarrollaban la enfermedad. Esto era

porque la flora bacteriana era diferente. Entonces, se volvió a sacar a los ratones al exterior

(donde habían patógenos) y muchos de ellos desarrollaban la enfermedad.

Federación Europea de Asociaciones Científicas de Animales de Laboratorio

Se listan unos 15 virus (enfermedades peligrosas para el hombre y para los ratones). Se

incluyen virus que pueden infectar al hombre, letales para ratones y que puedan interferir en

los resultados (por ejemplo el virus de la hepatitis murina).

Se obliga a hacer controles una vez al año, normalmente se hacen una vez al mes.

En un estabulario hay una barrera que lo mantiene alejado de todas las fuentes de patógeno.

El aire externo que estará en contacto con el animal se tiene que filtrar. Además se tiene que

esterilizar el pienso, el agua, las jaulas, el serrín… Esto implica barreras arquitectónicas

potentes y medios de esterilización (autoclave, gases tóxicos para superficie e irradiación). Es

más fácil la esterilización en sitios pequeños que es grandes, pero se realiza también en caso

de animales grandes (cerdos, ovejas…).

Dependiendo de cómo sea esta barrera estaríamos hablando de cuatro situaciones:

- Estabulación convencional: no se tiene control sobre los microorganismos que están

en contacto con los animales ni sobre el estado sanitario de estos.

- Animales libres de patógenos específicos (SPF): existe una barrera sanitaria en

funcionamiento y se puede garantizar que los animales no están en contacto con una

lista determinada de patógenos.

- Se conoce la microflora que está en contacto con nuestros animales. Es muy

importante conocer la flora bacteriana (como se digiere, que nutrientes se

absorben…).

- Animales sin microflora: carecen de cualquier microbio. Son muy delicados y la

alimentación es potente.

Hay que pensar que un estabulario con animales SFS ya tiene una barrera muy bien montada.

Si se conoce la flora, además, se deben introducir procedimientos que impidan la

contaminación de los animales. Cuando se trata de animales sin microflora, los procedimientos

deben ser de aislamiento total (trabajar con guantes…).

Esto se puede aplicar en todas las especies pero se hace más en ratón. Aun así, el proceso se

está expandiendo. Se hacen estudios en los que se inocula un microorganismo y se ven los

efectos. Se mira cómo reacciona un animal frente al ataque del patógeno. En cerdos, por

ejemplo, se estudia la adsorción de nutrientes.

Además de controlar las variables externas, la legislación tiene por objetivo mantener al

mínimo el sufrimiento animal. Se intenta mantener a los animales entretenidos.

Se intenta imitar a la naturaleza con cosas como poner trozos de madera para roer (para

ratones), balones de fútbol atados (para cerdos).

Los estudios de neurología se hacen en jaulas vacías. Se introduce una variable. Al hacer los

estudios de fobia al exterior, por ejemplo, no se podía evaluar su validez. A parte de eso, se

deben fenotipar todos los animales. Si se tienen 20000 ratones y se tienen que fenotipar se

necesita mucho tiempo y paciencia.

Por esto es importante armonizar todas estas cosas para no alterar los resultados y que los

experimentos salgan bien. Esto vino de un estudio Europeo.

Por ejemplo, el número de ratones por jaula afecta al nivel de glucosa.

La estabulación de los animales en experimentación está regulada por la ley, también las

condiciones ambientales (temperatura, humedad relativa, luz, niveles de ruido…).

Existe una barrera sanitaria, arquitectónica, de filtros y de control de lo que introducimos.

Todo esto es muy costoso, por ello, es muy importante velar por el buen estado de los

animales, controlar enfermedades, microorganismos…

Tema 8: Utilización de animales transgénicos. Estudio de

enfermedades. Cáncer.

Un animal transgénico es una herramienta de investigación. Este tema trata básicamente de

ratones en el estudio del cáncer.

El cáncer es un conjunto de enfermedades de las cuales no se conocen todas las causas.

Asimismo, tiene un componente de enfermedad social ya que la tasa de cáncer es más elevada

en la clase baja que en la alta. Los ambientes industrializados también aumentan la frecuencia

comparados con los países en vías de desarrollo. Esto es comprensible si se tiene en cuenta

que en los ambientes industrializados hay más carcinógenos. La ingesta rica en grasas también

favorece su aparición.

En los animales transgénicos se intenta acortar el periodo de latencia.

Un ejemplo de afectación de las radiaciones ionizantes sería las observaciones de los

supervivientes de las radiaciones.

