INTRODUCCIÓN A LA HISTOQUÍMICA

Gamaliel Ordenes 03 de Septiembre de 2002

La Histoquímica estudia la composición química y la actividad metabólica en células y tejidos

en los que ha sido preservada su organización estructural, mediante reacciones químicamente demostrables y justificables.

Para que la reacción química tenga validez se requiere:

Que la sustancia investigada conserve su localización: esto se puede lograr con una adecuada fijación.

La reacción química debe ser específica: debe haber mecanismos comprobables, reconocidos por los cuales se demuestre que es eso y no otra cosa lo que se está identificando.

Debe ser suficientemente sensible para la detección: muchas veces el tejido está incluido en parafina, lo que junto a la fijación, deshidratación y aclaramiento produce la extracción en parte de las sustancias a identificar, e incluso en estos casos la reacción debe ser capaz de detectar las sustancias, debe tener tal sensibilidad y no obtener falsos negativos.

Se debe conservar de la mejor forma la estructura. Para algunas técnicas se puede conservar la estructura bastante parecida a lo que estamos acostumbrados, pero para otras técnicas es necesario realizar cortes por congelación, en los que la estructura está medianamente conservada; en otras ocasiones la reacción química es agresiva y suele destruir ciertas estructuras, pero de igual manera se debe tratar de conservar las estructuras tisulares morfológicamente lo mejor posible, si no, no estamos haciendo histoquímica.

Establecidos estos preceptos obligatorios para el cumplimiento de los objetivos de la Histoquímica, podemos señalar que esta área cuenta con diferentes especialidades, las cuales son:

Enzimohistoquímica: trata de determinar la presencia y funcionalidad de enzimas dentro del tejido. Para esto se necesita conservar la morfología del tejido y la funcionalidad de la enzima. Algunas enzimas, al pasar por el procesamiento histológico, conservan su funcionalidad, su sitio activo, en cambio hay otras enzimas que no pueden ser fijadas.

Neurohistoquímica: está dentro de la enzimohistoquímica. Comprende el estudio de enzimas en el sistema nervioso y también incluye el estudio de marcadores neuroquímicos.

Histoquímica cuantitativa: no todas las reacciones histoquímicas son cuantificables, por ejemplo, una reacción enzimática va a depender de cuanto tiempo se deje la enzima con el sustrato para que se de un producto coloreado, si se deja más tiempo va a haber más color, lo que complica comparar dos tejidos cuantitativamente, pero hay reacciones que son cuantificables, porque reaccionan con el tejido en forma estequiométrica, es decir, se produce tanto color como sustancia hay y eso es cuantificable a través de instrumentos.

Ultrahistoquímica: se refiere a la histoquímica aplicada a la M.E.

Inmunohistoquímica: es el estudio de componentes cito-histológicos mediante reacciones antígeno-anticuerpo específicas.

Biología molecular in situ: se refiere a los estudios moleculares del DNA aplicados in situ. Enzimohistoquímica

La histoquímica enzimática se basa en la detección de la reactividad de enzimas en tejidos con morfología conservada. Lo básico para detectar una enzima, está en el hecho que:

E + S ↔ [ ES ] ↔ E + P

donde E: Enzima; S: Sustrato; [ ES ]: Complejo Enzima-Sustrato; P: Producto. En enzimohistoquímica interesa que cuando:

[ ES ] ↔ E + P

P + C → Producto coloreado

Es decir, que el producto sea reactivo con algo que ponemos en el medio para que haya color, que sea reactivo con un cromógeno, sustancia que permite que se observe color. Se va a trabajar con un corte de tejido en el que está presente la enzima. El corte se pone en una mezcla incubadora que contiene el sustrato, cromógeno, buffer adecuado, concentración salina adecuada y los cofactores que necesita la enzima. Esta mezcla se pone a una temperatura adecuada.

Histoquímica Cuantitativa En Hq. cuantitativa se trabaja fundamentalmente con DNA. Es posible determinar las

cantidades relativas de DNA en células y en poblaciones celulares, comparar entre poblaciones celulares la cantidad de DNA, determinar si en una población hay células con su cantidad de DNA equivalente a Go, equivalente a G2 o a la fase S. Para esto se utilizan reacciones específicas para DNA que sean estequiométricas, es decir, reacciones que dan tanta cantidad de color como DNA presente en el tejido. Luego las placas se leen en un equipo computarizado para realizar la cuantificación: microdensitómetro, citofluorómetro o citodensitómetro. Se puede cuantificar reacciones fluorescentes y no fluorescentes, obteniendo finalmente gráficas que indican la cantidad de células en cada etapa del ciclo.

DNA + Colorante estequiométrico Ψ DNA coloreado proporcionalmente

Biología molecular in situ Dentro de la biología molecular está la hibridación in situ, que permite detectar genes, segmentos génicos o secuencias de genes dentro del núcleo en células o tejidos. Cómo determinar si dentro de un tipo de células está presente la secuencia génica de un virus como el HPV, para esto se usan kits que permiten determinar incluso la cepa de virus que está infectando las células. Esto se logra a través de la complementariedad de bases que permite unir una sonda marcada a la secuencia de DNA complementaria (DNA viral), identificando positivamente el segmento génico que se estaba buscando.

Ε Ε Ε

CTGACTAGCTGAA ξ Ε Ε Ε CTGACTAGCTGAA

AGTCAAGGCTGACTGATCGACTTTCCAG

Existen técnicas de biología molecular que permiten identificar apoptosis. Una de las etapas de la apoptosis es la fragmentación del DNA en segmentos (180-50 Dalton), lo que se puede identificar con reacciones de biología molecular, para ello se utiliza una enzima la TDT (terminal deoxi nucleotidil transferasa), que donde encuentra un extremo 3' comienza a polimerizar. Se pone el tejido en una mezcla incubadora que contiene todo los elementos, los nucléotidos trifosfatados y los nucléotidos marcados. La enzima produce un alargamiento en el extremo 3' , sintetiza DNA dejándolo marcado y después se detecta esa marca con anticuerpos, la mayoría de las veces, y con eso se determina si hay o no fragmentación de DNA. Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica básicamente se fundamenta en que hay Ag, sustancias que se pueden tratar como Ag, para las cuales se pueden construir Ac. Por ejemplo, una citoqueratina del citoesqueleto, se puede tomar esa citoqueratina e inyectarla en una animal apropiado de experimentación y hacer que ese animal produzca Ac, tomamos los Ac y los ponemos en contacto con el tejido en la mezcla de incubación en las condiciones adecuadas y después se utiliza un sistema de detección de la unión Ag - Ac. Se pueden producir los Ac, pero hoy existen industrias que los fabrican de buena calidad.

Aplicaciones de la histoquímica:

Investigación biológica: - Procesos celulares. - Composición estructural.

- Análisis de DNA: ha permitido la comprensión de la cinética de las poblaciones celulares en tejidos normales y patológicos.

Clínica:

- Diagnóstico histopatológico de tumores. - Diagnóstico histopatológico de enfermedades no tumorales. Hay una serie de enfermedades metabólicas que son diagnosticadas con histoquímica enzimática, detectando la presencia o ausencia de una enzima determinada.

IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Introducción

El estudio de los ácidos nucleicos en el diagnóstico patológico, conlleva una serie de dificultades debido al histoprocesamiento de rutina que se realiza en los laboratorios de histopatolgía, dado principalmente por la heterogeneidad inherente de las distintas células que componen los diferentes tejidos, lo que afecta significativamente los resultados de una técnica determinada, sin embargo hoy en día gracias a numerosos estudios realizados sobre este tema, se ha logrado estandarizar e identificar las condiciones mas apropiadas de cómo realizar cada una de las técnicas que se describirán mas adelante, para el estudio de AN en el diagnóstico de un sin número de patologías, principalmente tumoral. Hoy en día las técnicas de DNA microarrays, microarrays en tejido y muchas otras, han tenido un gran éxito en proveer información sobre los genes y proteínas involucradas en un sin número de patologías. Son varios los genes y sus productos los que han sido identificados en variados tipos de cáncer humano, por screening en material archivado mediante el uso de estas técnicas de estudio del DNA. Actualmente el diagnóstico molecular es cada vez mas cotizado, hoy se requiere que el diagnóstico molecular sea cada vez mas concluyente, pero para que se logre esto es necesario estandarizar y poder evaluar la calidad del material y la forma en que se procesan estas muestras para darles validez a todos los métodos que comentaremos en esta unidad.

(FIG2) Los AN son macromoléculas de alto grado de polimerización, formadas estructuralmente por una unidad repetida que corresponde al nucleótido. Pero a su vez el nucleótido es una molécula compuesta por tres unidades. (FIG3) Una pentosa, ya sea ribosa o desoxiribosa, un fosfato, y una base nitrogenada, ya sea púrica o pirimídica que corresponden a los componentes aromáticos heterocíclicos. Según los conocimientos actuales, el DNA está presente únicamente dentro del núcleo, donde se localizan los cromosomas, en cambio el RNA puede ser demostrado en el citoplasma, nucleolo, y cromosomas. En el citoplasma el RNA está asociado principalmente con el RE, y por lo tanto con los ribosomas

(Fig4)Estos ácidos Nucleicos están formados, por largas cadenas de nucleótidos enlazados entre si por el grupo fosfato. Y Cada nucleótido entre sí está unido por enlace fosfodiester. (FIG5) La molécula de DNA esta formada por dos cadenas de nucleótidos adoptando una configuración helicoidal como fue descubierta por Watson y Crick en 1953. Estas cadenas de nucleótidos están unidas por enlaces débiles como puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas entre las bases complementarias. El esqueleto de la hélice de DNA consiste en subunidades alternadas de fosfato y desoxiribosas, la cuál queda hacia fuera del espiral. Las bases, que son hidrofóbicas quedan hacia el interior de la hélice El RNA es un filamento de una sola cadena, no forma doble hélice. Se encuentra ubicado principalmente en los ribosomas y en el o los nucléolos. La presencia de un oxígeno en la posición 2' de la ribosa impide que se forme la doble cadena de la manera en que se forma en el ADN. El filamento de ARN se puede enrollar sobre sí mismo mediante la formación de pares de bases en algunas secciones de la molécula. (HOME)

Obtención de una muestra de tejido para estudio molecular de ácidos nucléicos:

Es importante tener en cuenta que desde el momento es que se obtiene una muestra, comienzan a ocurrir cambios en sus constituyentes celulares, e incluso durante el procesamiento de rutina mismo de

la muestra. Por tal motivo dependiendo de la naturaleza de la muestra, son cuatro los posibles tipos de muestras que se podrían obtener para estudios moleculares.

1.- Tejido removido desde el paciente por cirugía o biopsia.

2.- Muestras citológicas obtenidas por punción o aspiración.

3.- Sangre, plasma o productos del suero.

4.- Autopsia. (gran degradación del mRNA)

Durante el procesamiento de la muestra existen tres alternativas que pueden realizarse para preservar de la mejor forma el tejido.

1.- Congelar el tejido.

2.- Mantenerlo fresco.

3.- o estabilizarlo en un fijador.

Hoy en día los estudios moleculares que se pueden llevar a cabo en tejidos, requieren de una preservación óptima de las proteína y ácidos nucleicos. Son varios los factores prefijación, intrafijación y postfijación los que influenciaran el estado de estas moléculas. En general en el tejido comienzan a ocurrir alteraciones luego de 10 minutos de extraído en tejido es decir luego de 10 minutos en estado de anoxia. Por lo tanto este itempo debe ser mínimo.

Fijadores.

Los mecanismos por los cuales los fijadores pueden actuar, han permitido clasificarlos en:

1.-Deshidratantes

2.- Efecto a través del calor

3.- Crosslinkers

4.- efecto ácido

5.- Combinación de estos.

Como debemos recordar, aquellos fijadores que actúan combinándose con las proteínas son llamados aditivos y los que precipitan las proteínas son coagulantes.

La formalina: Fijado universal mas ampliamente utilizado, sin embargo numerosos estudios indican que la extracción de DNA o mas bien la calidad de DNA extraído desde muestras fijadas en formalina tamponada para estudios moleculares, dan resultados no del todo exitosos y mas bien variables. No obstante en la fijación del tejido con formalina reduce notoriamente la solubilidad del DNA y produce algún grado de degradación del DNA. Los estudios existentes acerca de la reacción entre el formaldehído y el DNA, han demostrado que las reacciones básicas que ocurren son similares a las que ocurren entre la formalina y las proteínas.

Interacciones del formaldehído con el DNA:

Estudios sobre las interacciones químicas que ocurren entre el formaldehído y el DNA han demostrado, que las reacciones básicas que ocurren son similares a las que se observan entre el formol y las proteínas. El formaldehído inicia la denaturación del DNA en regiones ricas de AT, a través del rompimiento de los puentes de hidrogeno que unen las dos cadenas del DNA y despegando las bases.

Son cuatro las reacciones básicas que ocurren en la interacción DNA – formol:

1.- Lo primero que ocurre es una reacción de adición, el formaldehído es adicionado a una base del DNA para forma el grupo hidroximetil (CH2OH)(metilol).

2.- Posteriormente ocurre una ataque electrofílico lento del N -metilol sobre una amino base para formar un puente metilénico entre dos grupos aminos.

3.- El tratamiento con formaldehído puede generar sitios AP (apurínicos o apirimídicos), por hidrólisis de los enlace n-glicosídicos, dejando residuos libres de purinas o pirimidinas. Estos sitios apurínicos tienen un ion carboxílico altamente inestable, que se hidroliza rápidamente para producir 2 deoxiribosa.

4.- el formaldehído puede también causar una hidrólisis lenta del enlace fosfodiester, produciendo cadenas cortas de polideoxiribosas con las pirimidinas intactas.

Cuando se compara el DNA extraído desde tejidos frescos y tejidos fijados en formalina, se puede observar una gran frecuencia de alteraciones en la secuencia que no son reproducibles. El error mas frecuentemente encontrado en las moléculas de DNA ocurre en que el formol prodcue un crosslinking con el residuo citosina y posteriormente la Taq pol falla en reconocer la citosina e incorpora adenina en lugar de guanina, generando una mutación artificial.

Efecto del formol sobre el RNA:

En general la eficiencia de extracción del RNa desde tejidos fijados en formalina es muy pobre, debido principalmente a la falta de lisis del tejido debido al crosslinking que origina el fijador con la molécula de RNA y también debido a la presencia de RNA asa. Se han creado diferentes protocolos para aumentar esta eficiencia , pero en peral se logra con éxito en fragmentos cortos de RNA. Se piensa que gran parte del RNA es degradado durante la fijación del tejido.

Al igual que con el DNA , el formaldehído reacciona con el RNA formando un grupo n metilol y posteriormente sufre el ataque electrofílico para formar los puentes metilénicos. En el caso del RNA el ataque se produce principalmente sobre el residuo adenina.

Son varios los factores que influyen en la degradación del DNA por el formol, entre ellos , la concentración del fijador, pH, temperatura y.

A medida que se aumenta la concentración del formol , va aumentar la tasa de denaturación del DNA.

LA temperatura ambiente también favorece la degradación de la molécula de DNA , por tal motivo es recomendable realizar la fijación a 4°C. Cerca del 30 % del DNA se pierde durante la fijación, y mientras mayor es la T°, se obtiene fragmentos mas cortos de DNA.

Otro factor importante es el pH, en condiciones de hipoxia del tejido, se reduce el pH, provocando una degradación masiva del DNA en el tejido. Por tal motivo la fijación a pH ácido o en presencia de ácido fórmico por ejemplo produce una gran degradación del DNA. Además a pH ácido se producen mayor cantidad de mutaciones . Diversos estudios han concluido que lo mas recomendable es realizar la

fijación en formalina tamponada, incluso a un pH mas bien alcalino cercano 9 – 10 de pH, ya que a ese pH se mejora notoriamente por ejemplo la señal en los estudios de ISH.

Efecto de las nucleasas en el tejido:

la DNAasa en el tejido ha sido considerada como uno de los principales factores que favorece la degradación del DNA durante la fijación. Hoy en dia se utilizan en la solución de fijación , un neutralizante de la DNA asa, llamado ácidoetilendiaminotetracético.

Otro factor importante de tener en cuenta en la fijación con formol es su tasa de penetración, en general el formol, comparado con otros fijadores tiene una tase de penetración relativamente rápida, sin embargo lo recomendable es fijar muestras de 5 mm a 1 cm. Y el volumen del fijador debe exceder por lo menos unas 20 veces al volumen de la muestra. En general para este tamaño de muestras , lo mínimo es fijar durante una hora, pero lo mas común es que las muestras se fijen de 24 a 48 horas normalmente. Aunque el rango es relativamente amplio, y para propósitos generales de morfología no se observan mayores variaciones, para el estudio de AN , mientras mayor tiempo este el tejido en contacto con el fijador , mayor tasa de degradación del DNA se encontrará. EL protocolo mas recomendado para el estudio molecular es irradiar la muestra durante 1 a 2 minutos en horno microondas a 60°C, ya que reduce la degradación enzimática y potencia la fijación.

En conclusión los criterios recomendados para el uso del formaldehído son .

• mínimo (menor a 2 horas)

• Formalina tamponada Tiempo de prefijación al 10% a 4° C

• Baja concentración de sales

• La duración de la fijación de 3 a 6 horas.

• Ácido etilendiaminotetracético

• Evitar pH ácido, favorecer alacalino.

Fijadores alternativos:

Glutaraldehído: Funciona del mismo modo que el formol a través de la formación de cross linking con los AN. El gluta reacciona primeramente con el grupo e-amino de los amino ácidos de los ácidos nucleicos. Se utiliza en solución acuosa. Sin embargo su uso limitado debido a la baja coeficiente de difusión en el tejido, penetra muy lento en el tejido , favoreciendo la denaturación del DNA. Sin embargo se ha utilizado el gruta al 1% a pH 7, con excelente resultados, incluso mejores que el formol al 10 %

Genipina. Un agente formador de cross linking natural, reacciona espontáneamente con los amino ácidos dando origen a un pigmento azul oscuro, sin embargo su efecto sobre los An no se conoce y solo se utiliza porque provoca una resistencia a la colagenasa en el tejido después de su fijación. Solventes orgánicos y fijadores alcohólicos.

Múltiples estudios han indicado que los fijadores que no producen cross linking en el tejido producen mejores resultados en el estudio de los AN que los fijadores aditivos como el formol. El etanol y el metanol, preservan mejor los ácidos nucleicos porque producen cambios químicos mínimos sobre estas moléculas. El DNA en etanol al 65% está totalmente colapsado. El etanol y metanol al 100 % son excelentes fijadores del DNA y RNA, producido principalmente por la rápida penetración en el tejido de estos fijadores. Mezcla de Fijadores: Ya que no existe un único fijador ideal para los An, se han utilizado mezclas de fijadores, como por ejemplo el carnoy. Carnoy: etanol 60%, cloroformo al 30% y ácido acético al 10%. Esta mezcla fijador da excelentes resultados en la fijación de los ácidos nucleicos comparado con la formalina. Solo provoca una leve degradación del DNA y da excelentes resultados sobre el RNA, especialmente en el tratamiento postfijación con vapores del formaldehído. Methacarn: Metanol 60%, cloroformo 30%, ácido acético 10%. Excelente fijador del RNA, sus resultados son comparable con los obtenidos desde muestras frescas. Además causa precipitación de proteínas ribosomales, inactivando a RNAsa endógena y a su vez enmascarando al mRNA de la acción de RNA asa. Mantiene mejor la inmunoreactividad de los fijadores a base de zinc. Acetona: AMEX, acetona metilbenzoato xilol. Se usa un protocolo de fijación en acetona a -20°C durante toda la noche y después aclarar en metilbenzoato y posteriormente es xilol. HOPE : Hepes glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect). Consiste en la incubación del tejido en una solución protectora formada por una mezcla de amoniacidos a pH 5.8 a 6.4. posteriormente se incuba en acetona a 0 a 4 °C para deshidratación. Otros fijadores: Fijación de los ácidos nucleicos (fig7) Reacción de los fijadores sobre los AN: La fijación de los tejidos conlleva un cambio en el estado químico y físico de los AN. La fijación de estos ocurre en parte en la fijación convencional que se realiza en los tejidos como parte del histoprocesamiento de rutina. O puede ser realizado en forma más selectiva o específica, como por ejemplo para el estudio cuantitativo de medición citofotométrica o para el estudio de RNA en muestras de tejido de diferente naturaleza. Con la fijación convencional, los AN son fijados paracialmente e indirectamente, ya que la formalina causa la insolubilidad de las proteínas nucleares que rodean el DNA genómico.

Durante varios años muchos han sido los fijadores utilizados con el propósito de fijar de forma mas selectica los AA, pero relativamente pocos son los que se conocen que reaccionan con ellos químicamente. EL DNA al estar asociado a proteínas se fija razonablemente bien con casi todos los fijadores, sin embargo se prefieren aquellas mezclas fijadores que contienen ácido acético, como por ejemplo el ALFAC (formol, ácido acético, alcohol)

En su estado nativo los AN no reaccionan en ningún grado con el formaldehído. Sin embargo si la mezcla de reacción es calentada a cerca de 45°C en el caso del DNA y a 65°C en el RNA, comienza a haber algún grado de reacción. Los tiempos utilizados para fijar AN en general son cortos desde 6 horas hasta 1 día como máximo en muestras pequeñas. Un fenómeno similar es observado en la interacción de los AN con glutaraldehído. La importancia de estos hallazgos, es que las temperaturas normalmente utilizadas para la fijación, entre 20-22°C, no ocurre un desenrrollamiento o descompactación de los AN. Solo a T° elevadas, durante la impregnación con parafina puede tomar lugar la interacción entre los AN y restos del fijador. Esta falta

de reacción permite utilizar el material archivado para análisis de DNA, sin embargo se pierde cerca del 30 % de los AN en la fijación. Y en parte también son retenidas por la matriz proteinácea que no deja escapar estas moléculas de tamaño muy grande. El etanol y el metanol, generalmente son usados en mezclas fijadoras para la HQ de los AN, por ejemplo el Carnoy. Las medidas físico-químicas, han demostrado que el DNA está totalmente colapsado en el metanol y el etanol. En términos generales los AN son mejor preservados en fijadores alcohólicos o acídicos, un buen ejemplo es el Carnoy´s, el cuál contiene alcohol y ácido acético glacial. Este último no fija proteínas pero coagula o mas bien dicho colapsa los ácidos nucleicos, el mecanismo por el cual se producen estos cambios son aun oscuros, pero al parecer los factores de una penetración rápida y producción de hinchazón estarían involucrados. La formalina tiene sólo una reacción limitada con el DNA y el RNA, pero para el trabajo de rutina da resultados aceptables. En este caso la fijación se realiza a 4°C en formalina tamponada, porque previene la degradación del DNA por nucleasas. A pesar de que la formalina tamponada produce excelentes resultado en cuanto a la preservación de la histología y una morfología celular detallada, la principal desventaja, es que produce un efecto perjudicial sobre la calidad de los AN, lo que dificulta el análisis de genes y transcriptos en los tejidos. En estudios recientes se encontró una leve mejoría en la calidad morfológica de los tejidos estudiados y fijados con fijadores a base de zinc, además hubo una producción significativamente mas alta de DNA. Y tanto la producción como la calidad del DNA en tejidos fijados con ZBF fueron comparables con cortes por congelación sin fijar, y fue mejor preservada la inmunoreactividad. En general deben evitarse en el estudio de AN, fijadores que contengan metales pesados o pH muy bajo. SO3

- pK1, PO4= pK2, COO-= pK2-2,5, Identificación de AN: LA detección de ácidos nucléicos tradicionalmente y antiguamente se ha realizado mediante colorantes catiónicos, y el DNA ha sido demostrado más selectivamente mediante la reacción de Feulgen. La especificidad de los métodos histoquímicas para DNA o RNA pueden ser confirmados por remoción específica de estas sustancias mediante hidrólisis enzimática o extracción química. LA demostración de AN depende de la reacción de los colorantes con el grupo fosfato o de la producción de aldehídos desde el azúcar desoxiribosa. No existen métodos HQ para demostrar las BN. Demostración del DNA: Es realizada comúnmente por la Reacción de Feulgen, la cual identifica el azúcar desoxiribosa, y por la técnica de verde metil-pironina, cuando el fosfato se combina con el colorante básico verde metilo a un pH ácido. El DNA también puede ser demostrado por métodos fluorescentes usando acridine-orange, aunque la confiabilidad de este método es menor que los previos. EL DNA y el RNA pueden ser demostrados por el método de cromo alumbre- galocianina. Este método no es capaz de diferenciar entre uno y otro AN, por lo tanto requiere de una extracción enzimática según el AN que se requiera identificar. Sin embargo la técnica más sensible para identificar DNA es la ISH. EN la histoquímica tradicional los colorantes más utilizados para la demostración de AN han sido los colorantes básicos derivados de las tiazina, los más usados son la tiamina y el azul de metileno, que son moléculas pequeñas, básicas a pH ácidos. Estás reacciones no son específicas, porque por

ejemplo el azul de metileno a pH ácido también se une a los glicosaminoglicanes. A pH 4 por ejemplo se unirá al COO- de proteínas Reacción de feulgen Esta reacción fue propuesta por Feulgen y Rossenbeck hace 75 años atrás (1924), es una de las reacciones citohistoquímicas mas ampliamente utilizadas en la biología y medicina. Permite teñir el DNA in situ, específicamente, basada en la reacción del reactivo Schiff con los grupos aldehídos generados en las moléculas desoxiribosas por hidrólisis ácida (HCl). LA intensidad de la tinción es proporcional a la concentración de DNA. Esta reacción es utilizada principalmente para la cuantificación de DNA en el núcleo de las células por citometría de flujo para la evaluación de diploidia en patología tumoral. Sin embargo desde el punto de vista morfológico, la demostración específica del DNA en estructuras celulares a nivel de la microscopía de luz, es muy poco lo que se utiliza hoy en día. Los autores de esta técnica aconsejan una hidrólisis ácida para producir un grupo aldehído libre en el DNA, que puede ser detectado por una reacción coloreada para aldehídos. El reactivo de Schiff fue desarrollado en 1866. El objetivo fundamental de esta técnica en las ciencias biológicas ha sido la ubicación y distribución cuantitativa del DNA en una variedad de células normales y anormales. La reacción de Feulgen ha ayudado a establecer una seria de principios: 1.- Existe una relación 1:1 entre el contenido de DNA de un núcleo y su número de cromosomas. 2.- El contenido de DNA es el mismo o números enteros múltiples de dos en todos los núcleos celulares de un organismo dado. 3.- Antes de la mitosos las células duplican su contenido de DNA.

La reacción de Feulgen también permitió medir la cantidad de DNA presente en un solo cromosoma y comparar el contenido de DNA nuclear entre diferentes especies. En el área biomédica esta reacción ha permitido medir la ploidía en células tumorales, lo que ha permitido utilizarlas como metodología diagnóstica y prognóstica en varias lesiones neoplásicas. La medición de ploidía del DNA también se ha aplicado ha varias patologías no neoplásicas. La aplicación de esta técnica en la microscopía electrónica, provee una herramienta única para investigar in situ la organización ultraestructural de estructuras que contienen DNA. Mecanismo de acción: El primer paso en la reacción de Feulgen, es la hidrólisis ácida: EN un medio ácido las bases puricas son separadas del azúcar desoxiribosa, exponiendo un grupo aldehído libre y dejando intacto el esqueleto del DNA. Por lo tanto la molécula de DNA se transforma en un DNA “apurínico”. Las condiciones hidrolíticas óptimas para el procedimiento de la reacción han sido extensamente estudiadas, y se ha observado ue esots pasos están influenciados por los fijadores y la accesibilidad al DNA. Así, la producción de los grupos aldehído se puede contrapesar por una pérdida de fragmentos del DNA desde el núcleo, lo que altera la estequiometría de la reacción.

En el procedimiento original descrito por Feulgen, sugieren un tratamiento de 4 min. con HCl 1 N a 60°C. Sin embargo posteriormente establecieron que para la mayoría de las aplicaciones las condiciones hidrolíticas más favorables son producidas con HCl 5N entre 20-25°C por 45-60 min. ya sea en células fijadas o no. Esta variante retrasa y minimiza la producción de pequeños fragmentos de DNA que podrían escapar del núcleo. No obstante tanto la cantidad de grupos aldehídos producidos

como la solubilización del DNA están influenciado por la fijación y el grado de compactación de la cromatina.

En las condiciones originales la mayoría del DNA se rompe o es hidrolizado, haciendose

soluble y escapando del tejido. Sin embargo el DNA sólo es parcialmente hidrolizad. LA hidrólisis de Feulgen no rompe el enlace esterentre el ácido fosfórico y el azúcar en el DNA. No obstante la razón de porque ocurre esto en el DNA y no en el RNA, no está bien entendido. Una de las teorías explica que el residuo ribosil de cualquier RNA que no es removido durante la hidrólisis no reacciona con los CHO. Esto probablemente debido a la presencia de un grupo OH en la posición 2’ de la ribosa. El porque no se tiñen otras estructuras que poseen CHO, es porque la hidrólisis ácida los destruye, por lo tanto no se dan falsos positivos. (FIG16) (Química de la hidrólisis ácida)

EN el Gunter también se señala otra hipótesis alternativa de porque no se tiñen los RNA. Si la hidrólisi se realiza a tiempos cortos, se provoca en el RNA una perdida de reactividad a los colorantes, porque se altera la posición del ácido fosfórico. Si embargo a tiempos de hidrólisis más prolongados se vuelve a posicionar pero se protona. Reacción con el reactivo de Schiff: Después del paso hidrolítico las células son expuestas al reactivo de Schiff. Los sitios celulares con grupos aldehídos libres en las moléculas de DNA apurínica se unen a la pararosanilina incolora disuelta en el reactivo, adquiriendo un color magenta. LA pararosanilina (FIG17), es la forma desmetilada de una serie de colorantes triaminotrifenilmetano agrupadas bajo el nombre de fucsina básica. (carcinógeno). Formación del Reactivo de Schiff. Este reactivo es preparado por burbujeo o hervor de SO2, a través de una solución al 0,5% de pararosanilina, hasta saturación. Posteriormente se agrega metabisulfito de potasio o sodio, agregado en una cantidad de 5 – 10 mg/ml, a una solución de 0,5% de pararosanilina acidíficada con HCl, la cual es comúnmente hoy en día usada como fuente de So2. Todas las soluciones son filtradas finalmente a través de 2-10 mg/ml de carbón activado por 1 a 2 min. Para decolorar el reactivo, por remoción de impurezas. La solución final tendría un pH 1,5 aprox. La pararonalinina es blanqueada o incolora porque el So2 se une al doble enlace central del cromóforo, destruyendo la estructura quinoide de la molécula y formando un compuesto ácido sulfónico, el cuál es conocido como leucofucsina o ácido leucosulfónico. Química de la Reacción: Los dobles enlaces conjugados, los cuales confieren el color rojo púrpura, son rápidamente restaurado por la reacción de CHOs con exceso de SO2 en el reactivo, para dar un ácido alquilsulfónico, que reacciona con el grupo amino de la leucofucsina. El SO2 es desplazado y el doble enlace central es restaurado junto con el color. Una hipótesis alternativa, sugiere que el SO2 también reacciona con el grupo amino del anillo benceno para producir un ácido n-leucosulfínico. Este último reactivo, formaría un puente n-sulfínico con los CHO, causando un rearreglo del ácido leucosulfínico dentro del compuesto quinoide coloreado.

. (FIG20) Especificidad de la Reacción: HA sido investigado minuciosamente por una variedad de investigadores, llegando a un amplio concenso entre los citoquímicos , que bajo las condiciones controladas apropiadamente, la reacción de Feulgen es específica para el DNA y no para grupos CHO extraños formados en el núcleo. Las evidencias que permiten establecer esto son las siguientes:

• Los cromosomas no actúan como simples absorbentes de para el reactivo de Schiff.

• La reacción de Feulgen puede ser eficazmente obstaculizada bloqueando los grupo aldehídos del DNA hidrolizado por diferentes reactivos que se ac0oplan o reconocen CHO.

• Después de una digestión del tejido con deoxiribonucleasa la reacción de Feulgen no tiñe el núcleo o los cromosomas.

• Una hidrólisis de 5 min. Con HCl de núcleo aislados sin fijar, no produce solubilización del DNA.

• LA digestión prolongada con tripsina de los cromosomas no modifica la positividad de la reacción de Feulgen.

(FIG21) Para que la reacción de Feulgen sea específica, la fijación del tejido debe ser apropiada, por lo tanto es obvio que se deben evitar los fijadores a base de alcohol el gluraladehído, el cual después de la fijación mantiene su grupo CHO libre, el cual reacciona con el Schiff. LA forma de fijación que se ha establecido como la mas apropiada es la formalina tamponada al 10% para frotis y tejidos, y unamezcla de metanol o etanol, formalina, y ácido acético. Fijadores como el Bouin no son recomendados.

Reactivos que han reemplazado al Schiff: Se han realizado numerosos estudios para explorar nuevos reactivos que pudieran reemplzar la pararosanilina en la reacción de Schiff. El propósito de estos estudios fue esencialmente la necesidad de encontrar un producto final de reacción que sea más fluorescente que la pararosanilina o que despliegue un color diferente para realizar estudios histológicos con diferentes, y también para estudiar la cinética de la reacción. Todos los que han estudiado contienen al menos un grupo amino reactivo libre con SO2- y tesyeado positivo para la reacción de Felugen.

• Acriflavina fluorescente • Thiazinas • Tionina • Azul de toluidina

A Pesar DE que estos reactivos son específicos para el DNA apurínico, su mecanismo de acción y la estructura de los productos de la reacción no están bien establecidos

Preparación del espécimen: El estudio de ploidía del DNA mediante la reacción de Feulgen, puede ser medido nuclearmente o en suspensiones celulares sobre porta objetos , en placas de cultivo de fluidos biológicos, o cortes histológicos. La célula única e intacta, es el blanco menos común donde se reaiza este tipo de estudios. Las células pueden ser disociadas desde se cultivo celular o desde el tejido fresco con métodos que alteran el contacto célula-célula y su adherencia estromal. Por tal motivo pueden obtenerse preparaciones apropiadas para citometria de imagen desde sangre, u otros fluidos corporales, tales como orina, liquídos de efusión, o esputo, labado de cavidades, biopsias o piezas quirúrgicas. Por impronta o raspado de la superficie celular, que corresponderían a métodos adicionales para disociar celulas únicas desde el tejido. Una vez en suspensión, las células pueden ser llevadas a una monocapa sobre un portaobjetos, mediante citocentrigfugación o filtros de polycarbonato. Posteriormente son fijadas.

Las células pueden ser disociadas desde tejidos previamente fijados o tejidos fijados e incluidos en parafina, aunque para tal efecto se requiere de fuerzas más fuertes e incluso actividad enzimática. La sensibilidad de la reacción es comparable con cualquiera de los métodos descritos. Sin embargo es necesario tener en cuenta que el DNA extraido desde tejidos fijados en formalina e incluiudos en parafina, ha sido encontrado extensamente y degradado en diferentes grados pequeños fragmentos de DNA. LA cantidad de degradación puede variar de un organo a otro. Y a pesar de que la hidrólisis ácida ocurre en DNA intacto, denaturado y degradado, estas observaciones indicarían que el núcleo de diferentes células y diferentes preparaciones contienen DNA de estados diferentes, lo que podria darnos una fragmentación hidrolítica impredecible. Por tal motivo se a aplicado al estudio de polidia en cortes de tejido, algoritmos matemáticos que corrieran estas variables. Es necesario además estandarizar otras varalbes que se pueden manejar con respecto al procedimiento y procesamiento de las muestras en estudio, entre ellas el grosor de los cortes, la fijación (tiempo, temperatura y fijador). Por este motivo el principal uso de la reacción de Feulgen in cortes de tejido intactos , es usando la thiazina como tinción de contraste.

Aplicaciones hoy en día para la Reacción de Feulgen: Hoy en día es muy poco lo que se usa para la demostración histoquímica del DNA a nivel de estructuras celulares en la microscopía de luz. Solo se utiliza aplicado para comprobar si estructuras basofilicas contienen DNA. No obstante la principal aplicación de esta técnica ha sido en la cuantificación del DNA en núcleos celulares por citometria de imagen para la evaluación de ploidía, y esto debido a que la reacción del color es proporcional a la concentración de DNA. La intensidad del color final de la reacción es proporcional al número de grupos aldehídos liberados en la molécula de DNA

El contenido de DNA de núcleos teñidos con la reacción de Felugen , fueron primero cuantificados por citofotometría. LA cuantificación in situ del DNA, fue originalmente realizada por por citofotometria UV sobre núcleos celulares no teñidos

Verde de metilo pironina Este método histoquímico tiene su origen en los métodos empíricos de tinción más antiguos. Fue introducida por Pappenheim a fines del siglo ante pasado. Está técnica bajo condiciones muy controladas, permite demostrar los DNA y RNA en el mismo corte. Con esta técnica dos colorantes catiónicos son aplicados simultáneamente bajo condiciones cuidadosamente controladas de concentración y pH En términos generales el DNA se tiñe con el Verde de metilo, y RNA con la pironina. Tanto el verde de metilo como la pironina son colorantes básicos y su combinación con los AN no puede ser explicada con un fundamento puramente químico. Tanto la forma como el tamaño de las moléculas de colorantes determinan la selectividad de estos. La práctica enseña que el verde de metilo se une específicamente a los DNA altamente polimerizados, y que la pironina tiene una especial afinidad a los polímeros más bajos de RNA. La tinción selectiva puede por lo tanto ser atribuida a los diferentes grados de polimerización del DNA y RNA. Se ha observado por ejemplo, que si el DNA es depolimerizado en algún grado por calor, o agentes denaturantes, pierde su capacidad de unirse al verde de metilo, y de esta forma podría ser teñido con pironina. En un medio controlado (pH, fuerza iónica, temperatura, etc.), la unión del colorante es estequiométrica, y con técnicas microespectrofotométricas es posible la medición del contenido en DNA de los núcleos. Por lo tanto parece que la disposición molecular del

DNA (quizás dado por la periodicidad de los grupos electronegativos para la unión del verde metilo) es de vital importancia para la reacción tintorial. La reactividad específica del verde metilo por el DNA es atribuida al alineamiento espacial de los grupos NH2 del colorante a los radicales fosfatos sobre la doble hélice del DNA

En el caso del RNA, los mecanismos de captación de la pironina por los polímeros mas bajos de RNA no han sido tan estudiados. L apironina tiene una estructura mas planar, por lo tanto podría intercalarse entre los pares de bases de los AN, pero al DNA no puede entrar porque sus iones son excluidos por la molécula de verde metilo, pero como la molécula del RNA es mas abierta , admite más fácilmente los cationes de la pironina.Por tal motivo se considera que la especificidad de la pironina por el RNA es menor, y su tinción está influenciada por otros factores como el pH, por lo tanto la especificidad de la pironina debe ser controlada mediante el uso de la digestión con ribonucleasa en cortes control.

Está técnica se ha usado especialmente para la tinción histológica de sistema nervioso y tejido linfoide, y se ha utilizado para contrateñir con fluorocromos o incluso con procedimientos IHQ.

En el trabajo histoquímico sin embargo siempre es necesario la extracción enzimática o cortes control tratados con enzimas para chequear la especificidad de la tinción de DNA o RNA

Método de Galocianina-alumbre de cromo para DNA y RNA Este método fue introducido para la demostración de los granulos de Nissl. Con este método

exclusivamente no pueden diferenciarse los DNA de los RNA, ya que ambos se tiñen. Mecanismo: La galocianina (oxacina), es ligeramente ácida en solución acuosa. A altas

temperaturas puede formar tres complejos con el alumbre de cromo: una laca catión, galocianina-Cr- (H2O), una laca hidróxido, galocianina-Cr-(H2O)OH, y una laca sulfato, galocianina-Cr (H2O)2SO4. La laca catión es la responsable de la tinción de los ácidos nucléicos. Se una a los grupos fosfatados de los ácidos nucléicos, probablemente a través de enlaces salinos, para formar un complejo azul oscuro. Estas uniones tienen lugar en un medio ácido con un pH entre 0.8 y 4.3. A pH bajo (0.8-1,75), la laca catión se une solamente a los ácidos nucléicos y solo en una mínima cantidad a las proteínas. Al aumentar el pH de la solución de tinción, aumenta su reacción con las proteínas . Esta técnica también se ha utilizado para la determinación citofotométrica de los ácidos nucléicos. Una de las principales ventajas de esta técnica es que es progresiva, lo que significa que cuando se ha llegado al punto final de la reacción, no ocurrirá ningún cambio en la intensidad de tinción. Esta laca formada entre los ácidos nucléicos y la laca catión es estable y resistente al alcohol, xilol, ácidos diluídos, etc..Sin embargo está técnica ha sido bien controversial porque hay algunos autores que señalan que esta técnica no se puede considerar como un método HQ.

Extracción enzimática de los ácidos nucléicos Digestión con ribonucleasas: Brachet en el año 40 introdujo este procedimiento en la HQ, como

procedimiento control. Las tinciones debidas a la presencia de RNA se eliminan si los cortes son tratados con ribonucleasa antes de someterlos a la acción del colorante.

La ribonucleasa es una enzima termoestable que degrada los ribonucleótidos en dos etapas. En la primera realiza una actividad de fosfodiesterasa fraccionando los grupos terminales pirimidín-nucleósido2’:3’-fosfato, los cuales en una segunda etapa, más lenta son hidrolizados al correspondiente nucleósido 3’-fosfato. Estos productos de la hidrólisis son fácilmente difusibles.

En la extracción enzimática , se han utilizados enzimas pancreáticas como ribonucleasas

(RNasa) y desoxiribonucleasa (DNasa), con el fin de remover selectivamente los dos AN. También se

han utilizado enzimas para remover otro tipo de sustancias como colágeno, mucosustancias, glicógeno, etc..Sin embargo es necesario tomas una serie de recomendaciones para validar el método.

• El sustrato debe estar presente en el tejido en su estado apropiado par ser atacado por la enzima. Por lo tatno deben evitarse fijadores con ácido pícrico, mercurio o cromo, porque tienen un efecto inhibitorio sobre las enzimas.

• La enzima usada debe estar libre de la contaminación con otras enzimas, por ejemplo las DNasa debe estar libre de RNasa o las enzimas proteolíticas también deben estar libre de RNasa. Sin embargo hoy en día es posible encontrar enzimas de lata pureza

• Las condiciones de incubación deben ser las adecuadas para la completa acción de la enzima

• Puede existir extracción no específica, por lo tanto es necesario el uso de cortes controles tratados solo con el buffer de la ezima.

• Se deben incorporar los cofactores imprescindibles para la función de la enzima (neuroaminidasa).

Es posible extraer los AN no enzimáticamente, es decir mediante extracción química. Por

ejemplo el TCA 4% en solución acuosa (ácido tricloroacético), remueve el DNA y el RNA- el äcido perclórico al 10% remueve el DNA pero no el DNA si se realiza a 4°C durante toda la noche. Un tratamiento más drástico con ácido perclórico al 10% pero a 60°C durante 30’, extrae ambos ácidos nucléicos. Sin embargo este tratamiento también extrae algunas proteínas desde los cortes.

Estos procedimientos químicos están basados sobre la catálisis por ácidos de la hidrólisis de los puente entre los azucares y las bases y entre los azucares y el ácido fosfórico. El enlace ester –fosfato del RNA es más lábil que la hidrólisis del DNA.

El RNA también es posible removerlo con HCl 1 M, como por ejemplo en la hidrólisis de Feulgen.

Los reactivos utilizados para la extracción enzimática son mas baratos que las enzimas, sin embargo son menos específicos, y su acción, es mas difícil de controlar, además que son mas difícil de manipular.

Detección de Ácidos Nucléicos Con Fluorocromos

Existen tres tinciones de ácidos nucléicos:

• Colorantes intercalantes, tales como el bromuro de etidio y el ioduro de propidio

• Los que se unen a la curvatura menor del DNA, tales como el DAPI y el Hoechst

• Y colorantes misceláneos, incluyendo el acridine orange, 7-AAD, LDS 751 and hydroxystilbamidine, y cyaninas con propiedades especiales.

Dentro de los colorantes intercalantes clásicos se encuentran las acridinas, y las fenantridinas (BE, IP), son además impermeantes, es decir no pueden atravesar la membrana en células vivas. Estos colorantes se unen también a RNA , por lo que se requiere extracción enzimática para hacer específica su tinción. Este tipo de colorantes tiene una estructura de anillo aromático plano, con dimensiones apropiadas, y que tenga al menos un grupo polar, es capaz de ajustarse como relleno de un sándwich, entre las bases de un DNA. Entre ellos, las fenantridinas, propidios y etidios, cumplen con este requisito. El mecanismo de intercalación dentro de la doble hélice de DNA requiere de la apertura transiente de la hélice para admitir la molécula coloreada o fluorescente.

Ocurre una apertura como en bisagra de la hélice. Un ejemplo de estos fluorocromos intercalares es la quinacrina, la cual se une esbtre las bases A-T, pero no G-C. (aplicación en citogenética)

Entre los colorantes que se unen a la curvatura menor del DNA se encuentran los Indoles y los imidazoles, entre ellos el mas famoso es el hoechst y también el DAPI, este último se une con mayor fuerza en presencia de los clusters de A-T, pero deben haber por lo menos dos consecutivos. Estos fluorocromos catiónicos son atraídos a los grupos fosfatos del DNA por fuerzas iónicas, y son adheridos por fuera de la doble hélice en regiones ricas en A-T, pero sin intercalarse

Y otros mas, pero con aplicaciones más específicas.

Propiedades de los colorantes Cyaninas:

Las principales ventajas de estos colorantes, son que poseen una fluorescencia intrínseca mínima, cuando no está unido a un ácido nucléico.tienen una gran afinidad a los AN, y muy baja unión a otros biopolímeros. Otra característica representativa de esta familia de colorantes es que tienen un rango de fluorescencia de excitación y emisión en el espectro visible, y con un peak adicional en el espectro UV, lo que hace compatible con diferentes tipos de instrumentos. La principal diferencia entre ellos, es que tiene diferentes grados de permeabilidad celular y de especificidad por los ácidos nucléicos.(picogreen, oilgreen, etc..)

Otra familia de colorantes cyanine, son los TOTO, que corresponden a dímeros simétricos de cyanine, con una sensibilidad especial por los AN. Esta sensibilidad es debido a su alta afinidad por los AN, en combinación con una gran fluorescencia.

