ATERIALES Y MÉTODOSconsulta.up.ac.pa/ftp/2010/f_agropecuaria/document... · iii Autoridades...

Autoridades

Universidad de Panamá

Gustavo García de Paredes Rector Magnífico

Justo Medrano Vicerrector Académico

Betty Ann Rowe de Catsambanis Vicerrectora de Investigación y Postgrado

Carlos Brandariz Zúñiga Vicerrector Administrativo

Eldis C. Barnes Molinar Vicerrector de Asuntos Estudiantiles

María del C. Terrientes de Benavides Vicerrectora de Extensión

Miguel Ángel Candanedo Secretario General

Luis A. Posso Director General de los Centros

Regionales Universitarios

iii

Autoridades

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Juan Miguel Osorio R.

Decano

Rodrigo Cambra Vicedecano

Simón Vásquez Director de Investigación, Postgrado y Extensión

Jackeline Colucci

Secretaria Administrativa Campus

Eliseo Moreno Secretario Administrativo

Chiriquí

La Dirección de Investigación, Postgrado y Extensión tiene la responsabilidad de coordinar todo lo relacionado con la revisión y la publicación de los artículos científicos y trabajos de grado.

v

Presentación

La Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá,

presenta una serie de artículos científicos generados de las

investigaciones realizadas por los profesionales que laboran en nuestra

Institución.

La introducción de nuevas tecnologías y materiales genéticos que se

transfieren al pequeño y mediano productor impactan significativamente

en la productividad del sector primario, lo cual se refleja en el

mejoramiento de la calidad de vida en las zonas rurales.

Esta Revista ofrece información específica para las Ciencias

Agropecuarias y busca llevar a la población interesada información

científica aplicada, con el propósito de que se logren alcanzar estándares

de calidad, eficiencia y competitividad en este mundo globalizado.

Dr. Juan Miguel Osorio Decano

vii

Índice de Contenido

Pág.

AUTORIDADES UNIVERSIDAD DE PANAMÁ ii

AUTORIDADES FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS iii

PRESENTACIÓN iv

ÍNDICE DE CONTENIDO

vi

COMPARACIÓN DE TRES PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS OBTENIDOS POR FECUNDACIÓN IN VITRO O SUPEROVULACIÓN

Guerra R., Solis A., Sandoya G. y de Armas R.

1

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Y SU ACEPTACIÓN EN LA GANADERÍA

PANAMEÑA

Reinaldo De Armas, R.

11

BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA: SITUACIÓN ACTUAL Y PERSPECTIVAS FUTURAS PARA EL MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN ANIMAL Reinaldo De Armas, R.

16

RESULTADOS PRELIMINARES DEL EMPLEO DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN LA RAZA SENEPOL EN PANAMÁ Reinaldo De Armas, R.

30

INFLUENCIA DE LA DILUCIÓN SEMINAL PRE CONGELACIÓN, SOBRE LA VIABILIDAD ESPERMÁTICA POST DESCONGELACIÓN Reinaldo de Armas, Abdul Castillero y Neftalí Aparicio

38

EFECTO DEL RETIRO DEL CRIOPROTECTOR EN CUATRO PASOS VS TRANSFERENCIA DIRECTA SOBRE LA TASA DE PREÑEZ CON EMBRIONES BOVINOS CONGELADOS EN ETILENGLICOL Reinaldo De Armas, R., Adolfo Zambrano y Gerardo Sandoya

48

INFLUENCIA DE LA UTILIZACIÓN DE DOS BACTERICIDAS Y DIEZ VARIANTES DE MEDIOS DE CULTIVO SOBRE EL ESTABLECIMIENTO Y MULTIPLICACIÓN IN VITRO DEL OTOE Xanthosoma Violaceum Simón A. Vásquez W.

56

CUANTIFICACIÓN DEL CARBONO SECUESTRADO EN UN SISTEMA AGROFORESTAL DE CAFÉ ARBOLADO, EN EL DISTRITO DE BOQUETE, CHIRIQUÍ Christopher González R. Felícita González

62

viii

UTILIZACIÓN DE LOMBRICOMPUESTO EN LA REHABILITACIÓN DE SUELOS DEGRADADOS PARA USO AGRÍCOLA Felícita González

72

PRODUCCIÓN DE SEMILLAS DE Clitoria ternatea EN FUNCIÓN DE DISTANCIA DE SIEMBRA Y ÈPOCAS DE COSECHA Edgar Alexis Polo L.