El carcinoma más potente es la luz solar. Las personas blancas son más débiles frente a la

radiación solar.

A pesar de estar en un ambiente carcinogénico no se desarrollan tantos cánceres. Esto es

porque la célula tiene sus mecanismos de defensa, adquiridos por selección natural. Se debe

hacer énfasis en que los cánceres normalmente se desarrollan después de tener descendencia.

La aparición de tumores implica que algo ha fallado en el crecimiento y reparación celular.

Estos fallos son mayoritariamente adquiridos a lo largo de la vida.

Si alguna de estas relaciones se altera aparecerá un tumor. La proteína p53, por ejemplo, está

ausente en el 50% de los tumores humanos.

Si hay familiares afectados, algunos de estos cambios ya se habrán producido genéticamente,

harán falta menos para padecer la enfermedad.

En los ratones transgénicos se puede hacer cualquier manipulación genética ya que tienen una

vida muy corta.

Casi la mitad

Un ejemplo de estudio de la patogenia es descubrir las causas de que el virus de la hepatitis B

de cáncer. Ahora ya se sabe la transformación que hace el virus en las células.

Una prueba de conceptos podría ser realizar una selección de manera que las células sanas

sean más resistentes a quimioterapia o radioterapia. Así, se puede incrementar la dosis del

tratamiento.

Pruebas de agentes carcinogénicos

Los animales a los que se ha introducido una mutación implicada en el proceso de

carcinogénesis desarrollaran la enfermedad antes. En menos tiempo sabemos si un producto

es carcinogénico o no. Ahorramos tiempo.

Hay un virus murino que provoca tumor mamario en ratón y no se sabía por qué. Ahora ya se

ha podido descubrir qué causa la transformación maligna.

P53 es una de las proteínas de control celular más importante que tenemos. Es un paso de

control que está ausente (o mutado) en el 50% de los cánceres. En el proceso de síntesis de

DNA hay una serie de moléculas que detectan errores y reparan o activan la apoptosis de la

célula.

Un knock-out de la p53n permite estudiar qué pasa sin ella. Los ratones nacen, así que la

proteína no tiene un papel importante en la embriogénesis. Han aparecido muchos mutantes.

Se observaban diversas situaciones en los knock-out:

Homocigotos: a los 4-5 meses desarrollaban tumores.

Heterocigotos: a los 18 meses desarrollaban tumores (equivaldría en los humanos a 80

años).

Un animal tan sensible también es sensible a los anticancerígenos. Se pueden utilizar

productos para ver si tienen efecto terapéutico.

Se debe tener cuidado con las manipulaciones genéticas.

Los biólogos moleculares piensan que la molécula que estudian es la clave de todo. Esta

afirmación es falsa ya que el cuerpo se regula.

La falta de p53 predispone a la aparición del tumor. Apareció un KO de la p53 con la proteína

mutada, pero funcional. La mutación disminuía la producción de cáncer frente a las no

mutadas, pero los animales tenían envejecimiento prematuro.

Otro KO que se consiguió sobreexpresaba la forma normal de la p53 sin acelerar el proceso de

envejecimiento.

El resultado final es similar (más p53). En el primer caso produce una aceleración del proceso

de envejecimiento y en el segundo no.

La causa de esto podría ser que la forma mutada hubiera perdido alguna zona de control de

actividad. No afectaría a su regulación en la forma sobreexpresada ya que esta tiene una

buena regulación.

Se ha de tener en cuenta las diferencias entre humanos y ratones (diferentes tumores…). Los

ratones tienen los telómeros más largos y disponen de cierta actividad telomerasa. Los

humanos, en cambio, tienen actividad telomerasa solo en la línea germinal. La vida del ratón

es más corta.

La actividad metabólica es mucho más grande en el ratón. Se dan menos divisiones celulares

en ratones (1011) que en humanos (1016).

Hay que tener en cuenta que las cepas que se utilizan tienen poca variabilidad, son cepas con

consanguinidad.

Síndrome Peutz-Jeghers

En homocigosis produce pólipos benignos, en heterocigosis produce carcinomas.

La pregunta es si los pólipos benignos son precursores de los carcinomas. Parece ser que la

respuesta es sí.

Para estudiar este síndrome no se puede trabajar con homocigotos ya que mueren. Lo que se

hace es realizar un ratón heterocigótico para LKb1 que lleve el otro alelo floxado

condicionalmente (que se pueda quitar cuando se quiera).