Este tipo de colorantes o fluorocromos se unen de dos formas., intercalandose cada monomero de colorantes entre un par de bases. Con el sistema de sandwich, el anillo nezazolim, la pirimidina, y el anillo quinilina entree l anillo purina, causando el desenrrollamiento de la hélice. Una segunda forma de unión de estas moléculas, aunque menos estudiada, es a nivel externo.

Su sensibilidad es suficiente para detectar una molécula de ácido nucléico marcada, por ejemplo mediante citometría de flujo. Estos colorantes están considerados dentro de la clasificación de impermeables, es decir no penetran las células, por lo tanto se requiere fijarlas, o permeabilizar células vivas por ejemplo con DMSO al 5%.

Entre los colorantes permenates se encuentra el ioduro de hexidium, que pertenece a la familia de fenantridium, pero es lipofilico

EL acrdine orange, es un colorante misceláneo, que se une al DNA por intercalación, y también por interacciones electrostáticas, sin embargo, tiene las desventaja de se menos sensible cuando la cromatina se encuentra condensada, porque su compactación le impide intercalarse entre las bases.

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende1

Demostración de Ácidos Nucleicos

Prof. Cecilia Alliende G. Martes 03 de Septiembre de 2002

Aunque generalmente la identificación de ácidos nucleicos (AN) se realiza en tejidos fijados, ciertos

fluorocromos se pueden emplear en tejidos sin fijar. Siempre es recomendable utilizar fijadores que contengan ácido acético en la fijación de los AN pues es el único fijador que los precipita. Debido a que los AN están unidos a proteínas su fijación no presenta grandes problemas, obteniéndose una buena preservación de éstos con la gran mayoría de los fijadores. Sin embargo, deben conocerse ciertas reglas generales para la caracterización óptima del DNA y RNA.

Fijación del DNA y del RNA:

Es recomendable utilizar fijadores que tengan ácido acético. Se obtienen buenos resultados con fijadores alcohólicos que contienen ácido acético (Carnoy, etanol-ácido acético 3:1, etc) o fijadores que además del alcohol y ácido acético que contengan formaldehído (Alfac). Se deben evitar los fijadores muy ácidos como el Bouin acuoso pues producen hidrólisis del DNA durante la fijación.

El RNA por su parte se hidroliza fácilmente con medios ácidos o básicos, hecho que debe considerarse

al utilizar agentes decalcificantes ácidos. Hay que cuidar además que la temperatura no sea demasiado elevada (no mayor de 60º C pues provoca desnaturación del DNA).

Métodos Histoquímicos para la identificación de Ácidos Nucleicos:

Los Métodos Histoquímicos que permiten identificar los AN se pueden clasificar en 2 grandes

categorías: a) Reacciones de las pentosas desoxirribosa o ribosa b) Reacciones de los grupos fosfato Identificación del DNA mediante la Reacción de Feulgen:

Este método introducido por Feulgen y Rossenbeck en 1924 es una reacción específica y cuantitativa para el DNA que ha desempeñado un importante papel en el estudio de la fisiología celular, pues ha permitido realizar importantes estudios referidos al contenido de DNA nuclear, p. ej. estudios del ciclo celular, contenido de DNA anormal en tumores cancerosos, determinación del contenido de DNA nuclear característico de la especie, etc. Mecanismo de reacción: 1. Separación selectiva de las bases púricas (Adenina y Guanina) del DNA mediante una hidrólisis moderada.

Esta hidrólisis conduce a la formación de ácido apurínico. La ruptura de la unión glucosídica de las bases púricas (C1-C9) con la deoxiribosa, permite que el grupo aldehído potencial del azúcar se haga reactivo al quedar libre el C1 del azúcar. En la aparición del grupo aldehído hay que admitir la existencia de un estado de equilibrio entre la forma furanósica del azúcar (tautomérica) y la forma aldehídica. La forma tautomérica de la deoxiribosa corresponde a una estructura cíclica que se ha originado por la unión hemiacetal entre el grupo aldehído del azúcar y el grupo OH del C4. Las formas tautoméricas se encuentran siempre en equilibrio y predominan una sobre la otra según las condiciones del medio en que se encuentra. Tautomería es la emigración de un átomo o de un grupo de átomos desde un punto de la molécula a otro con lo que se forman enlaces diferentes pero fácilmente retornables a la posición primitiva.

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende2 Para obtener el mayor número de grupos aldehídos reactivos debemos realizar una hidrólisis que libere la mayor cantidad de bases púricas sin producir depolimerización de DNA ni romper las uniones ésteres con los grupos fosfato en los C3-C5. Para conseguir una hidrólisis óptima deben considerarse los siguientes factores: Tiempo de hidrólisis: un tiempo demasiado largo produce depolimerización de DNA, en tanto que un tiempo corto no permite exponer todos los grupos aldehídos. [ácido]pH Temperatura Fijador utilizado Compactación del DNA en el tejido utilizado La duración de la hidrólisis es fundamental para alcanzar la liberación de un mayor número de grupos aldehídos reactivos. Si la hidrólisis es muy corta la ruptura de las uniones glicosídicas del azúcar con la base púrica es incompleta y no todos los grupos aldehídos son desenmascarados. Si la hidrólisis es demasiado prolongada se produce la depolimerización del DNA, por lo tanto el azúcar portador del grupo aldehído se solubiliza. Es importante observar un tiempo de hidrólisis muy estricto, el que varía de acuerdo con: El fijador empleado La naturaleza del tejido Concentración del ácido Temperatura del ácido utilizada El tiempo de hidrólisis debe ser determinado en cada caso estudiado; los valores indicados en las tablas pueden servir de referencia. Todos los fijadores histológicos sirven para realizar la reacción de Feulgen. El único que debe evitarse es el Bouin acuoso que por ser muy ácido da una reacción menos intensa, pues en presencia del HCl la hidrólisis es excesiva y produciría depolimerización del DNA. La influencia del fijador sobre el tiempo óptimo de hidrólisis se debería a la acción del fijador sobre la fracción proteica (histonas y proteínas no histónicas). En 1966 Decosse y colaboradores realizaron un estudio histofotométrico en linfocitos humanos realizando una hidrólisis con HCl 5N a 26º C y HCl 1 N a 60º C. (ojo) El contenido de DNA óptimo fue igual en ambos tipos de hidrólisis; con HCl 5 N se obtiene un plateau con la cantidad máxima de DNA. La proximidad de las curvas ascendentes en los dos métodos de hidrólisis indicaría que la depurinación es dependiente primariamente de la concentración de H y es sólo modestamente acelerado por la temperatura. La amplia diferencia entre el final de la depurinación (tiempo óptimo) y el comienzo de la depolimerización con HCl 5 N (35 minutos tiempo óptimo y a los 120 minutos empieza la depolimerización. En cambio, con HCl 1 N a 60º C el tiempo óptimo se alcanza a los 16’ y a los 20’ se inicia la depolimerización. La depolimerización estaría más influenciada por la temperatura. Reactivo de Schiff: La fucsina básica tratada con un exceso de ácido sulfuroso se decolora, conociéndose esto como reactivo de Schiff, el que en presencia de un aldehído participa de la formación de un compuesto nuevo de color fucsia que tiene un espectro distinto a la pararosanilina. Ácido sulfuroso: H2O +SO2 H2SO3 H+ HSO3

- 2H+ + SO32-

La fucsina básica estaría formada principalmente por: Pararosanilina (magenta O) Rosanilina (magenta 2) Magenta 3 Nueva fucsina (magenta 4) El principal constituyente es pararosanilina; entre los distintos lotes comerciales de fucsina básica existen diferencias habiendo siempre impurezas que deben ser eliminadas con carbón activado. La pararosanilina es un derivado del trifenilmetano que presenta un espectro de absorción característico con 3 puntos de absorción máxima (538, 280 y 232 nm).

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende3 La absorción a 538 nm es típica de los colores derivados del trifenilmetano y debe ser asociada con la molécula de transición que por el fenómeno de resonancia puede asumir la pararosanilina, cualquiera de los 3 anillos puede transitoriamente asumir la configuración quinoide. Si a la pararosanilina se le agrega metabisulfito de sodio desaparece el peak de absorción de 538 nm que es el responsable del color que presenta la pararosanilina. El reactivo de Schiff más aldehído presenta un espectro similar al de la pararosanilina, con la diferencia de presentar peak de absorción a 560-290-240 nm. Se forma un producto nuevo muy estable y distinto de la pararosanilina. La naturaleza de este compuesto no está del todo clara, al respecto existen varias teorías, siendo la más aceptada en la actualidad aquella que propone la formación de un Ácido aminoalquilsulfónico. Varios colorantes y fluorocromos distintos a la fucsina básica, si se tratan con SO2 también se decoloran y forman reactivos llamados Pseudo Schiff, los que en presencia de grupos aldehído también forman compuestos coloreados. Son colorantes básicos que contienen al menos un amino primario y no poseen grupos ácidos. Estos compuestos pseudo Schiff son altamente sensibles y son cuantitativos, por ejemplo la acridina, acriflavina, auramina O. estos colorantes básicos fluorescentes saturados con SO2 emiten una fluorescencia especial en presencia de los grupos aldehídos y en los estudios cuantitativos no están sometidos al error distribucional. Preparación, conservación y uso del reactivo de Schiff: la calidad del reactivo de Schiff depende mucho de la calidad de la fucsina en parte del modo de preparación. Existe una gran variedad de procedimientos para la preparación del reactivo de Schiff. En cualquier caso deben tomarse ciertas consideraciones: 1. La concentración de la fucsina varía extremadamente de 0.017% a 1%.

En un trabajo de 1969 realizado por Dutt, se utilizaron diferentes concentraciones de fucsina básica para preparar el reactivo de Schiff. Se emplearon células hepáticas y mediante un citofotómetro se midió el DNA, encontrándose que la máxima intensidad de tinción se alcanza con una concentración de 0.5%, aunque con 0.25% la diferencia es mínima.

Concentración colorante (%)

DNA (unidades)

0.5 33.90 0.25 28.88 0.125 24.05 0.0625 21.50 0.03125 15.19

Hay una progresiva reducción de la intensidad de tinción del DNA cuando la técnica se realiza con un reactivo de Schiff que contiene una concentración de fucsina básica bajo 0.5%. la sensibilidad del reactivo de Schiff se relaciona con su contenido de SO2. Atkinson en 1952 preparó reactivo de Schiff con una concentración de 0.42% de fucsina básica y fue variando la cantidad de NaHSO3. En un rango que variaba entre una relación molar 5/1 a 100/1 bisulfito-colorante 5/1, 10/1, 100/1. Se alcanzó una mayor coloración con formalina como fuente de aldehídos con la relación molar 10:1 del bisulfito y el colorante. La cantidad excesiva de ácido sulfuroso baja mucho el pH del reactivo. Por estudios histofotométricos se ha visto que el rango de pH a los cuales se alcanza una mayor intensidad de reacción se situaría entre 1.8 y 2.0; a pH más bajos daría reacciones específicas pero de menor intensidad, en tanto que a pH 3.0 daría reacciones inespecíficas, por lo que es importante realizar los lavados con agua sulfurosa después del reactivo de Schiff pues si se transfiere directamente la preparación al agua corriente que tiene un pH cercano a 6 el exceso de reactivo presente en la placa se recolora transformándose en fucsina básica. Es decir, el reactivo se recolora en presencia de bases regenerándose la fucsina básica. Respecto de la conservación, debe hacerse en frío en frascos oscuros llenos y herméticos para evitar la evaporación del óxido sulfuroso; con el tiempo se produce la oxidación de sulfido a sulfato lo que baja

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende4 el pH de la solución. El reactivo de Schiff debe ser incoloro o de un color naranja debido a las impurezas de la fucsina. Para eliminar las impurezas se utiliza carbón activado, que actúa adsorbiendo las impurezas.

Uso de fluorocromos en la identificación de DNA: Fluorocromo es un colorante capaz de absorber la luz ultravioleta y emitir luz de longitud de onda más larga que la luz absorbida.

Una molécula para ser fluorescente debe contener un sistema de dobles enlaces conjugados, que pueden incluir los dobles enlaces del anillo aromático. Los dobles enlaces provenientes de compuestos cíclicos emiten una fluorescencia más fuerte que la proveniente de compuestos lineales.

Los compuestos fluorescentes de interés en microscopía son moléculas coplanares rígidas:

Poco fluorescente Mayor fluorescencia

Más fluorescente Menos fluorescente

Los compuestos coplanares son más fluorescentes cuando los anillos están puestos uno al lado del otro.

Por ello el antraceno fluoresce más que el fenantreno en respuesta al mismo nivel de excitación. La fluorescencia también es afectada por lo sustituyentes.

Cuando existe un solo sustituyente la fluorescencia es aumentada por –OH, -OCH3, -F, -CN, -NH y NHCH3; en tanto que es reducida por C=O, -COOH, -Cl, -Br, -I, -NO2, o –SO3H.

Las genealizaciones anteriores no se cumplen cuando hay más de un sustituyente. Los fluorocromos que identifican ácidos nucleicos se pueden clasificar en 2 grupos:

a) Los que forman complejos bastante estables con el DNA (Intercalares) b) Específicos para DNA, se unen externamente y no se intercalan:

Nitramicina NMC (GΞC) Hoechst 33342 (A=T) 4,6- diamino-2-fenilindol (DAPI) (A=T) actinomicina O (GΞC) Derivados de las cianinas: TOTO-1 y YOYO-1, que se pueden unir al DNA externamente y por intercalación, son extremadamente sensibles, tienen una fluorescencia más duradera pero su costo es considerablemente alto.

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende5 Acridina Orange:

Colorante básico de la serie de las acridinas, fue uno de los primeros colorantes intercalares que se emplearon para la tinción diferencial de DNA y RNA. Sobre células sin fijar o postfijadas con Carnoy este fluorocromo produce una fluorescencia verde en presencia de DNA y roja en el caso del RNA, lo que se debe a que la acridina Orange exhibe grandes cambios en sus propiedades de emisión si interactúa con DNA de doble cadena y RNA generalmente de una cadena rojo.

Cuando se une al DNA de doble cadena se une como un monómero, en forma intercalar entre 2 pares de bases. El mecanismo de intercalación en el DNA requiere una apertura transciente de la doble hélice para admitir el colorante fluorescente. Esta abertura no implica desenrollar la hélice ya que la apertura sólo puede ocurrir en sitios determinados. En cambio en el RNA de una sola hebra se une como polímero a las cargas negativas del RNA. Si el DNA es denaturado se observa fluorescencia roja. Aplicaciones:

Años atrás se utilizó ampliamente para la caracterización de células malignas en frotis, donde la cantidad de RNA ribosomal muestra un aumento en la síntesis de proteínas.

En las tinciones con fluorocromos es muy importante la concentración. Se utilizan bajas concentraciones. Altas concentraciones producen el fenómeno de Quenching (disminución de la fluorescencia). A+hv A* (monómero) A*+ A (A A*) (polímero) (A A*) hv2+ 2ª En algunos casos si se aumenta la concentración del soluto se observa la desaparición de la fluorescencia inicial. DAPI: es una molécula muy sensible que ha permitido la detección de DNA en micoplasmas, mitocondrias, cloroplastos y otros. Se emplea en métodos cuantitativos, es de 2 a 3 veces más sensible que el Feulgen, se utiliza a pH 4.4. es un colorante catiónico que se une a los grupos fosfato del DNA por fuerzas iónicas y tb a regiones externas a la doble hélice ricas en A=T por fuerzas no iónicas, y no se intercala. Detección del radical fosfato:

La basofilia de los ácidos nucleicos se relaciona con los radicales fosfato de su molécula. El radical fosfato de los AN a pH 2.0 está disociado; sus cargas negativas fijan a los colorantes básicos cargados positivamente.

En la célula viva los grupos fosfato cargados negativamente están unidos a las proteínas (en el caso del DNA están unidos a histonas) por ello los AN no se detectan por colorantes básicos en células sin fijar. La fijación libera en parte a estos grupos electronegativos.

Sin embargo, la coloración de los ácidos nucleicos por colorantes básicos implica siempre una competencia entre los cationes del colorante y los grupos amino de la fracción proteica de las nucleoproteínas. Siempre hay que recordar la influencia primordial del pH sobre esta fijación de colorantes básicos; a pH >3.0 se empieza a encontrar disociados los grupos ácidos de las proteínas.

Se considera en general que la unión de los colorantes básicos a los AN es por uniones salinas. Todos los colorantes básicos son susceptibles de fijarse sobre los AN, pero la mayor parte se fija igualmente sobre grupos ácidos no pertenecientes a los AN, especialmente en los proteoglicanos.

Para confirmar la especificidad de la unión de un colorante básico a los ácidos nucleicos se debe realizar por extracción enzimática o química.

Para el estudio de ambos AN las reacciones más utilizadas son las de verde metilo-pironina y galocianina que empleadas en ciertas condiciones tienen especificidad por los AN.

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende6 Método de Verde metilo- Pironina: En 1899 Pappenheim propuso el uso de dos colorantes básicos, el verde de metilo y la pironina para la caracterización diferencial de los ácidos nucleicos. Verde de metilo: es un colorante básico derivado del trifenilmetano preparado a partir del cristal violeta, por introducción de un séptimo grupo metilo; este metilo suplementario está débilmente unido por ello hay siempre una cantidad de cristal violeta en los stock comerciales de colorante, lo que requiere someterlo a purificación con cloroformo, en el cual el cristal violeta es soluble, en tanto que el verde de metilo no. La pironina Y o G (sinónimos) es un colorante básico derivado de los xantenos, son derivados metilados y deaminados. La pironina Y no debe confundirse con la pironina B en la cual los grupos metilos están reemplazados por grupos etilos. Mecanismo:

Los colorantes básicos cargados positivamente se combinan con los constituyentes tisulares cargados negativamente en una medida que depende del colorante dado y del pH de la solución colorante. Así ciertos constituyentes tisulares reaccionan con un colorante básico a cierto pH y con otro colorante básico a otro pH más bajo o más elevado. Si se somete a estos constituyentes celulares a una mezcla de colorantes básicos como el caso del verde de metilo-pironina, la coloración obtenida dependerá de la afinidad de estos constituyentes tisulares por los 2 colorantes básicos en función del pH de la mezcla colorante. Si la solución está a pH 1.5 todas las estructuras ácidas se tiñen con el verde de metilo, en cambio a pH 9.3 y superiores todas las estructuras ácidas se tiñen con la pironina.

A pH entre 4-5 el ADN se colorea en forma selectiva con el verde de metilo y el RNA con la pironina. Las causas de esta coloración diferencial no están aún muy claros pero se han propuesto diferentes

hipótesis: Kunnick y Pollesty estimaron que la coloración diferencial se debe al grado de polimerización diferente

de ambos AN. El DNA más altamente polimerizado tendría afinidad por el verde de metilo mientras el RNA menos

polimerizado se uniría a la pironina. Esta teoría se basa sobre experiencias realizadas in vitro. Después de tratar el DNA con desoxiribonucleasa que depolimeriza el DNA se tiñe con pironina.

Vercantier en 1950 sostuvo que influyen factores de estereoespecificidad; en efecto, verde de metilo con sus 2 grupos aminos terciarios puede unirse a los grupos fosfato del DNA que está a una determinada distancia que le permiten unirse con el colorante. Si se realiza una hidrólisis corta con HCl 1N se rompen los enlaces de H pero no las uniones fosfato C5-C3, no se depolimeriza el ADN pero de igual forma se pierde la afinidad por el colorante al romperse las uniones de H entre las bases complementarias se separan las cadenas de la molécula de ADN alterando la distancia entre los grupos fosfato.

Scott sugurió que la configuración helicoidal del DNA convierte a los grupos fosfato en una estructura no planar del verde metilo pironina. Mientras el RNA tiene una conformación más abierta fácilmente penetrable por la molécula más pequeña y planar de la pironina Y. Existe un mecanismo de tinción competitiva por el .

Métodos de extracción de Ácidos Nucleicos: Extracciones enzimáticas: Ribonucleasa:

Está ampliamente repartida en los tejidos animales y vegetales. Se ha aislado ribonucleasa de hígado, bazo, timo, páncreas.

La ribonucleasa pancreática porcina o bovina es la que ha sido más estudiada gracias a su fácil obtención.

RNAsa aislada de páncreas es una diesterasa que actúa sobre el grupo fosfato unido a la posición 3 de aquella ribosa que está unida en su C1 a una base pirimídica TC. El éster fosfato de la posición del C5 del siguiente residuo es transferido a la posición 2 de la 1ª ribosa. El RNA se rompe en oligonucleótidos solubles.

La ribonucleasa pancreática es una proteína soluble a pH óptimo 7.7 y es estable a una temperatura entre 40-70º C.

Identificación de Ácidos Nucleicos- Cecilia Alliende7 Actualmente se dispone de RNAasa muy puras que dan resultados confiables. No deben usarse

extractos animales de RNAasa que son más baratos pero están más contaminados con proteasas. Son inhibidas por Ca, Mg, Mn, ácido periódico, formaldehído.

Por especificidad es una reacción útil para observar en forma simultánea DNA y RNA; es más utilizado para caracterizar RNA no hay una buena reacción.

El verde de metilo a pH 4-5 también se une a mucinas, fundamentales para el cartílago y a las granulaciones de los mastocitos. Para identificar DNA se recomienda la reacción de Feulgen.

La pironina tampoco es totalmente específica por eso para determinar si la tinción corresponde a RNA se debe hacer una extracción con ribonucleasa o extracción ácida. Ribonucleasa y fijación:

Cuando se realiza la digestión con ribonucleasa no pueden utilizarse fijadores que contengan sales de Cr, formaldehído o glutaraldehído. Se recomienda fijar en alcohol acético, hacer controles enzimáticos en placas en cámara húmeda. La desoxiribosa se usa raramente ya que existe el Feulgen específico para DNA. Hidrólisis ácida:

Presenta la ventaja de ser más económica y el inconveniente de tener una acción hidrolítica más variable sobre los ácidos nucleicos. Algunas hidrolizan el RNA y otros RNA y DNA, algunas veces de manera incompleta.

Los reactivos químicos más utilizados son: Ácido tricloroacético (TCA) al 4% 90º C por 15 minutos elimina DNA y RNA Ácido perclórico 10% a 4º C toda la noche RNA Ácido perclórico 5% 30’ a 60ºC RNA y DNA

Se produce la hidrólisis entre el azúcar y la base y entre el azúcar y el fosfato. Los ésteres fosfato del

RNA son más hábiles a la hidrólisis que el DNA. HCl 1N a 60º C remueve RNA en el tiempo óptimo de hidrólisis. La extracción del RNA con ácido perclórico también extrae las bases púricas y pirimídicas del DNA el

que puede ser detectado por el reactivo de Schiff.

TÉCNICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DE APOPTÓSIS IN SITU

Gamaliel E. Ordenes 13 de Septiembre de 2002

Apoptosis: Es una forma de muerte celular cuyo objetivo es eliminar las células del huésped que ya no son necesarias a través de la activación de una serie coordinada y programada de acontecimientos internos, que se inicia por un grupo de productos génicos cuya función específica es precisamente ésta. Es responsable de numerosas respuestas fisiológicas, adaptativas y patológicas. Se puede observa en los siguientes contextos generales: 1) durante el desarrollo. 2) como mecanismo homeostático para el mantenimiento de las poblaciones celulares en los tejidos. 3) como mecanismo de defensa en las reacciones inmunitarias. 4) cuando las células son afectadas por enfermedad o por agentes lesivos. 5) en el envejecimiento. La connotación biológica que tiene este proceso es fundamental, sobre todo en las primeras etapas de la vida, como en la formación de los dedos de la mano referido a la desaparición de las membranas interdigitales. Durante el desarrollo embrionario, toda la morfogénesis tiene que ver con procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis, esto es lo que nos modela. Durante la apoptosis ocurren eventos tempranos, que si miramos la células, morfológicamente no presentan cambio alguno, pero los eventos tardíos sí reflejan cambios morfológicos que se pueden ver incluso con H-E: cuerpos apoptóticos, eliminados por células vecinas no macrofágicas. El esquema que a continuación se presenta (fig. 1), trata de explicar los mecanismos que controlan el proceso. Desde una señal externa a una interna como es la unión de un ligando al receptor de Fas, que desata una cascada de eventos hasta llegar a un fenómeno irreversible y definitivo que es la fragmentación del DNA. En el intertanto ocurren muchas otras cosas, algunas son reversibles y otros irreversibles. Existen ciertos puntos críticos de los cuales ya no hay vuelta. El proceso es extremadamente complejo y el esquema que se muestra es una simplificación.

La unión de una molécula a un receptor externo produce la transducción de la señal que activa moléculas como el Fas, que a su vez, al ser activado permite la activación de ciertos dominios que llevan a apoptosis. Esta molécula activada, a su vez va a ser capas de activar, de clivar a las enzimas caspasas, produciendo una cascada de caspasas clivadas y activadas. Estas a su vez van a desactivar una serie de otras proteínas, como por ejemplo el desmontaje de las proteínas nucleares lámina, estas proteínas son las que permiten la mantención de la estructura de la envoltura nuclear. Uno de los procesos que ocurre cuando se desensambla el núcleo es el desmontaje de las proteínas lámina, que produce el desensamblaje de la doble envoltura nuclear. Estas proteínas también son blanco del final de la cascada de las caspasas, al igual que otras proteínas, como la activación de las nucleasas específicas de la apoptosis que van a fragmentar el DNA.

fig. 1

Existen distintos tipos de señales, generalmente señales externas que permiten la activación del proceso de apoptosis. Tal como el proceso de proliferación celular, el proceso de apoptosis es exquisitamente regulado, significa que existen muchos elementos reguladores, la célula no prolifera en cualquier momento y por cualquier cosa, sino que en condiciones muy precisas se le permite proliferar porque es peligroso para el organismo, peligroso para la población celular. Esto depende de las condiciones del medio, de la economía del sistema. Si la proliferación se desata se pueden perpetuar mutaciones y esas mutaciones pueden llevar a neoplasias que finalmente van a terminar con la vida del individuo. En el caso de la apoptosis, como se trata de eliminar células, también se puede tener el fenómeno contrario, si la apoptosis se desatara tendríamos una muerte sin control de elementos importantes con perdida de funciones. Pero eso no ocurre porque son procesos finamente regulados. Hasta ahora no se conoce alguna patología donde ocurra una hiper apoptosis, pero si puede ocurrir la eliminación de poblaciones celulares completas como en el caso de elementos linfoides que fueron útiles en un proceso determinado que ya finalizó. Cualquiera de estas señales externa, generalmente provenientes de otras células van a producir un estímulo con la consiguiente transducción de señal. Desde estimulantes específicos, como el TNF, ligandos de Fas, proteínas de apoptosis, hasta inespecíficos como la luz UV, que es capas de producir necrosis por una parte y también apoptosis. El estímulo actúa sobre un elemento sensor como un receptor que produce la transducción de la señal. Los sensores participan en el método de detección de apoptosis. Existen diversos sensores, se considera como sensor a la molécula receptora y a los participantes del proceso del transducción de señal. Los adaptadores de la señal, a veces hay señales que son parecidas a otras, señales de estímulo de crecimiento, señales de estímulo de diferenciación, pero quienes adaptan la señal al proceso apoptótico son los adaptadores, por ejemplo la activación del dominio de apoptosis. Una vez que la señal ha sido adaptada el proceso de inicia, se inicia con los eventos propios de la vía de la apoptosis, uno de ellos es el clivaje de las caspasas o de los sustratos, uno de los primeros iniciadores en ese aspecto es la caspasa 8 que inicia una serie de eventos moleculares, generalmente fosforilaciones, desfosforilaciones, clivajes en proteínas, para llevar a elementos efectores, como por ejemplo la caspasa 3, que participaría en la activación de las nucleasas de DNA, finalmente tendremos un resultado, que es la fragmentación del DNA, un núcleo desensamblado.

FAMILIA Bax NOMBRE FUNCIÓN

Bad Promotor

Bik Promotor Bid Promotor Blk Promotor Hrk Promotor

BNIP – 3 Promotor BimL Promotor Bok Promotor Bak Promotor Bax Promotor

EGL- 1 Promotor

Se presenta los componentes de la familia Bax, todos ellos son promotores de la apoptosis y pueden ser identificados con IHQ.

Las conclusiones que se pueden obtener de esto son relativas al entorno y a una serie de cosas, porque no es suficiente decir que una células está en apoptosis porque hay Bax presentes, depende de otros factores también.

Si se tiene por ejemplo, un cultivo celular que normalmente no presenta Bax, pero si se pone en el cultivo un estimulante conocido de apoptosis y aparecen Bax en las células, se tiene un elemento para medir con IHQ que las células están en apoptosis.

Anexina V Permite detectar células en procesos tempranos o medios de apoptosis, en comparación con el proceso de fragmentación del DNA detectable con TUNEL, pero tiene la desventaja que sólo se puede usar con células viva porque requiere integridad de la membrana citoplasma y al fijarla se pierde. Cuando la célula inicia la apoptosis se da un fenómeno en la membrana celular que es característico. En la membrana celular normal, que es una bicapa lipídica, se presentan en rojo las fosfatidilserina, que están siempre en la cara citoplasmática, en cambio, cuando la célula entra en apoptosis inmediatamente se produce la traslocación de las fosfatidilserinas a la cara extracelular.

La anexina V, es una molécula similar a las moléculas adhesivas como la avidina,

biotina, etc. Por alguna razón se une específicamente, en forma muy potente a la molécula de fosfatidilserina, por la cara extracelular hidrófila. Entonces basta con que la célula presente fosfatidilserina en la cara externa para que la anexina V se una a ella y como es una proteína se puede identificar con un Ac anti- anexina V y un sistema detector (IHQ).

Es la imagen típica de la técnica de la anexina que usa fluorescencia, pero también

puede usar un cromógeno. Se ve que la célula (A) tiene una marcación verde en la membrana, por todo el contorno debido a que es una célula entera. En la segunda imagen (B) se ve la marcación verde de la anexina V por el contorno, pero además se ve una marca roja que corresponde a yoduro de propidio, que detecta DNA, por lo tanto indica que está pasando algo distinto de la apoptosis por la permeabilidad de la membrana, lo que posiblemente sea necrosis. Puede ocurrir en una misma célula necrosis y apoptosis simultaneamente. En C, se puede ver precisamente ambos procesos simultáneamente. En el caso de D, se observa todo marcado con yoduro de propidio, lo que indica que está sufriendo necrosis.

A B C D La otra ventaja que tiene es que permite la cuantificación de poblaciones en citómetro de flujo, como en el caso que a continuación se describe:

Donde se observa lo que no se tiñó, lo que se tiñó con anexina V y con yoduro de

propidio. Se puede cuantificar y decir la cantidad de células en apoptosis, necrosis y en ninguno de los dos procesos.

fig. 1

Existen distintos tipos de señales, generalmente señales externas que permiten la activación del proceso de apoptosis. Tal como el proceso de proliferación celular, el proceso de apoptosis es exquisitamente regulado, significa que existen muchos elementos reguladores, la célula no prolifera en cualquier momento y por cualquier cosa, sino que en condiciones muy precisas se le permite proliferar porque es peligroso para el organismo, peligroso para la población celular. Esto depende de las condiciones del medio, de la economía del sistema. Si la proliferación se desata se pueden perpetuar mutaciones y esas mutaciones pueden llevar a neoplasias que finalmente van a terminar con la vida del individuo. En el caso de la apoptosis, como se trata de eliminar células, también se puede tener el fenómeno contrario, si la apoptosis se desatara tendríamos una muerte sin control de elementos importantes con perdida de funciones. Pero eso no ocurre porque son procesos finamente regulados. Hasta ahora no se conoce alguna patología donde ocurra una hiper apoptosis, pero si puede ocurrir la eliminación de poblaciones celulares completas como en el caso de elementos linfoides que fueron útiles en un proceso determinado que ya finalizó. Cualquiera de estas señales externa, generalmente provenientes de otras células van a producir un estímulo con la consiguiente transducción de señal. Desde estimulantes específicos, como el TNF, ligandos de Fas, proteínas de apoptosis, hasta inespecíficos como la luz UV, que es capas de producir necrosis por una parte y también apoptosis. El estímulo actúa sobre un elemento sensor como un receptor que produce la transducción de la señal. Los sensores participan en el método de detección de apoptosis. Existen diversos sensores, se considera como sensor a la molécula receptora y a los participantes del proceso del transducción de señal. Los adaptadores de la señal, a veces hay señales que son parecidas a otras, señales de estímulo de crecimiento, señales de estímulo de diferenciación, pero quienes adaptan la señal al proceso apoptótico son los adaptadores, por ejemplo la activación del dominio de apoptosis. Una vez que la señal ha sido adaptada el proceso de inicia, se inicia con los eventos propios de la vía de la apoptosis, uno de ellos es el clivaje de las caspasas o de los sustratos, uno de los primeros iniciadores en ese aspecto es la caspasa 8 que inicia una serie de eventos moleculares, generalmente fosforilaciones, desfosforilaciones, clivajes en proteínas, para llevar a elementos efectores, como por ejemplo la caspasa 3, que participaría en la activación de las nucleasas de DNA, finalmente tendremos un resultado, que es la fragmentación del DNA, un núcleo desensamblado.

FAMILIA Bax NOMBRE FUNCIÓN

Bad Promotor Bik Promotor Bid Promotor Blk Promotor Hrk Promotor

BNIP – 3 Promotor BimL Promotor Bok Promotor Bak Promotor Bax Promotor

EGL- 1 Promotor

Se presenta los componentes de la familia Bax, todos ellos son promotores de la apoptosis y pueden ser identificados con IHQ.

Las conclusiones que se pueden obtener de esto son relativas al entorno y a una serie de cosas, porque no es suficiente decir que una células está en apoptosis porque hay Bax presentes, depende de otros factores también.

Si se tiene por ejemplo, un cultivo celular que normalmente no presenta Bax, pero si se pone en el cultivo un estimulante conocido de apoptosis y aparecen Bax en las células, se tiene un elemento para medir con IHQ que las células están en apoptosis.

Anexina V Permite detectar células en procesos tempranos o medios de apoptosis, en comparación con el proceso de fragmentación del DNA detectable con TUNEL, pero tiene la desventaja que sólo se puede usar con células viva porque requiere integridad de la membrana citoplasma y al fijarla se pierde. Cuando la célula inicia la apoptosis se da un fenómeno en la membrana celular que es característico. En la membrana celular normal, que es una bicapa lipídica, se presentan en rojo las fosfatidilserina, que están siempre en la cara citoplasmática, en cambio, cuando la célula entra en apoptosis inmediatamente se produce la traslocación de las fosfatidilserinas a la cara extracelular.

La anexina V, es una molécula similar a las moléculas adhesivas como la avidina, biotina, etc. Por alguna razón se une específicamente, en forma muy potente a la molécula de fosfatidilserina, por la cara extracelular hidrófila. Entonces basta con que la célula presente fosfatidilserina en la cara externa para que la anexina V se una a ella y como es una proteína se puede identificar con un Ac anti- anexina V y un sistema detector (IHQ).

Es la imagen típica de la técnica de la anexina que usa fluorescencia, pero también

puede usar un cromógeno. Se ve que la célula (A) tiene una marcación verde en la membrana, por todo el contorno debido a que es una célula entera. En la segunda imagen (B) se ve la marcación verde de la anexina V por el contorno, pero además se ve una marca roja que corresponde a yoduro de propidio, que detecta DNA, por lo tanto indica que está pasando algo distinto de la apoptosis por la permeabilidad de la membrana, lo que posiblemente sea necrosis. Puede ocurrir en una misma célula necrosis y apoptosis simultaneamente. En C, se puede ver precisamente ambos procesos simultáneamente. En el caso de D, se observa todo marcado con yoduro de propidio, lo que indica que está sufriendo necrosis.

A B C D La otra ventaja que tiene es que permite la cuantificación de poblaciones en citómetro de flujo, como en el caso que a continuación se describe:

Donde se observa lo que no se tiñó, lo que se tiñó con anexina V y con yoduro de propidio. Se puede cuantificar y decir la cantidad de células en apoptosis, necrosis y en ninguno de los dos procesos.

Cuantificación de DNA Esteban Órdenes 1

Técnicas de Cuantificación de DNA Citometría, Citofluorormetría, Citometría de Flujo

Prof. Gamaliel E. Órdenes

Viernes 06 de Septiembre de 2002 La mayor parte de las técnicas de HQ son cualitativas, algunas semicuantitativas y nos permiten hacer estudios semicuantitativos, y otras, excepcionales, nos permiten realizar reacciones cuantificables. La determinación cuantitativa también tiene sus limitaciones pues las cuantificaciones son relativas, aunque prestan una gran utilidad. Es interesante cuantificar el DNA pues precisamente durante el estudio de procesos celulares funcionales tan importantes como el ciclo celular se producen variaciones en la cantidad de DNA, que pueden analizarse gracias a técnicas como la reacción de Feulgen, que permiten comparar células con distintas cantidades de DNA. Nos referimos a la cuantificación del DNA en el sentido de determinar cuántos picogramos de DNA hay, lo que podría establecerse, pero el interés fundamental de estas técnicas es el establecimiento de cuantificaciones relativas a una cantidad conocida. Un ejemplo de ello es cuando conocemos la cantidad de DNA presente en células de una especie determinada en G1 y la comparamos con células que están en la misma etapa del ciclo, en cuyo caso se determinan las cantidades en relación con G1.

Figura 1: Microdensitómetro

Las técnicas se relacionan con la citometría de imágenes o estática (no de flujo) que emplea colorantes cromógenos como el Feulgen no fluorescente, la citofluorometría que utiliza fluoróforos, y la citometría de flujo, que también utiliza siempre fluoróforos. Los sistemas de citometría de imágenes se iniciaron con el empleo de microscopios a los que se asociaba un sistema detector de luz, como una celda fotoeléctrica, sistema que tiene una membrana o un elemento fotosensible y que al incidir fotones (luz) sobre este se generan cambios a nivel de electrones produciéndose una corriente eléctrica que genera una diferencia de potencial que resulta en un voltaje determinado medible y dependiente de la cantidad de luz, mientras más luz incida sobre la placa mayor será la diferencia de potencial. La celda fotoeléctrica o un fotómetro es capaz de captar la luz que pasó por el sistema óptico y llevarla a un voltímetro. Se puede medir la luz emitida, en el caso de un elemento fluorescente, o la luz transmitida o retenida, en el caso de un elemento opaco; debe entonces decidirse el tipo de medición a realizar. El sistema consta de un microscopio, la celda fotoeléctrica y un computador que tiene un programa capaz de captar la señal eléctrica proveniente de la celda y procesarla, analizarla, e incluso amplificarla si es necesario, obteniendo un gráfico final (figura 1). Se deben medir un mínimo de 200 células para realizar un análisis estadístico a partir del cual realizar un histograma: densidad óptica v/s número de células, operaciones que en la actualidad se realizan mediante programas estadísticos. Al seleccionar el operador las células a cuantificar existen ventajas y desventajas, pues deliberadamente se podría medir una célula que no corresponde, alterando los datos, o también ocurriría esto al seleccionar las células a medir y no medir en forma aleatoria la población celular. Cuando se eligen las células a medir, también se podrían descartar todas las células muertas presentes, pero que no debiesen estar; cuando el análisis es hecho mediante máquinas, sin intervención de operadores humanos, se hace la lectura de todos los tipos celulares presentes alterando los resultados. Otro ejemplo corresponde a la medición de células tumorales, separándolas de células normales, caso en que se puede realizar la separación de ambas poblaciones antes de la medición en el citómetro de flujo, utilizando un aparato de “cell sorting”, que permite separar físicamente las poblaciones, o bien realizar una selección a través de un software.

Cuantificación de DNA Esteban Órdenes 2

Citómetro de Flujo: La citometría de flujo se ha desarrollado principalmente en hematología. Permite utilizar el material histológico mediante un procesamiento adecuado relativamente simple (figura 2):

Se toman cortes de parafina gruesos (50 µm) y se ponen dentro de un tubo de ensayo con xilol para desparafinar, posteriormente se hidrata en una batería de etanol a concentraciones decrecientes hasta llegar a buffer. Luego se desmenuza mecánicamente en trocitos pequeños y se trata con una enzima proteolítica como papaína, tripsina u otra para lograr obtener una suspensión celular. Que se trata incluso con RNAasas para eliminar el RNA evitando su tinción, y luego se tiñen las células con yoduro de propidio, se obtiene una suspensión celular de un tejido incluido en parafina lista para pasar por el citómetro. Este procedimiento se ha utilizado con fines pronósticos en algunos cánceres como el prostático. Fundamentos: La citometría se relaciona con un cuerpo opaco.

Cuantificación de DNA Esteban Órdenes 1

Técnicas de Cuantificación de DNA Citometría, Citofluorormetría, Citometría de Flujo

Prof. Gamaliel E. Órdenes

Viernes 06 de Septiembre de 2002 La mayor parte de las técnicas de HQ son cualitativas, algunas semicuantitativas y nos permiten hacer estudios semicuantitativos, y otras, excepcionales, nos permiten realizar reacciones cuantificables. La determinación cuantitativa también tiene sus limitaciones pues las cuantificaciones son relativas, aunque prestan una gran utilidad. Es interesante cuantificar el DNA pues precisamente durante el estudio de procesos celulares funcionales tan importantes como el ciclo celular se producen variaciones en la cantidad de DNA, que pueden analizarse gracias a técnicas como la reacción de Feulgen, que permiten comparar células con distintas cantidades de DNA. Nos referimos a la cuantificación del DNA en el sentido de determinar cuántos picogramos de DNA hay, lo que podría establecerse, pero el interés fundamental de estas técnicas es el establecimiento de cuantificaciones relativas a una cantidad conocida. Un ejemplo de ello es cuando conocemos la cantidad de DNA presente en células de una especie determinada en G1 y la comparamos con células que están en la misma etapa del ciclo, en cuyo caso se determinan las cantidades en relación con G1.

Figura 1: Microdensitómetro

Las técnicas se relacionan con la citometría de imágenes o estática (no de flujo) que emplea colorantes cromógenos como el Feulgen no fluorescente, la citofluorometría que utiliza fluoróforos, y la citometría de flujo, que también utiliza siempre fluoróforos. Los sistemas de citometría de imágenes se iniciaron con el empleo de microscopios a los que se asociaba un sistema detector de luz, como una celda fotoeléctrica, sistema que tiene una membrana o un elemento fotosensible y que al incidir fotones (luz) sobre este se generan cambios a nivel de electrones produciéndose una corriente eléctrica que genera una diferencia de potencial que resulta en un voltaje determinado medible y dependiente de la cantidad de luz, mientras más luz incida sobre la placa mayor será la diferencia de potencial. La celda fotoeléctrica o un fotómetro es capaz de captar la luz que pasó por el sistema óptico y llevarla a un voltímetro. Se puede medir la luz emitida, en el caso de un elemento fluorescente, o la luz transmitida o retenida, en el caso de un elemento opaco; debe entonces decidirse el tipo de medición a realizar. El sistema consta de un microscopio, la celda fotoeléctrica y un computador que tiene un programa capaz de captar la señal eléctrica proveniente de la celda y procesarla, analizarla, e incluso amplificarla si es necesario, obteniendo un gráfico final (figura 1). Se deben medir un mínimo de 200 células para realizar un análisis estadístico a partir del cual realizar un histograma: densidad óptica v/s número de células, operaciones que en la actualidad se realizan mediante programas estadísticos. Al seleccionar el operador las células a cuantificar existen ventajas y desventajas, pues deliberadamente se podría medir una célula que no corresponde, alterando los datos, o también ocurriría esto al seleccionar las células a medir y no medir en forma aleatoria la población celular. Cuando se eligen las células a medir, también se podrían descartar todas las células muertas presentes, pero que no debiesen estar; cuando el análisis es hecho mediante máquinas, sin intervención de operadores humanos, se hace la lectura de todos los tipos celulares presentes alterando los resultados. Otro ejemplo corresponde a la medición de células tumorales, separándolas de células normales, caso en que se puede realizar la separación de ambas poblaciones antes de la medición en el citómetro de flujo, utilizando un aparato de “cell sorting”, que permite separar físicamente las poblaciones, o bien realizar una selección a través de un software.

Cuantificación de DNA Esteban Órdenes 2

Citómetro de Flujo: La citometría de flujo se ha desarrollado principalmente en hematología. Permite utilizar el material histológico mediante un procesamiento adecuado relativamente simple (figura 2):

Se toman cortes de parafina gruesos (50 µm) y se ponen dentro de un tubo de ensayo con xilol para desparafinar, posteriormente se hidrata en una batería de etanol a concentraciones decrecientes hasta llegar a buffer. Luego se desmenuza mecánicamente en trocitos pequeños y se trata con una enzima proteolítica como papaína, tripsina u otra para lograr obtener una suspensión celular. Que se trata incluso con RNAasas para eliminar el RNA evitando su tinción, y luego se tiñen las células con yoduro de propidio, se obtiene una suspensión celular de un tejido incluido en parafina lista para pasar por el citómetro. Este procedimiento se ha utilizado con fines pronósticos en algunos cánceres como el prostático. Fundamentos: La citometría se relaciona con un cuerpo opaco.

TÉCNICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DE APOPTÓSIS IN SITU

Gamaliel E. Ordenes 13 de Septiembre de 2002

Apoptosis: Es una forma de muerte celular cuyo objetivo es eliminar las células del huésped que ya no son necesarias a través de la activación de una serie coordinada y programada de acontecimientos internos, que se inicia por un grupo de productos génicos cuya función específica es precisamente ésta. Es responsable de numerosas respuestas fisiológicas, adaptativas y patológicas. Se puede observa en los siguientes contextos generales: 1) durante el desarrollo. 2) como mecanismo homeostático para el mantenimiento de las poblaciones celulares en los tejidos. 3) como mecanismo de defensa en las reacciones inmunitarias. 4) cuando las células son afectadas por enfermedad o por agentes lesivos. 5) en el envejecimiento. La connotación biológica que tiene este proceso es fundamental, sobre todo en las primeras etapas de la vida, como en la formación de los dedos de la mano referido a la desaparición de las membranas interdigitales. Durante el desarrollo embrionario, toda la morfogénesis tiene que ver con procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis, esto es lo que nos modela. Durante la apoptosis ocurren eventos tempranos, que si miramos la células, morfológicamente no presentan cambio alguno, pero los eventos tardíos sí reflejan cambios morfológicos que se pueden ver incluso con H-E: cuerpos apoptóticos, eliminados por células vecinas no macrofágicas. El esquema que a continuación se presenta (fig. 1), trata de explicar los mecanismos que controlan el proceso. Desde una señal externa a una interna como es la unión de un ligando al receptor de Fas, que desata una cascada de eventos hasta llegar a un fenómeno irreversible y definitivo que es la fragmentación del DNA. En el intertanto ocurren muchas otras cosas, algunas son reversibles y otros irreversibles. Existen ciertos puntos críticos de los cuales ya no hay vuelta. El proceso es extremadamente complejo y el esquema que se muestra es una simplificación.