79

EVALUACIÓN DEL RETRASO DE COSECHA Y CALIDAD MOLINERA EN LAS VARIEDADES DE ARROZ FCA 9738 Y FCA 97116 Norberto Pitty, José Batista

89

Revista Investigación Agropecuaria, F.C.A./U.P. 1

COMPARACIÓN DE TRES PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS OBTENIDOS POR FECUNDACIÓN IN VITRO O

SUPEROVULACIÓN

Guerra R.,1 Solis A. *, Sandoya G. *y de Armas R. *

*

RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar la eficiencia de las técnicas de conservación de embriones bovinos por vitrificación (V) o por congelación lenta (CL) con equipos programados, sobre la viabilidad post descongelación, utilizando embriones producidos in vivo (InVV) e in vitro (InVT). Para tal fin se implementaron tres protocolos de criopreservación: 1) CL con equipo programable, etilenglicol 1.5 M como criopreservante, 2) V con glicerol 6.5 M + 5% de sacarosa y 3) V con 25% etilenglicol + 25% glicerol. Cada protocolo fue ensayado tanto en embriones obtenidos InVV por superovulación (n: 90, 30 por cada método), como en embriones producidos por fecundación InVT (n: 90, 30 por cada método). La descongelación en el primer caso (CL), se realizó a temperatura ambiente (220C por 10 segundos) y luego en agua a 370C por 10 segundos. La desvitrificación se realizó en agua a 30 0C por 30 segundos y se retiró el crioprotector en una solución 0.5 M de sacarosa + 10% de suero fetal bovino durante 5 minutos. Luego de descongelados, se colocaron en medio TCM 199, en grupos de 10, según los tratamientos para su cultivo y evaluación morfológica. Finalmente se evaluó la reconstitución del blastocele, tasa de degeneración a las 12 y 24 h y la eclosión a las 48 y 72 h post cultivo. En el caso de la reconstitución del blastocele se encontró que los tratamientos que incluían embriones InVV y criopreservados por CL tuvieron una respuesta positiva mayor al 70%, siendo esto indicativo de que este proceso no afectó en gran medida la integridad del embrión, contrastando con los resultados que se obtuvieron con los producidos InVT y V donde las tasas de reconstitución fueron menores al 50%. Para la evaluación de la degeneración embrionaria, los embriones InVV presentaron una tasa menor al 30% a las 24 h post cultivo, independientemente del protocolo aplicado en tanto los obtenidos InVT los que presentaron tasas de degeneración entre 35% con CL y 56% en caso de V. Al evaluar la eclosión embrionaria se presentaron diferencias significativas (P>0.05) tanto a las 24 como a las 48 h siendo los tratamientos que involucraban embriones InVV los que mejor respondieron a los protocolos estudiados (76.67% en CL y 66.67% y 60% en los casos de V, comparados con los de embriones obtenidos InVT (56.67%, 36.67% y 40% respectivamente). En base a los datos obtenidos concluimos que los embriones InVV presentan mayor tolerancia a los procesos de criopreservación ensayados, siendo el protocolo de CL el que aportó los mejores resultados.

PALABRAS CLAVES: Embriones, in vivo, in vitro, criopreservantes, congelación lenta, vitrificación, eclosión.

1 Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias,

Universidad de Panamá. Carretera Interamericana, Chiriquí, Provincia de Chiriquí, República de Panamá. E mail: [email protected]


ABSTRACT

The research objective was to evaluate the efficiency of embryo cryopreservation technics by vitrification (V) or slow freezing (SF) using programmed equipment, and its effects on post thawing viability, using embryos produced in vivo (InVV) and in vitro (InVT). For this purpose three cryopreservation protocols were assayed: 1) SF using programmed freezer, ethileneglycol 1.5 M as cryopreservant, 2) V glycerol 6.5 M plus 5% sucrose y 3) V 25% etyleneglycol plus 25% glycerol; each protocol were evaluated in embryos obtained InVV by superovulation (n: 90, 30 each method), and in embryos produced by InVT (n: 90, 30 for each method). In first protocol, thawing was performed at room temperature (220C during 10 seconds) and later in warm water at 370C during 10 seconds. Thawing was carried out in warm water at 30 0C during 30 seconds and the cryopreservant was retired in a 0.5 M sucrose solution + 10% of bovine calf serum during 5 minutes. After thawing, embryos were placed in groups of 10 according to each treatment in TCM 199 medium, for culture and morphological evaluation. Finally, blastocele reconstitution and degeneration rate were evaluated at 12 and 24 hours and hatching rate at 48 and 72 hours after culture. In the parameter blastocele reconstitution, it could be observed in treatments that included InVV embryos and SF cryopreservation a positive response superior at 70%, being this fact considered as an indication that the process did not affect the embryo integrity, contrasting with results observed in protocols InVT and V in which reconstitution of blastocele rates were lower than 50%. For the parameter embryo degeneration, embryos InVV showed a lower rate, less than 30% at 24 hours post culture, independently of the protocol employed, but in the embryos obtained InVT were observed degeneration rates between 35% in SF and 56% in V. Finally, the evaluation of embryo hatching, were found significant differences (P>0.05) both at 24 and 48 hours after culture, the protocols that used InVV embryos showed the best responses according to the applied protocols (76.67% by SF, 66.67% and 60% in V protocols), compared with embryos obtained InVT (56.67%, 36.67% and 40%, respectively). According to these results, the conclusion is that embryos obtained InVV shows a better tolerance at cryopreservation protocols applied, being the SF protocol the more suitable.

KEYWORDS: embryos, in vivo, in vitro, cryopreservation, slow freezing, vitrification, hatching.