Una vez en cultivo se hace saltar la copia floxada. Así se tienen cepas con las que se puede

estudiar. Sin embargo, los resultados no cuadran actualmente con pacientes humanos. Las

preguntas que se deben resolver son:

¿Qué pasa si la actividad del LKd1 se produce después de que se active el oncogen?

¿LKd1 está protegiendo otros genes?

Tema 9: Modelos animales de enfermedades metabólicas

hereditarias

Se verán ejemplos del uso de la transgénesis para obtener modelos de enfermedades

animales.

Glucogenólisis

La idea era encontrar una terapia para la glicogenosis de tipo 7 (es una gran familia de

enfermedades). Implica el mal metabolismo del glicógeno. Hay una enfermedad para cada

enzima que participa en la síntesis del glicógeno.

PFK-1 (6 fosfofructoquinasa 1): enzima clave para metabolizar la glucosa por la vía citosólica.

Humanos Modelo Animal PFKM-KO

PFKM Pfkm

PFKM PFKM

Glucogenosis tipo VII Fenotipo mutante (¿enfermedad?)

Si se toca el gen de la PFKM se esperaría un fenotipo mutado. Normalmente no es tan fácil.

PFK-1

Fructosa-6P Fructosa-1,6P2

ATP ADP

PFK está codificada por tres genes (muscular, hepático y plaquetario).

El gen de la isoforma muscular (PFK-1M) se expresa en músculo esquelético, diafragma,

corazón, cerebro, eritrocito, testículo y célula

La isoforma hepática (PFK-1L) se expresa en hígado, eritrocitos, riñones, adipocitos, cerebro,

corazón, testículo, pulmón, bazo, musculatura uterina y célula .

La plaquetaria (PFK-1P) en cerebro, plaquetas, fibroblastos, linfocitos, bazo, testículo y células

.

La forma activa es un tetrámero que depende del tejido donde se encuentre. Si se expresa en

hígado, por ejemplo, tiene cuatro formas (formas hepáticas). En músculo también hay cuatro

formas. En el resto de tejidos suele haber combinaciones (híbridos). Por ejemplo en los

eritrocitos una de las formas está compuesta por dos formas musculares y dos hepáticas.

Regulación de la PFK-1

La PFK-1 está en el inicio de la glucólisis. Necesitará energía en niveles bajos (es decir, altos

niveles de AMPc y de ADP). Al tener mucho ATP se inhibe. Así, pequeños cambios en la [ATP]

pueden causar cambios rápidos y notorios en la vía.

Glucogenosis tipo VII

Es una enfermedad genética de carácter autosómico recesivo causada por un déficit en la

actividad PFK-1 muscular (PFK-1M).

Para realizar un modelo animal de la enfermedad se ha de tener en cuenta que en un mismo

gen hay muchas mutaciones. Por tanto, existe una heterogeneidad en la enfermedad. Además

de que la mayoría de estas enfermedades son heterogéneas, estas presentan variantes.

Si se eliminan los exones en ratón puede que no se obtenga las diferencias que en humanos se

obtendrían (por ejemplo, generar un codón stop).

Lo que se hizo es intentar cargarse la función del gen.

Existen tres formas de la glucogenosis de tipo VII:

- Forma clásica

- Forma hemolítica

- Forma tardía: se manifiesta a partir de los

60 años.

- Forma infantil letal: los niños no

sobrepasan el segundo año de vida.

Forma clásica

Ausencia de actividad PFK-1 en el músculo esquelético, que implica:

- Acúmulo de glicógeno en el músculo esquelético. Las hexosas se encuentran

incrementadas (azúcares de seis).

- Hiperuricemia miogénica: aumenta el ácido cítrico circulante.

- Alteraciones es la bioenergética muscular.

Déficit parcial de eritrocitos: hemólisis y reducción del 2,3DPG.

Cuadro clínico: intolerancia al ejercicio. Al empezar a correr dan rampas musculares.

Terapia: limitación del ejercicio físico. Dieta pobre en carbohidratos. Se hizo un modelo con la

esperanza de realizar terapia génica pero el modelo no daba mucho de sí. Igualmente, sería

una buena opción a investigar.

Creación de un ratón deficiente en PFK-1M

Se necesita mucha información. Ahora hay consorcios de mutagénesis que mutan todos los

genes del genoma humano. Se pueden ir a buscar aquí.

Hace unos años, cuando el genoma no se había secuenciado era mucho más complicado. Con

la secuenciación se puede clonar el gen por PCR.

Lo primero que se debe hacer es buscar toda la información disponible, vale la pena perder un

mes. Si hay un error aquí, al diseñar el vector, nos daríamos cuenta al cabo de tres años.