La unión de una molécula a un receptor externo produce la transducción de la señal que activa moléculas como el Fas, que a su vez, al ser activado permite la activación de ciertos dominios que llevan a apoptosis. Esta molécula activada, a su vez va a ser capas de activar, de clivar a las enzimas caspasas, produciendo una cascada de caspasas clivadas y activadas. Estas a su vez van a desactivar una serie de otras proteínas, como por ejemplo el desmontaje de las proteínas nucleares lámina, estas proteínas son las que permiten la mantención de la estructura de la envoltura nuclear. Uno de los procesos que ocurre cuando se desensambla el núcleo es el desmontaje de las proteínas lámina, que produce el desensamblaje de la doble envoltura nuclear. Estas proteínas también son blanco del final de la cascada de las caspasas, al igual que otras proteínas, como la activación de las nucleasas específicas de la apoptosis que van a fragmentar el DNA.

fig. 1

Existen distintos tipos de señales, generalmente señales externas que permiten la activación del proceso de apoptosis. Tal como el proceso de proliferación celular, el proceso de apoptosis es exquisitamente regulado, significa que existen muchos elementos reguladores, la célula no prolifera en cualquier momento y por cualquier cosa, sino que en condiciones muy precisas se le permite proliferar porque es peligroso para el organismo, peligroso para la población celular. Esto depende de las condiciones del medio, de la economía del sistema. Si la proliferación se desata se pueden perpetuar mutaciones y esas mutaciones pueden llevar a neoplasias que finalmente van a terminar con la vida del individuo. En el caso de la apoptosis, como se trata de eliminar células, también se puede tener el fenómeno contrario, si la apoptosis se desatara tendríamos una muerte sin control de elementos importantes con perdida de funciones. Pero eso no ocurre porque son procesos finamente regulados. Hasta ahora no se conoce alguna patología donde ocurra una hiper apoptosis, pero si puede ocurrir la eliminación de poblaciones celulares completas como en el caso de elementos linfoides que fueron útiles en un proceso determinado que ya finalizó. Cualquiera de estas señales externa, generalmente provenientes de otras células van a producir un estímulo con la consiguiente transducción de señal. Desde estimulantes específicos, como el TNF, ligandos de Fas, proteínas de apoptosis, hasta inespecíficos como la luz UV, que es capas de producir necrosis por una parte y también apoptosis. El estímulo actúa sobre un elemento sensor como un receptor que produce la transducción de la señal. Los sensores participan en el método de detección de apoptosis. Existen diversos sensores, se considera como sensor a la molécula receptora y a los participantes del proceso del transducción de señal. Los adaptadores de la señal, a veces hay señales que son parecidas a otras, señales de estímulo de crecimiento, señales de estímulo de diferenciación, pero quienes adaptan la señal al proceso apoptótico son los adaptadores, por ejemplo la activación del dominio de apoptosis. Una vez que la señal ha sido adaptada el proceso de inicia, se inicia con los eventos propios de la vía de la apoptosis, uno de ellos es el clivaje de las caspasas o de los sustratos, uno de los primeros iniciadores en ese aspecto es la caspasa 8 que inicia una serie de eventos moleculares, generalmente fosforilaciones, desfosforilaciones, clivajes en proteínas, para llevar a elementos efectores, como por ejemplo la caspasa 3, que participaría en la activación de las nucleasas de DNA, finalmente tendremos un resultado, que es la fragmentación del DNA, un núcleo desensamblado.

FAMILIA Bax NOMBRE FUNCIÓN

Bad Promotor

Bik Promotor Bid Promotor Blk Promotor Hrk Promotor

BNIP – 3 Promotor BimL Promotor Bok Promotor Bak Promotor Bax Promotor

EGL- 1 Promotor

Se presenta los componentes de la familia Bax, todos ellos son promotores de la apoptosis y pueden ser identificados con IHQ.

Las conclusiones que se pueden obtener de esto son relativas al entorno y a una serie de cosas, porque no es suficiente decir que una células está en apoptosis porque hay Bax presentes, depende de otros factores también.

Si se tiene por ejemplo, un cultivo celular que normalmente no presenta Bax, pero si se pone en el cultivo un estimulante conocido de apoptosis y aparecen Bax en las células, se tiene un elemento para medir con IHQ que las células están en apoptosis.

Anexina V Permite detectar células en procesos tempranos o medios de apoptosis, en comparación con el proceso de fragmentación del DNA detectable con TUNEL, pero tiene la desventaja que sólo se puede usar con células viva porque requiere integridad de la membrana citoplasma y al fijarla se pierde. Cuando la célula inicia la apoptosis se da un fenómeno en la membrana celular que es característico. En la membrana celular normal, que es una bicapa lipídica, se presentan en rojo las fosfatidilserina, que están siempre en la cara citoplasmática, en cambio, cuando la célula entra en apoptosis inmediatamente se produce la traslocación de las fosfatidilserinas a la cara extracelular.

La anexina V, es una molécula similar a las moléculas adhesivas como la avidina,

biotina, etc. Por alguna razón se une específicamente, en forma muy potente a la molécula de fosfatidilserina, por la cara extracelular hidrófila. Entonces basta con que la célula presente fosfatidilserina en la cara externa para que la anexina V se una a ella y como es una proteína se puede identificar con un Ac anti- anexina V y un sistema detector (IHQ).

Es la imagen típica de la técnica de la anexina que usa fluorescencia, pero también

puede usar un cromógeno. Se ve que la célula (A) tiene una marcación verde en la membrana, por todo el contorno debido a que es una célula entera. En la segunda imagen (B) se ve la marcación verde de la anexina V por el contorno, pero además se ve una marca roja que corresponde a yoduro de propidio, que detecta DNA, por lo tanto indica que está pasando algo distinto de la apoptosis por la permeabilidad de la membrana, lo que posiblemente sea necrosis. Puede ocurrir en una misma célula necrosis y apoptosis simultaneamente. En C, se puede ver precisamente ambos procesos simultáneamente. En el caso de D, se observa todo marcado con yoduro de propidio, lo que indica que está sufriendo necrosis.

A B C D La otra ventaja que tiene es que permite la cuantificación de poblaciones en citómetro de flujo, como en el caso que a continuación se describe:

Donde se observa lo que no se tiñó, lo que se tiñó con anexina V y con yoduro de

propidio. Se puede cuantificar y decir la cantidad de células en apoptosis, necrosis y en ninguno de los dos procesos.

UTILIZACIÓN DE PRECURSORES DE DNA PARA DETERMINACIÓN DE FRACCIONES PROLIFERATIVAS EN

POBLACIONES CELULARES

Gamaliel E. Ordenes 6 de Septiembre de 2002

Para realizar identificación de proteínas, se utilizan precursores de estas moléculas. Lo que se

utiliza generalmente es S marcado porque tienen enlaces disulfuro y permite hacer seguimiento, en cambio no sirve usar un amino ácido determinado porque casi todas las proteínas poseen. Para el DNA se utiliza la timidina o su homólogo. El objetivo de la utilización de precursores es establecer la fracción de células que están en la fase de síntesis del DNA durante el tiempo de administración del precursor.

El problema es que tenemos tejidos, células o poblaciones celulares que están transcurriendo en forma asincrónica y se quiere saber cuántas están ciclando, algunas células pueden estar en reposo proliferativo o ciclando. Una manera certera de saber si están dentro del ciclo es saber si están sintetizando DNA. El objetivo de esta técnica es establecer la fracción de células en fase de síntesis de DNA, no se trata de establecer la fracción proliferativa, qué es más complejo. La fracción proliferativa comprende todas las células que están en fase G1, S, G2 i M. Aquí sólo vamos a establecer aquellas células que están en S. Tipos de precursores del DNA utilizados como marcadores:

Radiactivos: - timidina tritiada. - Método de detección: autorradiografía.

No radiactivos: - bromodeoxiuridina (BrdU). - Método de detección: inmunohistoquímica. El método de detección para los precursores radiactivos es la autorradiografía. Es un método muy engorroso en que todo el material debe estar muy bien lavado y utilizarse exclusivamente en esta técnica, además tienen el inconveniente de ser radiactivo y para trabajar con material radiactivo el laboratorio debe contar con una licencia y contar con un lugar para eliminar los desechos (timidina: t 1/2 de 12 años; lo que quiere decir que en 12 años baja al 50%, aunque tiene una energía relativamente baja). Este método es largo y tedioso, demora 15 días o más para obtener resultados. Por la forma de la autorradiografía lo que se forman son granos sobre una emulsión fotográfica (baja resolución de la marca) Los métodos no radiactivos, que fueron inventados hace menos tiempo, tienen grandes ventajas. En el caso del método de la bromodeoxiuridina demora unas horas, es una marcación permanente, la resolución es buena ya que se forma una marca sobre la misma molécula. Formas de incorporación de precursores de DNA:

In vitro: Se puede trabajar con cultivos de células o tejidos o material de biopsias, en el caso de material de biopsia se puede incubar el tejido recién obtenido en una solución con bromodeoxiuridina, en medio de cultivo a 37 °C, hay otra técnica en que se incuba el tejido a alta PpO2 poniendo agua oxigenada. En el caso de los cultivos celulares se incorpora la bromodeoxiuridina en el medio de cultivo. La dosis es del orden de 1 mg. por 1 ml de BrdU, incluso existen algunas técnicas en que se microinyecta la BrdU al interior de las células.

In vivo: En los animales se administra intravascular, intraperitoneal o en el agua de beber. Se incorpora en mayor dosis por las barreras que tiene que traspasar.

En ocasiones de ha utilizado la BrdU junto a la fluodeoxiuridina, que actúa como competidor más activo con la timina en el pool intracelular. La célula fabrica su DNA con la BrdU que se le da porque está en exceso obligándola a usarla, y si además se le administra un competidor va a capturar mejor la que se le da que la del pool intracelular normal.

Pulsos: se llama pulso a la aplicación de un reactivo durante un tiempo determinado. El precursor se incorpora durante un período de tiempo predeterminado, dependiendo del tipo de estudio. Puede ser por 30 min., 60 min., 2 hrs., 24 hrs. El pulso estará en relación con la duración de la fase S, que se estima de 7 - 10 hrs. y con la cinética estimada de la población que se está estudiando. En general las células tienen un ciclo entre 25 - 30 hrs. Si se pretende estudiar síntesis de DNA en S.N., donde sabemos que prácticamente no hay células ciclando, están en reposo proliferativo, vamos a tener que poner días o meses para encontrar alguna; en cambio en la médula ósea o en el intestino va a bastar con una hora y ya va a haber marcación. También va a depender del objetivo del estudio, si se quiere saber cuántas células pasaron por S durante un ciclo celular completo, el pulso tendrá que tener por lo menos 24 horas. Pero si sólo se quiere ver cuál es la fracción proliferativa en un momento dado, llamado una ventana, se puede aplicar un pulso de 1 hora. Es cuantitativo en el sentido que se puede determinar porcentualmente las células, no en el sentido de la intensidad de la reacción, aunque si se pueden evaluar ciertas cosas. La idea es que el precursor se incorpore durante un tiempo determinado y esa va a ser nuestra ventana de observación. En la autorradiografía se ha incorporado brevemente un precursor al núcleo (azul) y este radionúcleo está emitiendo radiación particulada, estas partículas tienen una determinada energía cinética y son capaces de impactar sobre otras moléculas y desestabilizarlas. En la autorradiografía se cubre el material biológico con una emulsión (blanco) sensible a la radiación, en general esta condición la cumplen las emulsiones fotográficas. Entonces, se pone muy pegada a la célula una emulsión fotográfica que se seca y queda como una capa. Esta emulsión es sensible a la luz y a la radiación, no se ennegrece con la radiación, sino que se sensibiliza, cuando esto pasa, se debe revelar con un revelador fotográfico que lo que hace es reducir los granos de plata de la emulsión a plata metálica, además el revelado tiene un proceso de fijación con hiposulfito que saca toda la plata que no fue reducida a plata metálica, que no fue sensibilizada. De manera que se tiene en la zona impactada por la radiactividad gránulos negros y se verán sobre la célula, no exactamente dentro del núcleo, sino que encima.

Entonces los pasos que tiene la autorradiografía son:

incorporación del marcados. inmersión en emulsión fotográfica. exposición: que dura dependiendo de la emulsión, del marcador ,de la resolución de la técnica y de

la temperatura entre 1 semana y algunos meses. Es más rápido el tiempo de exposición a 4 °C que a temperatura ambiente. Para autorradiografía a nivel de M.E. demora entre 3 semanas y 1 1/2 mes de exposición a 4 °C.

revelado. Se puede realizar también una contra tinción.

La técnica de la autorrqadiografía, que no es muy recomendable por la radiación, ha aportado los grandes conocimientos respecto al ciclo celular y cinética del ciclo celular. La demostración de la BrdU incorporada comprende aplicar un Ac específico contra la BrdU y un sistema marcador. Aquí no hay emulsión y se ven las células directamente marcadas. Si tenemos una población de células en activa proliferación, supongamos un cultivo en su fase de crecimiento exponencial. Esto significa que si se siembran células a una baja densidad, con suero fetal, factores de crecimiento y todos los estimulantes, estas células por el hecho de haber sido sembradas a baja densidad, haber sido tritiadas previamente en otro cultivo, es un estimulo para proliferar. Entonces la curva de crecimiento va a ser así:

Supongamos que son células normales, no transformadas. Y luego, cuando se produce la confluencia, cuando se tocan unas con otras sufren una inhibición por contacto y la población celular tiende a estabilizarse en un plateau. En la fase de crecimiento exponencial hay mayor cantidad de proliferación. Si analizamos esas poblaciones en fase de crecimiento exponencial, las poblaciones son asincrónicas, es decir, no importa que todas hayan sido estimuladas en el mismo momento, no van todas en el misma etapa del ciclo, algunas van en S otras en G1, otras van partiendo, otras se quedaron en reposo, eso pasa especialmente en las poblaciones transformadas en cultivo y en condiciones in vivo, esto pasa con mayor frecuencia, son totalmente asincrónicas. En cultivo, con estrategias especiales se puede sincronizar poblaciones, pararlas en un determinado momento, juntarlas todas en una determinada etapa del ciclo con un factor de inhibición y luego levantar el bloqueo y partir, logrando poblaciones sincronizadas. Se entiende entonces que las poblaciones en crecimiento son asincrónicas. Entonces vamos a tener células que en un momento dado van a estar saliendo de S, están en G2 entrando a M, unas que están completamente en S, otras que están en G1 y a esa población que aun no ha entrado a S se le dará la BrdU, que será incorporada sólo en las células que están pasando por S. Si S dura 7 horas, el pulso debe ser proporcionalmente de 3 - 3 30 horas, sólo algunas células van a

incorporar la BrdU, si una célula está saliendo de S ya no va a incorporar. Esto se debe tomar muy en cuenta al hacer el análisis de resultados. Una célula que estaba en este punto cuando se dio el pulso alcanzó a incorporar poco lo mismo que una que venía de allá que alcanzó a estar poco rato mientras se

daba el pulso y otra en cambio, como estas dos, alcanzaron a incorporar un poco más, pero estas dos incorporaron todo lo que era posible incorporar durante las 330 horas. La ventana de observación corresponde al período de tiempo en que se agrega la BrdU. Las aplicaciones que tiene esto son numerosas, se pueden hacer estudios tanto de la fracción proliferativa, es decir determinar el porcentaje de células de la población en fase S:

Fracción “S” = porcentaje de células en fase S Podemos determinar utilizando estrategias especiales la duración del ciclo celular. Esto se puede hacer, sólo incorporando BrdU o timidina, estudiando el número de mitosis marcadas. Si se da en el punto O

un pulso, comienza el recuento de la siguiente manera: se tiene varias cápsulas de cultivo, se da el pulso y se saca una cápsula o un cubre objetos, se fijan y se procesan. Se hace lo mismo a los distintos tiempos seleccionados. Luego se observan y se cuenta el número de mitosis en cada una. La curva que se obtendrá será similar a la que se muestra arriba, donde pasa un tiempo (1 hora) en que no va a haber nada, luego empiezan a haber células positivas hasta llegar a un máximo, luego se estabilizan y finalmente empieza a bajar el número de células con mitosis marcadas. Pasa el tiempo, sigo sacando cápsulas y no se encuentra nada hasta que en un momento comienzan a aparecer nuevamente mitosis marcadas, se estabilizan y comienzan a bajar. Se debe tomar en cuenta que se trabaja con una población asincrónica. En el momento que se dio el pulso, las células que estaban entrando a S incorporaron la timidina tritiada y sus mitosis marcadas aparecieron después de un tiempo, son las primeras mitosis marcadas que se observan y las últimas mitosis marcadas que se observan corresponden a las mitosis de aquellas células que cuando se dio el pulso estaban saliendo de S. Entonces, el tiempo en que no hay mitosis marcadas corresponde a G2 y el plateau corresponde a S. Sabiendo que la mitosis dura habitualmente 1 hora, teniendo G2 y S, se puede calcular la duración de G1, que además es el tiempo más variable. Con sólo la autorradiografía y contando el número de mitosis marcadas se pudo determinar la duración del ciclo celular y de cada etapa. Análisis del ciclo celular- BrdU: Se puede hacer una serie de análisis del ciclo, incluso la BrdU se puede leer en un citómetro de flujo. La reacción de la BrdU no necesariamente tiene que ser con un cromógeno, si no que puede ser con fluorescencia, el marcador final puede ser fluoresceína. Los citómetros son capaces de leer la emisión de luz y leer muchas células, lo que es ventajoso pues al leer un mayor número de células, estos estudios estadísticos presentan menor error estándar. Al hacer un estudio con microscopia de imágenes de campo claro o de fluorescencia, se cuenta un número de células limitado, aproximadamente 100-200 células, y eso produce un error estadístico importante. Es posible en aparatos automáticos como los citómetros de flujo hacer recuentos de cientos de miles de células en mucho menos tiempo lo que baja el error estadístico, la diferencia está en que en los citómetros de flujo se tienen que usar células en suspensión, pero difícilmente es capaz de diferenciar células tumorales de las que no lo son.

Hay estudios compuestos, como el que se presenta, donde se utilizó BrdU con FITC v/s la marcación con yoduro de propidio. Usando los dos marcadores se puede obtener gráficos como este. Finalmente la citometría de flujo se reduce al análisis de gráficos.

En este gráfico se representa la intensidad de marcación con BrdU y con yoduro de propidio. Se ve que una célula en fase G1 tiene una cantidad de DNA marcado con yoduro de propidio con respecto a una célula en la fase G2 igual a la mitad, con una cantidad de DNA igual a 2c. Y el intervalo entre ambas será S. Se encuentra además que la incorporación de BrdU será en S y lo que es yoduro de propidio está fundamentalmente en G2. Podemos decir también que en G1 hay mayor cantidad de células que en G2. Si desde este gráfico aislamos los datos de yoduro de propidio, encontraríamos una curva así:

Partiendo de la base que se trabaja con una población celular normal, la mayor parte de las célula está en G1, una menor proporción está en G2/M y una cantidad menor aun está en S. Esta es la distribución habitual de las poblaciones cuando se mide intensidad de fluorescencia de acuerdo a la marcación del DNA. La incorporación de los marcadores por la célula es generalmente por pinocitosis, pues los marcadores están disueltos en líquidos. La incorporación del marcador se hace previo a la fijación. En los cortes el tejido está permeabilizado porque fue fijado y deshidratado, permitiendo que los anticuerpos penetren. En el caso de las células en cultivo (células enteras), si se fijan con un fijador no coagulante no hay penetración del Ac, entonces hay que permeabilizarlas, para lo que existen varias formas como con detergente o con etanol. Dependiendo de la forma de fijación, a veces, como en el caso de la tripsina requiere como forma de permeabilización cortar moléculas para permitir que el Ac pase o denaturar el DNA para permitir el paso hasta el DNA marcado.

HIDRATOS DE CARBONO, GENERALIDADES Los hidratos de carbono son compuestos orgánicos de origen biológico formados por carbono, hidrógeno y oxígeno. La importancia biológica de estos compuestos se encuentra en la formación del glucocalix, proteoglicanos en las membranas, hormonas y constitución de la lámina basal. Químicamente, los carbohidratos corresponden a polihidroxialdehidos o polihidroxiacetonas. Su origen se encuentra en las plantas como resultado de la fotosíntesis. Existen muchos tipos de hidratos de carbono, los que se clasifican principalmente según 1: • el número de unidades elementales que los constituyen: monosacáridos → glucosa,

manosa, fructosa, etc. ; oligosacáridos ( 2 o más monosacáridos) → lactosa, sacarosa, maltosa, etc. ; polisacáridos (muchos monosacáridos) →almidón, celulosa, glicógeno, etc.

• por el grupo funcional: aldosas→ glucosa, galactosa, arabinosa, etc. cetosas→ fructosa, etc. • por el número de átomos de carbono que constituyen el monosacárido: triosas, hexosas,

pentosas, heptosas, etc. Estas clasificaciones, que representan características estructurales de su molécula, serán de mucha utilidad para el posterior reconocimiento de los carbohidratos. Los carbohidratos se pueden encontrar en forma cíclica, ramificada o formando estructuras de mayor complejidad, uniéndose covalentemente a lípidos o a proteínas 1. Un ejemplo de estas moléculas son los mucopolisacáridos, los cuales están formados por dos unidades de monosacáridos modificados, asociados con proteínas. De esta manera, se encuentran las glicoproteínas (larga cadena proteica unida a numerosas oligosacáridos) y a los proteoglicanos (largas cadenas de polisacáridos unidos a un pequeño core proteico) cuyas unidades son los GAGs (ácido hilalurónico, condroitín sulfato y keratán sulfato). Los GAGs, están formados por ácidos urónicos y por acetilglucosamina, lo que le confiere propiedades químicas que influyen en las técnicas de su identificación, por ejemplo, ser PAS (-). Cualquier alteración en los carbohidratos, ya sea en su producción o en su estructura, se reflejará en una patología. De esta manera, se tienen cuadros como alteraciones enzimáticas, glomerulopatías, amiloidosis e incluso neoplasias, en donde es fundamental su detección para de esta manera clasificar a la neoplasia, ver su grado de malignidad e incluso, en el caso de metástasis, averiguar su procedencia. De este modo, se han desarrollado diversas técnicas que permiten la detección y reconocimiento de carbohidratos y de sus tipos. Es así que la técnica más general y más usada es el PAS para la detección de glicógeno, para la identificación de proteoglicanos se puede desarrollar el método de Alcian Blue (distintos pH para la identificación de distintos grupos químicos), metenamina de plata para la identificación de glicoproteínas de la lámina basal, método del rojo congo alcalino para la identificación del amiloide, etc. El presente informe tiene como objetivo el desarrollo de los métodos antes señalados, con el análisis respectivo de sus mecanismos de acción y la interpretación de sus resultados.

Método para la identificación de glicógeno: reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS)

Materiales y métodos Para la identificación de glicógeno mediante el método de PAS, se utilizaron trozos de hígado directamente sacados de un ratón. La fijación del hígado se realizó en fijador de Rossman durante 16-20 horas a 4º C. Posteriormente, se deshidrataron los tejidos en etanoles de escala ascendente, se colocaron en xilol como líquido intermediario (2 baños), y se incluyeron en paraplast. Se realizaron cortes de 4 µ en un micrótomo rotatorio. Se realizó la técnica de PAS indicada en guía Métodos de Histoquímica 2 pág. 39 con y sin tinción nuclear (tinción nuclear empleada fue hematoxilina de Mayer), PAS con digestión enzimática de amilasa salival (guía Métodos de Histoquímica 2 pág.40.) y H-E.

Mecanismo de acción Fijador de Rossman: los fijadores a base de alcohol, ácido pícrico y formalina son los más recomendados para la fijación del glicógeno y carbohidratos en general. Este es el caso del fijador de Rossman, ya que es a base de estos tres elementos. El alcohol precipita al glicógeno, dejándolo insoluble al agua. El ácido pícrico y la formalina fijan a las proteínas tanto las que están unidas al glicógeno como las que están en el resto de la célula. Importante es que al utilizar el fijador de Rossman, la perdida de glicógeno por solubilización en agua es mínima, por lo tanto, hay una mayor cantidad de glicógeno que se conserva en comparación con la utilización de otros fijadores (ej. Bouin, formaldehído). El fijador de Rossman es uno de los pocos fijadores que precipita al glicógeno en un medio soluble como el agua. También, el fijador de Rossman no dispersa el glicógeno, es decir, favorece su forma macromolecular y/o su unión a proteínas. Reacción de PAS: el ácido peryódico oxida selectivamente a los grupos OH unidos a átomos de carbono adyacentes. De esta manera, mediante fisión de enlaces carbono-carbono intermedios con producción de dos grupos aldehídos. Vale la pena mencionar, pese a que no es el momento, que éste es el paso que falla en los proteoglicanos, porque falla la oxidación de las formaciones glicol en C2-C3 en los ácidos urónicos. Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff formando un compuesto coloreado: el grupo aldehído reacciona con el metabisulfito, formando un compuesto bisulfito, el cual va reaccionar con el reactivo de Schiff. Entonces, el compuesto bisulfito va a perder un grupo hidroxilo y va a formar un nuevo compuesto estable llamado ácido amino alquil sulfónico derivado de la pararrosanilina. Digestión con amilasa: la amilasa es una enzima que degrada el glicógeno.

Resultados

Descripción hígado de ratón H-E. Se observan dos cortes de hígado de ratón, donde se aprecia la arquitectura normal del hígado: lobulillos hepáticos adjuntos a una vena central y al espacio porta. Los hepatocitos se ven de citoplasma muy granular, eosinófilo, disgregado, los núcleos son redondos, basófilos, cromatina granular y nucléolo prominente, algunos son binucleados. La morfología está medianamente conservada. Descripción hígado de ratón PAS con tinción nuclear, sin tinción nuclear y con digestión enzimática amilasa. Leyenda: + : reacción de intensidad leve. --- : reacción negativa ++: reacción de intensidad moderada. +++: reacción de intensidad fuerte. Nota: las sustancias PAS positivas presentan un color rojo púrpura, por lo que es éste color con el que se compara la reacción.

PAS sin tinción nuclear

PAS con tinción nuclear

PAS con digestión enzimática amilasa

Localización sustancia a identificar

Citoplasma de los hepatocitos

Citoplasma de los hepatocitos

Citoplasma de los hepatocitos

Comparación con control

Fucsia morado Morado fucsia Blanco. Existe una tonalidad muy suave de rosado

Intensidad reacción

+++ +++ ---

Especificidad reacción

Sí Sí no

Fracaso reacción y posibles causas

--- --- No hay reacción debido a que el glicógeno, que es la sustancia a identificar, fue degradado por la amilasa

Interpretación de los resultados En el hígado de ratón, al realizar la reacción de PAS resultó positivo. Sin embargo, para comprobar que la sustancia positiva era glicógeno, se realizó un control negativo utilizando digestión enzimática con amilasa, la cual va a degradar al glicógeno. Posteriormente se realizó otro PAS, el cual resultó negativo. En conclusión, la sustancia positiva era glicógeno, ya que, al ser degradado por la amilasa, el siguiente PAS realizado no tuvo con qué reaccionar y dio negativo.

Discusión

La utilización del fijador de Rossman dio excelentes resultados en

comparación con otros fijadores utilizados (Bouin). Efectivamente, otorgo una buena distribución del glicógeno en la célula conservando también su morfología. La cantidad de glicógeno en los hepatocitos que se ve con el fijador de Rossman es mayor que la cantidad de glicógeno que se ve con el fijador de Bouin (en donde se ve al glicógeno desplazado hacia un polo de la célula). El hecho de tener alcohol entre sus componentes hace necesario evitar las corrientes de difusión, para lo cual se guarda a 4ºC. ahora, todo esto es importante debido a los distintos tipos de glicógeno que existen ( glicógeno fácil de fijar, asociado fuertemente a proteínas, cuya estructura es más grande, se encuentra en mayor cantidad en el hígado; y el glicógeno difícil de fijar, poco asociado a proteínas, de estructura más pequeña y soluble). La presencia de glicógeno en la célula se determinó realizando el método de PAS y se comprobó realizando digestión enzimática con amilasa. Esto es de gran importancia, ya que se ha descrito en la literatura que la reacción de PAS no es específica, está sujeta a dar positiva con no solo los grupos aldehídos del glicógeno, sino que con otros grupos aldehídos formados en la célula. Por lo tanto, la realización de un control es fundamental para asegurar que lo positivo es glicógeno.

Método para la identificación de glicoproteínas de la lámina basal:

metenamina de plata.

Materiales y métodos

Para la realización de esta técnica, se emplearon trozos de cuello uterino humano, los que habían sido fijados en formalina. Estos tejidos se deshidrataron en una escala ascendente de etanoles, se colocaron en xilol como líquido intermediario (2 baños), y se incluyeron en paraplast. Se realizaron cortes de 4 µ en un micrótomo rotatorio. La técnica realizada a continuación es la señalada en guía Métodos de Histoquímica 2 pág.53-54 con y sin tinción nuclear (tinción nuclear empleada fue hematoxilina de Mayer). También se realizó PAS con tinción nuclear y sin tinción nuclear y H-E. Se realizó un control de la técnica de metenamina de plata utilizando riñón de ratón fijado en Bouin.

Mecanismo de acción El ácido peryódico oxida selectivamente a los grupos OH unidos a átomos de carbono adyacentes. De esta manera, mediante fisión de enlaces carbono-carbono intermedios con producción de dos grupos aldehídos. Así, al haber aldehídos libres, la plata interactua con estos grupos reduciendose a plata metálica. El mecanismo de acción del método de PAS puede leerse en método de identificación del glicógeno.

Resultados

Descripción cuello uterino humano H-E. Corte histológico de útero, donde se advierte la unión escamo columnar, quistes de Naboth, arriba de ellos hay un gran infiltrado inflamatorio. El epitelio del exocervix tiene una marcada acantosis y paraqueratosis. El endocervix tiene largas zonas de epitelio cubico simple, pero en zonas se ven nidos celulares cuyas células son globosas, citoplasma claro, núcleo redondo basófilo claro, nucléolo prominente, hay núcleos alargados muy basófilos cuya cromatina está condensada. Otros núcleos son pequeños, basófilos, cromatina descondensada. Todos estos últimos se encuentran en la misma zona de las células globosas. Descripción cuello uterino humano metenamina de plata con tinción nuclear y sin tinción nuclear (descripción PAS ver método de identificación de glicoproteínas). Leyenda: ver método de identificación del glicógeno; reacción de PAS.

Metenamina de plata sin tinción nuclear

Metenamina de plata con tinción nuclear

Localización sustancia a identificar

Lamina basal de epitelios de revestimiento y glandulares (endo y exocervix).

Lamina basal de epitelios de revestimiento y glandulares (endo y exocervix).

Comparación con control

Gris oscuro Gris oscuro

Intensidad reacción

+ +

Especificidad reacción

sí, aunque hay otras estructuras impregnadas en el tejido.

sí, aunque hay otras estructuras impregnadas en el tejido.

Fracaso reacción y posibles causas

----

----

Interpretación de los resultados

El cuello uterino humano presenta una suave lamina basal, la que se observa levemente en el corte. Para descartar que la baja “intensidad” de la reacción se debió a fallas técnicas con la solución de metenamina, se realizó conjuntamente con la impregnación del cervix, una impregnación de riñón de ratón, el cual sí presentó una gran impregnación de su lamina basal. Por lo tanto, la suavidad de la lamina basal que se observó en el cervix, se debe a que éste tejido presenta menos cantidad de glicoproteínas en su lamina basal en comparación con el riñón. Esto es debido a las diferentes funciones que realizan ambos tejidos, por lo que van a necesitar distintas magnitudes de lamina basal.

Discusión El significado que tiene en patología la identificación de la membrana basal en los tejidos es muy grande, sobre todo en patologías como la glomerulonefritis. La realización de técnicas como la metenamina de plata es muy útil para la identificación de laminas basales mediante la identificación de glicoproteínas asociadas a esta estructura. La lamina basal y, por lo tanto sus constituyentes (entre ellos las glicoproteínas), varían según el tejido de que se trate, ya sea por mayor aumento en su rol estructural, soporte, organizaciones, etc. Es importante que para la realización de esta técnica, el tejido conserve su reactividad para que de esta manera, reaccione otorgando grupos aldehídos al medio. De esta manera, hay que tener precaución en el tratamiento del tejido. Fundamental es la utilización de controles positivos en esta técnica, para asegurar el correcto resultado de la reacción. Cualquier alteración en la solución de metenamina puede provocar falsos positivos que perfectamente pueden ser detectados y evitados mediante el uso de controles.

Método de identificación de glicoproteínas: PAS

Materiales y métodos

En esta técnica se empleo cuello uterino humano fijado en formalina e incluido en paraplast. Los cortes que se realizaron fueron de 4µ. Los métodos realizados fueron PAS con tinción nuclear, sin tinción nuclear ( según lo indicado en en guía Métodos de Histoquímica 2 pág.39) y H-E.

Mecanismo de acción Las glicoproteínas tienen asociado azucares neutras como manosa y glucosa. Unidas a las proteínas hay monosacáridos que pueden ser glucosamina (PAS -) y galactosa (PAS +). Éstas están unidas a ácido siálico, el que tiene grupos hidroxilos vecinos capaces de formar aldehídos y, por lo tanto, dar PAS +. En resumen, las glicoproteínas son PAS + porque la galactosa y el ácido siálico tienen grupos OH, los que serán oxidados por el ácido peryódico. De esta manera, se generaran grupos aldehídos por fisión de enlaces carbono-carbono intermedios. Estos aldehídos reaccionan con el reactivo de Schiff formando un compuesto coloreado. Para más detalles ver método de identificación del glicógeno; reacción de PAS.

Resultados Descripción cuello uterino humano H-E. ver Método para la identificación de glicoproteínas de la lámina basal: metenamina de plata. Descripción útero humano PAS con tinción nuclear, sin tinción nuclear y con digestión enzimática amilasa. Leyenda: ver método de identificación del glicógeno; reacción de PAS.

PAS sin tinción nuclear

PAS con tinción nuclear

Localización sustancia a identificar

Citoplasma células cúbicas del endo y exocervix. Cornificación del epitelio del exocervix

Citoplasma células cúbicas del endo y exocervix. Cornificación del epitelio del exocervix

Comparación con control

No se realizó control. Aún así, la reacción dio color fucsia morado.

No se realizó control. Aún así, la reacción dio color morado fucsia.

Intensidad reacción

+++ +++

Especificidad reacción

Sí sí

Fracaso reacción y posibles causas

----

----

Interpretación de los resultados Las glicoproteínas se distribuyen en el citoplasma de las células, en la superficie de las membranas plasmáticas y en la lamina basal. Son estas zonas las que, pese a que no se ven en detalle, se ven rosadas fuertes, por lo tanto, resultaron ser PAS (+).

Discusión Una crítica del protocolo realizado en este método es la no utilización de un control negativo que me asegurara que la sustancia que dio PAS (+) fueron las glicoproteínas y no otras estructuras celulares. Esta técnica del PAS no es específica para glicoproteínas, por lo que se debe realizar un control. Ya que se esta identificando glicoproteínas, es fundamental la correcta elección del fijador: alcohol + ácido pícrico + formaldehído, para que las glicoproteínas se conserven bien y para que se oligosacárido unido no solubilice en el agua y que, por lo tanto, se precipite. También, la conservación del tejido es muy importante para el éxito de la reacción (buena conservación de su reactividad).

Método para la identificación de proteoglicanos: método del alcian

blue pH 2.5 y 1.0 .

Materiales y métodos Para la realización de esta técnica se utilizó cuello uterino humano, fijado en formalina e incluido en paraplast. Los cortes que se obtuvieron fueron de 4µ. Las técnicas realizadas son las indicadas en guía Métodos de Histoquímica 2, pág. 40-41 para alcian blue pH 2.5 (con y sin tinción nuclear) (tinción nuclear fue hematoxilina de Mayer), y página 41 para alcian blue pH 1.0 (con y sin tinción nuclear). Se realizó una metilación a 37º y 60ºC seguida de la realización de alcian blue pH 2.5, como se indica en guía Métodos de Histoquímica 2 pág.46 . También se realizó H-E.

Mecanismo de acción El alcian blue se une a grupos carboxilicos y sulfónicos del ácido siálico de los proteoglicanos. Debido a los distintos pK de estos grupos: pK carboxilo = 2.6 pK Sulfónico = 1.5 se puede realizar una identificación selectiva de estos grupos a distintos pH: pH 1 = se detecta grupo sulfónico pH 2.5 = se detecta grupo carboxilo y sulfónico. No se une a los ácidos nucleicos debido a su tamaño (muy grande para entrar en los surcos). Metilación: a 60ºC por esterificación de los grupos carboxilo y por hidrolización de los grupos sulfónicos, a esta temperatura quedan no reactivos los grupos carboxilo y desulfatados los sulfatos (no reactivos). A 37ºC se produce una esterificación de los grupos carboxilo dejando reactivos solamente los grupos sulfónicos.

Resultados Descripción cuello uterino humano H-E. ver Método para la identificación de glicoproteínas de la lámina basal: metenamina de plata. Descripción útero humano PAS con tinción nuclear, sin tinción nuclear y con digestión enzimática amilasa. Leyenda: ver método de identificación del glicógeno; reacción de PAS.

Alcian blue pH 2.5

Alcian blue pH 1.0

Alcian blue pH 2.5 metilación 37º C

Alcian blue pH 2.5 metilación 60º C

Localización sustancia a identificar

Citoplasma de células epiteliales. Secreciones glandulares

Citoplasma de células epiteliales. Secreciones glandulares

Citoplasma de células epiteliales. Secreciones glandulares

----

Comparación con control

Calipso calipso calipso ----

Intensidad reacción

+++ ++ + ----

Especificidad reacción

Sí sí sí ----

Fracaso reacción y posibles causas

----

----

----

Debido a la alta temperatura, los grupos carboxilo y sulfónico quedaron no reactivos, por lo que no hay reacción.

Interpretación de los resultados

Alcian blue a pH 2.5, ya sea con o sin tinción nuclear, muestra una gran zona calipso en el citoplasma de las células epiteliales y en las secreciones glandulares, que corresponde a proteoglicanos, específicamente a reacción de sus grupos carboxilo y sulfónico, ya que a éste pH, se detectan ambos grupos por su pK. Alcian blue a pH 1.0, ya sea con o sin tinción nuclear, muestra una menor zona calipso (en comparación con AB pH 2.5) en el citoplasma de las células epiteliales y en las secreciones glandulares. Esto sucede así porque a éste pH, se favorece la reactividad de los grupos sulfónicos de los proteoglicanos, debido a que su pK se asemeja más al pH (pK es de 1.5). los grupos carboxilo quedarían no reactivos a este pH, por lo que la reacción se produce sólo con los grupos sulfónicos, por esto es menor la intensidad. Con la metilación a 37ºC sucede esto mismo, ya que a esta temperatura se favorece sólo la reactividad de los grupos sulfónicos, debido a que los grupos carboxilo se han esterificado. Con la metilación a 60ºC no se ve nada ya que se ha perdido la reactividad de ambos grupos, por lo que no hay lugar a una reacción.

Discusión

La identificación de proteoglicanos es muy importante en el estudio de componentes de la lamina basal y el la identificación e interpretación de patologías como los adenocarcinomas. De esta manera, el diagnostico aumenta su eficiencia si se logra precisar en que grupos es más rico la patología.

Método para la identificación de amiloide: rojo congo alcalino y Rojo congo alcalino pretratado con permanganato de potasio

Materiales y método

Para esta técnica se utilizó un molde de corazón humano fijado en formalina. A este molde se realizaron cortes de 4µ. Las técnicas empleadas son las indicadas en guía Métodos de Histoquímica 2 pág. 49 para el rojo congo alcalino (con y sin tinción nuclear (hematoxilina de Mayer)), y página 50 para el método de rojo congo con pretratamiento de permanganato de potasio. También se realizo H-E. Se utilizó un control consistente en un trozo de bazo en el cual se sabía la presencia de amiloide.

Mecanismo de acción El método del rojo congo es una reacción selectiva porque: El rojo congo es un colorante de estructura lineal que por medio de puentes de hidrógeno se une a la fibrilla de amiloide. Esto se realiza gracias a la presencia de grupos OH en distancias determinadas y periódicas en la molécula del amiloide. La coloración que se obtiene es de color rojo ladrillo y, a microscopía de polarización es birrefringente. La estructura β plegada de la fibrilla de amiloide, en su mayor o menor expresión, determina la intensidad de la birrefringencia ( directamente proporcionales). El permanganato de potasio elimina la unión inespecífica favoreciendo sólo las uniones puentes de hidrógeno.

Resultados

Descripción de corazón humano H-E. En el corte de corazón se observa: epicardio, miocardio y pericardio. El epicardio se ve basófilo muy claro, núcleos basófilos ovalados. El epicardio está compuesto por varias capas de células (5 aproximadas), un poco separadas entre sí. El miocardio presenta dos zonas: una normal eosinófila, núcleos alargados basófilos, fibras separadas por artefacto de técnica (dificultad del corte). El otro sector está basófilo muy claro, fibras separadas (no por artefactos), sin núcleos. Hay un infiltrado celular entre las fibras. Esta zona corresponde a un infarto al miocardio y está cercana y seguida del endocardio. El pericardio se observa eosinófilo claro, normal, sin alteración. Descripción de corazón humano rojo congo alcalino, rojo congo alcalino pretratado con permanganato de potasio. Leyenda: ver método de identificación del glicógeno; reacción de PAS.

Rojo congo alcalino Rojo congo alcalino pretratado con permanganato de potasio

Localización sustancia a identificar

----

----

Comparación con control

Rojo ladrillo suave Rojo ladrillo suave

Intensidad reacción

---- ----

Especificidad reacción

---- ----

Fracaso reacción y posibles causas

No hubo reacción porque no hay amiloide en el tejido.

No hubo reacción porque no hay amiloide en el tejido.

Interpretación de los resultados En el corte de corazón humano no existen evidencias de amiloide, ya que al mirarse con polarización, ninguna sustancia dio birrefringencia. La posibilidad de que la reacción haya dado negativa por culpa de errores técnicos fue descartada parcialmente gracias al control positivo que se empleo (bazo), el cual fue procesado conjuntamente con el corazón. Parcialmente porque esta en duda su contenido de amiloide.

Discusión

La amiloidosis es una alteración compuesta principalmente por proteínas. Se ve como una sustancia hialina extracelular, agrupada principalmente en los vasos sanguíneos. Hay distintos orígenes del amiloide y, por lo tanto distintas proteínas amiloidogénicas, dentro de las cuales se destacan las AA y AL. Es aquí donde el permanganato de potasio juega un rol trascendental, ya que permite separar los tipos de amiloide del amiloide AA, ya que éste no se tiñe y, por lo tanto, no da la birrefringencia. Importante para el desarrollo de la técnica es la utilización de cortes de aproximadamente 8µ., ya que permite una mayor intensidad de la birrefringencia. Éste último elemento es fundamental en la identificación de amiloide, ya que la presencia de birrefringencia es el diagnóstico de amiloide. Para terminar la identificación de amiliode, se debiera realizar microscopía electrónica y técnicas de inmunohistoquímicas para lograr la identificación del componente amiloideo.. Es bueno tener presente que para obtener resultados óptimos, el amiloide se demuestra mejor por cortes por congelación, los moldes antiguos disminuyen la reactividad y que grandes depósitos de amiloide dan tinciones más suaves. El tiempo de fijación no altera los resultados. Como todo en histoquímica, es imprescindible la utilización de controles positivos que descarten los errores técnicos en los casos negativos, como lo que sucedió en este caso, en que el corazón no tenía amiloide y la posibilidad de errores técnicos fueron descartados gracias a la utilización de un tejido control (bazo) en el cual se analizara su contenido de amiloide el día de entrega de éste informe.

Glándula salival de ratón

Materiales y método

Se utilizó glándulas salivales de ratón, fijadas inmediatamente después de ser extraídas en fijador de Bouin. Se incluyeron en paraplast y se realizaron cortes de 4µ. Las técnicas que se realizaron fueron H-E, PAS (ver método de identificación del glicógeno) y alcian blue pH 2.5 (ver método de identificación de proteoglicanos).

Mecanismo de acción (ver método de identificación del glicógeno)

Resultados Descripción de glándulas salivales de ratón H-E. Corte histológico de glándulas salivales de ratón donde se aprecian, las glándulas submaxilar, sublingual y parótida. La submaxilar se encuentra en la parte superior izquierda del corte; ésta es una glándula mixta, de secreción mucosa y serosa. Las glándulas mucosas son levemente basófilas. El núcleo está desplazado a la parte basal, cromatina granular, nucléolo prominente. Las células cerosas son eosinófilas, citoplasma levemente granular, nucléolo redondo, basófilos, cromatina granular, nucléolo prominente. El núcleo está ubicado relativamente en el tercio inferior de la célula. Los conductos que se ven son contorneados y con gránulos, al igual que con los acinos, ambos tienen las células cubicas, eosinófilas, núcleo redondo basófilo central, cromatina granular. La glándula sublingual esta compuesta por grupos de células, cuyo citoplasma es claro, granular, levemente basófilo, núcleo desplazado a la base de la célula. Los acinos son redondos, lumen escaso, núcleo redondo central basófilo. Estas células están organizadas en grupos ovalados. Los conductos son más amplios que los de la submaxilar, pero de las mismas características celulares. La parótida, más pequeña, está al lado derecho de la glándula sublingual y bajo un ganglio. Las células presentan las mismas características que las células de la submaxilar (ambas son cerosas). Los acinos son alveolares y junto con los conductos, tienen las mismas características citológicas antes descritas. En el corte también se puede ver un ganglio.

Descripción de glándulas salivales de ratón con método de PAS y alcian blue pH 2.5.

PAS sin tinción nuclear

PAS con tinción nuclear

Alcian blue pH 2.5 sin tinción nuclear

Alcian blue pH 2.5 con tinción nuclear

Localización sustancia a identificar

Citoplasma de células de adenómeros mucosos (sublingual y submaxilar)

Citoplasma de células de adenómeros mucosos (sublingual y submaxilar)

Citoplasma de células de adenómeros mucosos (sublingual y submaxilar)

Citoplasma de células de adenómeros mucosos (sublingual y submaxilar)

Comparación con control

No se realizaron controles

No se realizaron controles

No se realizaron controles

No se realizaron controles

Intensidad reacción

++ sublingual +++ submaxilar

++ sublingual +++ submaxilar

++ sublingual +++ submaxilar

++ sublingual +++ submaxilar

Especificidad reacción

Sí Sí Sí Sí

Fracaso reacción y posibles causas

---- ---- ---- ----

Interpretación de los resultados Las células de las glándulas salivales de ratón muestran un gran contenido de glicógeno en su citoplasma, el cual se ve PAS (+).

Discusión Para mayor certeza de que la sustancia identificada fue glicógeno, se debió realizar un control negativo con digestión enzimática. La calidad de conservación y de precipitación del glicógeno con el fijador de Bouin es muy inferior a la calidad obtenida con el fijador de Rossman. En estos cortes, el glicógeno está más disperso y más desplazado hacia periferias celulares.

Bibliografía

-. 1 Varios Autores, Guía de seminarios de Química Orgánica, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, 1997, pág. 184-205. -. 2 Alliende C., Ordenes G., otros, Métodos de Histoquímica, Universidad de Chile, Facultad de Medicina, Escuela de Tecnología Médica, 2000, páginas 15-19; 24-26. -. Smitherman M. L., y otros, The effect of light microscopic fixatives on the retention of glycogen in protein matrices and the particulate state of native glycogen, The journal of Histochemistry and Citochemistry, 1972, pág. 463-471. -. Kiernan J.A., Histological & Histochemical Methods: Theory & Practice. Editorial Pergamon Press, 1981, 3ª edición, capítulo 11pág. 145-168; capítulo 10 pág. 128-129. -. Apuntes de clases: Glicoproteínas y proteoglicanos, Alliende C., 10/10/2000 Lamina basal, J. Gonzales, 13/10/00 Amiloide, aplicaciones del estudio de glúsidos en anatomía patológica, E. Ordenes, 18/10/00 Asignatura de Histoquímica,Carrera de Tecnología Médica. -. Cook H., Theory and practice of histological techniques, capítulo 11, pág. 180-216.

Identificación de glucoproteínas y proteoglicanos Las glicoproteínas tienen una parte proteica (14 – 60% de su peso) a la que se

encuentran unidas cadenas de oligosacáridos relativamente cortas, no más de 15 residuos de azucares de composición variable que generalmente termina en un ácido siálico seguido de una galactosa.

La parte proteica de las glicoproteínas es sintetizado en el RER, donde se le transfiere en bloque un oligosacárido proferido compuesto de 2 acetil-glucosamina, 9 manosa u 3 glucosas. Dado que este oligosacárido siempre es transferido al grupo NH2 de la cadena lateral de un residuo de asparragina se le denomina N-oligosacárido. En el RER se añade un mismo tipo de N-oligosacárido a muchas proteínas diferentes, este oligosacárido es posteriormente procesado en el Golgi donde pierden manosa y se les agrega galactosa o fucosa y ácido siálico en distinta proporción. Los N-oligosacáridos son los oligosacáridos más comunes que se encuentran en las glicoproteínas. Menos frecuentes son los oligosacáridos unidos al grupo de la cadena lateral de un residuo de serina treonina o de hidroxilisina. Estos O-oligosacáridos se forman en el complejo de Golgi.

Ejemplos de glicoproteínas: Proteínas de secreción tanto endocrinas como exocrinas reguladas o constitutivas las

que pueden contener glicoproteínas o proteoglicanos. Proteínas del glicocaliz celular. Glicoproteínas que forman parte de la membrana

plasmática. Glicoproteínas integrales de la membrana plasmática que presentan la parte glucídica hacia el exterior de la membrana plasmática para extraerlos hay que lavarlos con detergentes no iónicos, también existen en el glicocáliz, también existen proteoglicanos integrales de membrana y glicolípidos. Habitualmente el glicocaliz contiene a demás glicoproteínas y proteoglicanos que han sido secretados al espacio extracelular y que luego son absorbidos en la superficie celular.

Glicoproteínas de matriz extracelular. Laminina que forma parte de la lámina basal, fibronectina de matriz.

Proteínas del suero Antígenos A y B de glóbulos rojos Enzimas Proteínas de transporte Receptores Hormonas Proteínas estructurales proteoglicanos Tienen un centro proteico al igual que las glicoproteínas sintetizado en el RER al cual

se unen covalentemente largas cadenas no ramificadas de disacáridos llamadas glicosaminoglicanos (GAGs) se les denomina GAGs porque uno de los residuos del disacárido siempre es un azúcar aminada (N-acetilglucoamina y N-acetilgalactosamina). En la mayoría de los casos este amino azúcar se encuentra sulfatado siendo el segundo residuo un ácido urónico (glucurónico, idurónico). Debido a la presencia de grupos

sulfatos o carboxilo en la mayoría de los residuos glicoides presentan una gran carga negativa.

En función de dichos residuos glucídicos, el tipo de enlace entre ellos y el núcleo y localización de los grupos sulfatos se pueden distinguir 4 grupos principales de GAGs:

1. Ácido hialurónico 2. Condroitin sulfato y dermatán sulfato 3. Heparán sulfato y heparina 4. Queratan sulfato

Ácido hialurónico

Enlace β (1-3). Existe en varios en varios estados de polimerización. Cordón umbilical, humor vitreo, líquido sinovial.

Condroitín sulfato 4 y 6

Cartílago, cornea, pared vasos sanguineos, condrosarcomas.

Dermatán sulfato Mucosa gástrica, tejido conectivo, piel, vasos sanguineos

Heparina Mastocitos, hígado, pulmón

Keratán sulfato Cartílago, cornea, disco intervertebral El componente central del proteoglican del cartílago y matriz extracelular es una larga

molécula de ácido hialurónico, unido a el cada 40nm de intervalo están las moléculas de agregacan, el que tiene un centro proteico que por su dominio amino teminal se une a un disacárido del ácido hialurónico central con alta afinidad, la unión es facilitada por una proteína de unión la cual se une al ácido hialurónico y al centro proteico del agregacan. Al centro proteico de cada agregacan se unen 30 cadenas cortas de keratán sulfato y 17 cadenas más largas de condroitin sulfato.

Fijación

En la fijación de los carbohidratos debemos considerar su estructura molecular y grado

de polimerización, unión a proteínas y tratamiento que sufrirá el tejido en la coloración a utilizar.

Se han obtenido buenos resultados con mezclas fijadoras que contienen alcohol, formol y ácido pícrico Ej. Bouin alcohólico, Gendre, Rossman. También da buenos resultados formol alcohol a 4ºC.

Formol acetato de sodio al 2% conserva bien glicoproteínas y proteoglicanos pero la conservación de la morfología no es tan buena.

Para la fijación de frotis se utiliza metanol. Cuando se trata de identificar glúcidos débilmente unidos a proteínas los fijadores

antes mencionados no dan buenos resultados. Para estabilizarlos se utiliza fijadores que contienen sales de amonio cuaternario que vuelven insolubles a los proteoglicanos formando complejos insolubles en agua. Se utiliza formaldehído y cloruro de cetilpiridinium para preservar GAGs unidos débilmente a proteínas y los proteoglicanos de una enfermedad frecuentemente llamada mucopolisacaridosis o enfermedad de Hurler. La fijación se realiza a temperatura ambiente.

Se fija 24 a 48hrs con bromuro de cetiltrimetilamonio con deoxano y después fenil + bromuro de cetiltrimetil amonio.

Congelación, desecación o coagulación sustitución de buenos resultados para mucinas particularmente solubles.

Para identificar carbohidratos tres tipos de técnicas: 1. Utilización de colorantes catiónicos y reactivos catiónicos para identificar residuos

de azucares ácidos 2. Método de PAS, azucares neutros presentes en glicógenos y glicoproteínas 3. Utilización de lectinas Todos estos métodos se utilizan con controles negativos en los que se utilizan

bloqueadores de los grupos a identificar o extracciones con enzimas específicas. Todas estas técnicas no identifican a los proteoglicanos, glicoproteínas o glicógeno

como tal, sino que grupos característicos de estos carbohidratos como OH vecinos, COO-, SO4-, etc. Actualmente se caracteriza la parte proteica de proteoglicanos o glicoproteínas por inmunohistoquímica.

Utilización de colorantes catiónicos

Alcian blue Fierro coloidal Metacromasia

Azul de alcian 8gx es un colorante básico introducido por Steedman (1950) como

colorante específico para las mucinas. La composición química no se conoce exactamente, se sabe que pertenece a la familia de las talocianinas cúpricas, las que son pigmentos altamente coloreados insolubles en agua (color azul). Tienen una alta estabilidad física y química. Los átomos C y N forman un sistema de enlaces conjugados estabilizados por resonancia. La unión del átomo de Cu probablemente se debe a enlaces covalentes.

Las talocianinas están formadas por la condensación de cuatro moléculas: 1amino-3iminoisodolenina en presencia de cloruro cúprico. Para hacerlo soluble en agua se han introducido diferentes grupos catiónicos que

caracterizan los diferentes colorantes derivados de las talocianinas. Scott (1972) analizó el Alcian blue 8gx y determinó que contiene 4 grupos

tetrametilisotiourónicos los que le confieren la carga + al colorante. Tiene un tipo de resonancia donde la carga + es compartida entre el N y C (electrón

que se deslocaliza entre dos centros electromagnéticos). Entre los proteoglicanos y ácido siálico 3 grupos con carga: COO- ácidos urónicos pK 4,2 COO- ácido siálico pK 2,6 SO4 pK 1,5 Si estos grupos están ionizados o no depende del pH.

Mecanismos

Los grupos isotiourónicos cargados positivamente se unen a los grupos ácidos reactivos mediante uniones salinas.

La afinidad del Ab por los grupos ácidos de las sustancias glucosídicas depende principalmente del pH de la solución:

-pH 2,5 se une a los grupos COO- y SO= -pH 1 solamente a los grupos SO4-, a ese pH los grupos COOH no están ionizados. Es posible identificar mucosutancias que son ricas en COO-, ácido hialurónico y ácido

siálico y sustancias ricas en SO4=. Para identificar las mucosustancias ácidas que tienen grupos COO- y grupos HSO4- se

utilizan bloqueos específicos por metilación. La metilación se efectúa tratando con los cortes con una mezcla de alcohol metílico

absoluto y HCl. El HCl actúa como catalizador. La metilacion tiene doble efecto, por un lado esterifica los grupos COO- y por otro lado elimina los grupos sulfatados.

Los grupos COO- esterificados por la metilación se hacen nuevamente reactivos por

saponificación con K CL H. Los grupos SO3 no se recuperan por saponificación. Si se metila a 37ºC se bloque los grupos COOH y se conserva la reactividad de los

grupos SO3. Otro efecto de la metilación es que causa la hidrólisis ácida de la mayoría de los

enlaces glicosídicos con residuos con ácido siálico, por eso la perdida de basofilia de las glicoproteínas que contienen ácido siálico no puede ser restaurada por saponificación, al menos la mayor parte de la basofilia debido a ácido siálico, por eso la metilación-saponificación es más útil para el estudio de ácidos urónicos que de glicoproteínas.

El AB es un colorante catiónico muy adecuado para identificar en forma específica a

proteoglicanos y glicoproteínas sin teñir núcleo. La molécula de AB es demasiado grande para unirse a los grupos fosfatos de la doblehélice de DNA.

Otra ventaja de AB es que forma compuestos muy estables con los carbohidratos, no es extraído de los cortes por agua, alcohol y ácidos débiles.

El procedimiento PAS es frecuentemente aplicado en tejidos ya teñidos con AB.

Fierro coloidal

Éste método fue introducido por Haly en 1946, posteriormente a sufrido muchas

modificaciones que le dan más especificidad al método. El reactivo se prepara agregando cloruro de fierro a agua hirviendo se forma hidróxido

férrico que no precipita y forma una solución coloidal. Las partículas en la solución coloidal están positivamente cargadas, así ellas tienen

propiedades similares a las de los colorantes catiónicos. Para eliminar el fierro que no ha formado coloide y los iones H+ y Cl- que pueden interferir en la reacción se debe dializar la solución de fierro coloidal durante 24 hrs en agua destilada. Se utiliza a pH 1,8, las partículas coloidales se unen a los grupos COO- de los ácidos urónicos y ácido siálico y a los grupos sulfatados de los proteoglicanos.

Para detectar el fierro que se ha unido al tejido se trata con ferrocianuro de K, se forma ferrocianuro férrico Azul de Prusia.

La especificidad de la reacción depende del pH que se utilice, es más específico

cuando se utiliza a pH cercano a 2. Para dar mayor especificidad es conveniente dializar. Es conveniente controlar la especificidad metilando. Si no se dializa suele dar tinción

nuclear y algunas veces se tiñen proteínas dependiendo del pH utilizado.

CARBOHIDRATOS: ESTRUCTURA Y CARACTERÍSTICAS IDENTIFICACIÓN DE GLICÓGENO

Marioly Müller

1 de Octubre de 2002

Los Hc son la principal fuente de energía en la naturaleza. Se definen químicamente como derivados aldehídicos o cetónicos de alcoholes polivalentes y se clasifican según el tipo y número de productos que se forman al hidrolizar en medio ácido.

Principalmente se cuentan los Hc por unidades monosacáridas que son la unidad más pequeña. Al unirse los monosacáridos por enlaces glucosídicos se forman los disacáridos y oligosacáridos que van entre 2-12 monosacáridos aproximadamente y los polisacáridos que son cadenas mucho más grandes de monosacáridos.

Los monosacáridos pueden a su vez subdividirse en grupos según el número de átomos de C que poseen: triosas (CH2O)3, tetrosas (CH2O)4, pentosas (CH2O)5, hexosas (CH2O)6, heptosas (CH2O)7, etc.

Ahora los Hc también se subdividen además en aldosas y cetosas según tengan un grupo aldehído o ceto. Aquí hay un ejemplo de una glucosa en su estructura lineal en que sería una aldosa porque tiene un grupo aldehído y acá, esta otra tiene un grupo ceto y sería una cetosa como en este caso la fructosa.

D-glucosa D-fructosa

En general, esta ------------ representan estructuras llamadas N-acetales, son cíclicos, reacciona el grupo carbonilo con un OH ya sea del mismo grupo o de otro polisacárido, entonces forman N-acetales. En general, este sería el C1 del azucar, luego el C2 hasta el C6 y es importante porque el grupo funcional principal de los Hc son estos grupos OH que van a formar los grupos 1 y 2 glicoles que vamos a ver son importantes para la identificación de glicógeno y otros grupos que también son importantes para la identificación de otros carbohidratos.

Es importante saber que la unión de dos monosacáridos ocurre por un enlace glicosídico entre el C1 y el C6 de otro monosacárido, no siempre es con el C6, puede ser con el C3 o el C4 u otro, pero generalmente se representa con el C6. No sólo va a ser α también puede ser β, lo que depende de la

posición del OH, si está arriba en el plano va a ser α y si está abajo en el plano va a ser β, entonces se va a llamar α-D-glucosa o β-D-glucosa, dependiendo de la posición en el plano del OH.

Composición y clasificación de las mucosustancias: Aunque el termino Hc se ha aplicado a todos los azucares y sus derivados, en el tejido las principales sustancias que están disponibles son azucares ya sea unidos a lípidos o a proteínas o mucosustancias. Las mucosustancias incluyen:

polisacáridos, que están compuestos completamente por Hc proteoglicanes que son cadenas de polisacáridos unidos a un centro proteíco covalentemente glicoproteínas que son proteínas unidas a cadenas de oligosacáridos que son mucho más pequeños

que los polisacáridos, tienen hasta 12 monosacáridos. Clasificación: La clasificación es muy diversa. Hoy en día se habla de los Hc y mucosustancias como glicoconjugados. Los glicoconjugados se subdividen en proteoglicanes y glicoproteínas. Los polisacáridos consisten en muchas unidades de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos. Pueden ser homo polisacáridos cuando están formados por el mismo monosacárido, como por ejemplo el glicógeno, quitina, celulosa, etc. Un ejemplo es el glicógeno formado por residuos de α-glucopiranosa unidos por enlaces glicosídicos α1-6. Específicamente en este polisacárido el grupo funcional más importante es el OH, que forma los grupos 1 y 2 glicoles importantes para su identificación.

En el caso de los proteoglicanes, están compuestos por heteropolisácaridos, a diferencia de los polisacáridos. Cada cadena está compuesta por unidades repetidas formadas cada una de ellas por dos o más unidades de monosacáridos diferentes. Dentro de la clasificación de los proteoglicanes están los glicosaminoglicanes (GAGs), que son cadenas mas cortas de estos heteropolisácaridos, por ejemplo el ác, hialurónico, condroitin sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, heparina, etc.

Ác. hialurónico Heparina

Son disacáridos que tienen otros grupos incorporados como grupos sulfatos o ác. glucorónico, en general los grupos que tienen incorporados son grupos ácidos que le dan una fuerte afinidad a los colorantes catiónicos. Son unidades repetidas. Las dos características de los GAGs: nitrogenados y que tienen grupos ácidos. Las glicoproteínas que son las mucosustancias más numerosas y más variadas. Son cadenas de 2-12 unidades y las más comunes son la galactosa y la manosa y el azucar terminal está unido a un centro polipeptídico. Como ejemplo de glicoproteína están las Ig, productos secretores, constituyentes del glicocálix, del colágeno, del amiloide, etc. La demostración de las glicoproteínas por histoquímica tradicional está basada en la presencia de grupos carboxilos, hidroxilos o esteres sulfato. En general son preservados por la mayoría de los fijadores. (Profe Alliende)Las glicoproteínas tienen generalmente azucares que no son ácidos. Por eso se pueden detectar con el PAS, porque tienen azucares neutras y los esteres sulfato de los GAGs. Fijación de los carbohidratos: En general los proteoglicanes son preservados químicamente intactos por fijadores no oxidantes. Dan mejores resultados las mezclas fijadoras como la formalina-ác. acético o el Bouin, pero la solución de formalina sola no da resultados óptimos. Otro de los fijadores utilizados para la fijación de proteoglicanos es el cloruro de cetilpiridina, que es uno de los principales fijadores para la identificación de proteoglicanes, aunque disminuye la tinción con colorantes catiónicos. En el caso de las glicoproteínas son preservadas por la mayoría de los fijadores, pero las mezclas que tienen agentes oxidantes no deben ser usados porque en general precipita las proteínas y altera su identificación posterior. El modo de acción de los fijadores alcohólicos sobre las mucinas del tejido, es que actúan parcialmente por formación de una red de proteínas denaturadas y también parcialmente por precipitación de carbohidratos (acetato de calcio al 10% en formol al 10%). Fijación y preparación de los cortes para la identificación de glicógeno: Existen tres teorías que tratan de explicar el posible mecanismo de acción de los fijadores sobre el glicogeno. Los tres principales aspectos que explican la fijación del glicógeno, también se aplican a otras mucosustancias:

un atrapamiento físico del glicógeno por la matriz proteinacea circundante. Osea que el fijador estaría actuando más que nada sobre las proteínas del tejido más que una fijación directa del glicógeno.

es fijado por proteínas asociadas a él, siempre el glicógeno está asociado a proteínas, lo que insolubiliza al glicógeno y lo deja atrapado.

sería por deshidratación, disminuiría la solubilidad en agua del glicógeno y lo deja atrapado en esta red. En general, se toma como mecanismo principal el atrapamiento del glicógeno en la matriz proteinacea circundante.

Específicamente, para la identificación del glicógeno, los fijadores a base de alcohol y ác. pícrico, generalmente favorecen la demostración del glicógeno, como el Bouin o el Rossman (mezcla de alcohol, ác. pícrico y formol), que es uno de los principales. En general los fijadores acuosos dan una preservación adecuada pero no ideal, como el caso del formol. Entre las condiciones recomendadas que se utilizan para la fijación del glicógeno, está realizar la fijación a 4°C y el principal resultado es que minimiza parcialmente el efecto de "streaming", que se refiere a un efecto de difusión del glicógeno intra citoplasmático, observándose el glicógeno en forma no homogénea, desplazado en el citoplasma. Se ve una gran diferencia entre una fijación a temperatura ambiente y una realizada a 4°C. El tipo de fijador también afecta la presentación del glicógeno en el corte una vez teñido. Esto se refiere a que si se utiliza formalina el glicógeno se ve como partículas más finas dentro del citoplasma, en cambio con alcohol se ve mucho más grueso. En general como el glicógeno es citoplasmático se observa en una tinción corriente como la H-E, en el caso del hígado, en las células que tienen menor cantidad de glicógeno citoplasmático se tiñen más intensamente que aquellas que tienen mayor cantidad de glicógeno. Entonces dependiendo del fijador utilizado también va a afectar como lo vamos a observar en el M.O. Identificación del glicógeno: El glicógeno corresponde a un polisacárido simple, corresponde a D- glucosa y que en condiciones normales se encuentra en el citoplasma de la células. Se encuentra en mayor cantidad en el hígado y en el músculo cardiaco y esquelético. Las técnicas más conocidas de identificación de Hc son:

PAS alcian blue aldehído fucsina diamina de fierro y otras.

En general la mayoría de estas técnicas eran empíricas, pero hoy en día se reconoce una reacción química especifica implicada en la tinción, por lo que han caído en la histoquímica. Demostración de glicógeno: Uno de los métodos más utilizados es el uso de enzimas. Se sabe que el glicógeno es totalmente digerido con amilasa y para eso se utiliza saliva sobre los cortes para la digestión del glicógeno, hoy en día se utilizan además enzimas comerciales como la diastasa. En algunos tipos de glicogenosis, que son enfermedades donde hay un aumento de la cantidad de glicógeno, un poco distinto se utiliza la peptinasa, que realiza una digestión más fuerte y específica sobre el glicógeno. Entre los métodos más comunes para identificar el glicógeno está el PAS (reacción de ác. peryódico de Schiff), que es uno de los indicadores útiles de presencia de Hc en el tejido y especialmente es útil para la identificación de glicógeno cuando se incorpora previamente el paso de la digestión con diastasa. El principio de la reacción consiste en que el azucar (glicógeno) tiene grupos 1 y 2 glicoles, entonces mediante la acción de un agente oxidante (ác. peryódico que se usa al 1%) va a oxidar selectivamente grupos OH vecinos transformándolos en grupos aldehídos que posteriormente reaccionan con el ác. sulfuroso de la fucsina, la cual se combina con la pararrosanilina para formar el compuesto coloreado magenta.

Esta técnica de PAS identifica específicamente azucares neutros, que no contengan grupos esteres sulfatos, ácidos carboxílicos o nitrógenos, y/o ác. siálico como manosa, galactosa o glucosa. En general en esta reacción y otras en que se ocupa un agente oxidante con el mismo fin, el ácido peryódico es el oxidante de elección porque no sobreoxida progresivamente los grupos aldehídos a ác. carboxílicos lo que disminuiría la intensidad de la reacción de PAS porque habrían menos grupos aldehídos expuestos. Otras técnicas de identificación del glicógeno son el carmín de Best (Best’s carmine) que en un principio era empírica y que hoy en día se conoce un poco más su química. Se fundamenta en una interacción por puentes de hidrógeno entre los grupos OH del glicógeno y los átomos de hidrogeno del ác. carmínico, produciéndose también a nivel del grupo funcional del glicógeno la reacción. Otra de las técnicas comunes, que se utiliza también para M.E. es la de técnica de hexamina de plata. Tiene un principio similar al del PAS, hay una oxidación con ác. crómico, lo que también produce grupos aldehídos que reducen la plata-hexamina dejando un fino precipitado negro. Se han utilizado otros oxidantes como el permanganato de potasio, ác. crómico, pero el más utilizado es el ác. peryódico. En general, la técnica de PAS es la que se ha desarrollado más ampliamente. Cuando se forman los grupos aldehídos se rompe la unión entre el C1 y el C2 del compuesto, no queda unido, y en ese sitio se mete el grupo sulfato de la fucsina, sino no podría reaccionar. El ác. peryódico no sólo oxida los grupos OH, también oxida grupos ceto y oxhidrilos o grupo amino oxhidrilo. Para hacer la técnica más especifica para Hc, hay técnicas en que se bloquean estos otros grupos. El glicógeno no siempre aparece asociado igual en las células de distintos tejidos, a veces aparece más unido a proteínas o menos, en mayor relación glicógeno- proteínas. Según la fijación se puede encontrar como pequeñas partículas o en granos más grandes en el caso de las rosetas (tipo de agregado de partículas de glicógeno) que son visibles al M.E. Todas esas asociaciones distintas que va a tener el glicógeno con las proteínas dentro de la célula va a intervenir en su facilidad o dificultad para retenerlo en el tejido al fijarlo. Esto es importante tener en cuenta para saber como es la mejor condición de fijación. Por último, hay siempre una parte del glicógeno que es soluble, bajo cualquier circunstancia, entonces hay que tener en cuenta que es imposible ver el 100% del glicógeno presente en el tejido. En cuanto a las uniones del glicógeno son de dos tipos, no son sólo 1-6, también son 1-4. Las uniones ramificadas son 1-6 y las uniones lineales son 1-4. El almidón tiene la misma estructura del glicógeno, pero es más ramificado. El glicógeno no es igual en todos los tejidos, es distinto, en el caso del glicógeno del hígado si se fija con formaldehído o con otro fijador se ve igual. En cambio en el caso del endometrio, la ubicación intracelular del glicógeno antes y después de la ovulación varia, después de la ovulación, en la primera etapa, el endometrio secretor presenta el glicógeno en vacuola supranucleares, entonces si se fija con formaldehído este glicógeno se pierde, entonces es necesario fijar con Rossman, esto sirve para realizar estudios de fertilidad. Hay ciertas patologías en que la enzima es incapaz de cortar el enlace α 1- 6, sí el α 1-4, lo que produce que el glicógeno quede retenido produciendo problemas metabólicos. La amilasa al digerir el glicógeno no produce glucosa, produce unidades de dos monosacáridos, actúa a nivel de los enlaces α 1-4, estos disacáridos son solubles en agua.

LÁMINA BASAL: ESTRUCTURA MOLECULAR, IMPORTANCIA E IDENTIFICACIÓN DE COMPONENTES

Julieta González

11 de Octubre de 2002 En esta clase se va a tratar la parte no celular del tejido conectivo: la matriz extracelular. En un esquema de piel se ve todos los estratos celulares, desde los más superficiales hasta los más profundos y bajo ese estrato estaría toda la zona que parte desde la lámina basal hacia el interior que sería la dermis. Está mostrando que la mantención de cualquier conjunto de células que presentan una organización requiere de la presencia de adhesiones celulares: desmosomas en la membrana plasmática lateral o hemidesmosomas en la baso lateral. Pero no sólo existen este tipo de interacciones, hay otras que están formadas por otro tipo de proteínas que están participando preferentemente en la superficie lateral de las células. Como ejemplo se presenta la piel, que presenta diferentes estratos: -superior, que es cornificado donde ya no hay células, sólo hay queratina, que es una proteína del citoesqueleto. -basal, que son células en proliferación constante. En este estrato hay células que permanecen y proliferan y otras que se diferencian y migran hacia los estratos superiores. Para que las células se diferencien se requiere de señales. Estas señales se originan en algún compartimiento de todo este conjunto celular y no celular y tienen que llegar hasta es estrato basal para que las células adquieran un fenotipo diferente al que tenían y posteriormente las del estrato más superficial van a ser a adquirir otra forma hasta llegar a morirse y contener sólo queratina. La lámina basal que es el límite entre el epitelio y el resto de componentes: - fibrilares, - vasos sanguíneos, - vasos linfáticos, - componentes celulares, que son componentes estables de las matrices extracelulares, de los estromas, como son los macrófagos, los mastocitos, los fibroblastos, células dendríticas, etc. - material amorfo, compuesto por una gran cantidad de agua, rico en proteoglicanos. La hidratación de toda esta región va a estar dada por la capacidad de los componentes de la matriz extracelular a hidratarse y eso hace posible también que todas las células puedan migrar a través de este gel tridimensional que serían los componentes de la matriz extracelular. A nivel de los capilares sanguíneos y linfáticos se va a producir el intercambio ya sea de las moléculas que están siendo desechadas por el epitelio o de los nutrientes que llegan a este nivel, como glucosa, aa, factores de crecimiento, citoquinas y todos los componentes solubles que están en este sistema. Los componentes solubles son los que mantienen la comunicación o el diálogo bidireccional entre el epitelio y la matriz extracelular, que lejos de ser dos compartimentos separados, son prácticamente una sola cosa, donde hay una comunicación constante inequívoca de elementos que salen del epitelio hacia la matriz y de la matriz al epitelio. Los mastocitos por sí solos una fuente productora de una gran cantidad de factores solubles: factores de crecimiento, citoquinas, hormonas, proteasas, etc. Cada una de estas células es un mundo que aporta componentes al epitelio. Entonces, dentro del micro ambiente de la matriz extracelular hay factores de crecimiento y citoquinas que estarían dentro del rango de los factores solubles, libres o unidos a otros componentes; hormonas; receptores de superficie que comunican a la célula con el resto de componentes de la matriz; moléculas de adhesión libres o formando parte de la membrana plasmática de los epitelios y proteasas que también pueden estar libres o unidas. En todo este conjunto de elementos que se han mencionado puede haber una acción: - local - sistémica, en el sentido que molécula que son formadas y expresadas en otro epitelio o en otro órgano lleguen por vía linfática o sanguínea, en este caso a la piel,

- paracrina (hay una distancia entre las células, el producto difunde en la matriz y es tomado por el receptor de la célula), - yuxtacrina (cuando hay dos células vecinas a cierta distancia y el producto secretado por una de las células nunca queda libre en la matriz, sino que es tomado inmediatamente por el receptor de la célula vecina), - producida por la propia célula y tener una acción autocrina. Hay muchos ejemplos de yuxtacrinos que son secretados y captados inmediatamente. O sea, si se trata de medir la presión soluble de una hormona o de un factor de crecimiento no va a ser posible porque no va a estar libre, va a estar siempre de alguna forma ligado al receptor. Cada tejido tiene una matriz extracelular propia. Si se menciona cualquiera de los elementos, por ejemplo, moléculas de adhesión, sindecanes, proteoglicanos, etc., en algunos tejidos van a ser privativos o en otros van a ser proporcionalmente distribuidos. Pueden estar más representados en un epitelio o en otro tejido que no sea epitelio como el cartílago, adipocitos, músculo, donde cada uno tiene una matriz que le es propia. Por esto se entiende porque hay células que están cumpliendo funciones que son tan diferentes. Pongamos como ejemplo el páncreas, que tiene un componente endocrino y uno exocrino, donde la forma de las células, donde la expresión génica que tienen las células del endocrino, donde la organización estructural tridimensional al compararla con el exocrino es totalmente diferente. Entonces, necesariamente al analizar la matriz extracelular del componente endocrino y compararla con la matriz extracelular del exocrino, vamos a encontrar que están formados por constituyentes diferentes, con niveles de expresión distintos aunque sean los mismos constituyentes y eso lleva a tener un fenotipo diferenciado y funcional, que en un caso por ejemplo, en el endocrino haya cierto tipo de células que secreten insulina y glucagón y en el exocrino secreción de tripsina, quimiotripsina, amilasa, etc. Análisis de algunos de los constituyentes de la matriz extracelular Los constituyentes fibrilares de la MEC (matriz extracelular) son las fibras colágenas y entre los constituyentes no fibrilares están las glicoproteínas estructurales y los proteoglicanos.

Fibras Las que están en mayor cantidad son los colágenos. Todos ellos son de tipo fibrilar con la diferencia que algunos constituyen estructuras que son un tanto diferentes a fibras, un ejemplo de ellos es el colágeno IV. Hasta ahora se han encontrado más de 20 tipos distintos. De manera que si se buscan los colágenos en las diferentes matrices extracelulares, se va a encontrar que hay colágenos no equivalentes en cada una de ellas. Un colágeno que sí está muy representado casi en todas las matrices es el colágeno I y III. Lo interesante además, es que ha medida que se han estudiado más los colágenos, se ha encontrado que existe una interacción entre ellos. Todos los colágenos están formados por una triple hélice de cadena α. La triple hélice es una unidad que se repite e interactúan entre ellas a través de puentes de hidrógeno. Todas las fibras de colágeno son ricas en glicina, prolina, lisina, hidroxiprolina e hidroxilisina, estos aa son los que participan en los puentes que estabilizan la fibra. También hay puentes disulfuro que participan en la estabilización de la fibra. Las fibras de colágeno pueden tener hasta milímetros de largo. La cadena α es sintetizada en el RER y como cualquier proteína, su el mensajero debe tener información para secuencia señal. Dentro del RER se produce además el ensamblaje de la hélice y posteriormente es procesada en el Golgi quedando dos extremos equivalentes para finalmente ser exocitada en vesículas y en la matriz extracelular ser ensambla la fibra. como ejemplo está la fibra tipo I y II que tienen las características que se han señalado y si se miran simplemente por morfología no se ven diferencian estructurales, pero los componentes de la α hélice son los que tienen distintos componentes aminoacídicos que hacen que las fibras tengan un sello particular que les permite la interacción con otros colágenos que no son como los que forman estas fibras, sino que se forman como α hélice, pero después quedan como estructuras con regiones flexibles, regiones amino terminales que son globulares, como por ejemplo colágeno IX. En este caso el colágeno I tiene que tener sitios que permiten el reconocimiento del colágeno IX y entre ellos

ensamblan una trama fibrilar particular en un determinado tipo de matriz extracelular. Y el colágeno tipo I tiene afinidad por un colágeno formado por más unidades repetidas que tiene sitios de quiebre, que es el colágeno VI. Estos dos ejemplos son para ilustrar que los colágenos interactúan entre sí. La gran mayoría de los colágenos están codificados por genes diferentes, pero algunos de ellos pueden deberse a splicing alternativos.

Láminas basales Son importantes en la organización y funcionalidad de los epitelios. Es una especialización de la matriz extracelular. Tienen una organización básica, pero que no es equivalente en todos los epitelios, en todos los tejidos que tienen láminas basales. Se muestra una lámina basal de un epitelio que está formado por una monocapa de células, también la lámina basal de la piel puede tener características semejantes a esta lámina basal. Pero hay láminas basales que forman parte de los glomérulos renales, en ese caso hay una particularidad de esas láminas basales que entran en contacto con las células endoteliales que son bastante particulares en comparación con otras células endoteliales y permiten funciones propias que no son las mismas que ocurren en otros epitelios. Lo mismo si analizamos las láminas basales de las células musculares o de los adipocitos. Cada una de estas láminas basales tiene composiciones distintas, que aunque están los mismos elementos hay una enorme versatilidad de posibilidades de formar moléculas, que si bien son isoformas, ellas no están en todos los epitelios representadas y a veces pueden estar en un epitelio varias isoformas de un mismo tipo de moléculas. Dentro de lo que es la interacción de la lámina basal, lo clásico que se conocía era una estructura de soporte, un andamiaje para la organización de los tejidos, eso sigue siendo así. Por otro lado, mantiene una integridad en las funciones celulares, por ejemplo diferenciación, proliferación durante toda la embriogénesis cumple funciones muy importantes, también en todo lo que son las respuestas metabólicas, la expresión génica y un rol fundamental en lo que es la muerte programada y en los epitelios en lo que es la muerte no programada sino que es producida por daño causado por un agente. Es importante que los receptores presentes en la superficie de la célula mantengan este diálogo bidireccional con la matriz extracelular. Como ejemplos están las integrinas (moléculas de adhesión) y los sindecanes (proteoglicanos unidos a membranas), que participan activamente en el diálogo al recibir señales y transducirlas. Entre los componentes mayores están: - colágeno - proteoglicanos - glicoproteínas estructurales -elastina, la presencia de este último componente es

discutido. La MEC está permanentemente dando un medio dinámico para que se integre la forma del epitelio con su función. No es sólo determinar la forma, sino que la forma y función como dos elementos que van unidos muy estrechamente. Se muestra una microfotografía en que se ha extraído parte de la membrana plasmática y organelos, mostrando el límite de la membrana plasmática con la lámina basal. Se ve la trama que constituye la lámina basal, es una trama fibrilar con conexiones directas con los componentes de la membrana plasmática. Dentro de las glicoproteínas que forman parte de esta estructura, hay una familia de proteínas llamadas lamininas, son proteínas de alto peso molecular (900 KD) formadas por tres subunidades: α, β y γ (antes llamadas A, B1 y B2). Cada subunidad tiene dentro de su organización zonas globulares y otras que son fibrilares. Las cadenas polipeptídicas de las distintas zonas tienen diferentes secuencias, por lo tanto tienen información para interactuar con moléculas particulares. En el ejemplo se muestra que una zona globular de γ une ciertos tipos de colágenos, lípidos sulfatados, integrinas y una molécula que cuando se descubrió se llamó entactina y hoy se conoce como nidógeno (glicoproteína). Se verá la importancia de esta molécula en la organización tridimensional de la estructura de la lámina basal. En el dominio globular de la subunidad α, hay una zona que interactúa con un proteoglicano presente en todas las MEC, que es el heparán sulfato. La zona globular de la subunidad β tiene interacción con colágeno tipo IV, que es un componente estructural de las láminas basales.

Hoy en día se conoce 15 isoformas de laminina. Cada una de ellas con una combinación de las subunidades α, β y γ (α1, β1, γ1, α2, β2, γ2, etc.), incluso estas subunidades pueden ser diferentes tejido a tejido. Lo interesante es que hay tejidos que en su lámina basal pueden coexistir más de un tipo de isoformas de laminina, incluso en regiones. Por ejemplo, en la zona en que están los hemidesmosomas, existe un subtipo de laminina cuya distribución no es equivalente en el resto de la lámina basal. Si bien la lámina basal se dibuja en los esquemas como una línea continua, realmente son parches de diferentes tipos de moléculas. Lo que hace más interesante a esta proteína para comprender las funciones que tiene al activar procesos celulares, ya sea de diferenciación, proliferación, expresión génica, etc. Tenemos que pensar por un lado en la fisiología, pero también en que ocurre cuando se altera esta interacción, todo lo que le puede ocurrir a una célula cuando hay una mutación en la subunidad γ, en la zona globular de interacción con el nidógeno. Esta parte globular presenta 4 dominios y cada uno de ellos interactúa con moléculas particulares. Cualquier modificación que hay en la interacción de la lámina basal con los receptores de adhesión, se va a ver reflejado en el comportamiento celular. Se muestra un esquema del sitio donde la laminina interactúa con el nidógeno 1. Esta zona polipeptídica es altamente compleja. Hasta ahora se han descrito dos moléculas de nidógeno: 1 y 2. No son sólo moléculas polipeptídicas con un amino terminal y con un carboxilo terminal, sino que son estructuras que se van repitiendo y que en algunos casos, como en este caso en el extremo carboxilo terminal, no son equivalentes y esto hace la diversidad de ellas. Pero cumplen funciones que se han descrito que son homologas en cuanto a función. No todas las láminas basales tienen nidógeno 1 o 2, hay algunas que tiene ambas. Todo esto va incrementando el nivel de complejidad y de diversidad que hay entre las especies. Se muestra un esquema de la malla que forman las moléculas de laminina y de la interacción entre las lamininas y otros componentes. Estas interacciones necesitan de Ca+2. De manera que si se pone un quelante de Ca+2 se desorganiza esta malla. Otra de las moléculas importantes que forma una trama polimérica igual que la laminina es el colágeno IV. Tiene una estructura de triple hélice con la diferencia que tiene ciertos puntos de quiebre, en el carboxilo terminal (dominio NC1) tiene una estructura globular y tiene una estructura fibrilar en el extremo amino terminal (dominio 7S). Cuatro moléculas de colágeno IV forman una estructura que es el monómero de lo que va a ser la estructura polimérica que va a adoptar cuando forme parte de la lámina basal. A M.E. se ve como una red polimérica de grandes espacios, entre los cuales difunden los nutrientes, las moléculas de señalización, las citoquinas, etc. de un compartimiento a otro, del celular a la matriz y de la matriz al celular. Se muestra un esquema de un epitelio glandular donde se ve la lámina basal como una línea continua bajo la membrana plasmática de las células epiteliales y se representa la red polimérica de colágeno IV y el polímero de laminina. La laminina interactúa directamente con un dominio con el nidógeno y también va a interactuar con colágeno IV. Entonces, lo que hace el nidógeno es permitir la interacción de estas dos redes poliméricas, una de laminina y otra de colágeno IV, o sea la ausencia de esta molécula va a llevar a una desorganización de la lámina basal. Un proteoglicano representado ampliamente en las láminas basales, es un proteoglicano libre no unido a membrana plasmática llamado perlecan. Tiene dominios que interactúan con el nidógeno y otros que interactúan con el polímero de laminina y de colágeno IV. Otra molécula muy importante es la fibronectina. Puede interactuar a través de las láminas con la membrana plasmática de las células. Está presente en el resto de la MEC y puede interactuar con todas las células que forman parte de la MEC. Hay una gran cantidad de isoformas y variantes de splicing de fibronectina. Normalmente está formada por un dímero y una de las subunidades a nivel del carboxilo terminal forma dos puentes disulfuro que mantienen unidas las dos cadenas. Se conocen ya los sitios de interacción, puede unir fibrina, heparán sulfato, colágenos estromales, integrinas, etc. Es una molécula importante cuyas isoformas son tejido específicas y pueden modificarse durante el desarrollo.

Los proteoglicanos están formados por un eje central proteíco que interacciona con azucares llamados glicosaminoglicanos (GAGs) por las estructuras que forman. Las GAGs están formados por dímeros que se repiten. Algunos de ellos son el - ácido hialurónico: formado por el ácido glucorónico -N- acetilglucosamina.

- heparina y heparán sulfato: formados por ácido glucorónico o ácido yudorónico - N-acetilglucosamina o N- sulfo-D-glucosamina. Todas estos dímeros se pueden repetir muchas veces. El número de repeticiones es variable en una matriz y de matriz a matriz, también es variable en el tiempo. Los GAGs contienen grupos hidroxilos, carboxilos, sulfónicos, etc. en gran cantidad. Todos estos grupos tienen en común ser polares, interactúan con el agua, por lo tanto mantienen la hidratación de todas las MEC. Son los que acumulan el agua de los tejidos. En el eje central proteíco hay un a. a., que es la serina, que tiene un grupo hidroxilo en su cadena lateral

y este grupo permite formar una unión de tipo O- glicosídica con el GAG, y lo que lleva en la primera parte son los azucares xilosa-galactosa-galactosa y luego varían. Entonces la cadena polipeptídica en ciertos tramos tiene que tener serina para poder unir el GAG. El agrecán es el proteoglicano presente en todas las articulaciones y tendones. Esta compuesta por una larga cadena de ácido hialurónico (GAG no sulfatado) al que se le unen proteoglicanos. La unión es a través de uniones de tipo O- glicosídica entre una serina y el ácido hialurónico. Los proteoglicanos que forman el agrecán tienen dos zonas, una con el GAG presente que es el queratan sulfato y en la zona que va más hacia el extremo está el condroitin sulfato. El agrecán tiene una organización que otorga una gran resistencia y por otro lado facilita la migración celular, además adopta una gran hidratación. Hay proteoglicanos que están presentes en la superficie como componentes de membrana plasmática y tienen como característica ser concentradores de factores de crecimiento que pueden estar largo tiempo en las MECs y son presentados a sus receptores en el momento que la célula sufre alguna modificación o es activa. Cuando se produce una desorganización en la lámina basal, en un primer momento va a haber una gran liberación de factores de crecimiento, pero a la larga va a haber una perdida de ellos y la célula que se mantiene normalmente con ellos diferenciada o proliferando, va a disminuir su funcionalidad y la expresión de esos genes, incluso llegando a adoptar la vía de la muerte celular. El sindecan es el proteoglicano que está siendo más estudiado porque se ha visto que tienen una interacción y participación con algunos isotipos de integrinas, sobre todo el sindecan 4. En esta organización para mantener una estructura y función son críticos los contactos que mantienen la sobre vida, el crecimiento, la proliferación, etc. Por otro lado las moléculas de adhesión celular (MAC) van a mediar el contacto, la recepción y la transducción de señales. Cuando ocurre una transformación maligna, la célula se transforma independiente de su MEC porque pierde las interacciones, dándole una conducta de proliferación y de adquirir un fenotipo diferente como por ejemplo desarrollarse en un medio en que en estado no transformado no se podría haber desarrollado, pudieran ser menos susceptibles a apoptosis o están detenidas en alguna etapa del ciclo o ciclando permanentemente. Hay modificaciones en el patrón de proliferación , en el de migración, en la capacidad de invadir la lámina basal, tienen menor capacidad apoptóticas, no están detenidas en alguna etapa del ciclo y son capaces de desarrollarse en nuevos medios. Hay familias de MAC: - integrinas: formadas por dos subunidades: α y β. Hay una gran diversidad de estas subunidades por lo tanto grandes posibilidades de conformar diferentes dímeros y esto lleva a que tengan diferentes funciones dependiendo de las distintas interacciones con las células. Por lo general las integrinas tienen en la subunidad α dominios de unión a tres a. a. que están dentro de la nomenclatura RGD estableciendo una interacción física, pero a través de otras propiedades que tienen estas moléculas son capaces de interactuar con moléculas que están hacia el lado citoplasmático. El dominio citoplasmático es muy pequeño y a este nivel puede interactuar con una gran cantidad de moléculas que también se pueden asociar al citoesqueleto.