Hace unos años cuando no se tenían secuenciadores. Se tenía que ir plaqueando fagos y ver

los que tenían el gen que interesaba. Después se tenía que mapear. Se realizaban muchas

digestiones.

Así se consiguió identificar el exón 3, que es donde está el ATG (inicio de la proteína). Se pensó

que si se eliminaba este ATG la proteína no sería funcional. También se quiso cambiar el frame

(marco de lectura), pero no se podía.

Uno de los promotores estaba muy cercano al exón 3. Así que se intentó eliminar la región

promotora y el exón 3. Para ello, se hizo un vector con una región homóloga al promotor y otra

al final del exón 3 con resistencia a neomicina.

Se ha de tener en cuenta que un pequeño grado de cambio en la selección puede dar que la

línea germinal no quede afectada y no se transmita la mutación. Se han de hacer muchos

cambios de medio.

Ahora se pueden mirar clones y clones de células (de las células que han pasado la selección +

y -.

MEF

Se hace un Southern (con 200-400 clones) y se va mirando cual tiene la mutación correcta. La

selección negativa te ayuda a enriquecer. Al realizar el Southern se controla que un lado del

exón está correctamente en 5’. Después se hace un segundo Southern con las que tienen en 5’

correcto para mirar cuales tienen también el 3’ correcto. Por último, se realiza un tercer

Southern para ver cuantas tienen el gen neo, para comprobar que la mutación está donde le

toca y en todas las células.

Ahora es el momento de inyectar en blastocisto. Las stem cells son de color agutí para poder

identificar rápido los quimera.

Los quimera tienen manchas agutíes y negras, al seleccionarlos por color se ahorra la mitad del

trabajo. Estos animales han de transmitir a la descendencia el carácter. Si al cruzar el animal

con otro animal se obtienen agutíes, estos agutíes serán 100% homocigotos para la mutación.

Las madres que se utilizan son hembras blancas para que no se coman las crías. Además, las

blancas adoptan crías de otras madres.

La célula muscular necesita la glicólisis para hacer ejercicio. Se hizo un análisis de la PFK-1M al

animal homocigoto para la mutación

- Homocigoto: no presentaba la mutación en células musculares. Como en

- Heterocigoto: 50% respecto al normal. Humanos

Bloqueo de la glucólisis en el músculo esquelético

Las hexosas en el mutante también estaban elevadas. El lactato era bajo.

En músculo se vio incrementado el nivel de glicógeno y las fibras también estaban muy

elevadas. Entonces, se detectó una mutación en la ultraestructura.

Contenido de glicógeno en el músculo esquelético:

Ultraestructura del músculo esquelético:

En los animales se reprodujo la intolerancia al ejercicio. Para comprobarlo se puso una cinta y

el ratón mutado tan solo aguantaba un par de minutos y acababa con las extremidades

enrampadas. Un ratón normal aguanta mucho y al hacer ejercicio incrementa sus niveles de

lactato.

Niveles de lactato sérico:

Metabolismo en ejercicio:

El fenotipo real de este animal es una letalidad muy elevada (duraban de 1 a 3 meses). Si se

generaban 50 homocigotos, nacían 25, morían 15, al empezar el experimento eran 7 y

quedaban 3 o 4. Esto es un problema.

Los animales en reposo tienen ya el 50% de niveles de ATP (de promedio, en las células del

músculo esquelético). El nivel de ATP caracteriza la viabilidad de las células.

Nucleótidos de adenina:

Además, presentan un incremento de glucosa en el diafragma:

La musculatura intercostal también resulta alterada:

De igual manera la musculatura cardíaca, donde se apreciaba una hipertrofia con el tiempo:

La PFKM también se expresa en eritrocitos. El eritrocito vive exclusivamente de glucosa. Si se

quita la PFK-1, la glicólisis no funciona y cae el metabolito que regula la afinidad de la

hemoglobina por el oxígeno. Por esto las células son hemolíticas y hay tanta letalidad. Para

compensar esto se producen más eritrocitos.

Cae pues el 2-3-BFG y el oxígeno se queda retenido en los pocos eritrocitos viables cosa que da

hipoxia.

Hemólisis:

Fragilidad eritrocitaria:

Para quemar ácidos grasos se necesita oxígeno. Si los eritrocitos no ceden oxígeno el músculo

en sí es poco viable.

La enfermedad no es solo severa, sino que el déficit eritrocitario la agrava. Se puede intentar

acceder a las células de la medula ósea. Por esta vía, quizá en un futuro se logre una mejora.