Normalmente están distribuidas en la superficie basolateral, más bien basal de las células porque tienen que interactuar con componentes de MEC, en este caso con fibronectina, pero puede interactuar también con laminina. Tienen uniones heterofílicas. - caderinas: tienen uniones de tipo homofílicas porque interactúan con moléculas idénticas presentes en células vecinas. Las características de estas interacciones es que a este nivel hay gran afinidad por Ca+2 y se establecen puentes de Ca+2 entre ambas moléculas y eso es lo que hace que permanezcan estas interacciones estables. De manera que si se pone un epitelio en contacto con algo que atrape el Ca+2 , estas interacciones fácilmente van a salir. O puede ser que en el medio extracelular se modifiquen las interacciones o que haya moléculas que sean atrapadoras de Ca y se van a desensamblar esas interacciones. Otra cosa interesante es que estas moléculas por el lado citoplasmático, al igual que las integrinas, interactúan con proteínas, entre las proteínas con las que interactúa está la familia de las cateninas, estas proteínas tienen funciones en transducción de señales e incluso pueden llegar como tales al núcleo y activar promotores y encender genes apagados. Hay una serie de señales mecánicas que pueden modificar o activar el sistema de transducción de señales. Inicialmente lo que se conoció en recepción y transducción de señales era referido a moléculas agonistas o ligandos químicos que llegaban a la célula, interactuaban y producían todo un proceso de transducción de señales y formación de segundos mensajeros. Actualmente, además de eso se adiciona este tipo de interacciones físicas capaces por acción mecánica de activar transducción de señales. En este caso se llaman E-caderinas porque pertenecen al epitelio. - superfamilia de las Ig: son las primeras que fueron descubiertas. Tienen una estructura y un componente muy similar al de las Ig. Lo característico de esta familia es que tienen uniones de tipo homofílico, interactúan dominios semejantes y establecen uniones entre ellas. - selectinas: son proteínas caracterizadas por tener un dominio con la capacidad de reconocer azucares. Todas las proteínas o glicoproteínas que reconocen azucares o que interactúan como azucares se las denomino lectinas. Por eso las selectinas tienen dominios de lectina, o sea hay un sitio que tiene afinidad para azucares en particular. Hay una diversidad de lectinas, algunas de ellas tienen mayor afinidad por manosa, por azucares carboxilados, azucares sulfatados, etc. Se usan experimentalmente para identificar sitios donde haya residuos de azucares o si se quiere conocer la distribución de azucares sobre una superficie. Las interacciones de la MEC se dan a través de estas MAC y estas MAC que interactúan entre sí en los espacios intercelulares, las integrinas, son las que interactúan directamente con componentes de la MEC. Todo esto va a definir el comportamiento del epitelio y del tejido. Acá tenemos como ejemplo un proteoglicano, sindecan 4, de membrana que es sintetizado en el RER, glicosilado en el Golgi y tiene toda esta parte que corresponde a los GAGs y especialmente es rico en heparán sulfato. Se ha visto que tiene por el dominio citoplasmático interacciones con el citoesqueleto y se ha asociado con el proceso de transducción de señales activando proteína quinasa C que está relacionada con activación de fosfoinositol. Se muestra una tabla con algunas de las subunidades de las integrinas, como β1, β2 y una larga lista de subunidades α. Se combinan las subunidades y puede formarse la α3 con la β1, la α6 con la β4. La α6 con la β4 forman parte de los hemidesmosomas, lo mismo que la α3 con la β1 y otras proteínas. Entonces en una superficie se puede tener más de un tipo de integrinas, lo que da interacciones, porque no todas las integrinas interactúan con todos los sustratos, por ejemplo la α3 con la β1 van a interactuar con colágeno y laminina, pero no con fibronectina, entonces hay especificidad en el reconocimiento y también en lo que va a desencadenar posteriormente. Este tipo de adhesión es modulada por cambios de actividad y en el número de integrinas y los factores que rompen la adhesión promueven la migración y la remodelación de la superficie celular. Si bien en tejido adulto se relaciona la migración de células como un fenómeno que ocurre en procesos patológicos, normalmente en la MEC las células se están moviendo. En el caso de las interacciones en un epitelio, por más que tengan adhesiones a la MEC, hay un recambio de componentes que en algún momento puede gatillar un programa genético en particular. En estas interacciones hay inversiones de las integrinas de dos tipos para formar lo que se llama la adhesión focal. Esto es más propio de células que están libres, no formando epitelio y los

hemidesmosomas, que si son interacciones con células epiteliales. En el caso de la adhesión focal, por el lado citosólico, interactúan con proteínas de andamio que establecen interacciones indirectas de las integrinas con las fibras de actina. En el caso de los hemidesmosomas, no son las fibras de actina, sino que es la queratina, los filamentos intermedios los que estarían participando en esta interacción y tampoco lo estarían haciendo en forma directa sino que a través de otras proteínas que estarían formando una placa a ese nivel. Un ejemplo de interacción es una célula libre con puntos de adhesión focal, estos pueden ser reconocidos porque hay una enzima que es una quinasa de adhesión focal que puede identificarse con Acs, esta quinasa está presente sólo cuando está formando puntos de adhesión focal. Algunas moléculas de andamio son la talina, vinculina y tensina. Todas actúan como intermediarios en la interacción con los filamentos de actina. Si a nivel de la unión integrina- célula de la MEC hay una modificación o una activación, se activa la quinasa de adhesión focal que fosforila sustratos que pueden estar derivando a una serie de otras señales mucho más complejas, que van a llevar a encender diferentes programas. En el caso específico de los hemidesmosomas que interactúan por el lado citoplasmático con citoesqueleto de queratina, la interacción a nivel de la membrana plasmática no sólo es a nivel de las integrinas sino que también con otras proteínas. En este momento hay un número importante de proteínas en la interacción para formar los hemidesmosomas, a partir de estas interacciones se generan también procesos de transducción de señales. Hay lamininas que están presentes sólo en las regiones donde hay hemidesmosomas y en las zonas donde no hay hemidesmosomas no están presentes. Es necesario considerar las interacciones entre las integrinas con el citoesqueleto que son importantes en la conducta de las células. Para entender esto se han mutado sitios particulares de unión, ya sea en las integrinas, moléculas de matriz o en las moléculas de andamio, para ver el comportamiento que tiene ahora en la interacción con el citoesqueleto, para ver si son capaces o no de formar adhesiones focales o midiendo algunas de las moléculas que participan en transducción de señales, si se activa una u otra vía. Lo otro interesante es el número de moléculas que hay en la superficie, cuando hay una sobre expresión o si ocurre una disminución en la expresión de las moléculas de la superficie va a cambiar la conducta de la célula. Los sistemas de adhesión focal son muy complejos. Un ejemplo es una integrina inactiva que al activarse tiene una gran variedad de vías posibles de transducción de señal que se activan. Muchas de estas vías son conocidas, pero otras aun no se conocen bien. El sistema de transducción de señal está dado por componentes extracelulares, factores solubles, interacción célula- célula, moléculas de adhesión, etc. Los niveles van a llevar a que una célula pueda progresar en el ciclo, que pueda diferenciarse o mantener un fenotipo, etc. Hay cascadas unidireccionales, pero hay un sin número de cascadas que están cruzadas, es lo que se llama conversación cruzada (cross talk). Se puede pensar en lo complejo que son estos sistemas imaginándose la cantidad de receptores para factores de crecimiento que hay en una célula, en la cantidad de diferentes isoformas de integrinas que se pueden tener, de calidades de láminas basales por diferentes tipos de integrinas. Para que las integrinas tengan un efecto en las células debe ocurrir su agregación. Cuando se produce la interacción lo que desencadena es la agregación y como agregado ellos van a desencadenar la respuesta celular, no como dímero. Es importante que las moléculas de adhesión estén expresadas en los niveles adecuados porque cuando están sobre expresadas o hay una baja, de alguna forma la conducta celular y la interacción se modifica. Este un ejemplo de ello, hay dos líneas de células de glándulas mamarias, una línea de células S1 que expresan en forma normal la integrina β4 y una línea tumoral que sobre expresa la integrina β1 y receptores para factores de crecimiento epidermal. Se muestra que si se bloquea la sobre expresión se puede bloquear el fenotipo anormal. Identificación de lámina basal Para su identificación se debe buscar sus componentes. Si se hace una reacción de PAS y la reactividad es baja o es mucha, indica que hay una alteración. Entonces, se debería buscar expresión de moléculas

específica de la lámina como es la expresión de laminina, de nidógeno, de colágeno IV. Si se quiere llegar a niveles cuantitativos necesariamente se tiene que usar RT PCR. La M.E. ayuda mucho. Hay muchas enfermedades renales que están dadas porque las láminas basales del riñón están formadas por distintas lamininas, entonces en algunos casos hay lamininas que no se expresan en alguna etapa. La metenamina de plata sirve para identificar las glicoproteínas de la lámina basal. La identificación de colágeno IV se realiza con IHQ. La remodelación de la MEC se realiza con proteasas que son bastante selectivas y especificas. Cuando una célula está sometida a una noxa, se activa la inducción de estas enzimas que son metaloproteinasas que comienzan a degradar localmente componentes de la lámina basal. Esto se puede producir por el desbalance de cualquier molécula.

METACROMASIA Una reacción se considera metacromática cuando un colorante tiñe selectivamente una estructura tisular con diferente color al que tiene la solución colorante diluida. Ej: intestino grueso teñido con Azul de toluidina diluido las células caliciformes se tiñen rojas mientras que el resto del tejido queda azul. En la mayoría de los casos el color metacromático es de una longitud de onda mayor que el colorante ortocromático. Cuando un colorante catiónico imparte su propio color a un objeto la tinción es ortocromática. La sustancia que se tiñe metacromáticamente se llama cromótropa. Para que una sustancia sea cromótropa debe presentar las siguientes características: a) tener un carácter ácido dado por los siguientes grupos sulfónicos –HSO3 proteoglicanos carboxilos –COO ac hialurònico, ac siálico, proteoglicanos fosfatos –HPO3 como RNA y DNA Otros radicales ácidos no confieren carácter cromótropo b) la metacromasia depende del numero y estado de disociación iónico de los radicales

ácidos de la sustancia cromotrópica c) grado de separación de los grupos ácidos. Se necesita una distancia de alrededor de 5 A

entre los grupos aniónicos para que se produzca metacromasia. Si la distancia es menor que 5 A hay aumento de la metacromasia, si es mayor que 5 A no hay metacromasia.

Características de los colorantes metacromáticos Generalmente son básicos. Se conocen mas de 36 colorantes básicos capaces de inducir metacromacia los mas utilizados pertenecen al grupo de las tiazinas, oxazinas, azinas, xantenos como el azul de toluidina, azur A, tionina, azul de cresilo etc. Generalmente se trata de moléculas planares. El colorante debe ser muy puro por que existen algunos colorantes comerciales que contienen dos o más colorantes de modo que la coloración policroma resulta de la absorción selectiva de los componentes de la mezcla y no de verdadera metacromasia. Verde de metilo colorea el DNA verde y otras estructuras violeta no es metacromático sino que normalmente el verde metilo esta mezclado con el cristal violeta. Existen también colorantes ácidos capaz de producir metacromasia Ej Orange G, carmín índigo, rojo congo, Biebritch Scarlett, etc el mecanismo de acción de la metacromasia debido a los colorantes ácidos se conoce muy poco y es diferente al mecanismo de los colorantes básicos. Para ser metacromático un colorante debe por lo menos tener un grupo NH2 no sustituido. No todos los colorantes que tienen grupos NH2 sin sustituir son metacromáticos. El efecto meta cromático es Hipsocromo, es decir, los colorantes son capaces de aumentar su longitud de onda, o sea la absorción de la luz se desplaza hacia las longitudes de onda mas corta y la transmisión hacia las más largas.

Factores antagónicos a la metacromasia a) dilución del colorante. Las soluciones concentradas de colorantes metacromáticos

presentan colores muy diferentes en la soluciones diluidas. Ej: solución diluida azul de toluidina azul, solución concentrada violeta. Por estudios espectrofotométricos, las soluciones más concentradas presentan su máxima absorción en las zonas de longitud de onda cortas, soluciones diluidas bandas α. En la práctica histoquímica se usa soluciones diluidas 0,1- 0,01 % el colorante debe estar en una banda α.

b) Temperatura. El aumento de temperatura se opone a la metacromasia. Azul de toluidina

al 0,6% a temperatura ambiente violáceo, si se hace hervir azul. c) Presencia de sales neutras como cloruro de K, cloruro de sodio, cloruro de Bario, se

oponen a la metacromasia. Cantidades mínimas de soluciones salinas bastan para inhibir una reacción metacromatica. Esta inhibición esta unida al fenómeno de competición entre la sal y los cationes del colorante por la sustancia cromótropa.

d) Agentes deshidratantes como el alcohol son antagónicos. El alcohol una constante

dieléctrica más baja que el agua disminuye la ionización y por consiguiente hace dedesaparecer la metacromasia.

e) Aumento de la acidez también dificulta la metacromasia Para explicar la metacromasia existen muchas teorías. Una de ellas es de Michaelis 1944 y Sylver 1957. Según esta teoría los cromótropos son sustancias capaces de favorecer la polimerización del colorante pues como son sustancias con numerosas cargas negativas colocadas en la superficie y a corta distancia unas de otras favorece la polimerización del colorante. Se sostiene que el agua mantiene unidas las moléculas colorantes al deshidratarse se perdería la metacromasia. El agua interpuesta entre el colorante se cree que es necesario para modificar la distribución de los electrones en el colorante de tal manera de reducir la longitud de onda a la cual la luz es máximamente absorbida. Práctica histoquímica Fijador: el fijador es capaz de modificar de manera significativa el grado de metacromasia Los fijadores más recomendados: a) fijación con subacetato de Pb y formalina b) alcohol formol c) bouin alcohólico

d) congelación-desecación colorantes: los mas utilizados son los derivados de las tiazinas . azul de toluidina, azur A concentración 0,1- 0,01 solvente agua o alcohol ph 0,5 - 7 tiempo soluciones débiles horas a días Resumen La metacromasia depende esencialmente de la unión del colorante a grupos aniónicos del tejido que no tengan una separación mayor de 5 A. La reacción metacromática se realiza solo para hacer una caracterización siempre debe ir acompañada de otras coloraciones mas especificas para la sustancia en estudio. La falla en obtener metacromasia se puede deber a baja densidad electrónica y unión a otros ... . Uso de lectinas Los métodos estudiados permiten diferenciar carbohidratos que contienen determinados grupos COO-, HSO3 C-OH-C-OH, sin embargo no nos permiten caracterizar un determinado carbohidrato. Mucho avance en la caracterización de carbohidratos se ha obtenido con el uso de lectinas que son proteínas de plantas o animales cuya importancia en histoquímica yace en su afinidad por azucares terminales especificas conjugadas con un marcador visible al microscopio de luz o ME (electrónico) las lectinas sirven como un reactivo histoquímico para visualizar en forma selectiva determinados residuos de azucares a los cuales la lectina se une Esquema

La unión de una molécula de lectina a un azúcar no compromete una unión covalente, es similar a la unión antígeno anticuerpo, las moléculas de algunas lectinas incorporan Ca o Manganeso la presencia de estos esencial para la unión del carbohidrato. Las lectinas son proteínas con peso molecular de 20000 a 300000 es posible unir los marcadores en algunos de sus grupos de amino libre sin interferir con la unión al carbohidrato. Los métodos histoquímicos que usan las lectinas tienen mucho en común con los métodos inmunohistoquímicos. En el procedimiento más simple una lectina unida covalentemente con un fluorocromo en una concentración 1mg/ ml en buffer ph 7 – 7,6 es aplicada al tejido por 15 a 60 min. Tambien se puede utilizar como marcador, enzimas. Siempre se debe controlar la especificidad de la unión de la lectina, esto se hace utilizando un control al cual se le coloca en una alta concentración del azúcar a la cual se une la lectina antes de tratar el tejido en estudio con la lectina, esta no se puede unir al tejido pues tiene su sitio de unión al azúcar ocupado. Otro control son digestiones enzimáticas especificas. Ej en el caso de las lectinas que identifican ac. siálico se utiliza neuroaminidasa Los estudios con lectinas pueden realizarse en cortes por congelación o cortes de tejidos incluidos en parafina. La tinción con lectinas marcadas con fluorocromos generalmente se utilizan cortes por congelación, no conviene utilizar cortes fijados en formaldehído pues da auto fluorescencia. Hay que fijar en alcohol y acetona. Las técnicas que utilizan enzimas como marcadores es aplicable a cortes por congelación o tejidos incluidos en parafina fijados en formaldehído o soluciones alcohólicas, las fijaciones con formaldehído debe ser corta. Con las lectinas se reconoce un monosacárido individual. Controles enzimáticos Hialuronidasa de origen bacteriano (Streptococus): rompe las uniones glicosídicas del ácido hialuronico causando su depolimerización especifica para ácido hialuronico. En cambio la hialuronidasa de origen testicular remueve ácido hialuronico y condroitin sulfato A y C. Condroitinasa A B C remueve ác. hialurónico y condroitín sulfato ... Heparitinasa remueve heparán sulfato. Neuroaminidasa Generalmente se utiliza la enzima proveniente de vibrio colerae. La neuraminidasa remueve los residuos terminales de ácido siálico, por eso es posible determinar si la tinción es debida a ácido siálico. Sin embargo no todos los ácidos siálicos son sensibles a la enzima. Sialoconjugados acetilados en el C4 resisten la hidrólisis con sialidasa. Saponificacion de los cortes con KOH remueve el acetilo del C4 y permite su remoción por neuraminidasa.

Partes de las sialomucinas resistentes a neuraminidasa contienen ác. siálico en la forma N –acetil o O- diacil por saponificación con KOH se rompe los grupos acetilos y el tejido es fácilmente digerible por neuraminidasa.

Enzimas

Es importante conocer la actividad de la enzima para conocer la fisiología de la célula, porque si bien a veces por un lado importa la localización por otro lado nos interesa la actividad. Actualmente, la presencia de enzimas puede seguirse por dos vías: la inmunohistoquímica, (tiene cada vez más auge) en que se detecta la enzima como tal, como proteína antigénica construyendo un anticuerpo contra la enzima, el problema que tiene es que muchas veces detecta la proteína como tal pero no se sabe si está o no activa, a veces se puede detectar enzimas en procesos diagnósticos como las metaloproteinasas, que son enzimas que degradan las proteínas de la lámina basal, donde lo que importa es la ubicación, si están en las células epiteliales (hay una enfermedad donde hay destrucción de las células de los conductos y los acinos) o si están en los linfocitos. Pero para detectar si están activas hay que realizar una técnica bioquímica. Otro ejemplo son las caspasas, pero en este caso, utilizando HIQ si se puede detectar si están activadas o no, dependiendo de si ha sufrido proteólisis.

Antes lo que se hacía era bioquímica pero era muy complicado, ahora las técnicas son más simples y se puede purificar proteínas muy chicas mediante electroforesis pequeñas fácilmente por lo que ha habido un auge de la HIQ. De todos modos aun se hacen técnicas histoquímicas para realizar diagnósticos, pero cada vez menos.

Cuando uno inicia un estudio enzimático, primero se caracteriza bioquímicamente la proteína (Km, pH, etc.) y después se realiza el estudio histoquímica.

En la histoquímica nosotros detectamos la actividad de la enzima. A la enzima se le agrega un sustrato, y ese sustrato por acción de la enzima puede ser hidrolizado, oxidado, reducido, y tiene que obtenerse un producto.

1_ Sustrato enzima producto reactivo producto específico reacción + agente final de primario capturante reacción PRP AC PFR(coloreado) 2_ Sustrato enzima PRP +AC PI + Reactivo II PFR PI: Producto intermediario insoluble sin color 3_ Sustrato enzima PFR soluble no coloreado

Es muy importante que el PFR se forme rápidamente para que no haya desplazamiento desde donde está produciéndose la actividad de la enzima, porque entonces tendríamos una mala localización de la actividad de la enzima. Para esto es importante la concentración del agente capturante, si hay poco va a quedar parte del producto de reacción primario sin reaccionar, el que puede unirse a otras estructuras del tejido y dar reacción inespecífica. Si

tenemos mucho agente capturante éste puede en algunos casos inhibir la enzima se puede unir en forma inespecífica a grupos aniónicos.

La reacción 3 es la que da reacción más específica ya que tiene menos pasos pero no siempre se puede realizar. Para microscopía electrónica se utiliza está reacción porque es muy importante la localización.

La reacción 1 es la más eficiente. PRF es insoluble y no tiene color. Debe ser muy insoluble, algunas veces este es

insoluble en agua pero si soluble en solventes orgánicos, entonces aquí hay que montar en medios acuosos, otros son solubles en agua y en medios orgánicos...

En la reacción 2 la localización es más mala porque hay un paso más por lo que puede haber difusión.

En la reacción 3 participan enzimas de óxido-reducción. El sustrato cuando está oxidado es soluble y no tiene color y por acción de la enzima es reducido y se forma un precipitado que si tiene color. Reacción simple que da localización buena.

Antes de realizar una reacción enzimática hay que preparar el tejido y luego hacer la reacción y procesos que son posteriores a la reacción, y en todo ese proceso, preparación de tejido, incubación del tejido y procesos posteriores, nunca hay que olvidar dos cosas:

1. Preservar la actividad enzimática 2. Mantener la localización

Para preservarla tengo que tener todos los cuidados de darle el pH y la temperatura que sea adecuada, de evitar agentes que la denaturen como la fijación, pero siempre vamos a tener que considerar el objetivo de nuestro estudio, podemos perder parte de la actividad en base a una mejor localización.

Para mantener la localización podemos considerar dos aspectos, por un lado que muchas enzimas son solubles entonces con la fijación se insolubilizan, y por otro lado hay que mantener también la morfología, porque si no se mantiene no va la actividad de la enzima no va a ser la adecuada, así que muchas veces sacrificamos la actividad y fijamos periodos cortos para mantener la localización. Siempre está en juego estos dos factores, la actividad y la localización. Si en un estudio nos interesa ver si es más activa o menos activa la enzima generalmente no se fija y se usan las condiciones óptimas de la enzima, si nos interesa la preservación y la localización muchas veces una enzima que tiene actividad óptima a 37º se estudia a 4ºC o a temperatura ambiente para que no se produzca una gran cantidad de producto de la enzima y no haya agente capturante como para capturarlo y se produzca desplazamiento.

Fijación.

Entonces, para identificar la actividad de una enzima hay que considerar la

preparación del tejido. En esta preparación es importante la fijación, no todas las enzimas resisten fijación, pues, como sabemos, es un proceso denaturante que altera las estructuras terciaria y cuaternaria y muchas veces se puede modificar el sitio activo de la enzima. Hay enzimas que si resisten fijación muy bien, pero otras, como las enzimas oxidativas, en general no pueden ser fijadas o resisten fijaciones muy cortas (10 min., por ejemplo) y siempre en frío. Todas las fijaciones de enzimas, largas o cortas, deben ser en frío, si se fija,

por ejemplo 18 horas, a temperatura ambiente no se conserva la actividad. Siempre es mejor fijar, si se puede, pero eso va a depender del objetivo del estudio, si se quiere conservar la actividad hay que mantener condiciones muy estables de fijación y procesamiento, va a ser muy importante la inclusión que es donde más se puede perder la actividad de una enzima por la temperatura, como veremos más adelante. Entonces, la fijación puede tener 3 objetivos:

• conservar la morfología • insolubilizar la enzima • aumentar la permeabilidad de la célula, permitiendo la entrada del sustrato, del

agente capturante y otros agentes que participen en la reacción, sobre todo si se trabaja con células que están enteras.

Enzimas oxidativas. Si no se fija se puede tener una serie de problemas, uno de ellos es que habrá desplazamiento de la enzima, la morfología no va a ser buena y también se observan daños propios de la falta de suministro de oxígeno en mitocondria, donde se encuentran las enzimas oxidativas, todas las deshidrogenasas, que por esta falta de oxígeno, rápidamente se inactivarán y no podrán ser identificadas. En este caso, después de la extracción del tejido se debe congelar rápidamente. Los cortes también deben ser mantenidos en frío. En muestras de autopsia muchas veces es difícil hacer estudios de enzimas, algunas deshidrogenasas pueden mantenerse hasta 6 horas, pero en cadáveres de 24 horas los estudios enzimáticos ya no tienen ningún valor. Al congelar, es importante que no haya deshielo pues se pueden perder cofactores (iones metálicos, activadores) que son bastante solubles y difunden. Entonces, hay que congelar y luego mantener en ambiente frío, generalmente se guardan a –20 o, aún mejor, a –80º C; a –20º C dura unos 7 días y a –80º C pueden durar meses.

Luego de obtener cortes en crióstato, éstos deben ser mantenidos en frío (dentro del mismo crióstato), hasta realizar la técnica.

Por factores osmóticos se puede producir aumento de permeabilidad mitocondrial y difundir cofactores o coenzimas como NAD, NADP, FAD, para evitar esta pérdida de factores solubles se agrega agentes protectores como polvinilpironidona o la sucrosa 0,88M (medio hiperosmótico).

Entonces, lo más importante es congelar rápidamente y lo más adecuado es usar isopentano.

Tejidos sin fijar: TIPO DE INJURIA

CAUSA EFECTO REMEDIO

Anoxia Privación suministro de sangre

Daño mitocondrial Extracción y congelación inmediata del tejido

Térmica

a) congelación y deshielo b) almacenamiento a tº ambiente c) calentamiento de cortes en secado

a) Pérdida de cofactores b) Reducción actividad enzimática c) Pérdida actividad enzimática

a) mantener bloque a –20º, mejor a –70.

b) Mantener cortes a 4º.

c) Guardar cortes mientras se secan en ambiente húmedo a 4º

Osmóticos Tumefacción mitocondrial, aumento de permeabilidad.

Pérdida de enzimas solubles

Protección con soluciones hiperosmóticas

Fijadores usados.

Se puede usar alcohol y acetona, en algunos casos glutaraldehído, pero éste es más

para microscopía electrónica. También hay otros fijadores aldehídicos que preservan bien las enzimas pero mal la morfología. Los más usados son:

• alcohol • acetona • formaldehído.

Se pueden usar de dos formas: • Fijar el tejido a 4º C por tiempos no muy largos que van de 2 a 6 horas • Cortar el tejido en fresco y después posfijar 10 minutos en acetona fría (más

usada) o 15 minutos en formaldehído. De todas formas siempre que se fija se pierde algo de actividad enzimática, no se

conserva totalmente, lo que también va a depender de la enzima. Se han hecho estudios cuantitativos en que por bioquímica se ve la actividad enzimática total sin fijar y se compara con actividad en homogenizado de tejido fijado para ver lo que se ha perdido.

- Fosfatasas alcalinas: En tejido fijado con alcohol sin incluir: se pierde 25%. En acetona se pierde lo mismo.

Después de la inclusión se pierde cantidad considerable, sobre todo con acetona. Entonces, para fosfatasas alcalinas se recomienda fijar en alcohol. Si no se incluye, también se puede fijar en acetona.

La actividad de la enzima también se conserva muy bien con la congelación-desecación, pero ésta no permite inclusión.

Con formaldehído se conserva 80%, pero cuando se incluye hay una pérdida muy importante. En general, los tejidos fijados en formaldehído no se incluyen.

- Fosfatasas ácidas: Si se fija en alcohol se produce gran pérdida de actividad de la enzima, se conserva

sólo de un 2-18%. En cambio, con acetona se conserva muy bien la actividad, aunque cuando se incluye también se pierde bastante, 42%.

No sólo no se debe fijar en alcohol, sino que tampoco se debe usar en ningún proceso previo a la incubación porque se inhibe de una manera muy importante.

Por congelación-desecación se conserva mucho sin incluir, pero nada después de la inclusión.

Con fijaciones en formol, la morfología se conserva mucho mejor que con alcohol o

acetona, pero en general no permiten inclusión en parafina porque se produce una gran pérdida de actividad de la enzima. En estudios de tejidos congelados se puede fijar 2-4 horas en formaldehído de buena calidad, ojalá a partir de paraformaldehído que está libre de metanol porque algunas enzimas son inhibidas por metanol, sino se tiene paraformaldehído se debe usar formol neutro, para que esté en la mejor forma para fijar, forma monomérica, y para que no contenga ácido fórmico que también puede actuar como inhibidor. Después de la fijación hay que lavar muy bien y si no se puede hacer la reacción al tiro, se guarda en medios generalmente hiperosmóticos que contienen sucrosa y/o goma arábiga a 4º C, son crioprotectores, se conserva bien la morfología y actividad enzimática, se puede guardar meses. También se puede hacer cortes del tejido fresco y posfijar en los portaobjetos con formol frío. Si son enzimas hidrolíticas se deja secar el corte una media hora y luego se fija.

Inclusión Para incluir en parafina se usa alcohol o acetona de 100º, a 4º C por 18 horas. La

impregnación debe ser lo más corta que se pueda, de una hora y usando parafina de bajo punto de fusión para que la temperatura de la estufa no sea tan alta (50-52º C). Se puede usar vacío para disminuir el tiempo. Los bloques deben ser muy pequeños para que se impregnen bien en tiempos tan cortos. Son pocas las enzimas que resisten inclusión y siempre hay pérdida.

Los cortes se secan por poco tiempo y después se guardan a temperatura ambiente o en frío.

ENZIMA FIJADOR ACTIVIDAD

DESPUÉS DE FIJAR ACTIVIDAD

DESPUÉS DE INCLUIR F. alcalina Alcohol 4º

Acetona 4º Congelación-

desecación

75%-74% 75%-71% 85%-87%

40% (1hr.), 20% (2 hrs.)

28% (1 hr.), 20% (2hrs.)

29% (1 hr.) F. ácida Alcohol 4º

Acetona 4º Congelación-

desecación

2-18% 78% 91%

7% (2 hrs.) 42% (1 hr.) 10% (2hrs.)

Mezclas incubadoras. El sustrato debe estar en concentraciones saturantes, para que se mantenga la

velocidad máxima de la enzima. Se debe usar el pH adecuado (al menos intentarlo), con enzimas alcalinas usar pH de 8,5-9, hay otras que requieren pH de 7,2, otras son ácidas (pH 5), para esto se usan tampones.

El tipo de tampón dependerá de la reacción, por ejemplo, cuando se usa enzimas fosfatasas en que se tienen aniones fosfatos, no es bueno usar búfferes fosfato, porque ésos fosfatos pueden precipitar también con el metal que se va a agregar. En este caso se puede usar buffer acetato o bórax.

Cuando se trabaja con una enzima oxidativa, las coenzimas (NAD, NADP, FAD) propias del tejido son muy escasas. Todas las reacciones de dehidrogenasa se basan en que ésta le quita hidrógeno al sustrato y lo recibe la coenzima y luego el aceptor artificial. Para esto debe haber una cantidad suficiente de coenzima, cuando ésta está unida covalentemente a la enzima (coenzima FAD de la succinato deshidrogenasa) no es necesario agregarla a la mezcla de incubación, pero otras dehidrogenasas no unidas covalentemente a la coenzima (NAD, NADP) es necesario agregarla al medio.

También se requiere agregar activadores como Mg o Mn que son los más usados, el activador que se agregue depende de la enzima.

Además, las mezclas incubadoras deben contener el agente capturante, que puede ser un metal o un compuesto reducible como una sal de tetrazolium u oxidable como la diamino bencidina (DAB). Es muy importante la concentración, para que no inhiba a la enzima y, a la vez, tenga una visualización adecuada.

Controles. Controles negativos:

• Supresión de sustrato. Si no hay sustrato la enzima no va a actuar y lo que se vea no va a ser producto de la actividad de la enzima.

• Uso inhibidores específicos. A veces, una misma familia de enzimas, por ejemplo las fosfatasas alcalinas, no todas se inhiben con el mismo inhibidor, algunas se inhiben con levamisol, otras con cisteína, no son tan específicos. Para fosfatasas ácidas muchos usan fluoruro se sodio.

• Calor. Si se calienta unos 10 minutos en agua hirviendo todas las enzimas se inhiben.

El uso de controles negativos es muy importante porque muchas veces pueden verse

precipitados que tienen el mismo color que el producto que se forma en la reacción y no es debido a la actividad de la enzima.

Control positivo: Se usa un tejido que se sabe que tiene abundante actividad de la enzima en estudio.

Por ejemplo, las dehidrogenasas son muy abundantes en riñón, hígado, corazón; las fosfatasa ácidas y alcalinas son abundantes en riñón e intestino.

Clasificación de enzimas.

CLASE TIPO DE REACCIÓN Oxidorreductasas Transferencia de electrones Transferasa Transfieren grupos químicos Hidrolasas Hidrolizan uniones Liasas Adicionan grupos a dobles enlaces Isomerasas Transfieren grupos dentro de la molécula Ligasas Formación de C-C, C-S, C-O y C-N en

racciones de condensación unidas a degradación de ATP.

Enzimas hidrolíticas. Hay distintos tipos: Fosfatasas: Catalizan la hidrólisis de ésteres y amidas de ácido fosfórico. Fosfatasas alcalinas: hay específicas e inespecíficas, nosotros estudiaremos las

inespecíficas que hidrolizan monoésteres y requieren estar a pH entre 8 y 9-9,5. Hay fosfatasas alcalinas específicas como la ATPasa, que actúa a pH 7,2 y su sustrato específico es ATP.

Fosfatasas ácidas: las inespecíficas actúan a pH 5 y específicas. Catalizan la

hidrólisis de uniones éster entre ácidos carboxílicos y una variedad de alcoholes y fenoles. Así, tenemos familias de esterasas, colinesterasas, lipasas, etc.

Estos van a ser nuestros productos de reacción primarios: un alcohol y un fosfato y

vamos a ver dos tipos de identificación de la fosfatasa alcalina en que ocupamos ambos productos, el alcohol y el fosfato.

O enzima R O P OH R OH + H2PO4 H2O OH

pH óptimo 8,8 - 9,4 Activadores: Mg+, Mn++, Zn++ Inhibidores: EDTA, L-cisteina, levamisol (uno de los más utilizados), tetramisol. No se inhiben todas las fosfatasas alcalinas sino la mayoría de ellas.

Ubicación (controles positivos): túbulos proximales del riñón, endotelio de las arterias, chapa estriada del intestino, etc. Pretratamiento del tejido *Fijación en alcohol de 100º a 4ºC por 18 horas Inclusión en parafina 1 hora *Fijación formol neutro 2 a 4 horas a 4ºC (cortes por congelación) *Fijación formol Ca Baker 2-4 horas a 4ºC (formol neutro más calcio 1%)

Muy importante realizar un lavado cuidadoso de al menos una hora y luego realizar cortes por congelación.

Tejido sin fijar se corta en crióstato o en micrótomo de congelación, pero cuando se trabaja con enzimas oxidativas hay que cortar con crióstato porque el CO2 la inhibe.

Tejido sin fijar se monta en portaobjetos, se deja secar por 15 minutos y se fija en acetona por 10 minutos.

La actividad más alta de las fosfatasas alcalinas se obtiene cuando se realiza congelación desecación o congelación sustitución (más difícil).

También se puede usar formaldehído por 15 min. Métodos que se utilizan para ver la actividad de la enzima:

Métodos que utilizan sales metálicas (Gomori 1946-1952)

Es muy usado pero no es el mejor, es más barato. Puede usarse muchos fosfatos, el más usado es el β glicerofosfato de sodio, también

fenilfosfato y naftilfosfato. Hay enzimas con las que es mejor utilizar naftilfosfato que el β glicerofosfato (glicerol unido a fosfato por unión éster).

HO-CH2 O H C O P O- + H2O fosfatasa alcalina HO-CH2 OH pH 9-9,4

β glicerofosfato

HO-CH2 H C OH + HPO=

4

HO-CH2 Glicerol HPO=

4 + CaCl2 CaHPO4 + 2H+ + 2Cl

Incoloro CaHPO4 + Co (NO3) CoHPO4 + (NH4)S2 CoS Incoloro Bajo pH 9 se obtiene un producto más soluble, se puede usar un pH hasta 8,5 pero es

mejor usarlo a pH 9, porque a ese pH es más insoluble el producto que se forma por el producto de reacción de la enzima con el agente capturante.

Anión fosfato se une a una sal de calcio (no necesariamente CaCl, puede ser otra pero se ha estudiado la concentración con esta sal porque no se puede agregar mucho calcio ya que inhibe la enzima). Se forma fosfato ácido de calcio que es insoluble pero incoloro (PI), es insoluble a pH 9-9,2 pero a pH 8 se empieza a solubilizar (la enzima es capaz de actuar a pH8), entonces es importante mantener un pH cercano a 9, incluso puede ser 8,8.

Fosfato ácido de calcio se le agrega una sal de cobalto (fosfato de cobalto, pero puede ser otra porque aquí no es tan importante la concentración), se va a formar fosfato ácido de cobalto, ocurre precipitación fraccionada (el fosfato de cobalto es más insoluble que el fosfato de calcio, entonces si tenemos fosfato de calcio en presencia de una sal de cobalto el calcio va a tener tendencia a ser reemplazado y formarse el fosfato que es más insoluble). Fosfato de cobalto también es insoluble e incoloro.

Para detectar este precipitado agregamos sulfuro de amonio el que va a producir un precipitado de color negro de súlfuro de cobalto, que es insoluble en agua y también en solventes orgánicos. De todos modos no debe permanecer mucho tiempo en los alcoholes ni xiloles durante la deshidratación porque igual algo se solubiliza, hay que realizar deshidrataciones cortas (no dejarlo de un día para otro).

Problemas del método a) Difusión de la actividad de enzima, hay que ser cuidadoso con el tiempo, algunas

enzimas necesitan 10 min, otras 20, etc, pero si las dejamos por tres horas entonces va a haber gran difusión de la actividad.

b) Difusión fosfato por lenta unión al Ca, se ha realizado muchos estudios (sobretodo en ME)en cuanto a la concentración que debe tener de calcio para que la unión a este sea rápida, no haya difusión y no se inhiba la enzima. Si hay poco calcio va a haber difusión del fosfato, unión lenta al calcio y unión del fosfato a grupos positivos del tejido dando reacción inespecífica.

c) Disolución fosfato de Ca por usar pH bajo 8.5, bajo este pH el fosfato de calcio es soluble.

Es una técnica que siempre resulta mientras se controlen los factores importantes,

como por ejemplo mantener a 37ºC. ¿Por qué formol calcio no inhibe a la enzima? Hay trabajos en que se compara formol

con formol calcio y se ve que este último es mejor pero no dan una explicación. Parece que el calcio tiene relación con preservar la reactividad de las enzimas, y probablemente la actividad del calcio sea distinta durante la fijación y durante la incubación.

Métodos que usan sales de diazonio

α naftilfosfato en presencia de fosfatasa alcalina a pH8 (más adecuado para que se produzca la copulación del naftol a la sal de diazonio, no a pH9), entonces vamos a obtener por acción de la enzima un naftol y un anión fosfato. Ahora se utiliza el naftol (no el fosfato) en presencia de la sal de diazonio (catión, tiene cargas positivas), por sustitución electrofílica se une a la sal de diazonio (en posición para al naftol) para formar un colorante azoico.

Esta técnica es la más adecuada para estudiar las fosfatasas alcalinas, porque tiene un solo paso, es muy sensible y es específica. Es una técnica más cara.

Existe otro método, el que utiliza sales de tertazolium, que no es muy utilizado

cuando se investiga pero en IHQ y en HIS se usa mucho, tiene algunos inconvenientes, cuesta interpretarlo.

Métodos de sales de tetrazolium. El compuesto que se forma (formazán) no es soluble en compuestos orgánicos por lo

que las preparaciones se pueden deshidratar y aclarar, al contrario de lo que ocurre con las sales de diazonio. Pero, por otro lado, la reacción no es tan específica porque siempre hay algo de reducción inespecífica de la sal de tetrazolium.

El sustrato es un grupo indoxil con 4 bromos, 5 cloros, tres indoxil y fosfato. Es un monoéster fosfato. Por acción de las fosfatasas se obtiene indoxil + el grupo fosfato. Para detectar la enzima usamos el grupo indoxil, que puede estar en forma enólica y por tautomería puede formar la forma ceto. Dos formas ceto y exceso de indoxil en presencia de un oxidante como las sales de tetrazolium, se forma un compuesto índigo que tiene un color azul débil. Lo que importa, es que las sales de tetrazolium oxidan los indoxilos, reduciéndose a formazán. Entonces, el color de la reacción está dado por el formazán y el índigo, pero más por el formazán. La sal que se usa es el NBT (nitro blue tetrazolium).

Fosfatasas ácidas Fosfatasas ácidas al igual que las alcalinas también son inespecíficas, actúas sobre

monoésteres fosfato siempre que estén a pH cercano a 5, pH es mucho más estricto que fosfatasas alcalinas, va entre 5-5,5 pero no más.

Métodos que utilizan sales metálicas (Gomori 1946-1952)

Es el método más utilizado porque con las sales de diazonio es muy difícil que se

produzca la copulación por el pH tan ácido.

Con este método al igual que las alcalinas vamos a usar el anión fosfato pero ahora no lo vamos a unir al calcio porque como vimos el fosfato de calcio es soluble a pH ácido, entonces vamos a usar plomo, cualquier sal de plomo. Anión fosfato más sal de plomo va a formar fosfato ácido de plomo que es insoluble y sin color. Fosfato de plomo con sulfuro de amonio va a formar sulfuro de plomo que es negro. Sulfuro de amonio debe prepararse en el momento de usarlo.

Este precipitado es insoluble también en solventes orgánicos por lo que se puede deshidratar usando alcoholes y aclarar usando xilol por períodos no muy largos.

Métodos que usan sales de diazonio

También se puede utilizar sales de diazonio pero da resultados inferiores por el

problema del pH. Se usan naftoles que tiene grupos sustituyentes como el CH3 que hace que estos

sustratos sean más insolubles que el αnaftol y sean más reactivos. Hay distintos tipos de naftol sustituidos como el Naftol AS-MX, Naftol AS-TR, etc.

Estos naftoles tienen dos ventajas, una es que son más insolubles entonces para solubilizarlos hay que agregar solventes orgánicos, de este modo la copulación es más lenta no se va a solubilizar como el α naftol y va a poder estar en el medio de incubación no 10 min como la fosfatasa alcalina sino 2 o 3 horas sin que se desplace. La otra es que es más reactivo por los sustituyentes que tiene (sustituyentes positivos). Son más sustantivos, es decir tienen más afinidad por proteínas y se desplazan menos.

Naftol fosfato de Naftol + HPO4 Sodio (sustituído) pH6 Naftol + Ar N = N+ Ar Colorante Sal de diazonio azoico Fast Garnet gbc Pararrosanilina Hexaziotizaida

No puede ser cualquier sal de diazonio, no todas funcionan. No se usa pH óptimo sino que se usa pH 6 para facilitar la copulación.

La reacción es lenta, la intensidad no es muy buena porque tiene difusión. Los mejores resultados se obtienen con la pararrosanilina que uno la prepara.

Naftoles sustituidos son más estables a pH ácidos, son más fácilmente hidrolizables

porque tienen esos grupos sustituidos y soportan incubaciones más largas porque son más insolubles.

Esta técnica no se usa mucho, y en algunos libros ni siquiera aparece (ej.: Kiernan).

Enzimas Oxidativas (oxidorreductasas) Participan en el proceso de oxido-reducción, especialmente todo lo que sea de

respiración de donde se obtiene la energía que necesitamos para todas nuestras actividades. Se encuentran principalmente en las mitocondrias, y precisamente como participan en estos proceso de respiración en que se necesita oxígeno, son muy sensibles a la anoxia (falta de oxígeno), resisten muy mal la fijación, hay algunas excepciones que pueden ser fijadas por diez minutos aprox pero no más.

Estas enzimas se siguen estudiando en patologías, por ejemplo en músculo para establecer el diagnóstico en atrofias musculares, se usa ATPasa y deshidrogenasas.

enzima SH2 + A S + AH2 Sustrato reducido que por acción de la enzima se oxida y se reduce el aceptor. De acuerdo al aceptor se dividen en 3 grupos:

Oxidasas: aceptor es específico, es oxígeno. Ej. Citocromooxidasa. Sustrato es más inespecífico. No permite fijación.

oxidasa SH2 + O2 S + H2O

Deshidrogenasas: hay toda una familia de deshidrogenasas que participan en el ciclo

de Krebs. Aceptor nunca es oxígeno. Aceptor el NAD, NADP, FAD (coenzimas). Sustrato es específico: D.láctica-ácido láctico, D.succínica-succinato o ácido succínico. Sustrato se va a oxidar (succinato a fumarato en D.succínica). FAD se va a reducir, en D.succínica coenzima unida covalentemente a enzima, entonces no hay que agregar FAD al medio. deshidrogenasa SH2 + A AH2 + S

Peroxidasa: utiliza agua oxigenada como oxidante y agua como aceptor. Tampoco

son específicas para el sustrato (se utiliza colorantes como sustrato). La peroxidasa para que oxide este sustrato rápidamente tiene que estar unida al agua oxigenada. Peroxidasa + agua oxigenada van a oxidar a un compuesto que no es específico (compuesto oxidado). Agua oxigenada va a ser aceptor y se va a transformar en agua. Agua oxigenada sería el aceptor específico, y el dador sería inespecífico, generalmente sería la DAB, la bencidina, etc. (compuestos que al estar reducidos son solubles y no tienen color, y al estar oxidados se hacen insolubles y tienen color). peroxidasa SH2 + H2O2 S + 2H2O

Oxigenasas: introducen oxígenos en lugares de doble enlace en el sustrato. Ej: triptofano oxigenasa.

Deshidrogenasas

deshidrogenasa SH2 + A AH2 + S

Existe un sustrato reducido más un aceptor oxidado, y por efecto de la enzima vamos a

tener un sustrato oxidado y un aceptor reducido. Aceptores son NAD, NADP y FAD.

Preparación del tejido Puede haber distintos tipos de preparación, éste es uno de los más adecuados.

a) Pequeños bloques de tejido. Congelar rápidamente a –70ºC en propano o isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Corte en crióstato. Sin fijar. Si la reacción no se puede hacer inmediatamente se guarda a –80ºC (donde puede durar meses). También puede ser a –20ºC pero es menos recomendable y dura sólo una semana.

b) Pequeños bloques de tejido sin fijar. 5-10min formol neutro a 4ºC y de ahí cortar en crióstato. No es el mejor método porque se forman cristales y el tejido no da una ubicación muy buena. El músculo es bastante resistente a este efecto y no se destroza mucho.

c) Pequeños bloques de tejido sin fijar (se pueden fijar 5-10min y luego lavar en agua fría) se congelan en crióstato rápidamente a –15ºC y cortan. El problema es que se forman cristales grandes y la ubicación no es muy buena. Los cortes se pueden fijar brevemente en formol neutro o acetona.

Identificación de la enzima Ej.: succino deshidrogenasa COOH COOH CH2 CH Enzima-FAD + Enzima-FADH2CH2 CH COOH COOH Ácido succinico Ácido fumárico Sustrato ácido succínico. Participa en el ciclo de Krebs, y es la única que está unida a

la membrana interna de la mitocondria (las otras están en la matriz). Tiene como grupo prostético (es decir unido covalentemente) el aceptor FAD (no se agrega coenzima al medio).

Ácido succínico se oxida a ácido fumárico y el FAD se va a reducir. Nosotros vamos a reemplazar el aceptor por un aceptor artificial que serán en este caso

las sales de tetrazolium (compuestos heterocíclicos derivados del tetrazol), las que al estado oxidado no tienen color y son solubles, y al estado reducido son coloreadas en insolubles y se llaman formazanes. Estas sales de tetrazolium van a recibir los H del FAD, por lo tanto tendrán que tener un potencial de oxido-reducción mayor que el FAD para que el FAD le pase los protones (potencial mayor que el aceptor biológico).

Sales de tetrazolium: Son aceptores artificiales que reciben los hidrógenos desde el aceptor biológico.

En la identificación de enzimas deshidrogenasas se utiliza como aceptor sales de tetrazolium, que son compuestos heterocíclicos derivados del tetrazolium. Una sal de tetrazolium sin reducir es un catión, que en presencia de hidrógeno se va a reducir, se rompe unión N-N y se reduce. Sales de tetrazolium oxidadas son solubles e incoloras y al estar reducidas forman el formazan que es insoluble y coloreado.

Las características que debe tener una buena sal de tetrazolium son: a) Que sean reductores eficientes, que tengan un potencial de oxido-reducción alto, más

alto que el del aceptor biológico. Dependiendo de la sal va a poder aceptar más del NAD o del FAD o de la ubiquinona, etc. dependiendo del potencial de reducción.

b) Que las partículas de formazán no sean solubles en lípidos (las primeras sales que se usaban producían formazanes solubles en lípidos que daban ubicación inespecífica).

c) Que las partículas de formazan sean pequeñas para obtener una buena localización de la actividad enzimática, algunas forman cristales grandes entonces la localización de la actividad de la enzima no es buena.

d) Que sean estables, no alteradadas por la luz. Todas estas características son muy importantes de considerar. En general hay dos tipos de sales, unas que tienen un grupo tetrazolium y otras que son

ditetrazolium, tienen dos grupos tetrazolium. Las que se ocupan generalmente son de ditetrazolium, y en estas sales si se reduce un grupo dan un color y si se reducen los dos da otro color, generalmente cuando se reduce un grupo da color rojo y cuando se reducen los dos da un color azul. En general es mejor que se reduzcan los dos.

Este es el esqueleto básico de las sales de tetrazolium, que tiene diferentes

sustituyentes y de ahí van a ser las variaciones que tenga la sal. Algunos ejemplos un poco antiguos, probablemente ahora hay algunas mejores, son los

siguientes. Estos eran muy recomendados antes. Reducción Solubilidad lípidos Cristales Yodonitrotetrazolium (INT) Rápida +++ Gruesos Neotetrazolium (NT) Rápida +++ Finos Nitro Blue Tetrazolium (nitro-BT) (NBT) Rápida - Finos Metiltiozolil tetrazolium (MTT) Rápida - Finos Nitroneotetrazolium (NNT) Rápida +- finos

El más usado es el nitro blue tetrazolium (NTB), que tiene potencial de óxido-

reducción de –0,05 y puede recibir electrones del FAD, ubiquinona y citocromo b. Este potencial se da cuando la concentración de los reactantes es igual a la del producto, si se aumentan los electrones puede recibir electrones en un estado más avanzado de la cadena

Mezcla incubadora:

• pH 7-7,2 del medio, que no es el óptimo de la enzima (para todas las deshidrogenasas se usa el mismo), porque pH más alcalino haber reducción inespecífica del NAD (o NADP). Por ejemplo, en músculo hay muchos grupos SH que actúan como reductores a pH alcalino sobre 8,5, lo que provocará reducción de las sales de tetrazolium no por actividad de la enzima sino por los grupos SH, sin embargo, a pH 7 los SH no tienen ppoder reductor.

• Buffer Tris. • Sustrato: generalmente anión orgánico como sal sódica, por ejemplo succinato

de sodio o ácido succínico pero hay que neutralizarlo con NaOH ara transformarlo a succinato.

• Coenzima: NAD o NADP, hay que agregarlas porque las del tejido son muy pocas. FAD no porque está unido a la enzima.

• Cofactores: generalmente Mg++ • Se agrega sucrosa o polivinilpironidona que contribuyen a hiperosmolaridad,

para que no difundan las enzimas Entonces, la manera de determinar deshidrogenasas es reemplazar aceptor artificial

por una sustancia más reductora y que en estado oxidado sea soluble e incolora y en estado reducido sea insoluble y coloreada.

Diaforasas. Por su acción hay traspaso de electrones desde aceptores biológicos NADH y

NADPH a las sales de tetrazolium. Si se estudia deshidrogenasa que tienen como coenzima NAD o NADP, no es necesario agregar diaforasas porque están presentes en el tejido. Si se quiere identificar actividad diaforásica hay que agregar NADH o NADPH (reducidos) y la sal de tetrazolium, si se realiza reducción de la sal se determina que hay actividad

diaforásica en el tejido, en ausencia de las diaforasas la reacción es muy lenta. La reacción debe ser realizada a pH 7. En el caso del FAD no participan las diaforasas, no se sabe bien cuál es el mecanismo.

NADH o NADPH + sal de tetrazolium NAD o NADP +formazán

diaforasa

Peroxidasas. Enzimas presentes en peroxisomas que participan en la reducción del agua oxigenada

formada en la degradación de ácidos grasos. Al reducir el agua oxigenada, oxidan diferentes compuestos.

Las enzimas oxidativas degradan ácidos grasos en presencia de oxígeno y, en este proceso se produce agua oxigenada, que es tóxica para la célula.

RH2 + O2 a

El agua o

estas enzimas s

Alcoholes, Al reduci

Para detectarlacuando se oxidagua oxigenada

Si hay b

convierten agua 2 H2O2

Pueden d

siempre en frío Son abun

granulaciones d Identifica Método dBencidina

presencia de ag

Enz. oxidativ

R + H2O2

xigenada es convertida en agua por acción de la peroxidasa, por lo tanto, on detoxificantes.

peroxidasa

fenoles + H2O2 R + H2O

rse el agua oxigenada, puede oxidar otros compuestos, como los alcoholes. s se utiliza compuestos que al estado reducido son solubles y sin color y an adquieren color (al revés de las dehidrogenasas). Tiene que estar unida el a la peroxidasa para oxidar en forma eficiente estos componentes.

ajas concentraciones de compuestos oxidables actúan las catalasas y oxigenada en agua.

2 H2O + O2

catalasa

etectarse en tejidos sin fijar o fijados en alcohol de 70º o formaldehído 4%, . En general, se usa tejido fijado e formol sin incluir.

dantes en tejido mamario, glándula tiroides, gándulas sudoríparas, en e leucocitos, etc.

ción:

e bencidina: reducida no tiene color y es soluble, por acción de la peroxidasa en ua oxigenada unida a la enzima, se produce la oxidación de la bencidina

formándose un pigmento azul muy inestable que se llama quininhidrona (cromóforo quinoide), después de poco tiempo (1/2 hora) adquiere un color parduzco que no es específico. Este compuesto puede estabilizarse por unos días con nitroprusiato de sodio.

Método de diamino bencidina (DAB): DAB al estado reducido no tiene color y es soluble. En presencia de agua oxigenada y

enzima peroxidasa se oxida, formándose quinonas iminas que son inestables. Luego, estas quinonas iminas forman polímeros que contienen cromóforos quinoides. Se observa un color pardo que puede no ser muy intenso, por lo que se usan intensificadores como el osmio, cobalto o níquel.

Controles negativos: inhibición con agua oxigenada a concentración alta (0,3%) en metanol.

La DAB es ampliamente usada como marcador: para ICQ, para lectinas. Hay quienes usan LAC? en lugar de DAB, que al oxidarse da color rojo, pero tiene el

incoveniente de ser soluble en solventes orgánicos y no ser tan duradera la reacción. En ausencia de peroxidasa, el agua oxigenada puede oxidar la DAB, pero la reacción

es muy lenta.

A M I L O I D O S I S

16 de Octubre del 2002 Gamaliel Ordenes

Enfermedad caracterizada por depósito de material amorfo, eosinófilo, predominantemente extracelular. Material amorfo = sustancias hialinas, ejemplo: fibrina, fibrinoide, colágenas (en ciertas condiciones). En general son sustancias que aparecen como depósitos desprovistos de estructuras a microscopía de luz y que se tiñen con eosina. No es fácil distinguir entre un elemento y otro (amiloide vs fibrinoide), algunos se depositan en la pared de los vasos sanguíneos y la importancia de diferenciar entre uno y otro es muy distinta, p. ej. Fibrinoide se ve en enfermedades como la vasculitis y enfermedades autoinmunes, en cambio, el amiloide es parte de un proceso entre normal y patológico predominantemente extracelular. De acuerdo a la forma de presentación de la amiloidosis se clasifican en:

PRIMARIA.Idiopática. Afecta músculo, corazón, piel y lengua. SECUNDARIA. En artritis reumatoide, TBC, y otras. Afecta hígado, riñón, bazo y

suprarrenales ASOCIADA A MIELOMA MÚLTIPLE. Afecta órganos como A. Primaria ASOCIADA A TUMORES. Especialmente APUD. Se localiza dentro del tumor

(ej.: ca. medular del tiroides) o en forma sistémica FAMILIAR ASOCIADA A VEJEZ ALZHEIMER

La primaria es idiopática, no se sabe la causa que la produce, lo interesante es la distribución atípica que tiene. La secundaria es la más frecuente, es secundaria a enfermedades de larga data; tiene distribución típica. El mieloma es una neoplasia con proliferación de células de tipo plasmocitoide, son verdaderas células plasmáticas bien diferenciadas que producen Ig. Asociado a esta enfermedad aparece el amiloide compuesto en gran medida por cadenas lambda de Ig, afecta a órganos como la amiloidosis primaria. Asociado a otros tumores, especialmente del sistema APUD, está el Ca medular de tiroides, que crece formando cordones sólidos y típicamente produce amiloide. La gracia en el diagnóstico de ese tumor es demostrar la presencia de amiloide, aparte de otras cosas, como demostrar que son células APUD. En la amiloidosis familiar hay un componente genético implicado. La amiloidosis asociada a la vejez y asociada a enfermedad de Alzheimer (EA) en la que hay pérdida de la memoria reciente en personas relativamente jóvenes (40 años). Uno de los problemas es el depósito de amiloide en SNC. Hay dos fenómenos típicos en EA:

• Alteraciones de neurofibrillas que forman los tangles (ovillos neurofibrilares)

• Depósito de amiloide intercelular.

Composición química del amiloide:

Agua y solutos simples 75% Proteína fibrilar amiloidea 18% Proteínas plasmáticas 2% Mucopolisacáridos 1-2% Lípidos (variable) 2-3%

En general, su composición es heterogénea, dependiendo del tipo de amiloide, localización, origen, antigüedad, etc. Para determinar la antigüedad se considera principalmente el tamaño. Dentro de las proteínas plasmáticas se encuentran las Ig; los mucopolisacáridos y los lípidos se consideran contaminantes. Hay una relación entre el tipo de amiloide y la enfermedad asociada con determinada disfunción:

Correlación clínico-patológica en amiloide según los tipos de proteína amiloidea

Proteína amiloidea

Posible precursor Enfermedad Distribución

AL Cadena liviana Ig Primaria Asoc. a mieloma

Corazón,lengua, riñón (distr. atípica)

AA SAA (Suero) Secundaria Riñón y vasos (distr. típica)

A(MCT) Pro calcitonina Ca.medular tiroides

Tiroides

A (SCA) Senil Corazón

A (FAP) Subunidad prealbúmina

Polineuropatía familiar

Nervios periféricos corazón riñón

AL: amiloide light. El precursor es una cadena liviana lambda completa de Ig; es común en mieloma múltiple. Típicamente las Ig monoclonales son IgM con cadenas lambda. AA: derivado del precursor amiloideo sérico, proteína producida por el hígado (es una prealbúmina), es una proteína única y típica que secreta el hígado. Casi siempre es secundaria a algún proceso crónico y tiene distribución típica. A(MCT): se ve en el Ca medular de tiroides. Esta está relacionado con derivados de componentes (hormonas) del sistema APUD, p. ej. a partir de calcitonina se forma esta proteína, así que es muy específica. La A(SCA): no se sabe cuál es el origen, asociada a amiloidosis de tipo senil, típicamente se ubica en el corazón. La A(FAP) está relacionada con la EA.

Neuropatía familiar: hay producción de una proteína especial llamada transtirretina, que es una forma de transportador capaz de asociarse con otras proteínas. Mutaciones en el gen que codifica para dicha proteína puede llevar a la expresión de una proteína anormal que puede precipitar o asociarse con otro tipo de proteínas y formar amiloide.

Otros componentes del Otros componentes del amiloideamiloide

Transthyretin

El amiloide reacciona con yodo de manera similar al almidón con lugol, dando un color azul. Los órganos con amiloide se incuban con lugol y macroscópicamente se pueden ver los depósitos de amiloide como puntitos azules (amiloide = almidonoide). Cuando no está teñido el órgano se puede ver translúcido, firme. Ya hemos visto que el amiloide es muy heterogéneo, sin embargo, hay dos características que comparten ultraestructuralmente.:

• Componente fibrilar amiloideo (las colágenas?) • Componente puntiforme (componente P)

Ultraestructura Ultraestructura del del amiloideamiloideFibrillas amiloideas

Las dos microfibrillas presentan la misma estructura a microscopio electrónico, a pesar de que tienen origen distinto. Proteína fibrilar amiloidea:

Fibrillas AL (amyloid light chain). Proviene de plasmocitos. Generalmente, contiene cadenas lambda de las inmunoglobulinas

Fibrillas AA (amyloid-associated). Proteína única, sintetizada por el hígado. PM:8,5kD, 76 aminoácidos. Deriva de SAA (serum amyloid associated) de 12kD circulante, asociado a lipoproteínas séricas clase HDL3

La proteína fibrilar amiloideaLa proteína fibrilar amiloidea

Son barras de 4 elementos rodeados por un componente proteico que forma una malla. Componente P (puntiforme):

Es estructuralmente distinto de las fibrillas, pero su composición está relacionada. Aproximadamente 10% del amiloide está formado por P Similar a glicoproteína alfa-1 del suero Tiene homología estructural con proteína C reactiva PM: 180-220kD

¿Cómo demostramos el depósito de amiloide?

TINCIONES SELECTIVAS

Reacción del yodo Rojo congo y derivados (X-34) Azul de toluidina Metacromasia con cristal violeta Tioflavina T (fluorescente) Tricrómicos: Van Gieson, Masson, PTAH Reación del cloruro de oro yodado Colorantes para fibras textiles

TINCIONES INMUNOHISTOQUIMICAS

Cadenas kappa o lambda Calcitonina o insulina B2 microglobulina Proteína B A4 PrP (proteína prion)

La reacción del yodo se puede hacer también en cortes con crióstato. Lo más importante es el RC por su especificidad. Hay una serie de moléculas colorantes derivadas del RC como el X-34. Cuando descubrieron el RC, que tiñe textiles (almidón, celulosa, etc.), descubrieron que otros colorantes, la mayoría, dan reacciones positivas para el RC, aunque no siempre específicas. Los tricrómicos también son importantes: con Van Gieson, el amiloide se ve amarillo, con Masson da rojo, con PTH se ve parecida a la colágena, de color rojizo. Las reacciones inmunohistoquímica permiten determinar la composición específica del amiloide y su origen. Proteína B A4 típica de la EA, proteína prion que se encuentra en encefalitis progresiva de tipo espongiótica (vacas locas). La proteína amiloidea tiene conformación beta plegada, lo que implica que deja ciertos residuos expuestos al exterior, por ej. Grupos OH, en forma regular. El RC de estructura lineal, puede unirse a la proteína a través de estos grupos OH. Si se altera la proteína de manera que estos grupos no se expongan regularmente, el RC no se une (mentira!!). La unión sería por puntes de hidrógeno (uniones débiles), pero cuando estos grupos son abundantes se produciría una unión apropiada del colorante. Esta forma de unión es importante, porque el RC puede reaccionar formando enlaces electroquímicos con componentes del tejido, especialmente citoplasma, pero esta forma de unión no da la coloración típica de color rojo ladrillo ni tampoco da la birrefringencia. El dicroismo también es un fenómeno típico del amiloide, significa que puede dar dos colores y funciona poniendo un solo polarizador en el microscopio. Para hacer diagnóstico de amiloide, se debe hacer la polarización. Ojo: ¿cuáles son las características típicas de una sustancia amiloidea?, componentes ultraestructurales, estructura proteica beta plegada y que se une al RC en forma no electroquímica dando birrefringencia (RC no tiñe como colorante, porque no está usando los auxocromos). Para mejora la tinción (eliminar el fondo) se maneja el pH, alcalinizando la solución. También se pude diferenciar entre el amiloide AL y el AA, haciendo un pretratamiento con

permanganato de potasio desaparece parte de lo que se tiñe y sólo quedan focos teñidos con rojo Congo (RC). Según esta técnica, se puede determinar que la amiloidosis será del tipo AA, esto es una ayuda aunque no es específica. La amiloidosis del bazo (nuestra muestra) evidentemente es una amiloidosis secundaria, toda la parte clínica, el tamaño del órgano así lo indican, sin embargo, pareciera tener un componente AL que desaparece según la técnica con permanganato. Entonces, todas estas cosas no son tan claras porque el amiloide es muy heterogéneo y la característica que comparten es tener estas fibrillas con estructura beta plegada a la que se une el RC.

Modelo de estructura del Modelo de estructura del amiloide amiloide y y tinción con rojo congotinción con rojo congo

C. Alliende pregunta: “entonces este es un colorante ácido o básico? y Ordenes responde: “es un colorante…mmm…..????.....básico!”. Entonces a la C. Alliende le da un preinfarto y responde: “si fuera básico, qué pasaría si Uds. Para hacerlo más específico están usando una solución alcalina? Qué le pasa al colorante? ¿cómo queda la tinción? Si el colorante fuera básico, los auxocromos serían los grupos amino; RC se une electoquímicamente a algunos componentes de las colágenas, pero predomina el grupo sulfato, porque es un grupo muy ácido, el que se une a los grupos amino de las proteínas. Si Uds. meten a un pH alcalino, cómo están los grupos amino? protonados!, por lo tanto se tiene que usar un pH ácido, si lo tiene a un pH alcalino van a estar desprotonados y no va a tener afinidad por los grupos sulfónicos. (Uds, sacan sus conclusiones…!!!). Hay una serie de derivados del RC que son moléculas parecidas, de estructura lineal. La tioflavina T tiene un mecanismo de unión similar al RC, pero requiere de un microscopio de fluorescencia, da fluorescencia bastante intensa.. Con azul de toluidina puede teñirse ortocromáticamente, pero al hacer uso de polarización, da metacromasia de color rojo; no

se sabe por qué se produce esta polarización y tampoco es específica, así que no tiene el mismo valor que la reacción con el RC. Con cristal violeta también hay metacromasia, se postula que esta metacromasia se debe a la presencia de mucopolisacáridos en el amiloide. TINCIONES SELECTIVAS

Reacción del yodo Rojo congo y derivados (X-34) Azul de toluidina Metacromasia con cristal violeta Tioflavina T (fluorescente) Tricrómicos: Van Gieson, Masson, PTAH Reaación del cloruro de oro yodado Colorantes para fibras textiles

GLUCOGENOSIS Se llama glucogenosis a las enfermedades producidas por acumulación de diversas formas de glucógeno. Estas son enfermedades que resultan de un trastorno de tipo genético como alteración de un gen que codifica para algunas enzimas, por lo tanto, la falla aquí es enzimática. Clasificación:

ENFERMEDADES POR ALMACENAMIENTO DE GLUCÓGENO

Número de la izquierda corresponde a la enzima defectuosa según esquema de página anterior.

. von Gierke (enf. de Cori tipo I)

. Pompe (tipo II)

. Forbe (tipo III)

. Anderson (tipo IV)

. McArdle (tipo V)

. Hers (tipo VI)

. Lewis-Spencer-Peet-Stewart (tipo VII)

La acumulación de glucógeno se da habitualmente en el hígado, a veces en el músculo y puede ser glucógeno común o ciertas formas de glucógeno, dependiendo de la enzima afectada (esquema).

Si se genera una falla en cualquier nivel, el proceso va a ser más lento; la falla no puede ser absoluta porque no sería viable. En todo caso, las enfermedades se dan en niños, porque es complicada la vida con este tipo de fallas. Dependiendo de la enzima es el proceso que se va a ver. Por ejemplo, si ocurre una falla en la fosforilasa hepática, la glucogenólisis se va a detener y va a haber acumulación hepática. Si falla la enzima desramificante, se va a acumular glucógeno porque no puede ser cortado en las ramificaciones y se va a acumular gran parte del glucógeno, la otra parte que sí fue cortada se procesa para obtener glucosa.

Hoy se estudian todos estos procesos por métodos enzimáticos, nosotros sólo podemos demostrar la presencia de glucógeno, pero en el hígado y músculo siempre hay glucógeno!. Los métodos bioquímicos son más fáciles y permiten tener mediciones cuantitativas. MUCOPOLISACARIDOSIS Otras enfermedades que conviene mencionar son las mucopolisacaridosis: acumulación de diversos tipos de mucinas. También corresponden a defectos enzimáticos de origen genético. Todos estos pacientes, casi todos son oligofrénicos, con trastornos del SNC y presentan compromiso de diversos órganos como el corazón, alteraciones intelectuales, cambios esqueléticos que van de moderados a severos, y hepatoesplenomegalia, porque es allí donde más se acumulan los mucopolisacáridos.

En este tipo de enfermedades, los GAGs no están unidos a proteínas, por lo tanto hay que fijar con insolubilizantes de glúcidos, como las sales de amonio cuaternarias. Depende de la enfermedad el tipo de GAG que se acumula. Las técnicas que se utilizan son el PAS y el alcian blue a pH 1 para grupos sulfatados. Mixoma: no es un tumor, tiene forma de edema. Hay mixoma peritibial (¿?), mixedema y otros son verdaderos tumores mixoides. No todos los mixomas son tumores verdaderos. El termino “mixoide” significa “que está presente en el cordón umbilical”, el tejido intersticial de los vasos es tejido mixoide. Típicamente es rico en mucopolisacáridos ácidos que pueden ser teñidos sólo con azul de toluidina, no con PAS (y alcian blue????). Es un tejido laxo, con pocas células y que se tiñe de un color azul-rosado (hay metacromasia). Células en anillo de sello tienen vacuolas teñidas con alcian blue, por lo tanto, contienen mucopolisacáridos ácidos, es decir, es un adenoCa. El diagnóstico de estas células es muy importante; esto es un tumor con hematoxilina y PAS (Diapo): hay una gran vacuola, el núcleo está desplazado y hay secreción intersticial. En este caso tiene mucinas neutras. A pesar de ser indiferenciado (porque el tumor no forma glándulas), la presencia de mucina indica que es un adenoCa, aunque la morfología no lo diga. No todas las células en anillo de sello tienen mucina. Las células en anillo de sello tienen una vacuola y no un hoyito como picarón. Algunas tienen vacuolas claras y otras no (esquema). La importancia de estas células es que permite el diagnóstico de adenoCa.

Aquí se ve un frotis de líquido ascítico de una paciente con adenoCa ovárico: si se ven células en anillo de sello, hay que buscar el tumor primario en sistema digestivo o en ovario. Hay una tremenda aplicación diaria de la determinación de mucinas en Anatomía Patológica. Uds. Pueden diferenciar entre tumores productores de glucógeno, de los que hay varios, p. ej. Los seminomas. Uds. Tienen que descartar la presencia de glucógeno o demostrar la presencia de mucinas ácidas o neutras tanto en vacuolas como en forma difusa o extracelular, como en el caso de la piel que vimos anteriormente y en CA de colon. Hay ciertos cánceres que se clasifican como adenoCa mucosos y que tienen un pronóstico distinto: habitualmente en colon es un tumor muy maligno, porque las células pierden la polaridad y secretan para cualquier lado, abriéndose camino. En cambio, el adenoCa mucoso de mama es bastante más benigno y se da en personas mayores. Hay ciertos casos como la metaplasma intestinal en esófago en que la determinación de mucinas es muy útil. En el esófago de Barret no basta con que haya metaplasma columnar, sino que además debe haber un cambio en el tipo de mucinas secretadas: de mucinas gástricas (neutras) cambia a intestinal (ácidas). El esófago de Barret se produce por un reflujo gastroesofágico, debido a una falla en el esfínter gastroesofágico o a una hernia hiatal, junto con un mal manejo de la acidez estomacal. Puede afectar a cualquier porción del esófago, incluso puede producir faringitis o laringitis crónicas. Hay una enfermedad del duodeno en que se produce una atrofia total de las vellosidades (enfermedad de mala absorción), una de ellas se llama Enfermedad de Whipple, en que se produce acumulación de material PAS (+) en ciertas células de la mucosa. Las vellosidades están acortadas y engrosadas, con presencia de células de citoplasma granuloso, eosinófilo y que cuando se tiñen con PAS, previo tratamiento con diastasa (para descartar glucógeno), dan (+). No se sabe si son mucinas o pigmentos como la lipofucsina, pero son características de esta enfermedad.

HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA EN PATOLOGÍA MUSCULAR

Gamaliel Ordenes 13 de Noviembre de 2002

El estudio enzimohistoquímico tuvo una fuerte aplicación a la patología hace muchos años atrás, sobre todo a la neuropatología. Procesamiento de tejidos para histoquímica enzimática en patología muscular

Biopsia muscular: son de dos tipos: abierta o PAF (punción con aguja fina; miden aprox. 0.5 mm de diámetro y 1-2 mm de longitud).

Cortes en crióstato: ambas muestras deben ser cortadas en crióstato. Orientación de las muestras: para corte transversal ambos tipos de muestras. Congelación inmediata: no es tan estricta, pero debe efectuarse dentro de los primeros 30 min. La congelación

no debe realizarse en el crióstato ni en el congelador porque se produce cristalización del agua intracelular lo que provoca un aumento del volumen de la célula rompiéndola mecánicamente. Entonces, para evitar este artefacto se realiza una congelación rápida por ejemplo en estos compuesto: diclorodifluorometano (Arcton 12) o en isopentano, que se mantienen en nitrógeno líquido a -150°C. El isopentano al ser un alcohol no se congela, entonces dentro de una cápsula con isopentano se pone la muestra y se introduce en nitrógeno líquido, ocurriendo así la congelación del agua a -150°C lo que evita la formación de cristales o los cristales que se forman son extremadamente pequeños y no alteran la morfología.

Artefactos: en el músculo fácilmente se producen artefactos por cristalización del agua. Tipificación de fibras musculares Una de las aplicaciones del estudio enzimático del músculo es la caracterización de fibras musculares. Las fibras musculares pueden dividirse en 1, 2A, 2B y 2C.

Características de las fibras tipo 1 •Contracción lenta •Mayor resistencia a la fatiga •Mayor actividad de enzimas oxidativas •Menor actividad de ATPasa muscular y enzimas de la glicólisis Este tipo de fibras tienen mayor actividad mitocondrial que glicolítica.

Características de las fibras tipo 2 (A, B, C) •Contracción rápida •Menos resistencia a la fatiga •Menos actividad de enzimas oxidativas •Mayor actividad de ATPasa muscular y enzimas de la glicólisis Esta tipificación, en cuanto a la velocidad de contracción de las fibras musculares, es importante para la medicina del deporte. Las biopsias musculares en los países desarrollados son importantes para clasificar a los deportistas que están en desarrollo. Si el deportista tiene mayor cantidad de fibras tipo 2, lo pondrán en velocidad; en cambio, si tiene mayor cantidad de fibras tipo 1 será un fondista. Tipificación de fibras musculares a través del estudio de enzimas

TIPOS DE FIBRAS MUSCULARES HUMANAS

Tipo 1

Tipo2A

Tipo 2B

Tipo 2C

ATPasa pH 9.5 luego de fijación en metanol frío + + + + + + + (+) luego de una pre-incubación a pH 4.6 + + + + + + + +(+) luego de una pre-incubación a pH 4.3 + + + - - + (+) SDH/NADH- TR + + + + + + + + (+) Miofosforilasa + + + + + + + (+) El músculo de un adulto normal debería contener < 3% de fibras 2C

Entre las técnicas enzimohistoquímicas que permiten realizar la tipificación de las fibras musculares está la ATPasa a pH 9.5, luego tipificación en metanol frío. La misma ATPasa con una preincubación a pH 4.6 y también luego de una preincubación a pH 4.3. Ambas son variantes de la ATPasa que están presentes y que son resistentes o sensibles a un pre tratamiento ácido. La deshidrogenasa succínica o la NADH tetrasolium reductasa y la miofosforilasa también permiten realizar tipificación de fibras. Entonces, las fibras tipo 1 típicamente presentan intensa la reacción con ATPasa a pH 4.6, a pH 4.3 y la SDH/ NADH-TR, pero dan muy poca reacción o nada con ATPasa pH 9.5 luego del metanol frío y con miofosforilasa. Al contrario, las fibras tipo 2 tienden a dar una reacción positiva intensa con ATPasa pH 9.5 luego de metanol frío y con miofosforilasa. Las fibras 2C son contradictorias en algunos aspectos, pero son escasas, representan menos del 3%. En la foto se ve un músculo normal tratado con ATPasa pH 9.5 después de metanol frío. Las fibras tipo 1 dan muy poca reacción, en cambio las fibras tipo 2A y 2B dan reacción intensa y las 2C dan reacción con intensidad intermedia. ATPasa pH 9.5 después de metanol frío ATPasa post incubación pH 4.3

ATPasa post incubación pH 4.6 NADH-TR

En el mismo tejido (cortes seriados) después de incubación a pH 4.3, las fibras tipo 1 dan reacción intensa, las fibras 2A y 2B no dan reacción y las fibras 2C dan reacción intermedia. Entonces con ATPasa a pH 4.6 y a pH 4.3, las fibras tipo 2, excepto las 2B, presentan una reacción al revés que con la técnica de ATPasa a pH 9.5, lo mismo pasa con las fibras tipo 1, pero al contrario. Por último, con la NADH, las fibras tipo 1 dan positivo y las fibras tipo 2 tienden a dar negativo. Con esta batería de reacciones se podría dar un informe. Si se hace estas reacciones en tejido muscular obtenido adecuadamente y cortado en crióstato, deberíamos obtener los mismos patrones observados anteriormente e informar el porcentaje de fibras musculares tipo 1 y tipo 2, lo que sería útil para la medicina del deporte. Primera aplicación. Otra aplicación es en patología. Permite ver como disminuye o aumenta el porcentaje de cada una de las fibras o cómo cambian sus formas bajo diversas condiciones patológicas. De lo anterior, lo que hay que tener claro es que hay fibras que dan mayor cantidad de reacción positiva para enzimas mitocondriales (NADH) y otras más para enzimas glicolíticas (ATPasa). Enzimas marcadoras de estructuras celulares

Mitocondrias •SDH. Exclusiva de las mitocondrias. •NADH-TR (tetrazolium reductasa). Esta en el músculo no es exclusiva de las mitocondrias.

Miofibrillas (más bien en el citoplasma) •ATPasa miofibrilar: disminuye su actividad en desorganización de miofibrillas. Tiene que ver con la actividad glicolítica.

Lisosomas •Fosfatasa ácida •Esterasas (alfa naftol). Son marcadores de actividad lisosómica (las alfa naftol esterasas). Protocolo para diagnóstico en biopsias musculares •Hematoxilina-Eosina Ψ para estudio morfológico. •ATPasa miofibrilar Ψ con y sin pre-incubación ácida para tipificación de fibras. •SDH o NADH-TR Ψ para actividad y detección de anormalidades mitocondriales. •PAS Ψ para detección de almacenamiento anormal de glucógeno u otros

polisacáridos. En el músculo la distribución del glicógeno es característica y permite ver alteraciones en ella.

•Miofosforilasa Ψ para evaluación de actividad glicolítica. •Negro Sudán B Ψ para evaluar acumulación de lípidos neutros y/o fosfolípidos. •Fosfatasa ácida y/o esterasa Ψ para evaluar alteraciones en lisosomas e identificar infiltración por fagocitos o

histiocitos en el caso de necrosis. Para realizar el diagnóstico de patologías musculares, lo primero es hacer un estudio morfológico para lo cual se utiliza una H-E que sirve para ver el estado general de las fibras musculares: si están grandes o chicas, pues hay patologías en que las fibras musculares disminuyen considerablemente de volumen o son irregulares. Luego se realiza la batería de técnicas enzimohistoquímicas.

Alteraciones musculares por desnervación Se entiende por desnervación cualquier fenómeno que dañe las vías nerviosas alterando la conducción del impulso al músculo, ya sea a nivel medular o del nervio periférico. Ocurren por lesiones (traumatismos, infecciones, etc.) que afectan a:

Células de las astas medulares anteriores (atrofias musculares espinales). Axones de los nervios periféricos o células de Schwann (neuropatías periféricas).

En el dibujo se esquematizan las atrofias musculares espinales y las neuropatías periféricas.

Neuropatías periféricas: Son secundarias a lesiones de los nervios periféricos: traumatismos, inflamaciones y enfermedades desmielinizantes. Neuropatía periférica: ATPasa ph 9.5 post fijación MFF

En la foto de la derecha se muestra un corte de tejido normal con ATPasa a pH 9.5 para evaluar. En la foto de la izquierda, la porción izquierda está relativamente normal, pero hacia la derecha, se muestra un fascículo de fibras totalmente alterado donde se observa un predominio de fibras tipo 1 o bien fibras que no son reactivas para la ATPasa, podrían ser fibras tipo 2 que han perdido su reactividad, que han perdido su actividad ATPasa. En este caso se produjo el daño de un nervio en algún punto y se daña el músculo a continuación.

Atrofias musculares espinales: Son todas síndromes neuropáticos no muy frecuentes y muchas de ellas ligadas al cromosoma X, por tanto se nace con ellas y son más frecuentes en niños, en hospitales infantiles: • Enfermedad de Werdnig-Hoffman • Atrofia muscular espinal intermedia • Atrofia muscular espinal de Kugelberg-Welander En estos casos se produce daño de las neuronas de las astas espinales anteriores, siendo ésta la célula degenerada. Atrofia muscular espinal (forma intermedia) NADH-TR ATPasa pH 9.5

Las microfotografías inferiores muestran cortes de tejido normal con tinción para lactividad de NADH-TR y ATPasa Ph 9.5 a la izquierda y derecha respectivamente. La foto superior derecha muestra reactividad positiva de ATPasa en todas las células, presencia sólo de fibras tipo 2 y ausencia de fibras tipo 1, además de alteraciones en la distribución de la reactividad, así como áreas claras negativas centrales. Esto significa que la célula está alterada, sus estructuras y componentes han sido reorganizados, de manera que presentan otra distribución de reactividad. Por otra parte, en la reacción con NADH, las fibras tipo 1 deberían dar positivo, pero también se ve una alteración en la distribución mitocondrial que deja además espacios centrales negativos. Esto correspondería a una atrofia muscular intermedia en cuanto a su nivel de gravedad patológico. Enfermedad de Werdnig-Hoffman: ATPasa post incubación pH 4.6

En la microfotografía derecha se muestra un corte de tejido normal tratado con ATPasa pH 4.6 y a la izquierda se ve el tejido patológico, donde se observan células muy grandes medianamente conservadas y gran cantidad de células pequeñas con algo de conservación de la reactividad. Esta es una distrofia muscular grave.

Distrofias musculares: En el caso del músculo son cambios de gravedad variable, casi todos ligados al cromosoma X. • Distrofia muscular de Duchenne (distrofia severa ligada a X) • Distrofia muscular de Becker (distrofia benigna ligada a X) • Distrofia fascioescapulohumeral Enfermedad de Duchenne: ATPasa pH 9.5 ATPasa pH 4.3

Para explicar la enfermedad de Duchenne en estas microfotografías se muestra en las fotos inferiores los patrones de tejido normal. A pH 9.5 se ve una total pérdida de la actividad normal de las fibras 2B, incluso se ven algunas células muy aumentadas de tamaño. Las células están atróficas y con forma redonda por aumento del espacio extracelular, y ya no se tocan entre sí. A pH 4.3 se ve una distribución medianamente normal, pero con atrofia. En la distrofia muscular de Becker, por su parte, hay cambios graves. Con P.A.S. se ve la distribución del glicógeno formando un patrón diferente al normal, lo que quiere decir que ha cambiado la estructura de la célula. La ATPasa a pH 9.5 también muestra un cambio importante en la reactividad, aumenta mucho la reactividad de las células tipo 1 y disminuye la actividad de la ATPasa, no hay prácticamente fibras con actividad intensa.

P.A.S. ATPasa pH 9.5

istrofia facioescapular

NADH-TR

n la distrofia fascioescapulohumeral, las fibras se ven como apolilladas, como si tuvieran hoyitos. Hay un grave

Miopatías congénitas e o del núcleo central.

es. los tipos de fibras musculares.

ta de una proteína específica que se deposita como

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Ecambio de la estructura de la célula, en la distribución se ve que las mitocondrias están en un lugar que no les corresponde. En el músculo, las mitocondrias están formando una especie de vaina alrededor de cada miofibrilla muscular, entonces en este caso se ven zonas del tejido que no tienen actividad mitocondrial, puede ser que las mitocondrias estén, pero no tienen actividad mitocondrial, dando un aspecto apolillado, hay muchas fibras, más del 80% de las fibras que no están funcionando como fibras con actividad mitocondrial, por lo tanto el paciente se debe cansar muy rápido, no debe tener fuerzas.

•Enfermedad de central cor•Enfermedad multicore. •Miopatías centronuclear•Disproporción congénita de •Miopatía nemaline (material anormal en línea Z). Se trabastones en la zona de la línea Z.

Enfermedad de centralcore:

NADH-TR

n esta enfermedad de forma un núcleo central. Lo que ocurre es que las células están desprovistas en todo su

iopatía centronuclear NADH-TR ATPasa post pH

Ecentro de actividad mitocondrial y todas las células dan este patrón de reactividad. M

Esta enfermedad, al realizar la técnica de la NADH-TR se ve que las fibras presentan atrofia, la distribución está

o que es importante tener claro es que a través de un conjunto de enzimas bien seleccionadas y bien aplicadas, en

totalmente alterada y que presentan un aspecto apolillado. La ATPasa a pH 4.3 (actividad glicolítica) tiene una distribución más o menos normal, hay un poco más de fibras tipo 1 y las células se ven redondas y no con caras planas por el contacto entre ellas. Luna biopsia muscular es posible hacer diagnóstico histopatológico de diversas enfermedades por el patrón de reactividad enzimática que presentan las células. Aunando la enzimología y la histoquímica enzimática se puede hacer diagnóstico de patologías musculares o apoyar o corroborar cuadros clínicos. Lo segundo es que también se puede tipificar las fibras, lo que es esencial para patología tanto para ....

Distrofia facioescapular NADH-TR

En la distrofia fascioescapulohumeral, las fibras se ven como apolilladas, como si tuvieran hoyitos. Hay un grave cambio de la estructura de la célula, en la distribución se ve que las mitocondrias están en un lugar que no les corresponde. En el músculo, las mitocondrias están formando una especie de vaina alrededor de cada miofibrilla muscular, entonces en este caso se ven zonas del tejido que no tienen actividad mitocondrial, puede ser que las mitocondrias estén, pero no tienen actividad mitocondrial, dando un aspecto apolillado, hay muchas fibras, más del 80% de las fibras que no están funcionando como fibras con actividad mitocondrial, por lo tanto el paciente se debe cansar muy rápido, no debe tener fuerzas.

Miopatías congénitas •Enfermedad de central core o del núcleo central. •Enfermedad multicore. •Miopatías centronucleares. •Disproporción congénita de los tipos de fibras musculares. •Miopatía nemaline (material anormal en línea Z). Se trata de una proteína específica que se deposita como bastones en la zona de la línea Z. Enfermedad de centralcore: NADH-TR

En esta enfermedad de forma un núcleo central. Lo que ocurre es que las células están desprovistas en todo su centro de actividad mitocondrial y todas las células dan este patrón de reactividad.

Miopatía centronuclear NADH-TR ATPasa post pH

Esta enfermedad, al realizar la técnica de la NADH-TR se ve que las fibras presentan atrofia, la distribución está totalmente alterada y que presentan un aspecto apolillado. La ATPasa a pH 4.3 (actividad glicolítica) tiene una distribución más o menos normal, hay un poco más de fibras tipo 1 y las células se ven redondas y no con caras planas por el contacto entre ellas. Lo que es importante tener claro es que a través de un conjunto de enzimas bien seleccionadas y bien aplicadas, en una biopsia muscular es posible hacer diagnóstico histopatológico de diversas enfermedades por el patrón de reactividad enzimática que presentan las células. Aunando la enzimología y la histoquímica enzimática se puede hacer diagnóstico de patologías musculares o apoyar o corroborar cuadros clínicos. Lo segundo es que también se puede tipificar las fibras, lo que es esencial para patología tanto para ....

ESTRUCTURA QUÍMICA Y CARACTERÍSTICAS DE LOS LÍPIDOS

IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS CON LISOCROMOS

C. Alliende 22 de Octubre de 2002

Lípidos: Son compuestos orgánicos, producidos por plantas y animales. Entre sus características está el ser insolubles en agua o débilmente solubles en agua y ser solubles en solventes orgánicos como acetona, cloroformo y metanol, en los que en general son más solubles. No todos son apolares. Uno de los componentes principales de los lípidos son los ácidos grasos, presentes en todos los lípidos menos en el colesterol. Son largas cadenas de carbohidratos, entre 12-20 carbonos, que tienen en un extremo un grupo carboxilo. El ácido palmítico, es un ácido graso saturado, en cambio otros como el ácido oleico, que tiene 18 carbono, tiene un doble enlaces, es insaturado. La importancia de la saturación o instauración radica en que los ácidos grasos insaturados están en estado líquido a temperatura ambiente, mientras que los saturados se encuentran como sólidos a temperatura ambiente pues tienen un alto punto de fusión, 60°C. Los lípidos en nuestro organismo tienen tanto ácidos grasos saturados como insaturados y en general están en estado líquido, estado en que pueden ser identificados pues en estado sólido no son identificables con lisocromos. Hay muchas reacciones que van a ser influidas por la presencia de ácidos grasos insaturados. Las ácidos grasos saturados más frecuentes, tanto en células animales como vegetales, son:

ácido palmítico que tiene 16 carbonos. ácido esteárico con carbonos. ácido linoacético con 24 carbonos.

Entre los ácidos insaturados más comunes están: ácido oleico que tiene 18 carbonos y una instauración. ácido linoleíco que tiene 18 carbonos y dos instauraciones. ácido araquidónico con 20 carbonos y una instauración.

Hay ácidos grasos que son más insaturados que otros y van a ser más solubles que los que tienen menos insaturaciones. Los ácidos grasos libres, en el organismo normalmente no existen, están esterificados, en cambio son abundantes en algunas enfermedades como la cirrosis. Las grasas neutras se encuentran almacenadas en los adipositos y tienen como función ser fuentes de energía a largo plazo, pues se oxidan con dificultad en las mitocondrias y en los peroxisomas. Si el producto de esta oxidación sigue al ciclo de Krebs pasa a la cadena respiratoria generando ATP. Es decir, las grasas neutras son la mayor fuente de energía junto a los azucares. Se encuentran en los adipositos como depósitos de grasa y en patologías, en el caso del hígado se encuentran no en adipositos, están solas. Las grasas neutras están formadas por un glicerol (alcohol), que es una cadena de tres carbonos con grupos hidroxilos que se unen a través una unión éster con los grupos carboxilos de los ácidos grasos, se esterifican, formando los triglicéridos. El C1 está esterificado con un ácido graso, el C2 con otro ácido graso y el C3 con otro, pueden ser todos iguales, pero esto en la naturaleza ocurre muy poco, generalmente son mezclas de ácidos grasos saturados e insaturados para que puedan ser líquidos. Lo que vamos a detectar son casi todas grasas neutras. En ciertas patologías es frecuente la acumulación de grasas neutras, como en el caso de patologías hepáticas o de vesícula.