Tema 10: Análisis de los mecanismos epigenéticos implicados en

el silenciamiento y activación de transgenes in vivo

Cada vez está más de moda la epigenética.

Ejemplo de transgen:

Después de microinyectar en ovocitos el transgen se puede integrar (una o más copias) en más

de una zona y que no se exprese.

Utilizando un marcador se puede ver la expresión. Curiosamente contra más copias se

observaba más expresión. Las copias no deben implicar cambios en el marco de lectura.

Epigenetic reprograming

La epigenética no son cambios en la secuencia de DNA. Son modificaciones de las bases, de la

cromatina o de las histonas. No alteran la secuencia, son reversibles y muchos de estos

cambios son regulables por factores ambientales.

Mecanismos epigenéticos

Ejemplos de estos mecanismos son microRNA, RNA de cadena larga no codificante,

metilaciones, modificación de histonas…

Metilación del DNA

Añadir grupos metilo a citosinas. La metilación del DNA es la única modificación del genoma

que siempre pasa en la parte de la citosina por donde se une la guanina.

La metilación es imprescindible para la vida del organismo. Se da por la metiltransferasa.

En las islas CpG la hipermetilación de C está asociada al silenciamiento. Las proteínas

antitumorales presentan una hipermetilación y los oncogenes hipometilación.

La metilación del DNA impide la unión del factor de transcripción. También atrae otras

proteínas implicadas en otros complejos, estas proteínas silencian la expresión del gen.

Cromatina

Hay dos metros de DNA/célula. La cromatina está compuesta por proteínas, aparte de por

DNA. Estas proteínas son muy pequeñas y su masa iguala a la del DNA.

El DNA se organiza en el collar de perlas, el solenoide, los loops… Esto lleva a la formación de

heterocromatina.

El DNA envuelve las histonas. En el extremo C-terminal hay residuos de lisina o de otros

aminoácidos. Modificaciones en estos residuos dan lugar a alteraciones en la expresión

genética. Las modificaciones son acetilaciones, metilaciones, ribosilaciones…).

Existen una serie de modificaciones de histonas. Hay un código de histonas que actúan de

manera combinatorial. Esto lleva a un estado de activación o de represión. Es un concepto

nuevo.

Ejemplos: histona 3 y 4.

Un metil en la histona 3 genera un STOP. Si está acetilada da activación.

Hay una serie de combinaciones que marcan que un transgen se exprese o no.

Puede haber residuos mono, di o trimetilados. Esto implica diferentes grados de acivación o

silenciamiento.

Heterocromatina: inactiva, compactada.

Eucromatina: activa, tiene cierta plasticidad (para pasar de una a la otra).

Al tener heterocromatina abierta se puede realizar modificaciones en residuos específicos que

pueden hacer que esta pase a eucromatina. La acetilación permite el paso de heterocromatina

a eucromatina.

A continuación se muestra una tabla con proteínas que modifican las histonas. Hay metilantes,

desmetilantes… (histonas metilasas y demetilasas)

La función de las enzimas se intenta descubrir mediante la invención de transgénicos, KO… Se

encuentran con que la mayoría de transgénicos son letales y no se puede ver su función.

Alguno se ha hecho no letal pero no viven mucho tiempo.

HAT, HDAC, HMT determinan el paisaje epigenético del genoma.

Las proteínas de unión al DNA pueden atraer metilasas, acetilasas… pueden tener una activi

dad metiltransferasa.

Se une la demetilasa y demetila la histona 3 o 4, una vez demetilada atrae otras proteínas que

demetilan el DNA adyacente. Después se produce deacetilación y se impide la unión de

factores de transcripción. Se silencia el gen.

Se han encontrado metilaciones en proteínas antitumorales e hipometilaciones en oncogenes

(MIC…).

Hay estudios de cáncer, asma… Existen muchas enfermedades donde hay evidencia de que los

fenómenos de metilación afectan.

Por ejemplo, SIRT1 puede llevar al desarrollo de cáncer. Por un lado deacetila, realiza cambios

en la función de la proteína que provocan senescencia o apoptosis. También deacetila las

histonas. Esto da lugar a la proliferación celular y al bloqueo de la senescencia y la apoptosis.

Del mismo modo, atrae la DNA metil transferasa a los promotores, cosa que provoca más

proliferación. Con el paso del tiempo esto implica cáncer.

Para evitarlo se están inventando fármacos que alteren estas funciones. Se han encontrado

inhibidores de histonas acetilasas. Los fármacos se aplican en casos extremos y no se suelen

observar mejoras.

El problema de los fármacos es que no se puede dirigir su acción solo a las células que interesa.

Su efecto se encuentra en todas las células. Inhibir la acetilación de histonas en una célula sana

también comporta problemas.

Para introducir genes se tienen varias maneras: microinyección, con vectores de DNA…

Inactivación de transgenes

¿Qué pasa cuando se administra un gen a un vector?

Tiene lógica que el transgen se active y se inactive de forma endógena (ya que el vector se

integra. Cuando se utilizan vectores que no se integran (vectores no virales), san niveles bajos

de expresión y la expresión es transitoria.

Los plásmidos perduran al cabo de un año de estar en un organismo. Aun así, no se encontraba

expresión. Esto hizo pensar que el plásmido se encontraba silenciado (como si fuera

endógeno).

Se utilizaron dos vectores. Uno era el plásmido que aunque se tuviera en mucha cantidad su

expresión era cero.

Hay otra manera de obtener plásmidos modificados. En el plásmido había una parte no

eucariota, bacteriana que parecía la responsable de la silenciación. Del plásmido se eliminó la

parte bacteriana y solo quedó el transgen (parte eucariota). Después se pueden aislar estos

minicírculos con nuestro transgen. La parte bacteriana tiene muchas CpGs, más que la

eucariota.

Se pensó que los plásmidos se metilaban y por esto se silenciaban. Se metió el minicírculo (con

solo el transgen), el plásmido normal y un plásmido normal pero sin CpGs.

El resultado fue que los plásmidos sin CpGs mejoraban pero no tenían nada que ver con los

minicírculos. Como las islas CpGs son inmunogénicas se pensó que quizás desencadenaban una

respuesta inmune. Se hicieron pruebas y no se encontró evidencia de ello.

Entonces se pensó que quizás eran las metilaciones de histonas. Para analizarlo se hicieron

inmunoprecipitaciones de cromatinas (ChIP). Se hace la inmunoprecipitación contra el

anticuerpo que sospechamos que tiene que ver con el silenciamiento. Una vez aislado se

puede mirar de secuenciar el DNA, encontraríamos el DNA causante de la silenciación.

Ejemplo de inmunoprecipitación en ratones.

El minicírculo tenía altos niveles de expresión, en cambio el plásmido poco nivel.

Al hacer un ChIP se esperaría en los minicírculos un incremento de eucromatina (activa). En los

plásmidos se esperaría un incremento de heterocromatina. Esto indicaría que las histonas

tienen un papel en la silenciación.

Análisis de las modificaciones de histonas por ChIP:

En un experimento se observó un incremento en marcadores de heterocromatina en el

plásmido y de eucromatina en el minicírculo.

En otro, había diferencia aunque no tan evidente.

Se probaron 19 plásmidos. En uno el promotor de la ubiquitina no se vio silenciado ni en el

plásmido ni en el minicírculo al cabo del tiempo.

La explicación es que a lo largo del tiempo la expresión del plásmido activo se va perdiendo.

Las señales que inactivan el plásmido se desconocen del todo, pueden ser: una señal de

localización nuclear (no se integra en el núcleo, queda episomal), la modificación de histonas,

anticuerpos intracelulares que detectan el DNA exógeno…

Esto lleva a la deacetilación de las histonas, la histona metiltransferasa va metilando las

histonas.

Al llegar al día 35 todo el plásmido está prácticamente silenciado.

Conclusiones:

Vectores plasmídicos: incrementan los marcadores de heterocromatina.

Minicírculos: incrementan los marcadores de eucromatina.

Tema 11: Mouse clinics

En el genoma hay unos 20000 genes. En Europa y en Estados Unidos se han iniciado proyectos

de hacer el genoma a escala.

En el mundo se va rápido, ahora todo es high-throughput. Hoy en día se saben todos los

genes.

Los proyectos de high-throughput solo mutan el gen. Se debe hacer todas las mutaciones de

cada gen del genoma. Después hay que generar un animal y por último fenotiparlos.

El fenotipaje no es algo trivial, debe haber centros especializados en fenotipaje de high-

throughput.

Para solucionar esto, mouse-genetics tuvo una iniciativa. Se financió un proyecto en Europa

(EUCOMM). EUCOMM ha generado muchos genes knockeados, además, dispone de una

página web donde por 1500€ o 2000€ facilitará algo que costaría 40000€ si se hiciera en una

empresa particular. Proyectos similares se hicieron en EEUU (NorCOM) y Canadá (KOMP). Al

final decidieron unirse (IMMC).

Si da la casualidad que el gen que se necesita no lo tiene el consorcio, se puede encargar.