Los ácidos grasos que vimos, tienen el grupo carboxilo esterificado, ya no ácido, y una cola larga de carbonos, entonces las grasas neutras en cuanto a su polaridad son apolares, hidrófobos. Las grasas neutras también se llaman triglicéridos porque vienen de un alcohol glicerol unido a tres ácidos grasos. No son solubles en agua y son muy estables. Si queremos identificar grasas neutras, no es necesario fijarlas, se mantienen, no se alteran, lo único que puede pasarles es que se oxiden y se pongan rancias, como la mantequilla, pero en general son muy estables y no necesitan ser fijadas, cuando trabajamos con tejidos grasos lo único que estamos fijando es el entorno, la proteína, todo lo que está rodeando las grasas neutras, pero las grasas neutras no se ven afectadas por la fijación porque no son solubles en agua en el caso del formol. Otro grupo de importancia, que interesa detectar en investigación o en algunas patologías, son los fosfolípidos. Hay dos tipos de fosfolípidos:

fosfoglicéridos fosfoesfingol

En el caso de los fosfoglicéridos el alcohol corresponde al glicerol. El glicerol tiene en los C1 y C2 ácidos grasos unidos por uniones éster, esta parte de la molécula es apolar y en el C3, en lugar de estar esterificado con un ácido graso, está esterificado con un fosfato que le da carga negativa y unido también a través de una unión éster al fosfato está un grupo amino-alcohol, en este caso es un etanol-amina. En el caso de los fosfolípidos, los ácidos grasos forman la región hidrofóbica y el grupo fosfato esterificado con una amina-alcohol que tiene carga al igual que el grupo fosfato, así este fosfolípido, que se llama fosfatidiletanolamina tiene carga negativa y carga positiva dada por el grupo etanol-amina. Hay distintos fosfolípidos según el grupo amino-alcohol al cual se una el grupo fosfato: fosfatidilcolina tiene carga positiva fosfatidilserina, tiene carga negativa y positiva. fosfatidilinositol, tiene carga negativa. fosfatidilhidroxiprolina. Todas estas moléculas se llaman fosfatidil y se les agrega el nombre del amino-alcohol. Son fosfolípidos que tienen como alcohol un glicerol con un grupo fosfato esterificado con un grupo amino-alcohol. En la identificación de los fosfolípidos es importante la colina, porque la colina une cromo, forma sales de cromato, cromatos de colina. Cuando se tratan los lípidos con cromo por estudios de cromatografía se ha visto que el cromo se une a la colina y no a los otros lípidos. Otros fosfolípidos que tienen como alcohol un glicerol son los plasmalógenos, la diferencia de este fosfolípido con los otros, es que en el C1 en lugar de tener un ácido graso tienen un grupo aldehído con una larga cadena de carbonos (18C-20C) con cola apolar unido a través de una unión éter-vinílica con el glicerol y unido al fosfato está un grupo etanol-amina o colina, pero con mayor frecuencia se encuentra el etanol-amina. Para detectar los plasmalógenos es importante el grupo aldehído del C1 que es fácilmente hidrolizado y queda libre, pudiendo teñirse con el reactivo de Schiff, entonces al trabajar con tejidos no incluidos siempre hay que tener una placa adicional sin tratamiento porque en medios ácidos no tan fuertes se hidroliza el aldehído y se hace reactivo. Entonces hay que tener en cuenta que la presencia de plasmalógenos puede interferir al realizar estudios de lípidos o carbohidratos en tejidos cortados por congelación. El segundo tipo de fosfolípidos son los que en lugar de tener un alcohol glicerol, tienen el esfingol que es un amino-alcohol que tiene un grupo oxhidrilo. El esfingol tiene alrededor de 18C, tiene instauraciones y un grupo amino que forma una unión amida con un ácido graso y el alcohol está esterificado con un grupo fosfato que a su vez está esterificado con una colina, esto es lo que se llama esfingomielina, que es muy importante en la mielina y también es un fosfolípido que tiene colina, entonces igual que la fosfatidilcolina, la esfingomielina es detectada con las técnicas que usan cromación como el método de Backer. Los dos fosfolípidos que tienen colina y que pueden ser detectados, porque el plasmalógeno se hidroliza muy rápido, es la fosfatidilcolina y la esfingomielina (alcohol esfingol con grupo oxhidrilo y amino unido por unión amida a un ác. graso y donde está el

alcohol hay una unión éster con un fosfato que se une a una colina). A veces interesa detectar sólo colina y la unión amida al ácido graso es resistente a la saponificación (hidrólisis alcalina). Si se saponifica un fosfolípido, fácilmente son hidrolizadas las uniones esteres con los ác. grasos, en cambio estas uniones amida con los ác. grasos son resistentes. Así, para detectar esfingomielina podemos saponificar y luego realizar la reacción de Backer detectando sólo esfingomielina porque la fosfatidilcolina ha sido hidrolizada. Pregunta de prueba: ¿por qué se puede detectar en forma independiente la esfingomielina? porque es resistente a la saponificación como se efectúa habitualmente, si se realiza una hidrólisis alcalina muy enérgica por supuesto que también se va a hidrolizar, en cambio los ác. grasos de los otros fosfolípidos fácilmente se hidrolizan, se saponifican. Otro grupo que también interesa conocer son los glicolípidos. Hay enfermedades en que se acumulan glicolípidos. También están formados por un alcohol esfingol y está presente una unión amida entre el grupo amina y el ác. graso, pero en el grupo oxhidrilo en lugar de haber un grupo fosfato hay un azucar, un oligosacárido, si este es el caso se denominan gangliósidos y hay enfermedades en que están aumentados e interesa detectarlos, para ello existe un panel de reacciones. Los oligosacaridos, siempre tienen azucares que están acetilados, como la acetilgalactosamina o acetilglucosamina y también siempre terminan en ácido siálico. Se pueden detectar en forma diferencial a otros lípidos como las grasa neutras realizando PAS, son PAS positivo porque tienen ác. siálico, los azucares acetilados no dan mucha reacción PAS positiva. Otros glicolípidos que están aumentados en ciertas enfermedades, como algunas de niños no muy frecuentes, son los cerebrósidos. Están formados por un alcohol esfingol, una unión amida entre el grupo amida y el ác. graso, pero unido al grupo oxhidrilo del alcohol hay un solo azucar, que puede ser una galactosa o una glucosa. Por último están los llamados glicolípidos sulfatados, que son igual que los cerebrósidos, pero uno de los oxhidrilos del azucar está sulfatado. Otro lípido que es muy importante, pero que no hay una buena reacción para detectarlo es el colesterol, derivado del ciclopentanoperhidrofenantreno. El colesterol libre se caracteriza por tener en el C3 un grupo oxhidrilo no esterificado, pero muchas veces el grupo oxhidrilo forma un doble enlace constituyendo una unión éster con otro compuesto. Entre el C5 y el C6 hay un doble enlace. El que nos interesa es el C7, que es fácilmente oxidable. El colesterol esterificado es el que forma uniones con otros compuestos formando los derivados del colesterol como las hormonas esteroidales. El colesterol no existe en las plantas. FIJACIÓN DE LÍPIDOS En la fijación generalmente se usa formol cuando se trata de grasas neutras. Se pueden fijar un tiempo prolongado sin que ocurra mayor extracción puesto que son hidrófobos, no son solubles en el formol, la intención es fijar las proteínas que los rodean, además son muy estables. Algo similar ocurre con el colesterol, generalmente se encuentra esterificado, estado en que es poco hidrofílico, cuando está libre el grupo oxhidrilo le da cierta polaridad haciéndolo un poco hidrofílico. Pero como generalmente está esterificado también se puede fijar con formol sin que se pierda. Los fosfolípidos, son abundantes en las membranas celulares y en la mielina, encontrándose sólo trazas en los depósitos de grasas. Interesa muchas veces hacer estudios de mielina, pues hay enfermedades en que se produce desmielinización o en alguna investigación en que interese ver presencia de fosfolípidos, hay algunos fosfolípidos que están unidos a proteínas formando fosfolipoproteína, es difícil encontrar fosfolípidos libres. La mielina es la membrana plasmática de las células de Schwann que rodean los axones y en las estrangulaciones de Ranvier no hay mielina. Entonces lo que se detecta es una gran cantidad de membranas plasmáticas enrolladas (pueden tener hasta 100 vueltas) formadas por su bicapa lipídica con fosfolípidos y además colesterol. Los fosfolípidos tienen una parte polar (fosfatos y alcohol-amina) y una parte apolar (cola hidrocarbonada), la porción polar se disuelve en la formalina tamponada y son en gran parte eliminados, formando lo que se denomina figuras mielínicas, que se refiere al estado intermedio de disolución de fosfolípidos en el formol que forman a M.E.

estructuras similares a ovillos, esto refleja una falta de fijación. Para evitar la disolución de lípidos se utiliza formol calcio en un tiempo corto, se usa 6 horas cuando es tejido congelado, cuando es tejido para incluir en parafina se deja fijando 3- 4 días, la temperatura también va a influir, el calcio insolubiliza en parte a los lípidos no totalmente. El mecanismo no es claro pero se postula que:

puede formar complejos lipídicos insolubles, coacervados que serían grandes agrupaciones de miscelas que los harían insolubles. El calcio induciría la formación de miscelas.

producirían la formación de sales, fosfatos de calcio que son solubles a pH ácido, por eso es importante que se use formol a pH neutro. El formol calcio insolubiliza en parte los fosfolípidos, pero muchas veces hay que incluir en parafina, para ello hay que cromar. La cromación insolubiliza los fosfolípidos de tal manera que puede incluirse el tejido en parafina sin mayor perdida, el mecanismo no es muy claro, pero se cree que en los carbonos que se unen a través de dobles enlaces se une el cromo formando compuestos que después se podían polimerizar y eran insolubles, pero estudios posteriores con fosfolípidos sintéticos que no tenían ác. grasos insaturados, igual fijaban colina, entonces estudios posteriores que usaban cromatografía vieron que el cromo sólo se unía a los fosfolípidos que tenían colina, al parecer la presencia de dobles enlaces influiría, algo de cromo fijan, pero lo que más fija cromo es la colina a la cual se une formando cromatos. Entonces las técnicas que usan cromo para identificar fosfolípidos, lo que están identificando en el fondo es fosfatidilcolina y esfingomielina. La manera de insolubilizar los fosfolípidos a través de la cromación es que se une a la colina formando cromatos de colina y también algo influye la presencia de dobles enlaces, pero es una participación menor. Después que uno croma se tiene que lavar por lo menos por un días el tejido y la cromación dura 2-3 días. Son técnicas larga.

Medio Porcentaje de fosfolípidos extraídos Agua 7.1

CaCl2 1% 2.0 Formol 4% 2.7

Formol neutro 1.3 Roozmod (1969). Se hizo este experimento para ver la efectividad del ión calcio sobre la conservación de los fosfolípidos. Esto se hizo por cromatografía y luego utilizando distintos solventes vieron la extracción de lípidos. Las DS eran pocas. Se demostró que el formol calcio en relación al formol solo disminuye la extracción de fosfolípidos cuando la fijación es corta. En una fijación de 2-3 días para tejido nervioso con formol calcio se mantienen los fosfolípidos, pero en una fijación más prolongada como las que se realizan normalmente, también ocurre una extracción importante de fosfolípidos. La cromación posterior tiene un tiempo definido, no se puede cromar por un tiempo largo pues el tejido se endurece y se ve inespecífico porque se croman las proteínas, se croma todo. Entonces con el cromo no es recomendable guardar el tejido, en cambio con formol calcio sí. En general cualquier fosfolípido se conserva bien con formol calcio (formol neutro).

IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS HIDRÓFOBOS Se utilizan seudo colorantes llamados lisocromos. No son verdaderos colorantes porque no tienen grupos auxocrómos, tienen sólo cromóforos. Son colorantes con grupos azo como cromóforos y tienen grupos hidroxilos (OH) en posición orto en relación al grupo azo, esto favorece que el H sea atraído por el N que es muy electronegativo y se forma un doble enlace perdiéndose el auxocromo y el grupo azo, se produce tautomerización. Al no tener auxocrómos, estos colorantes tiñen los lípidos al disolverse en ellos, no por uniones químicas con el tejido. Es decir, el mecanismo de tinción de los lisocromos es por disolución en los lípidos. Por esto, se debe utilizar lisocromos muy solubles en lípidos para que la tinción sea rápida. Características de los lisocromos: • No son verdaderos colorante. • No presentan grupos auxocrómos. • Presentan grupos cromóforos. Condiciones óptimas que deben tener los lisocromos: • Deben ser muy solubles en lípidos. • No tener gran afinidad por el solvente. Deben ser más solubles en los lípidos que en el solvente, eso es lo fundamental. El solvente no debe extraer las grasas. Por ejemplo, vamos a utilizar etanol, entre el etanol de 70° y el de 100°, se prefiere el etanol de 70° que extrae menos grasas. Entonces, se debe utilizar un solvente que no extraiga mucho las grasas y en el que el lisocromo no sea muy soluble, porque si el lisocromo es más soluble en el solvente no se va a traspasar a los lípidos o se va a traspasar muy poco. • No tener afinidad por otros constituyentes celulares. Al no tener auxocrómos no está ionizado,

entonces no tiene afinidad por otros constituyentes, sólo por los lípidos a través de disolución. • Debe tener un color fuerte, que se vea bien para que los lípidos destaquen. • Se debe disolver en solventes que no extraigan lípidos. Todos los solventes extraen algo de lípidos,

pero se debe utilizar el que lo haga en menor cantidad. El que extrae menos lípidos es el propilen glicol, pero entre los más usados están el etanol 70° y el alcohol isopropílico, no son grandes extractores de lípidos y disuelven medianamente a los lisocromos.

El coeficiente de reparto de una sustancia S (lisocromo) entre dos líquidos no miscibles, esto de no miscible es hasta por ahí porque el lisocromo es miscible en el etanol y en los lípidos, pero tiene un coeficiente de reparto grande si tenemos la concentración de lisocromos en A (lípidos), comparado si tenemos la concentración de lisocromos en etanol (B). Tienen que presentar un coeficiente de reparto grande, lo que indica que el lisocromo está en mayor concentración en los lípidos que en el etanol, por tanto es más soluble en los lípidos que en el etanol, esto permite que el lisocromo pase del solvente a los lípidos, llegando un momento en que no va a pasar más, se va a establecer un equilibrio y ese es el coeficiente de reparto, a un determinado tiempo se va a alcanzar una constante K. El coeficiente de reparto es la razón entre la concentración de la sustancia en estudio entre un solvente y otro, siempre va a ser grande en relación a los lípidos.

K = CA

CB Lo que interesa entender es que los lisocromos deben ser más solubles en los lípidos que en el solvente y que el mecanismo de tinción es por disolución y no por mecanismos electroestáticos. Sudán III, Sudán IV y Oil red

Es un colorante azo. Lo que venden no es colorante puro, es una mezcla. Da tinciones que son menos intensas que el Sudán IV. El Sudán III y el IV no son tan buenos lisocromos como el Oil red porque son menos solubles en lípidos. El lisocromo de preferencia es el Oil red, pero es mucho más caro por eso generalmente en los servicios no se encuentra.

Todos estos lisocromos tiñen triglicéridos y esteres del colesterol (porque son los esteres del colesterol los que son apolares) por el mismo mecanismo: disolución en los lípidos. No tiñen fosfolípidos porque no se disuelven en ellos.

Sudán negro

Para teñir lípidos en general se usa el Sudán negro. La solución no dura mucho porque se descompone fácilmente, dura 1 semana aproximadamente, tiñe mejor cuando está preparado en el día o el día anterior. Si se quiere hacer un estudio y no hay certeza que lo que se observa sea un lípido, es recomendable realizar la tinción con Sudán negro. También es un lisocromo pero con características distintas. Es una mezcla de colorantes. Es un colorante azo que tiene un grupo amino en posición orto y otro en posición para. Esta mezcla de colorantes es un lisocromo que se disuelve en triglicéridos, esteres de colesterol y a diferencia de los otros, también se disuelve en fosfolípidos, en ácidos grasos y cerebrósidos, menos en colesterol libre porque no está en estado líquido, está en estado sólido lo que no hace posible su detección. El grupo amino en posición para puede ionizarse y actuar como un colorante catiónico uniéndose a los tejidos por uniones electroestáticas, es más probable que se ionice el grupo amino en posición para que en posición orto. Cuando se ioniza el grupo para puede teñir ácidos grasos. El Sudán negro puede teñir de dos maneras:

disolviéndose en los lípido. Es muy soluble en lípidos, las tinciones con Sudán negro son muy sensibles.

actuar como colorante catiónico, siempre que el pH no sea ácido porque a ese pH tiende a descomponerse en compuestos color café que dan tinciones inespecíficas. Si se deja mucho tiempo tiende a teñir núcleos, por la posibilidad de ionizar. Se recomienda utilizar los tiempos señalados por las técnicas y también tomar en cuenta la cantidad de lípidos. Las tinciones que son válidas son las de color negro o negro-azulado. Para teñir el colesterol libre el tejido se broma y con esto el bromo se une al colesterol transformándolo a estado líquido. Entonces para ver lípidos totales, incluido el colesterol libre, primero hay que bromar el tejido y luego realizar la reacción del Sudán negro. En general para ver lípidos totales se realiza la reacción de Sudán negro y no interesa tanto ver colesterol libre. Todos los lisocromos se preparan saturados porque al realizar tinciones se va sacando colorante de la solución de trabajo, se va gastando, por lo mismo se trabaja con pequeñas cantidades, para no gastar tanto lisocromo. La tinción si se realiza en placa por goteo, existe sólo una superficie de contacto entre los lípidos y el colorante, entonces la tinción demora más tiempo y es menos sensible, las pequeñas gotas de lípidos no se tiñen; en cambio al realizar la tinción por inmersión hay dos superficies de contacto, es más rápido y más sensible, también influye la cantidad de lípidos presentes en el tejido.

CARACTERIZACIÓN DE LÍPIDOS ÁCIDOS O NEUTROS Para determinar el carácter ácido o neutro de los fosfolípidos se utiliza un colorante que se llama sulfato azul de nilo.

Es un colorante derivado de las azinas (C=N-N=C), pero este colorante en lugar de un N tiene un O, entonces es una oxacina (C=O-N=C). Es un colorante básico con un grupo amina como auxocromo, que viene en mezcla con el lisocromo rojo de nilo. Entonces al teñir con sulfato azul de nilo, este colorante como es catiónico tiñe los ácidos grasos o algún fosfolípido ácido que haya, pero en general los fosfolípidos son polares, pero no ácidos, entonces los grupos ácidos presentes en el tejido corresponden a ácidos grasos y a otros componentes como proteoglicanos, ác. nucleícos y proteínas, estos se van a teñir de azul y se distinguen por la forma de gota que presentan y el rojo de nilo que actúa como lisocromo se va a disolver en los triglicéridos que se teñirán de color rosado. Esta técnica nunca hay que usarla sola porque es poco sensible, el rojo de nilo es un lisocromo no muy soluble en lípidos, entonces pequeñas gotas de triglicéridos no son detectadas. Sirve como un estudio preliminar para ver si hay lípidos ácidos y neutros. Cuando hay mezclas de fosfolípidos ácidos y neutros, tiende a teñirse azul, entonces es raro ver rosado, se ve más bien color fucsia (mezcla de azul y rosado). Es inespecífico, tiñe ácidos grasos y otros componentes, pero se distingue por la forma de gota que presentan los lípidos. FOSFOLÍPIDOS Para ver fosfolípidos hay varias técnicas, pero la más usada es la técnica de Backer (1946) que es muy sensible, no es tan específica y es muy largo, dura aproximadamente 1 semana. El tejido que no va a se incluido se corta en trozos pequeños y se fija con formol calcio, la fijación es corta dura aproximadamente 6 horas. El formol calcio estabiliza los fosfolípidos por medio del formato coacervado o sales con calcio y después se realiza una cromación con dicromato, que debe ser muy precisa, primero se realiza a temperatura ambiente y luego a temperaturas más altas para que se una el cromo bien al tejido, el cromo se una a las colinas formando cromatos de colina. Los fosfolípidos que se detectan con esta técnica son los que tienen colina, los otros se ven teñidos poco intenso. Lo que se tiñe bien son la fosfatidilcolina y la esfingomielina. Después, el cromo unido a la colina de los fosfolípidos se detecta con hemateína ácida que se une al cromo formando una laca de color azul. Al principio se ve todo el tejido cromado, pero esa unión de la hemateína al cromo no es firme en todos los casos, entonces hay que diferenciar. El último paso es reconocer el cromo que está unido sólo a la colina para ello se diferencia con ferricianuro de potasio + borax, la diferenciación tiene que ser controlada. El mecanismo de diferenciación de la hemateína unida al cromo en forma débil usando ferricianuro de potasio con borax no está claro. Según Backer, el ferricianuro mas el borax oxidarían la hemateína dando un color débil.

Esta técnica se usa mucho para detectar mitocondrias en los túbulos proximales, donde hay muchas pues se necesita mucha energía para la absorción. Sirve para detectar mitocondrias por la cantidad de membranas internas y externas que tienen, por la cantidad de fosfolípidos que presentan. Con esta técnica se detectan finos haces de mielina porque han sido mantenidas por el cromo y es muy sensible. Además de los fosfolípidos, se detectan proteínas que tengan como grupos prostéticos un metal, como la hemoglobina. Entonces los GR también se tiñen al unirse la hemateína al fierro de la hemoglobina. También se pueden detectar con esta técnica otros componentes como proteoglicanos y ác. nucleícos. Debido a esto se recomienda hacer un control, lo que se usa es piridina caliente a 60°C. Con este control hay que tener cuidado porque extrae todos los lípidos, pero los que están unidos fuertemente a proteínas no los extrae. Cuando previo a la tinción con el método de Backer se hace la extracción con piridina a 60°C y desaparece la tinción hay certeza que se trata de fosfolípidos, pero si se mantiene la tinción no hay certeza que no se trate de fosfolípidos, puede tratarse de fosfolípidos unidos fuertemente a proteínas. Usando el método de Backer, se puede detectar también la esfingomielina. Esto se logra realizando previamente una saponificación, un tratamiento con una base, KOH. Se saponifica la fosfatidilcolina, los ácidos grasos pasan a formar jabones, pero no así la esfingomielina, que posteriormente puede ser detectada con el método de Backer. El método de OTAN distingue entre fosfolípidos insaturados hidrófobos y fosfolípidos insaturados hidrófilos. Para ello utiliza el osmio como tetróxido de osmio, que en presencia de dobles enlaces se reduce formando un precipitado de color negro y oxidando el doble enlace a aldehídos. Cuando se le agrega clorato de potasio, el osmio se reduce a nivel de los lípidos insaturados hidrófobos, pero no a nivel de los hidrófilos porque penetra en ellos impidiendo su reducción, así se forma un precipitado color negro sólo en los lípidos hidrófobos. Cuando ponemos tetróxido de osmio en presencia de clorato de potasio, se presentan de color negro sólo los lípidos insaturados hidrófobos. Primero se une el osmio a los dobles enlaces insaturados formando un éster cíclico. Al agregar el clorato de potasio, penetra a los lípidos hidrófilos y no a los hidrófobos impidiendo que el osmio unido a los dobles enlaces se reduzca, fenómeno que sí sucede en los lípidos hidrófobos, formándose un precipitado negro de dióxido de osmio. La detección del osmio oxidado unido a los lípidos hidrófilos se realiza agregando α-naftilamina formando un quelato insoluble de color rojo. Entonces, en esta reacción: lípidos insaturados hidrófilos → color rojo. lípidos insaturados hidrófobos → color negro. Es una técnica cara por la utilización del osmio. REACCIÓN DEL PLASMALÓGENO Los plasmalógenos son fosfolípidos que tienen como alcohol un glicerol y en el C1 en lugar de tener un ácido graso tienen un grupo aldehído con una larga cadena de carbonos (18C-20C) con cola apolar unido a través de una unión éter-vinílica con el glicerol y unido al fosfato está un grupo etanol-amina o colina, pero con mayor frecuencia se encuentra el etanol-amina. Esta reacción se hace siempre en tejidos congelados. El grupo aldehído presente en el C1 es fácilmente hidrolizado. Se utiliza cloruro de mercurio a un pH más o menos ácido. En un tiempo corto se forma un compuesto hemi acetal inestable. Está unido el mercurio por uniones hemi acetal y después rápidamente esta unión inestable se va a disociar en dos: alcohol y unido al tejido va a quedar el aldehído. Este aldehído se va a detectar con el reactivo de Schiff. En general no interesa el estudio de plasmalógenos, pero hay que saber que al trabajar con tejidos congelados, al ponerlo en cualquier solución con pH ácido fácilmente el aldehído de los plasmalógenos se va a disociar produciendo una reacción PAS positiva en forma espontánea. Por esto se recomienda

hacer siempre un control cuando se trabaje identificando glicolípidos porque se puede confundir la presencia de plasmalógenos con glicolípidos. La reacción del plasmalógeno es muy sencilla, en lugar de hacer la hidrólisis con cloruro de mercurio se podría hacer con ácido clorhídrico 6N, es mucho más eficiente para hacer la hidrólisis, el problema es que es mucho más drástico y el tejido congelado es más delicado que el tejido incluido. Posteriormente se separa en alcohol y aldehído, pudiendo detectar el aldehído con el reactivo de Schiff. Siempre hay que hacer un control con esta técnica, un corte tratado con cloruro de mercurio y otro sin tratar y luego poner en el reactivo de Schiff. DETECCIÓN DE COLESTEROL No existe una buena técnica para detectar colesterol. Primero se realiza la oxidación del colesterol con alumbre de fierro a nivel del C7. una vez oxidado se detecta con una mezcla a partes iguales de ácido acético y ácido sulfúrico, ambos P.A. La mezcla tiene que ser en frío. Una vez que el colesterol ha sido oxidado por 3-4 días, si es más tiempo es mejor, se lava el tejido y se le agrega la mezcla de ác. acético-ác. sulfúrico y en los lugares en que hay colesterol aparece un color verde. Es una reacción inestable y caprichosa. El color verde dura aproximadamente 30 min. y si aparece color rojo, no es colesterol, tiene que ser color verde. El color rojo corresponde a otros pigmentos presentes en el tejido. Es una técnica drástica debido a la utilización de la mezcla de ác. acético-ác. sulfúrico que daña el tejido, observándose una mala conservación de la morfología. EXTRACCIÓN DIFERENCIAL DE LÍPIDOS Si se quiere estudiar triglicéridos, fosfolípidos u otro lípido en particular. Se puede complementar el estudio con la realización de una extracción diferencial de lípidos. Se hace con solventes a distintas condiciones y extraen determinados lípidos.

Solventes orgánicos Lípidos extraídos Acetona fría anhídrida Triglicéridos, colesterol

(lípidos hidrófobos) Acetona caliente Cerebrósidos Cloroformo-metanol Todos los lípidos Piridina a 60°C Todos los lípidos (menos los unidos

fuertemente a proteínas) Cuando se hace un estudio de lípidos siempre hay que hacer este tipo de controles para caracterizar bien lo que se está identificando

IDENTIFICACIÓN DE MIELINA La mielina se forma a partir del enrollamiento de la membrana plasmática de las células de Schwann vecinas. Composición lipídica de la mielina: • colesterol en gran cantidad. • pocos triglicéridos porque en las membranas hay pocos. • cerebrósidos. • sulfatidos, que son cerebrósidos con grupos sulfatos. • fosfatidilcolina que son los que se van a cromar. • esfingomielina Métodos para la detección de mielina • Hemateína ácida de Backer: detecta esfingomielina y fosfatidilcolina. • Método de OTAN: detecta lípidos insaturados hidrófilos e hidrófobos. En el caso de la mielina se

verá principalmente de color rojo por los fosfolípidos. • Métodos que utilizan mordientes + hematoxilina: estos son los métodos más utilizados en tejidos

incluidos en parafina. • Luxol fast blue: es el método más fácil. Para los tejidos incluidos en parafina se recomienda fijar en formol calcio 2-3 días, con lo que se logra conservar bien los haces gruesos de mielina y realizar luego una cromación para conservar bien haces finos de mielina. La cromación se realiza con dicromato de potasio 2.5% durante 3-4 días. Luego lavar bien en agua corriente por 16 hrs. y realizar la inclusión en parafina. De esta forma se conserva bien la mielina que ya está totalmente insolubilizada. Los métodos que utilizan hematoxilina utilizan como mordientes más comunes alumbre de fierro, cloruro de fierro, carbonato de litio, dicromato de potasio. Incluso los tejidos que han sido cromados, tienen incorporado cromo en el tejido como cromato de colina y se utiliza como mordiente. Para detectar los metales se usa hematoxilinas que han sido oxidadas químicamente o que han sido oxidadas en forma natural dejándolas al aire para que se forme la hemateína que se une al metal. Luego de la tinción con la hemateína se diferencian, para esto se puede usar el mismo mordiente (competencia). Con la diferenciación, las zonas en que la hematoxilina está unida débilmente se diferencian rápidamente y se pueden detectar finos haces de mielina. Estos estudios se usan en los servicios de neuroanatomía. Luxol fast blue Es la técnica más usada por ser sencilla, pero es poco específica. El luxol fast blue es un derivado de las ftalocianinas igual que el alcian blue. Las ptalocianinas se forman por condensación de 4-amino, 3-iminoindoleinas con un cobre central. El luxol fast blue tiene grupos sulfato y el auxocromo es una diaril guanidina que es un catión. Es un derivado de las ptalocianinas cúpricas, tiene un auxocromo diaril guanidina, es un colorante básico. La característica que tiene es que es muy soluble en los fosfolípidos, lo que podría ser el mecanismo de tinción. Probablemente uno de los mecanismos que participarían en la tinción, que es muy sensible, es la disolución en la fosfatidilcolina y en el etanol-amina, en los dos fosfolípidos que tienen colina. No es específico, como es un colorante catiónico puede teñir también proteínas, pero se puede detectar bien los haces de mielina. Da un color azul fuerte.

L I P I D O S

29 de Octubre de 2002 Cecilia Alliende

Fijación

El formol preserva bien a las grasas neutras sin que estas sean considerablemente extraídas. Esto se debe a que son lípidos apolares hidrófobos muy estables los cuales no necesitan una verdadera fijación. Es muy importante fijar a las estructuras que rodean a los lípidos. Se debe evitar: alcohol, acetona y los fijadores ácidos producen hidrólisis de los ácidos grasos del glicerol u otro alcohol.

Una fijación prolongada con formol no produce una mayor pérdida de los lípidos

apolares, triglicéridos y colesterol. Cuando se fijan fosfolípidos o lípidos polares, una cantidad considerable de lípidos

entra en solución por acción del formol. Esto se debe a que la parte polar de los lípidos es fuertemente hidrófila, al atraer agua el lípido aumenta su volumen y se forman las figuras mielínicas las que son fases intermedias en la disolución de los lípidos.

Para disminuir la disolución de lípidos se le agrega calcio o cadmio al formol, se

incrementa la preservación de fosfolípidos posiblemente por la formación de un complejo lipídico insoluble. El calcio forma sales con los grupos fosfatos.

En el trabajo de Roozemond (1969) se han visto los siguientes resultados:

Medio % fosfolípidos extraídos

Agua 7.1 +/- 0.6 1% CaCl 2 +/- 0.3 4% formaldehído 2.7 +/- 0.3 4% formol + 1% CaCl 1.3 +/- 0.3

Las sales de Ca no son totalmente efectivas en la insolubilización de los lípidos.

Después de fijar en formol – calcio se hace una postcromación que insolubiliza a los lípidos hasta el punto que puedan incluirse en parafina.

Los tejidos se tratan un tiempo prolongado con dicromato de potasio a temperatura

ambiente y a 60º C. Además sugiere la formación de un complejo salino por combinación de los iones

Cr2O7 y un grupo amonio cuaternario fuertemente ionizado de la colina. En un comienzo se sostuvo que el dicromato actuaría como oxidante a nivel de los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados, ocurriría una oxidación y polimerización lo que provocaría pérdida de solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos.

Lo anterior no parece ser efectivo. Casselman comprobó con fosfatidilcolina sintética que contenía sólo ácidos grasos saturados que los lípidos se cromaban perfectamente.

Trabajos de Bourgeous y col. (1962) y Adams (1965) han demostrado por test

realizados in vitro y estudios cromatográficos que sólo los fosfolípidos que contienen colina, fosfatidilcolina y esfingomielina fijan el cromo.

La presencia de grupos insaturados no pareciera tener una importancia fundamental

en el mecanismo de reacción, pero es posible que jueguen un papel accesorio intensificando la reacción.

IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS POR LISOCROMOS

Los lisocromos no son verdaderos colorantes pues a pesar de poseer grupos cromóforos no presentan auxocromos, por lo tanto no se unen a los lípidos por mecanismos electrostáticos. Los lisocromos colorean a los lípidos porque se solubilizan en los lípidos. Los lisocromos no son ionizados ni ionizables (¿?) son insolubles en agua.

Condiciones óptimas de un lisocromo:

1. debe ser muy soluble en lípidos 2. no tener afinidad por otros constituyentes celulares (no presentan grupos

auxocromos iónicos) 3. debe ser suficientemente coloreado para ser puesto en evidencia con un contraste

satisfactorio 4. que se disuelva en solventes que no extraigan gran cantidad de lípidos.

El solvente utilizado debe disolver el lisocromo, pero no demasiado para que la

transferencia hacia el lípido sea rápida. En este tipo de coloración hay una simple transferencia del lisocromo desde el solvente en el cual se encuentra el lisocromo al lípido al cual va colorear. La condición fundamental de este tipo de coloración es que el coeficiente de reparto esté a favor de una disolución del lisocromo en el lípido. Los lisocromos son más solubles en el lípido que en el solvente utilizado.

Los colorantes liposolubles son utilizados en un solvente elegido de tal suerte que el

coeficiente de reparto entre la sustancia lipídica y el solvente sea muy grande. El coeficiente de reparto de una sustancia entre dos líquidos no miscibles A y B es la

razón entre la concentración A/B de la sustancia respectiva en los líquidos A y B.

K = A/B

A una temperatura determinada el coeficiente de reparto es una constante. Cuando un corte de lípidos es tratado con un lisocromo en un solvente determinado este pasa a la sustancia grasa hasta que se alcanza un equilibrio, es pues una transferencia de un solvente mediocre a un buen solvente. Principales lisocromos:

Sudan III Sudan IV (colorea en forma más intensa)

Sudan III y IV al ser estudiados cromatográficamente se encontró que son una mezcla

de colorantes. Sudan III: uno o dos colorantes mayores y tres o cuatro componentes menores. Sudan IV es una mezcla de 4 componentes mayores con 3 menores.

Son colorantes ortoazoicos con un grupo OH fenólico o naftólico que debería funcionar

como auxocromo, sin embargo, a causa de la proximidad del grupo azoico –N=N- en posición orto se tautomeriza y así la capacidad de ionizarse del grupo OH es anulada.

Sudanes III comerciales varían en su composición y calidad de tinción.

Para teñir lípidos neutros hidrófobos el más recomendado es el Red Oil, tiñe

triglicéridos y esteres de colesterol. Para teñir todo tipo de lípidos se utiliza el Negro Sudan introducido por Lison (1934).

Su estructura química es única entre los colorantes de los lípidos pues se trata de un colorante azoico portador de dos grupos aminos secundarios. Comercialmente se vende como una mezcla de 2 isómeros orto y para. En soluciones antiguas se forman por descomposición de los …..otros colorantes que tiñen proteínas y ácidos nucleicos (soluciones de 1 semana).

Con el negro sudan B se demuestran lípidos hidrófobos e hidrófilos. Tiñe: triglicéridos, esteres de colesterol, ácidos grasos, cerebrósidos, fosfolípidos.

Sudan B puede disolverse en lípidos hidrofóbicos, pero además en virtud de sus dos

aminos secundarios potencialmente ionizables también puede actuar como colorante catiónico y se une al fosfato de los fosfolípidos en los cuales es más soluble que los otros sudanes. El isómero para es más básico que el orto a causa que en el orto un N ionizable está unido por puentes de H a un N del grupo azo lo que impide la ionización.

El negro sudan es muy sensible. Tiñe pequeños depósitos de lípidos, es el lisocromo de

elección para el estudio de lípidos en general. Los lisocromos se pueden disolver en los lípidos a temperaturas superiores al punto de

fusión. Los lípidos cuyos ácidos grasos son todos saturados tienen un punto de fusión cercano a 60º C.

Los lípidos insaturados son líquidos a temperatura ambiente. El colesterol tiene un punto de fusión 150º C y sus esteres saturados también tienen un alto punto de fusión. Se pueden teñir estos lípidos con sudan negro si los cortes son primero bromados. El bromo reacciona con los enlaces insaturados de los ácidos grasos y también con el colesterol para formar un aceite el cual es líquido a temperatura ambiente.

La técnica bromación – negro sudan reacciona con todos los lípidos. Los únicos no

teñidos serían los triglicéridos cuyos ácidos grasos son todos saturados. Si se omite la bromación no se tiñe el colesterol libre.

El negro sudan en soluciones ácidas se descompone con formación de productos de

hidrólisis de color café capaz de colorear los núcleos, proteínas y mucopolisacáridos. Se considera como tinción de lípidos sólo las coloraciones negras. Solventes más utilizados que extraen menos lípidos:

Propilenglicol al 100% Alcohol etílico 70% Alcohol isopropílico 65%

Métodos que caracterizan los lípidos en forma diferencial

1. Carácter ácido o neutro de los lípidos 2. Fosfolípidos 3. Plasmalógeno 4. Colesterol y sus esteres

1.-Carácter ácido y neutro de los lípidos

El azul de Nilo comercial no es un producto puro. Está formado por una oxaxina de color representada por el sulfato azul de Nilo. Colorante básico insoluble en lípidos, soluble en agua y alcohol. Oxaxina….. que contiene O: Oxaxona insoluble en agua pero soluble en lípidos es un lisocromo llamado Rojo de Nilo. Mecanismo de coloración: El rojo de Nilo es un lisocromo y colorea como tal disolviéndose en los lípidos (grasas neutras) en fase líquida.

El azul de Nilo es un colorante básico que colorea a todos los grupos ácidos, sean provenientes de lípidos o no. Los lípidos que tienen grupos ácidos se tiñen intensamente enmascarando la coloración rosada; cuando hay una mezcla de lípidos ácidos y neutros se ven de un color azul rojizo. Las grasas neutras se ven de un color rosado cuando están en gran cantidad (poco sensible).

Con el sulfato de azul de Nilo además de teñirse los ácido grasos libres que pueden

estar en ciertas patologías una gran cantidad también se pueden teñir los fosfolípidos, glicolípidos, colesterol y sus esteres.

Sulfato de azul de Nilo sirve como un test preliminar para indicar la distribución de

lípidos neutros versus los ácidos. Si se remueven los lípidos hidrofóbicos por acetona solo se tiene la tinción azul

correspondiente a lípidos ácidos. Se debe utilizar aa un pH no ácido ( a pH ácido la tinción de lípidos es …..

2.- Identificación de fosfolípidos Fosfolípidos:

Fosfoglicéridos: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilhidroxiprolina, plasmalógeno.

Esfingolípidos: esfingomielina

Los fosfolípidos se encuentran casi exclusivamente en membranas celulares y lipoproteínas. Solamente se presentan trazas de ellos en los depósitos de grasas neutras. Su papel principal sería estructural , no se almacenan en gran cantidad.

Para identificar fosfolípidos que contienen colina el método de Baker (1946) es la

técnica más utilizada: 1. fijación con formol-calcio, una fijación corta (6 horas). El Ca insolubiliza a los

lípidos por formación de complejos o formando sales con los grupos fosfatos. La fijación debe ser corta para evitar solubilización de los grupos fosfatos.

2. postcromación con dicromato de potasio (mecanismo visto en fijación).

Los fosfolípidos se vuelven completamente insolubles en solventes orgánicos después del tratamiento con el Cr resisten la inclusión en parafina; el mecanismo de cromación no se conoce bien, probablemente participan los dobles enlaces y la colina.

En la técnica de Baker el tiempo de cromación no debe exceder al indicado en la

técnica, pues en cromaciones más prolongadas el Cr se une a los grupos ácidos.

3. el cromo ligado a los fosfolípidos se reconoce con la hemateína ácida, se forma una laca con la hemateína.

4. diferenciación en una solución alcalina de ferrocianuro de potasio. Tiñe estructuras como mitocondrias y la mielina que contiene esfingomielina y fosfatidilcolina.

Además del valor histoquímico de identificar fosfolípidos…en…, el método de Baker

es el mejor método para teñir mitocondrias. El modo de acción del diferenciador es desconocido. Baker sugiere que puede oxidar la hemateína a un compuesto más débilmente teñido.

Especificidad … la fosfatidilcolina y esfingomielina dan reacción positiva, el resto de

los fosfolípidos dan una reacción muy débil. También tiñe otras sustancias no lipídicas como: ácidos nucleicos y proteínas con grupos prostéticos metálicos como la hemoglobina,…

Control : extracción con piridina a 60º C, se extrae gran parte de los fosfolípidos, los

fosfolípidos fuertemente unidos a proteínas no se extraen. Una sustancia que se tiñe con el método de Baker antes de la extracción con piridina y después da tinción negativa se debe considerar como fosfolípido. Una sustancia que se tiñe y continúa teñida después de la extracción con piridina no se puede concluir que no sean fosfolípidos porque existen fosfolípidos fuertemente asociados a proteínas que no son extraídos con piridina caliente.

El método de Baker es un método muy sensible. Las uniones esteres entre ácidos grasos y glicerol pueden ser rotas por una hidrólisis

alcalina, saponificación (¿?). Los ácidos grasos son liberados como jabones solubles. La unión amida de los ácidos grasos con la esfingosina no es hidrolizada en las mismas

condiciones de tiempo y temperatura. Consecuentemente los ácidos grasos de la esfingomielina no son hidrolizados después de la saponificación y pueden ser detectados con el método de Baker (saponificación-método de Baker es específico para la esfingomielina).

El inconveniente de la técnica de Baker es la larga duración (6 días)

Método de OTAN Se utiliza para distinguir en un mismo corte lípidos insaturados hidrófobos de los lípidos insaturados hidrófilos. Una mezcla de …………

No es reducido más que a nivel de los lípidos insaturados hidrófobos, pero no a nivel de lípidos insaturados hidrófilos. El clorato de potasio penetra en las miscelas de lípidos insaturados hidrófilos e impide la reducción del tetróxido de osmio, pero el osmio no reducido se une a los dobles enlaces de los lípidos hidrófilos insaturados y puede ponerse en evidencia por una reacción de quelación por medio de α naftol ….con la cual da una coloración roja.

Los lípidos saturados no reducen ni fijan el ….y quedan..

Resultados con OTAN: Lípidos insaturados hidrófobos : color negro Lípidos insaturados hidrófilos : color rojo.

3.- Identificación de plasmalógeno

El plasmalógeno se caracteriza por poseer un aldehído superior estearico o palmítico unido por unión eter vinilica al glicerol.

Para identificar el plasmalógeno se utiliza la reacción plasmal introducida por

Feulgen y Volt (1924). En cortes de tejido sin fijar se realiza un breve tratamiento con cloruro de mercurio

al 1% el que libera al grupo aldehído del plasmalógeno al que se identifica con el reactivo de Schiff.

El mercurio se une al doble enlace de la unión vinílica. El producto inicial es un

hemiacetal inestable el cual se disocia en alcohol y aldehído. El cloruro de mercurio queda unido al C2 del aldehído el que es detectado por el reactivo de Schiff.

El eter vinilico es fácilmente hidrolizable en un medio ácido HCl 6 N, es más

efectivo que HgCl2 pero no es utilizado porque es más drástico. Si se omite el tratamiento con HgCl2 y se deja un tiempo prolongado (más de 20

minutos) en el reactivo de Schiff se produce la hidrólisis del aldehído por el pH ácido del reactivo.

Cuando se realiza la reacción se debe con reactivo de Schiff (¿?)

1 corte tratado con HgCl2 1 corte sin hidrólisis tinción corta con reactivo de Schiff (10 minutos).

4.- Colesterol Método de Schultz

Oxidación del colesterol, 7 dehidroxicolesterol con alumbre férrico. El colesterol oxidado se trata con una mezcla a partes iguales de ácido sulfúrico y ácido acético.

Específica para el colesterol y sus esteres. Es inestable de color verde característico de la reacción, dura poco tiempo. Es específica pero poco sensible. Reacción digitonina

Antes de teñir con el método de Schultz para distinguir entre colesterol libre y sus esteres se trata el tejido con digitonina. Extracción diferencial de lípidos con solventes orgánicos.

Acetona fría totalmente anhidrida: triglicéridos y colesterol (lípidos hidrofóbicos), cerebrósidos.

Acetona caliente Cloroformo-metanol: todos los lípidos Piridina caliente: todos los lípidos excepto aquellos fuertemente unidos a proteínas.

Para disolver los lípidos fuertemente unidos a proteínas se usa un solvente acidificado,

rompe unión lípido-proteína y disuelve los lípidos. Mielina

Algunos axones del sistema periférico están rodeados de una vaina de mielina y contiguo a la vaina de mielina hay una capa de células de Schwann, se enrolla espiralmente en torno al axón puede ser muy grueso (100 capas concéntricas).

La vaina de Schwann y la vaina de mielina están interrumpidas a intercvalos

regulares por los nódulos de Ranvier que son puntos de discontinuidad entre las células de Schwann vecinas a lo largo del axón. Aquí el axón está en parte desnudo pues queda envuelto incompletamente por la compleja ordenación de expansiones de las células de Schwann.

En el SNC las células de Schwann son reemplazadas por células de la

oligodendroglia.

Químicamente la mielina consiste en una mezcla de lípidos complejos y proteínas. La fracción lipídica constituye alrededor del 60 a 70% de la mielina, contiene grasas neutras, fosfolípidos, cerebrósidos y colesterol.

Como estos fosfolípidos están en su mayor parte unidos a proteínas son

parcialmente extraídos en la inclusión en parafina. El método de Baker demuestra mielina pero como es un método muy largo requiere cortes por congelación se han desarrollado algunos métodos que identifican mielina en tejidos incluidos en parafina.

Hay 2 metódicas más utilizadas: 1. métodos que utilizan un mordiente y hematoxilina 2. métodos que utilizan luxol fast blue, colorante derivado de las ptalocianinas de

cobre. Fijación para incluir en parafina:

Trozos de tejidos se fijan 2 a 3 días en formol-calcio, cromación con bicromato de potasio al 2.5 % durante 3 a 4 días. Lavado con agua corriente 15 a 16 horas, incluir en parafina.

Materiales fijados sólo en formaldehído sin cromación tiñen bien a las fibras

gruesas de mielina, fibras finas requieren ser cromadas para su conservación. Si los tejidos han sido cromados y los cortes se tiñen con hematoxilina se forma una

laca con el cromo unido a los fosfolípidos y después se diferencia hasta que se destaquen solo las fibras mielínicas.

Como diferenciadores se utiliza ferrocianuro alcalino. Si los tejidos no han sido cromados como mordientes se utilizan sales de fierro

(alumbre de fierro o de litio (carbonato de litio), etc. Después se tiñen con hemateína y se diferencian con alumbre de Fe, cloruro de Fe o

ferrocianuro de potasio saturado con carbonato de litio. El principal inconveniente de estos métodos es la diferenciación que es crítica y que

demora varios días. Luxol fast blue es un colorante catiónico derivado de las ptalocianinas de cobre, la

estructura exacta del colorante no se conoce, serían sales de aril guanidina:

Es insoluble en agua y es utilizado en solución alcohólica. Luxol fast blue es muy soluble en fosfolípidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. Esta solubilidad puede ser la base para teñir la mielina. No es específico, probablemente también entre en los dominios hidrofóbicos de algunas proteínas.

El catión arilguanidico es liberado a la solución en el momento de la tinción dejando solo el …..coloreado.

Si se contrasta con un colorante catiónico rojo o violeta como cresil violeta no se ve

una solamente a los ….sustancia de Nissl sino también a los aminos de luxol fast blue presentes en la mielina incrementando la intensidad de la coloración.-

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 1

Aplicaciones de la Histoquímica al Diagnóstico de Enfermedades Relacionadas con Transtornos del Almacenamiento de Lípidos

Prof. Esteban Órdenes G. Miércoles 30 de Octubre de 2002

En esta clase trataremos algunas aplicaciones de la Histoquímica al estudio de los lípidos en

condiciones patológicas, especialmente relacionadas con transtornos en el almacenamiento de éstos. Las aplicaciones más frecuentes de las técnicas hasta ahora desarrolladas en nuestras actividades prácticas de laboratorio son las siguientes:

• Hepatopatías: esteatosis, cirrosis de Laenec, lipoidosis. • Vesículopatías: colesterolosis vesicular • Cardiovasculopatías:ateromatosis, cardiomiopatía xantomatosa, degeneración grasa, • Neuropatías. Enfermedades desmielinizantes • Neoplasias. Liposarcomas, etc.