EUCOMM se encarga de realizar mutagénesis a gran escala.

Interesa elegir la cepa del ratón, todos trabajan con la misma: C57BL/6N (una cepa negra). Esta

cepa lleva un constructo que puede dar a la vez un KO total y un transgénico específico de

tejido.

Los consorcios solo te proporcionan la stem cell. Esta se debe inyectar en blastocisto para

obtener quimeras y seguir con los cruces habituales para obtener KO.

Hay proyectos más pequeños agrupados en IMMC (por ejemplo el español).

Puede que al implantar el quimera haya muerte embrionaria. Hay centros que estudian esta

posibilidad.

Para fenotipar bien se deben saber todas las características del organismo (cardíacas,

pulmonares…).

Por esto, los centros de fenotipado a gran escala tienen que fenotipar con unos estándares.

Hay un proyecto para estandarizar la manera de fenotipar un ratón en Europa, llamado

EUMORPHIA.

Aquí se estableció como fenotipar la función cardíaca, respiratoria, immune… todo. De esta

manera se puede comparar resultados entre centros.

Se establecieron las mismas pruebas (EMPReSSslim).

Se hacen dos pipelines en las que se utilizan 10 machos y 10 hembras (mínimo número de

ratones). Se empieza cuando el ratón está en 9 semanas. El proyecto busca el mínimo trabajo

de fenotipaje que permita establecer la caracterización de los ratones por tal de ahorrar

tiempo y dinero.

En el pipeline se pasa por diferentes pruebas (tensión, immunológica…). No responde igual un

macho que una hembra. Las hormonas cambian en fenotipar actividades.

Esto va unido a un equipo de bioinformáticos. En Europa hay cuatro grandes centros que

hacen fenotipado a gran escala:

EUMODIC surgió para fenotipar animales que provenían del proyecto EUCOMM. Lo coordina

Steve Brown, la idea es fenotipar 650 ratones.

EUCOMM (genera las stem cells)

Ratones (mouse clinics)

EMMA (aquí se guardan los ratones)

Mouse clinics

EMPReSSslim (análisis básico)

Centro especializado de fenotipaje (si interesa un fenotipado más concreto).

Si se quiere fenotipar todos los genes se debe hacer más rápido. Se amplió el proyecto con

más países, entre ellos España.

Infrafrontier

Para crear estructuras legales, todo está muy interaccionado (como deben ser los

estabularios…). El objetivo del proyecto es relizar una empresa de la vida.

Se creó el IMPC, un mouse clinic a nivel mundial. Cuesta varios billones de euros. En estados

unidos se hacen tres mouse clinics. También se decide hacer mouse clinics en Australia, en

Taiwán, en China…

Se tienen que organizar. En octubre de 2008 se ponen en marcha.

Las determinaciones son dar la máxima información con el menor coste.

Fase 1: fenotipar 5000 ratones (5 años)

Fase 2: analizar 10000 ratones (a partir del 2016)

Genoma de ratón stem cells fenotipado (EUMODIC, ARRA) IMPC (ya están

fenotipados a gran escala, para ver algo más concreto hacer un

fenotipado más específico en otro centro).

Para curar enfermedades genéticas si no hay modelos animales nunca llegará a la clínica.

Los consorcios son muy importantes para trabajar a gran escala, sobre todo para tratar

enfermedades raras. En cinco años se pretende tener todo el genoma mutado.

CBATEG, Spanish Mouse clinic

Es un mouse clinic. Se presentó a final de año del 2005.

ICTS: infraestructuras singulares.

Catalunya presentó cuatro proyectos y se escogieron dos. Uno de ellos fue el mouse clinic

(febrero de 2007). Se tuvo que hacer otra gran memoria.

Desde 2007 se han ido modificando planes… Se evaluó el proyecto muchas veces. A parte de

ICTS, también era parte de un proyecto europeo.

El proyecto se definió como very high priority in Spain. El problema es que el proyecto se debe

firmar por España, Europa y Catalunya. Con la crisis España no lo firma.

En los consorcios europeos siempre se está al día de la tecnología.

Las empresas que hacen mouse clinics necesitan que otras empresas las prueben (aplicación

de fármacos…). Hay empresas que están interesadas en utilizar mouse clinics para probar sus

productos.

Se están desarrollando más los métodos de fenotipado. Estan surgiendo tecnologías que lo

permiten hacer más rápido. Se debe tener en cuenta que mantener animales transgénicos es

caro, pero que mantener colonias lo es más.