En las patologías hepáticas, una de las alteraciones más comunes es la esteatosis (presencia de

una gran vacuola lipídica en célula parenquimatosa) así como la cirrosis con esteatosis, particularmente en este caso la Cirrosis de Laennec de tipo nutritivo-alcohólica, y las lipoidosis (infiltración de tejido adiposo en el tejido, por ejemplo en páncreas). La lipoidosis no suele darse en hígado.

Respecto de la patología vesicular lo más usual es la colesterolosis vesicular; no siempre es necesario estudiar los lípidos para el diagnóstico, aunque en algún caso se podría requerir. Importantes son las cardiovasculopatías, éstas son una de las causas principales de muerte en el mundo actualmente, principalmente por la arteriosclerosis. La ateromatosis es un depósito de sustancias de origen lipídico que se acumulan en las paredes vasculares, susceptibles también de ser estudiadas con HQ. También hay cardiomiopatías que cursan con acumulación de lípidos, como por ej la xantomatosis (xantoma: acumulación de lípidos en ciertos tejidos), por células como histiocitos cuyo citoplasma es de aspecto espumoso. Pueden encontrarse xantomas en la piel como zonas de manchas amarillas solevantadas populares constituidas por múltiples acúmulos de células de aspecto espumoso similares a las de la suprarrenal. Hay también una cardiomiopatía xantomatosa en que se acumulan este tipo de células; también degeneración grasa o esteatosis en músculo cardíaco.

Las neuropatías, bastante importantes en clínica, especialmente las que cursan con cuadros desmielinizantes por diversos orígenes, pudiendo estudiarse la mielina u otros compuestos lipídicos. Por último algunas de las neoplasias se caracterizan por presentar lípidos, y antes de la IHQ se usaba el estudio de lípidos para determinar, por ejemplo, si un tumor pleomórfico era un liposarcoma. A continuación se presenta una tabla de alteraciones cardiovasculares y aplicaciones histoquímicas al estudio de éstas:

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 2

Aplicaciones de la Histoquímica a la Patología Cardiovascular

Condición Material detectado Técnica Aterosclerosis Colesterol libre y esterificado Negro Sudán B

Bromuro-Negro Sudán B Oil Red O +Luz polarizada PAN

Cambios reparativos en la Aterosclerosis

Macrófagos y lípidos de ateroma Esterasa-Negro Sudán B β-Galactosidasa-Oil Red O

Infarto al Miocardio Deshidrogenasas Prueba del Nitroazul tetrazolio Amiloidosis Primaria Amiloide Rojo Congo Enfermedad de Pompe Glicógeno Carmin de Best

P.A.S.-Diastasa Degeneración grasa Triglicéridos Negro Sudán B

Oil Red O Atrofia parda Lipofuscina Schmorl

P.A.S. Ziehl-Neelsen Autofluorescencia

Cardiomiopatías Nervios adrenérgicos Fluorescencia inducida por catecolamina-Formaldehído

a) Obstructiva b) Metabólica (inducción por alcohol y drogas) c) Xantomatosa infantil (histiocitoide)

Triglicéridos

Negro Sudán B Oil Red O

Fuente: En el caso de la aterosclerosis se detecta colesterol esterificado o libre en las placas ateromatosas; se podrían estudiar tempranos acúmulos de colesterol libres o conjugados (esteroficados) en la íntima de las arterias, usándose el Sudan Black B, Oil red O y también luz polarizada. El colesterol puede estar en alguna de sus formas cristalizado y presentar birrefringencia. (interviene la inefable Prof. Alliende y dice(EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEÉSTA ES LA PREGUNTA, JAJAJA): El colesterol esterificado se detecta con el Sudán y el Oil red porque es apolar y está líquido, en tanto el que está libre está cristalizado, entonces para detectarlo hay que tratarlo con Bromo y una vez bromado éste permite que se licúe y se pueda entonces detectar con el negro Sudán u otra tinción) Claro, la otra técnica mencionada es la del Sudan Black B con Bromo. En los cambios reparativos en la arteriosclerosis hay macrófagos y lípidos del ateroma, se pueden estudiar enzimas para detectar los cambios de los macrófagos, para los lípidos Sudan Black B o para los macrófagos usar técnicas de IHQ con marcadores específicos para éstos (CD-68, CD-31 o α1-antiquimotripsina) o estudiar la β-Galactosidasa, enzima presente en los macrófagos. A continuación se mostrará una fotografía donde se demuestran simultáneamente la enzima, presencia de macrófagos y de lípidos. El infarto miocárdico, en particular, se relaciona con la presencia de lípidos, estudiándose en ese caso la presencia de deshidrogenasas. En esta tabla se mencionan otras patologías como las amiloidosis, acúmulos de glicógeno y otros; degeneración grasa, estudio de triglicéridos en que se emplean Oil red y Sudán Black. Luego veremos los pigmentos y lipofuscina y sus reacciones; existen los denominados lipopigmentos o lipofuscinas que reaccionan positivamente para Sudán entre otras reacciones; por ende no hay que confundirse cuando por ejemplo en corazón se observa un lipopigmento alrededor de los núcleos y el citoplasma, que es la lipofuscina y que da positividad para Sudán Black B después de la inclusión en parafina, con lípidos verdaderos como grasas neutras que pudieran encontrarse en una degeneración grasa. Se mencionan también cardiomiopatías metabólicas inducidas por ingesta de alcohol y drogas con acumulación de grasas en

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 3 el músculo cardíaco. En este caso veremos triglicéridos con las técnicas de Sudan Black B y Oil red O, y también con los Sudanes III y IV. Se prefiere el Sudán Black porque destaca más y el Oil red también, dan una tinción más intensa. Y lo último mencionado son las xantomatosis del corazón. Los lípidos se encuentran en macrófagos de aspecto espumoso o histiocitos. En la fotografía se observa una lesión arteriosclerótica en la íntima de una arteria teñida con Sudán III y la reacción para histiocitos:

Este es un proceso arteriosclerótico en vías de reparación. Ha sufrido complicaciones, como ocurre normalmente en la arteriosclerosis, cuáles son estas complicaciones? Calcificación, ulceración, fibrosis, entre otras. La fibrosis ocurre con un fenómeno reparativo, pues hubo daño, se acumularon lípidos, se hizo papilla y luego viene el cuadro regenerativo con fibrosis, y cuando empieza ésta habitualmente llegan histiocitos a la zona que pueden ser detectados

por la reacción de la β-galactosidasa (en azul) y la presencia de lípidos (en rojo). Esto no es necesario para el diagnóstico, pero en estudios de investigación en que se requiera estudiar la evolución del proceso estas herramientas son útiles. Enfermedades o neuropatías desmielinizantes que pueden afectar el SNP o SNC; se mencionan algunas patologías que afectan al SNC:

• Esclerosis múltiple • Encefalitis virales • Encefalitis por priones • Deficiencias vitamínicas • Intoxicaciones

Éstas pueden llevar a desmielinización de los axones en el SNC. En la página siguiente se muestra una tabla de enfermedades del SNC que se tomó de un libro de Aplicaciones de Histoquímica a la Patología; en esta tabla aparecen desde gangliosidosis (enfermedades por acumulación de lípidos que afectan al SNC), hay varias, la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Batten, la de Gaucher, la de Krabbe y otras, la leucodistrofia metacromática, la de Niemann-Pick tipos A y B, etc. En la tabla se menciona el defecto enzimático (lo mismo ocurre en enfermedades por acumulación de glicógeno), el sustrato que se acumula (en el caso de la enfermedad de Gaucher es un glucocerebrósido, en Niemann-Pick es esfingomielina y colesterol), los sitios típicos de almacenamiento; no solamente el SNC está comprometido, sino también hígado, bazo, pero típicamente en cada enfermedad presentan tendencia a acumularse en un determinado órgano, lo que es importante para hacer el diagnóstico. Por ejemplo en Niemann-Pick se acumula en la sustancia blanca y neuronas, en el bazo, hígado, músculo y endotelio. Otros aspectos señalados en la tabla son los sitios para diagnóstico por microscopía y las técnicas de tinción. Muchas de estas sustancias son P.A.S. (+), cuando son glicolípidos, además de presentar reactividad con técnicas como Sudán, luz polarizada u otras. En muchos casos se puede estudiar la mielina con técnicas específicas para ésta y ver si recubre los axones o no.

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 4

Aplicaciones de la Histoquímica al estudio de los Desórdenes Metabólicos del Sistema Nervioso

Desorden Defecto Substancias

estudiadas Sitios de

AlmacenamientoTejido a analizar

Métodos de Tinción y otras

pruebas Gangliosidosis-GM1 (2 tipos)

β-Galactosidasa Gangliósido-GM1, oligosacáridos, tetrahexósido ceramida

Neuronas, hígado, bazo, riñón

Sangre, médula ósea, biopsia rectal, hígado

P.A.S., Tionina, β-Galactosidasa, TLC, ME

Gangliosidosis-GM2 (muchos tipos, Tay-Sachs, Sandhoff, etc)

Hexosaminidasa Gangliósido-GM2, trihexósido ceramida

Neuronas Biopsia rectal

P.A.S., Tionina, TLC

Enfermedad de Batten (lipofuscinosis ceroide) muchos tipos

Desconocida Substancias de tipo lipofuscina

Neuronas, músculo, hígado, riñón, páncreas, células sanguíneas, glándulas sudoríparas

Biopsia rectal, sangre

P.A.S., Negro Sudán, Luxol fast blue, Fosfatasa ácida, Autofluorescencia, ME

Enfermedad de Gaucher (3 tipos)

Glucocerebrosidasa (β-glucosidasa)

Glucocerebrósido Bazo, hígado, núcleos basales cerebrales (forma infantil)

Médula ósea, hígado

P.A.S, Fosfatasa ácida, TLC, ME

Leucodistrofia de Krabbe

Galactocerebrosidasa Gactocerebrósido Sustancia blanca cerebral en células globoides

Cerebro (nervio periférico)

P.A.S., Fosfatasa ácida, Leasing nervioso, TLC, ME

Leucodistrofia Metacromática (sulfatidosis)

Aril sulfatasa A Sulfátidos Sustancia blanca cerebral, nervio periférico, riñón, vejiga urinaria

Orina, nervio periférico (biopsia de piel)

Violeta de cresilo fast, azul de toluidina, acriflavina-DMAB, TLC

Enfermedad de Niemann-Pick tipo A (infantil)

Esfingomielinasa Esfingomielina, colesterol

Neuronas, sustancia blanca, bazo músculo, hígado, endotelio

Sangre, médula ósea, hígado, biopsia rectal

Negro Sudán, hemateína ácida, fosfatasa ácida, TLC, ME

Enfermedad de Niemann-Pick tipo B(adulto)

Esfingomielinasa Esfingomielina, colesterol

Bazo, hígado, músculo

Médula ósea, hígado, biopsia rectal (para excluir participación neuronal)

Negro Sudán, hemateína ácida, fosfatasa ácida, TLC, ME

Enfermedad de Niemann-Pick tipo C (lipoidosis oftalmopléjica)

Desconocida Oligosacáridos ácidos hidrosolubles de composición desconocida

Neuronas, hígado, bazo

Médula ósea, biopsia rectal, hígado

Cell P.A.S., cell dig P.A.S., Fosfatasa ácida, Tionina,TLC, ME

Enfermedad de Fabry

α-Galactosidasa Trihexósido ceramida

Riñón,músculo liso, bazo

Médula ósea, riñón, piel, orina

Negro Sudán, luz polarizada, ME, TLC, u orina

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 5

Enfermedad de Pompe (GSD 2)

α-Glucosidasa ácida (maltasa ácida)

Glicógeno Lisosomas de cualquier tipo celular, núcleo basal cerebral, hígado, corazón, bazo, músculo, endotelio

Sangre, músculo, corazón

Cell P.A.S., Fosfatasa ácida, ME

Mucopolisacaridosis (muchos tipos)

Mucopolisacáridos ácidos (heparan sulfato, condroitin sulfato, queratan sulfato), muchos gangliósidos

Neuronas (no mps), hígado, bazo, corazón

Orina, sangre, hígado, fibroblastos en cultivo

Azul de toluidina, fierro coloidal, P.A.S, ME

Enfermedad de Farber

ceramidasa Ceramidas Gangliósido-GM1

Neuronas, hígado, nódulos linfáticos

Nódulos linfáticos, hígado, biopsia rectal

Negro Sudán, luz polarizada, P.A.S., Tionina, TLC, ME

Adrenoleucodistrofia desconocida Ésteres de ácidos grasos de cadena muy larga

Suprarrenal, sustancia blanca

Suprarrenal, cerebro

ME, GLC, Oil red O, extracción

Manosidosis α-Manosidasa Oligosacáridos que contienen manosa

Neuronas, hígado, bazo, endotelio

Sangre, médula ósea

Cell, P.A.S., ME, TLC

Leyendas: TLC= cromatografía de capa delgada; ME= microscopía electrónica; GLC= cromatografía líquida de gas; cell= celoidinizado; dig= digestión. Fuente:

Es más fácil en todo caso acceder al estudio de enfermedades desmielinizantes del SNP que con frecuencia son secundarias a algún tipo de lesión del nervio:

• Desmielinización segmentaria (primaria) • Neuropatía diabética • Neuropatía diftérica • S. De Giulian-Barré • Degeneración secundaria

Aun así existen algunas patologías desmielinizantes primarias del SNP como ocurre con la desmielinización segmentaria. Una forma experimental de producir una degeneración secundaria es seccionando quirúrgicamente el nervio en algún animal, pudiendo verse un efecto equivalente al de estas enfermedades. Cuando se produce un daño en algún punto del nervio el resto de éste queda como si estuviese seccionado. Si tenemos un nervio normal de un ratón, teñido con una hematoxilina ácida-dicromato que tiñe el nervio de color azul, además de Oil red (lípidos) y verde metilo (núcleos), el aspecto que presenta es el siguiente:

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 6

Prácticamente no se observa grasa (rojo) y la estructura es más o menos homogénea en el corte longitudinal de nervio periférico.

A los 10 días de haber cortado el nervio se encuentra lo siguiente:

La mielina está alterada, gran parte del nervio, con pérdida de mielina en algunas áreas y otras con degeneración de la mielina, su estructura alterada, y se encuentran acúmulos de grasas teñibles con el Oil red, lo que aumenta cuando han transcurrido 14 días desde el seccionamiento (figura siguiente). La mielina sigue degenerando, grandes ramas de nervio sin mielina, queda poca mielina conservada y la cantidad de grasa aumenta.

Se puede entonces hacer el estudio con estas 2 técnicas y evaluar el tiempo transcurrido desde iniciado este fenómeno en un determinado nervio periférico. Como podemos ver este campo es extensísimo y tiene aplicaciones muy especializadas. Básicamente las técnicas son las ya conocidas: Sudán, Oil red, técnicas para mielina (tinción con hematoxilinas especiales, hematoxilinas ácidas, tinciones con osmio [OTAN], luxol). Todas estas patologías mencionadas son muy infrecuentes y se dan fundamentalmente en niños, viéndose más en la bibliografía que en la práctica. Es factible que en algún hospital de niños puedan conocerse. No necesariamente se estudia la A.P. sino el estudio de las enzimas que puedan estar fallando por métodos bioquímicos (muestras de sangre). La mayoría de estas enfermedades no tienen tratamiento. Las enfermedades desmielinizantes son más frecuentes de estudiar cuando su causa obedece a traumatismos, enfermedades virales, en servicios de neuropatología se hacen estudios de este tipo.

En muchos casos el nervio ha sufrido daño hacia proximal, con frecuencia el daño está en un punto más alto en la vía nerviosa, en lesiones del brazo o atrofia muscular ha ocurrido frecuentemente lesión a nivel de la neurona. No siempre es en el nervio la lesión, lo que produce cuadros desmielinizantes.

A continuación veremos una serie de fotografías correspondientes a diversas patologías en las cuales se verán algunas aplicaciones del estudio de lípidos. Lipoidosis hepática de tipo xantomatosa, que no es la típica esteatosis en que los hepatocitos están llenos de lípidos.

Diagnóstico de Histopatología Lipídica- Esteban Órdenes 7

Lípido Solubilidad Colesterol Agua= 0.2mg/100ml

Alcohol= 1.29% v/v Alcohol caliente= 28 g en 100 g de alcohol 96% a 80º Éter= 1 g/2.8 ml Cloroformo= 1 g/ 4.5 ml Piridina= 1 g/ 1.5 ml Benceno, éter de petróleo, aceites, grasas, soluciones acuosas de sales biliares.

Esfingomielinas Alta solubilidad= Alcohol absoluto caliente, ácido acético, cloroformo Baja solubilidad= piridina, éter, acetona, agua (estos últimos casi nada)

Gangliósidos Insolubles en compuestos no polares Solubilidad creciente en compuestos polares de acuerdo con el largo de los residuos carbohidratos y ácido siálico

Cerebrósidos Grasas neutras Solventes orgánicos Lípidos extraídos Acetona fría anhídrida Triglicéridos, colesterol

(lípidos hidrófobos) Acetona caliente Cerebrósidos Cloroformo-metanol Todos los lípidos Piridina a 60°C Todos los lípidos (menos los unidos

fuertemente a proteínas) Saponificación por hidrólisis alcalina Grasas neutras y fosfoglicéridos

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 1

Identificación Histoquímica de Pigmentos Prof. Esteban Órdenes G.

Martes 26 de Noviembre de 2002

En esta clase nos corresponde estudiar sustancias pigmentadas de interés biológico y clínico-patológico. Mencionaremos algunos de ellos y realizaremos el estudio histoquímico de éstos. Si los clasificamos en términos generales, algunos son artefactos introducidos generalmente por la técnica empleada, por ejemplo un fijador a base de mercurio producirá un precipitado pigmentado, también por efectos del fijador, aunque este no deje precipitados puede alterar las sustancias internas como el material sanguíneo para producir pigmentos como el pigmento formolado; otros son pigmentos endógenos parte de los procesos biológicos o patológicos y que serán nuestro foco de atención; y por último pigmentos exógenos introducidos desde el exterior e incorporados al organismo, ejemplo de ello es la antracosis (carbón acumulado en pulmones y ganglios) así como el pigmento de los tatuajes que queda incorporado en los macrófagos de la piel. Una forma de diferenciar pigmentos es su localización, pudiendo agruparse en 2 grandes tipos: pigmentos intracelulares y extracelulares, que prestan gran utilidad al momento de diagnosticar pigmentos. Pigmentos producidos por artefactos:

• Pigmento Formolado: Pigmento fundamentalmente extracelular producido por interacción principalmente de la formalina ácida (habitualmente a pH 3.0-4.0) en tejidos hemorrágicos o muy congestivos. Se ha sugerido que estaría relacionado con las hemateínas (es de origen hemático), se desconoce su estructura no tiene fierro, por lo que no sería equivalente a la hemosiderina que sí tiene fierro, pero es derivado de la interacción con los GR; lo importante es reconocerlo para no confundirlo con otros pigmentos y extraerlo si es necesario. La forma única de identificarlo, porque no se tiñe con otros métodos (no da otras reacciones), salvo que es birrefringente con luz polarizada, se extrae con alcohol-ácido pícrico o Bouin por algunos minutos y desaparece, y se previene usando formalina neutra o tamponada.

Las microfotografías muestra el aspecto del pigmento formolado; en el área hemorrágica se ven áreas más oscuras de color café a negro a campo claro y con luz polarizada se ve birrefringente

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 2

• Pigmento Malárico: Pigmento intracelular de importancia clínica, pues aunque en nuestro país no tenemos focos de malaria, es una de las enfermedades infecto-contagiosas más difundidas en el mundo que da cuenta de la muerte de millones de personas al año. Produce un pigmento especial muy particular parecido al pigmento formolado, pero es menos soluble. Es una hemazoína, que se forma en el interior de glóbulos rojos que contienen el Plasmodium falcíparum u otros plasmodium por interacción de éstos con la Hb; este parásito durante el proceso de parasitismo de los glóbulos rojos detoxifica las moléculas heme que contienen hierro formando un compuesto polimerizado. Se ha observado también en fagocitos que han incorporado glóbulos rojos infectados. Se remueve con alcohol-ácido pícrico, pero con un tratamiento más prolongado que el pigmento formolado.

En la micrografía se ven eritrocitos nucleados de ave, y macrófagos en que se observa el pigmento de color pardo oscuro (indicado con flechas). Es importante como ayuda diagnóstica, si se le encuentra en un frotis sanguíneo debe sospecharse inmediatamente pues siempre está presente, aun cuando no se observe el parásito.

• Pigmento mercurial • Depósitos de dicromato

Estos últimos ya conocidos por los efectos de la fijación y que han sido Pigmentos endógenos:

• Pigmentos de origen hemático o de la cadena respiratoria: Fundamentalmente relacionados

con la hemoglobina. Se pueden clasificar en los siguientes tipos:

Tipo porfirinas

• Porfirinas • Hemoglobinas: No existen métodos específicos histoquímicos de detección de éstas

porque los reactivos disponibles destruyen los tejidos, sólo se detecta por su coloración típica.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 3 • Citocromos • Mioglobina

Metaloproteínas no porfirinas

• Con hierro: Hemosiderina. Pigmento de color pardo, generalmente intracelular (eventualmente se encuentra fuera de la célula pero siempre está dentro de macrófagos, u otras células con capacidad fagocítica), que contiene Fe+++ demostrable con la reacción de Pearls; contiene ferritina (molécula transportadora de fierro en sangre) en cantidades variables. La Hemosiderina es importante en el diagnóstico patológico porque es la evidencia de un proceso hemorrágico antiguo. Los procesos hemorrágicos son importantes en patología pues hay enfermedades que cursan con hemorragias microscópicas, que en ocasiones son de origen reciente (es importante encontrarlas recientemente para hacer el diagnóstico), las púrpuras, las vasculitis en la piel tienen aumento en la permeabilidad vascular, extravasación de eritrocitos; podemos encontrar una lesión temprana con GR indemnes, o tardía, con presencia de hemosiderina, que evidencia la ocurrencia de hemorragia. Para su identificación se realiza la identificación del fierro con el método de Pearls: No se identifica la Hemosiderina como tal, sino específicamente los iones férricos. La hemosiderina y la ferritina liberan iones Fe+++ en presencia de un ácido mineral diluído. El ión Fe+++ en presencia de iones de ferrocianuro forma un precipitado de color llamado azul de Prusia (esencialmente compuesto de ferrocianuro férrico). El azul de Prusia se ha empleado en la industria textil por años, aunque aún se desconoce su fórmula exacta. Se sabe que parte de este colorante es ferrocianuro férrico. A continuación se muestra la reacción del ión férrico con el ferrocianuro de potasio, que forma ferrocianuro férrico de color azul y queda precipitado en los tejidos control. Recuerden que se usa ferrocianuro de potasio.

Se mezcla ferrocianuro de potasio a 20% con partes iguales de HCl 1 N, se expone la placa de 15 a 30 minutos, se lava en agua para detener la reacción y se deshidrata y monta. Existe otra reacción, que permite identificar iones ferroso, utilizando ferricianuro de potasio (Turnbull). La principal reacción de reconocimiento es la de Perl’s pero la que veremos a continuación es una alternativa. La identificación de iones ferroso (Fe++) se puede realizar con un proceso más complejo que implica la reducción del fierro férrico Fe+++ (identificación de todo el fierro)a Fe++ y luego se identifica con ferricianuro de potasio, con lo que se genera ferricianuro ferroso, de color azul similar al azul de Prusia, postulándose incluso que el compuesto fomado es básicamente el mismo (es decir, no está clara la química final de estas reacciones), pero llamado azul de Turnbull; primero se trata al tejido con sulfuro de amonio, formándose sulfuro ferroso (soluble), que se disocia en iones ferroso y sulfuro, que se va como gas. El sulfuro ferroso reacciona con el ferricianuro de potasio formándose un compuesto tipo ferricianuro ferroso o azul de Turnbull, que es una molécula compleja y se considera esencialmente similar al azul de Prusia.

En la primera etapa se reduce el ión férrico a ferroso, como muestra la reacción sobre estas líneas, y luego el ión ferroso se hace reaccionar con ferricianuro de potasio para dar lugar a ferricianuro ferroso (azul de Turnbull), esencialmente similar al azul de prusia.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 4

En cualquier caso, la reacción se da de esta forma. En las micrografías siguientes se muestra un caso de hemocromatosis hepática (acumulación excesiva de hierro (Hemosiderina) en células parenquimatosas o fagocíticas) y grandes cantidades de pigmento identificados con la reacción de Perls.

En médula ósea se puede hacer detección de hemosiderina o fierro porque la hemosiderina es resultado de la destrucción de GR para recuperar el hierro, que es un elemento muy preciado en la economía corporal, alrededor del 90 % de él presente en la Hb y un 10 % en la hemosiderina; cualquier cantidad de eritrocitos eliminados por cumplir su vida útil o por procesos hemorrágicos con salida de los vasos, se recupera el hierro; se rompe la célula, se rompe la Hb, y el hierro es acumulado como hemosiderina y luego captado para ser transportado por la ferritina a la médula donde se reutiliza; el valor diagnóstico en médula está relacionado con la evaluación de la actividad de renovación y lisis de eritrocitos, identificando las células fagocíticas. Cuando se trata la médula con descalcificadores debe tenerse cuidado porque puede haber pérdida de hierro por solubilización, especialmente al trabajar con ácido nítrico.

• Con cobre: Ceruloplasmina (circulante); el cobre se acumula. Pigmentos biliares: Importantes por su presencia en patologías

• Bilirrubina • Biliverdina

• Urobilina • Estercobilina

Estos presentes en el tracto digestivo. Todos son hematógenos, derivados del catabolismo de la hemoglobina (Hb)

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 5 • Melaninas: (Melaninas cutáneas, Neuromelanina, Melanina retinal) Pigmentos importantes para nuestra adaptación al ambiente, pues ha facilitado nuestra supervivencia a las radiaciones, especialmente a las UV. Son pigmentos especiales que capturan y absorben prácticamente todo el espectro de luz visible y por ende, al estar localizado en piel nos protege de las radiaciones solares. Las personas que carecen de estos pigmentos como los albinos, son muy susceptibles a desarrollar cánceres de piel. La protección brindada por el pigmento melanínico es tal que las personas morenas son menos susceptibles a cáncer de la piel, el que por efectos del sol se da en zonas más expuestas al sol: cara, manos, mamas, mejillas, afortunadamente benignos en su mayor parte: carcinoma basocelular, espinocelular, que son consecuencia directa de la radiación solar. Cuando estudien piel de la cara, en la dermis siempre van a encontrar degeneración basofílica del tejido conjuntivo; el tejido conjuntivo pierde su estructura y se transforma en una masa parecida a amiloide, cambio producido por efecto del sol y que se conoce como elastosis solar; en personas mayores de 30 años en la piel de la cara hay que observar la diferencia con la piel de otras zonas; en la cara tiene dermis muy afectada, más evidente esto en personas de tez blanca que en morenos (tienen una evolución mejor respecto a la exposición a radiación solar); las razas blancas se desarrollaron aparentemente en áreas menos expuestas al sol (Europa, Norte de Europa, zonas más frías), en tanto las razas de color lo hicieron en zonas más cálidas, expuestas al sol (África); en la actualidad hay una gran mezcla racial por la globalización, que nos permite encontrar todo tipo de individuos en todas partes, lo que nos expone más a desarrollar tumores; las melaninas, es el factor natural de protección solar. No hay un solo tipo de melanina, sino varios, por su ubicación, reactividad y otras características. Hemos hablado fundamentalmente de las melaninas cutáneas, pero también hay neuromelanina, que confiere un color al cuerpo oscuro en el cerebro, también presente en coroides; también hay melaninas retinales. Estas son variantes; pese a no tenerse claridad respecto de la composición de la melanina, sí se sabe cuál es el proceso de la melanogénesis. En términos generales se sintetiza a partir de tirosina por acción de la dihidroxifenilalanina oxidasa (DOPA oxidasa), formándose fenilalanina a partir de tirosina por acción de DOPA oxidasa. Esta misma enzima actúa sobre fenilalanina formando un pigmento intermedio y luego la melanina, cuya estructura es característica, los gránulos de melanina que permanecen en citoplasma y que están rodeados, habitualmente, por membranas. Veamos un esquema representativo de la melanogénesis:

A partir del RE se forman las membranas que van a rodear finalmente los gránulos de melanina, y que dan inicialmente origen a vesículas que luego quedan llenas de pigmento, que a M.E. se ve como sigue:

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 6

• Dentro de este gránulo se encuentra polimerizado (en alguna forma) este pigmento de color

café que es la melanina. Estos gránulos pueden ser traspasados de una célula a otra, lo que ocurre en melanocitos (células de la piel que tienen la DOPA oxidasa y por ende son capaces de producir la melanogénesis);los melanocitos pueden traspasar estos gránulos de pigmento a otras células vecinas (epiteliales de la epidermis, algunas de ellas, especialmente en las capas basales, están llenas de melanina), o traspasarlas a células con características fagocíticas, los melanófagos o melanóforos (del Gr. Phoros: portador de), que no generan melanina. Los melanocitos son de origen embriológico neuroectodérmico, lo que se sabe por su inmunofenotipo. Comparten la reacción de S-100 (marcador típico de tejido neuroectodérmico). En patología tiene gran importancia; existen procesos en que hay ausencia de melanina por ejemplo en áreas focales, como ocurre en el bitíligo, que son zonas blancas de piel desprovistas de melanina en un individuo de coloración normal, y que tienen distinto origen: psicosomático, en individuos con ciertas características de personalidad, en quienes la aparición de bitíligo crea un círculo vicioso (se siente socialmente inhibida por sus manchas y más aparecen); secundarios a inflamaciones locales u otras lesiones. En biopsias puede ser necesario evaluar la presencia de melanina y de melanocitos. También es necesario investigar el pigmento en lesiones tumorales, como por ejemplo el melanoma (tumor maligno relacionado con la exposición al sol), que simula otros tumores, y da metástasis difíciles de diagnosticar; en su sitio primario de origen no es difícil de identificar morfológicamente, pero en metástasis es muy difícil. Las melaninas parecen estar firmemente unidos a proteínas, por lo que son muy difíciles de extraer (se ve fácilmente en cortes pasados por xilol, alcoholes, fijadores) a menos que se utilicen agentes ácidos que destruyen los tejidos. Sí se pueden decolorar con agentes oxidantes como: H2O2, KMnO4, HCl, FeCl3, ácido ascórbico y clorato de potasio, son insolubles en solventes orgánicos, mientras que tienen buena solubilidad en NaOH 1N. A continuación vemos un ejemplo de lesiones pigmentadas:

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 7

En la micrografía se ve una lesión benigna (encapsulada), que tiene su componente celular bastante dispersa dentro del área de encapsulamiento (lo que podría conducir a pensar que es maligna), conocida como nevo azul, que a diferencia del nevo celular que tiene células névicas típicas en nidos en la dermis o conjunción dermoepidérmica, no presenta células névicas, sino una acumulación de melanocitos generalmente fusiformes mezclados con melanófagos, siempre situado en profundidad en la dermis, y forma un nódulo bilobular con células muy alargadas, que casi siempre tienden a disponerse en paralelo a la epidermis, y que en clínica se ve como una mancha azul.

La imagen que vemos arriba es un melanoma (primario en el lugar en que se sitúa, o metastático) y evidentemente está lleno de melanina (como problema se puede plantear que sea melanina o hemosiderina, o bien melanófagos cargados de melanina); debe tipificarse la célula y el pigmento.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 8 El tipo de tumor que vemos a continuación es muy problemático pues se puede tratar de una metástasis de un tumor de células claras, pero es un melanoma amelanítico (generalmente los melanomas son amelanóticos, no producen melanina, por lo que representan un serio problema pues se asemejan a los tumores de células claras de ovario por ejemplo), caso en que no se podrá demostrar la existencia de melanina, sólo habría que tipificar la célula para saber si se trata o no de un melanocito.

Para la identificación de Melanina existen 4 métodos que se pueden emplear: Métodos de reducción: Schmorl, Masson-Fontana. La melanina tiene capacidad reductora por su estructura. Masson-Fontana (Masson 1914; Fontana 1912): El fundamento de esta técnica es que la melanina es argentafin y como tal reduce soluciones de plata amoniacal a plata metálica, sin necesidad de agentes externos. Los cortes se incuban con solución de plata amoniacal a tº ambiente toda la noche en oscuridad. Posteriormente, se elimina la plata no reducida con tiosulfato. Se observa a continuación una micrografía de piel normal con reacción argentafin de melanina en la zona basal de la epidermis hasta los estratos intermedios, y bajo la epidermis un grupo de células névicas muy teñidas.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 9 Reacción de Schmorl: La melanina es capaz de reducir ferricianuro férrico a ferrocianuro férrico, los cortes se incuban en una solución que contiene cloruro férrico y ferricianuro de potasio y se forma un precipitado de color azul semejante al azul de Prusia. Otra característica de la melanina es la capacidad de formar quelato con iones ferroso si éstos le son proporcionados, como ocurre en la reacción de captura del ion ferroso de Lillie, que veremos a continuación. Reacción de captura del ión ferroso (Lillie, 1957): Es uno de los métodos más sensibles para melanina, que se basa en la capacidad de las melaninas para formar quelatos con el hierro ferroso (sulfato ferroso) que quedan capturados dentro del pigmento y se forma una melanina ferrosa, y posteriormente se incuban los cortes con ferricianuro de potasio formándose ferricianuro ferroso semejante a azul de Turnbull. El resultado de esta reacción se muestra en la siguiente micrografía de un nevo cítico o celular, diferente al nevo azul; se ve la epidermis normal con su melanina y un grupo de células névicas dérmicas:

Reacción DOPA: Sólo se menciona por razones históricas, demuestra la actividad de la enzima DOPA oxidasa, requiere el uso de una mezcla incubadora que contiene D.L.3:4 dihidroxifenilalanina (DOPA) en buffer fosfato a pH 7.4; se incuban cortes por congelación sin fijar a 37°C por 45 min a 2 horas, y las áreas de actividad enzimática se observan de color pardo oscuro; se pueden hacer cortes por congelación. Otros método usados como elementos diagnósticos también son aquellos que implican la decoloración de la melanina. Decoloración de melanina: Las melaninas se decoloran con agentes oxidantes, al parecer por ruptura de su anillo fenólico que tendría dobles enlaces que le dan la característica de color café, que al hacer la oxidación se perdería el cromóforo de la melanina; se pueden emplear:

• Peróxido de hidrógeno (clásicamente utilizado): Tratando los cortes por varias horas se decoloran. Es de utilidad diagnóstica para identificar melanina, al igual que el ácido ascórbico pues son específicos.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 10 • Permanganato de potasio: Puede aplicarse a 60º en estufa o en microondas; como inconveniente, decolora otros pigmentos, por lo que no sirve para hacer diagnóstico de melanina. Sin embargo, la decoloración que ocasiona puede ser útil cuando se requiere ver todo lo que oculta la melanina o el enmasacaramiento de cromógenos como DAB (de color similar a melanina) usados en IHQ, en que por ejemplo en el caso de melanoma se requiere saber donde está la reacción en células pigmentadas; por lo que siempre hay que hacer la decoloración antes de hacer la IHQ facilitándose la interpretación de resultados; la decoloración en peróxido de hidrógeno puede tomar hasta 48 horas lo que varía para las diferentes melaninas; se puede controlar la decoloración. No es necesario esperar que se decolore para hacer el diagnóstico. Para caracterizar melanina se pone una lámina en peróxido y se hacen otras técnicas.

Los 2 anteriores son aquellos que emplearemos. Otros métodos para identificar la melanina son : Métodos enzimáticos: DOPA oxidasa, que ya está obsoleto, pues se ha reemplazado por métodos de IHQ como el S-100, vimentina o antígenos específicos como el Melan-A que identifica melanomas y el HMB-45, que también identifica melanoma y reemplazan a la DOPA. Cuando se hacía enzimohistoquímica para DOPA oxidasa se empleaba, por ejemplo en el tumor que vimos en la última foto para demostrar si era melanoma o no, pues si daba DOPA (+) significaba que estas células eran melanogénicas, es decir, tenían la maquinaria enzimática necesaria para producir melanina aunque no la estuviesen produciendo. Métodos fluorescentes

Lipopigmentos: Pigmentos producidos por desgaste

Con hierro Sin hierro

Lipofuscinas Ceroides

En general los lipopigmentos corresponden a lipofuscinas y ceroides. Estos son siempre intracelulares, de color pardo-amarillento en granitos de tamaño variable (pequeños) que serían el resultado de la oxidación de lípidos y lipoproteínas. También se les llama pigmento de desgaste produciéndose a todas las edades acumulándose en el tiempo, y se observan en: hepatocitos, miocardio, neuronas, corteza suprarrenal (zona reticulada), células intersticiales del testículo (testículo tiene parénquima de color pardo). Son pigmentos heterogéneos (en cantidad y composición), al parecer dependiendo del grado de oxidación (mayor antigüedad) que posean sus componentes. El pigmento ceroide fue considerado separadamente (Lillie et al. 1941 y 1942) porque no da la reacción de Schmorl con ferricianuro férrico (menos oxidado), pero hoy se piensa que los ceroides son lipofuscinas menos oxidadas (Pearce). Reacciones típicas:

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 11 • Sudan black B post inclusión en parafina (por ello se llaman lipopigmentos, dan reacciones

para lípidos) • Schmorl (variable) • PAS (variable) • Ziehl-Neelsen (también típicas; es alcohol-ácido resistente, captura al colorante y resiste el tto.

con alcohol- ácido.

Se ve el aspecto en hígado, con granulaciones variables, desde puntos pequeños a grandes:

La siguiente es corazón con H-E en que se ve el pigmento también, con área de infarto, fibras normales y lipofuscina:

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 12 A continuación también se ve una preparación con H-E con disposición polar de los gránulos de lipofuscina:

En ancianos el corazón se ve pardo, fláccido; el término lipofuscina proviene de la atrofia fusca (café)

Carotenoides Clorofilas

Estos dos últimos no los estudiaremos porque en humanos prácticamente no tiene importancia, además de ser solubles en lípidos y no se ven en los cortes. Pigmentos biliares: Grupo de sustancias pigmentadas derivadas de la destrucción de glóbulos rojos y el catabolismo de la hemoglobina (normal o patológico como en las púrpuras (síndromes hemorragíparo múltiple) o en cuadros de rechazo). Entre estos se incluyen: bilirrubina (conjugada con glucuronato y no conjugada), biliverdina y hematoidina. Se observa normalmente en la bilis y en procesos patológicos que afectan la excreción normal de estos compuestos por el sistema biliar por hemólisis o por obstrucción de las vías biliares; normalmente la bilirrubina actúa como coadyuvante de la digestión o como parte de los pigmentos de las heces. Revisemos brevemente el metabolismo de la hemoglobina: En el esquema que se muestra a continuación se representa la síntesis de hemoglobina a partir de precursores que parten desde porfobilinógeno hasta el grupo hem y la hemoglobina. A partir de hemoglobina, y por un proceso catabólico, se libera el hierro que es recuperado para ser empleado nuevamente en la síntesis de eritrocitos, quedando libre el grupo hem, que se puede abrir, como veremos a continuación, transformándose en biliverdina y por reducción de éste en bilirrubina, que puede ser transportada en sangre por albúmina hasta el hígado donde es capturada y conjugada, haciéndose más hidrosoluble y luego eliminada por las vías biliares como bilis. En las vías biliares puede estar como bilirrubina o biliverdina si está oxidada, o bien transformarse en urobilinógeno y ser reutilizado por diálisis o pasar a uro o estercobilina para ser excretado por intestino (estos pigmentos biliares transformados son los que dan el característico color pardo a las heces).

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 13

A continuación vemos un esquema general de la molécula de hemoglobina (Hb) formada por un grupo terapirrólico (es decir, formado por 4 grupos pirroles) con un núcleo central de hierro, que constituye el grupo Hem, es que está unido a la proteína globina que está unida en el sentido planar de la molécula de Hem.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 14 cuando se genera bilirrubina se retira el hierro, se separa la globina y el anillo tetrapirrólico se puede abrir quedando una molécula lineal, la biliverdina, que se diferencia de la bilirrubina por la presencia de un par de hidrógenos; mientras la biliverdina está oxidada, la bilirrubina está reducida. Esto es importante porque una forma de identificarlo es mediante esta reacción.

En procesos patológicos como la cirrosis biliar que vemos en la fotografía de arriba, podemos observar grandes acúmulos de pigmento biliar; en la cirrosis biliar se ha producido un daño en el parénquima hepático con acumulación de pigmentos en grandes cantidades por una obstrucción del sistema biliar; puede haber tenido una obstrucción crónica de cualquier segmento del sistema biliar desde el colédoco hasta la ampolla de Vater en duodeno, siendo un proceso crónico que lleva a la acumulación retrógrada de pigmento, aumento de la presión en los vasos y conductos biliares, con el consecuente daño al parénquima hepático que puede llegar a una cirrosis o un estado reparativo nodular distinto a la cirrosis común, con micromódulos pero con gran acumulación de pigmentos (de hecho el hígado en la foto se ve verde oscuro). Como veremos en las siguientes micrografías, cuando se ve en la histología lo característico es encontrar una colestasis intrahepática, o trombos biliares, que originalmente aparecen como pequeños trombos en los conductillos biliares interhepatocitarios; estos trombos se van agrandando, dilatándose al mismo tiempo los conductillos biliares en que se encuentran, rompiéndose finalmente la célula; si observan bien verán que se trataba de un hepatocito, pero alrededor de él hay una reacción inflamatoria por la destrucción de células debido a la hipertensión del sistema de excreción

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 15 biliar, observándose grandes manchas de pigmentos en la última micrografía, que corresponden a depósitos de pigmentos biliares, que corresponden a un preparado de hígado con trombosis biliar.

Identificación del pigmento biliar: Métodos de oxidación de la bilirrubina: La bilirrubina se ve pardo amarillento, pero al oxidarla se logra su conversión a biliverdina (verdosa)

• Reacción de Kutlik (1957). Utiliza cloruro férrico en presencia de ácido acético o bien alumbre de hierro (férrico) en agua. La bilis es oxidada a biliverdina (verde) y colecianina (azul verdoso)

• Reacción de Stein (1935). Emplea una solución de yodo. La bilirrubina (pardo) se oxida a biliverdina (verde)

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 16 Otras reacciones que permiten identificar el pigmento biliar son:

• Reacción de Fouchet (1917), que utiliza cloruro férrico en TCA. • Reación de Glenner (1957), que utiliza bicromato de potasio en cortes por congelación.

Es importante comparar con un corte sin oxidar para verificar si hay cambios de color. El color observado, según señalan algunos autores frecuentemente es verde pues hay biliverdina preexistente. La real utilidad sólo es posible determinarla cuando hay áreas de color pardo (bilirrubina) y se observa la existencia de cambio de color en esas áreas, comprobándose la posibilidad de cambio de color por oxidación. Otra reacción clásica para el pigmento biliar es la de Reacción de Gmelin.(Tiedermann y Gmelin, 1826). La reacción positiva se caracteriza por una secuencia de cambios de color que sufre la bilis cuando es tratada con HNO3 (o HSO4) concentrados: amarillo, verde, azul, rojo, púrpura. No siempre resulta. Es poco confiable, no permanente y altamente peligrosa pues los ácidos con que trabaja son muy concentrados. En ocasiones la reacción es tan rápida que al observarla se ha producido y culmina con la destrucción del tejido. Es preferible hacer el método de Stein o Kutlik. Sin embargo, si se desea realizarla es preferible hacerla más lentamente, con el ácido diluido a la mitad lo que da más tiempo de observación. Una tercera forma general de identificar el pigmento biliar es mediante reacciones con sales de diazonio. Reacción de van den Berg para bilirrubina directa e indirecta (Raia, 1965 y 1967). Esta se hace en suero, y la realizan en Laboratorio clínico para determinar la bilirrubina conjugada y no conjugada. En un examen de laboratorio aparecen distintas proporciones de estas formas de bilirrubina Utiliza 2:4 dicloroanilina diazotizada (compuesto azoico) Permite distinguir entre bilirrubina glucuronato (conjugada) y no conjugada. Reacción directa. El glucuronato, que es más soluble en agua reacciona directamente con la solución diazo. Reacciona con la reacción de incubación sin acelerante. Reacción indirecta. La bilirrubina no conjugada, menos soluble en agua, requiere la participación de un acelerante (una mezcla incubadora que contiene cafeína, urea, benzoato, formalina). Da un color pardo amarillento.

La tabla anterior nos muestra un resumen de la reactividad de los pigmentos biliares con diferentes métodos histoquímicos (el color que dan). La reacción de Raia es equivalente a la de van der Berg. Finalmente, se muestra una tabla de comparación entre los distintos métodos y pigmentos que estudiamos, que se tomó de Zugibe.

Histoquímica de Pigmentos- Esteban Órdenes 17

IDENTIFICACIÓN HISTOQUÍMICA DE PIGMENTOS Pigmento Color y Forma Ubicación Causa Extracción Formolado Café oscuro Extracelular Formol ácido + tejido

congestivo Bouin (min) Etanol-ácido pícrico

Malárico Pardo Intracelular (en Mφ y GR)

Malaria, plasmodium Soluble en alcohol ácido unas hrs

Hemosiderina Pardo Intracelular (en Mφ) Hemorragia - Melanina Café Intracelular

(melanocitos, célula epitelial, melanóforos)

Pigmentación normal Agentes oxidantes, H2O2, permanganato de potasio, ácido ascórbico

Lipofuscina Pardo amarillo pequeños

Intracelular Oxidación de lípidos y lipoproteínas

-

Biliar Amarillento en H-E Extracelular en canalículos biliares

Destrucción de GR y del catabolismo de la hemoglobina. Procesos patológicos que afectan la excreción normal de la bilis

-

Respecto de los cromafines, estos gránulos no corresponden a pigmentos, sino a componentes del sistema APUD, que son más bien detectados por IHQ, que no se ven con tinciones corrientes.