Basándose en el diseño, se necesita que alguien haga el fenotipado. Se debe externalizar,

buscar una empresa que haga el fenotipado (por ejemplo, universidades, centros de

investigación…). El mundo se ha globalizado.

Al lado de una mouse clinic ha de haber investigadores. Se ponen a punto tecnologías que se

pueden ofrecer cómo plataformas tecnológicas. Se va innovando.

El personal técnico de las plataformas también ha de ser investigadores, normalmente

doctores. Esto es una fuente de sitios de trabajo.

Los patólogos están muy buscados (en patología del ratón…). Los morfólogos también.

Una mouse clinic puede hacer todo. Hay tres grandes plataformas.

Modificación genética en animales

Capacidad de analizar los animales

Evaluación preclínica (de fármacos, drogas…)

Muchas no prevén evaluación preclínica pero cada vez se hace más.

Una plataforma se divide en varias subunidades. Una vez se tienen los ratones habrá que

fenotiparlos.

La primera unidad nutre toda una unidad de animales transgénicos, hace fertilización in vitro,

criopreservación…

Habrá también una segunda unidad que se dedicará a vectores virales. Se puede manipular un

órgano inyectando un vector.

La tercera unidad es de vectores no virales.

Con estas tres unidades se consigue animales modificados genéticamente.

Hay subplataformas divididas en subunidades (plataformas de fenotipado). Después de pasar

al animal por las diferentes plataformas se consigue el fenotipado (por ejemplo, plataforma

que se encarga del metabolismo: unidad de endocrinología, análisis metabólico, hematología,

estudios de expresión génica, inmunología (que podría convertirse en sí en una plataforma)).

Con los diferentes análisis se pueden hacer muchas cosas. Se tiende a utilizar el mínimo

número de animales. Las plataformas de imagen dicen como es el animal. El mismo grupo de

animales se va incluyendo en estos equipos (in vivo, morfología, patología, análisis

microscópico…).

Hay también un área de medicina interna (parte cardiovascular, neurología, sensorial (pruebas

acústicas…), pneumología, gastroenterología, nefrología, reproducción…).

Por último, también hay un área de comportamiento.

Pasar a los animales por todas las baterías es muy caro. Cada vez hay más pruebas.

Imagen: tags para ratones, equipos de resonancia magnética, ultrasonido…

Todo esto no se puede tener a punto en un centro. Las técnicas necesitan muchos especialistas

de diferentes áreas.

Behaviour: actividad locomotora (cintas donde corren…), circuitos, pruebas de atención…

Si se tiene una mouse clinic interesa que el animal sea fenotipado a diferentes tiempos. Al

mismo lote de animales se le hace un seguimiento. Se utilizan estabularios libres de

patógenos. Esto interfiere en las investigaciones

En el estabulario han de caber todas las máquinas, sino no puede ser una mouse clinic (hace

seguimiento), sino que ha de ser de punto y final (como el de la UAB).

Hay diferentes zonas en el estabulario. La complejidad no es hacer el animal sino fenotiparlo.

Las plataformas han de estar muy internamente organizadas. A veces un animal tiene un

fenotipo primario esperado pero al pasar por las baterías se encuentran diferentes fenotipos

no esperados que pueden ayudar a entender una enfermedad.

Medicina translacional

En el proceso de Drug Discovery entra en pie una mouse clinic o centro de fenotipado. Se

empieza a nivel de ratón y va evolucionando. Se ensaya en los pequeños animales, cuando

funciona se ha de ir a animales más grandes.

Además, no debe olvidarse que se requiere de una regulación para que se acepten los

medicamentos… Para ello son necesarias las empresas de regulación que se encargan de

preparar la documentación.

Evaluación preclínica

Se ha de tener en cuenta muchas cosas: efectos secundarios del medicamento (por ejemplo

aparición de tumores, toxicología…)…

Generación del KO

Fenotipado

Modelos animales de Terapia génica (medicinas innovadoras)

enfermedades humanas Terapia de Drug Discovery

Nuevo tratamiento de cura

El fenotipado es muy importante para el establecimiento de modelos animales y así poder

encontrar nuevos tratamientos.

Las empresas farmacéuticas piden ratones humanizados (con el gen humano que provoca una

enfermedad…).

Los centros pueden participar en muchos tipos de proyectos (pequeños, medianos y grandes).

Se diseña el estudio. Como el mundo es global, también se pueden hacer proyectos online.

Actividades de training

Se hacen cursos de entrenamiento, estancias cortas de estudiantes…

Siempre va la investigación ayudada por las plataformas y las actividades de training.