INTRODUCCIÓN

Con el desarrollo de biotecnologías en la reproducción, entre las cuales destacan la superovulación, la fecundación in vitro y micro manipulación de embriones, entre otras; se ha logrado dar un gran avance en cuanto al número de embriones que se pueden obtener de una sola vaca de alto valor genético y salvar las limitantes de esta especie, maximizando sus capacidades gaméticas.

Debido a estos avances surgió la necesidad de encontrar técnicas que permitieran preservar estos embriones por un tiempo más largo que el que se acostumbra en programas de transferencia inmediata, y la alternativa más estudiada y aplicada en este sentido es la

criopreservación de los mismos, la cual ha permitido que material biológico de diversas especies animales sea almacenado indefinidamente sin pérdida funcional de la actividad y las funciones genéticas (Mazur, 1984).

Dentro de las diferentes técnicas de criopreservación desarrolladas destacan la congelación lenta asi como la vitrificación de los mismos, técnicas que permiten la conservación de este material por tiempo prolongado (Gordon, 1994). Incluso Leibo et al., (2002), plantean como factible la idea ambiciosa de mantener viable embriones a temperaturas de -196 °C en nitrógeno líquido durante quizás 1000 años o más.


En tal sentido, García et al., (2000) reportaron el nacimiento de bovinos provenientes de embriones criopreservados y almacenados durante 28 meses, Fogarty et al., (2000); de ovinos durante 13 años; en tanto Márquez-Alvarado et al., (2004), la determinación el índice de apoptosis de embriones bovinos igualmente almacenados durante 16 años.

Sin embargo, en reproducción asistida hay poca necesidad de pensar en la conservación que vaya más allá de algunos meses o años (Gordon, 1996).

Aunque los resultados de la transferencia de embriones producidos in vivo ha logrado alcanzar resultados estables y aunque innegablemente un poco más bajos (Palma, 2008) que si fueran transferidos en fresco (De Armas, 2007). Como es lógico por el daño celular que ocurre durante el proceso de crioprotección y enfriamiento queda mucho por investigar para minimizar los mismos; en el caso de los embriones producidos in vitro, estos resultados son aún inferiores (Palma, 2008) y muy variables por múltiples causas y resulta hoy en día el principal problema que posee la técnica de FIV para poder ser empleada no solo la conservación de los embriones producidos, sino para el intercambio comercial a gran escala.

La aplicabilidad de los resultados obtenidos en esta investigación se justifica sobre la base de estudiar la efectividad del proceso de criopreservación tanto en embriones producidos in vivo como in vitro, dado que tanto en uno como en otro sistema de producción de embriones no siempre se cuentan con los animales receptores para que sean transferidos de manera inmediata. Ya sea por que los animales receptores se encuentran distantes, o simplemente, por que la intención de la obtención de múltiples embriones es de conservar el material por un tiempo prolongado hasta que se tengan las condiciones para realizar la transferencia o ser empleados para intercambio comercial dentro del país o internacionalmente y estas técnicas indudablemente constituyen una herramienta de soporte en estos casos. Por otra parte el empleo de la vitrificación nos permitiría el obviar la necesidad del empleo de equipos de congelación costosos y pudiera ser empleada incluso a nivel

de fincas en programas rutinarios de transferencia de embriones de manera fácil y efectiva e incluso en laboratorios de FIV.

MATERIALES Y MÉTODOS La investigación fue llevada a cabo en el Centro de Investigación en Biotecnología Agropecuaria (CIBA), de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá el cual se encuentra ubicado en el corregimiento de Chiriquí, localizado a los 8°23’15.12’’ de latitud norte y 82°19’47.48’’ de longitud oeste. Las características micro climáticas del área son: zona climática tropical de sabana, con una temperatura máxima de 32.0

ºC y mínima de 22.1

ºC, una precipitación pluvial anual con promedio de 2 856.9 mm y una humedad relativa de 80%. Y se encuentra a una altura de 25 msnm aproximadamente. La duración de esta investigación fue de aproximadamente ocho meses.

Dado que nuestra investigación requería la obtención de embriones in vivo e in vitro para ser criopreservados según los protocolos a evaluar, la primera parte del ensayo consistió en la superovulación de vacas donadoras para obtener embriones in vivo, para lo cual se utilizaron animales de la raza Simbrah, entre 36 y 96 meses de edad.

Primeramente se realizó palpación rectal de ovarios en todas las candidatas a donadoras, para comprobar que estuvieran ciclando al momento de iniciar el tratamiento superovulatorio.

El protocolo utilizado para la superovulación fue el siguiente: Día 0: Implante de Progestágeno (Crestar

®) +

2cc de Benzoato de estradiol (IM) Día 4: 28 mg FSH (Folltropín V

®) Mañana y tarde

Día 5: 26 mg FSH (Folltropín V®) Mañana y tarde

Día 6: 24 mg FSH (Folltropín V®) Mañana y tarde

+ 500 mcg Prostaglandina (Sincroplex®) en la tarde Día 7: 22 mg FSH (Folltropín V

®) Mañana y tarde

+ retiro del implante y aplicación de 250 mcg de Prostaglandina (Sincroplex

®) en la mañana.

Día 8: Observación de celo mañana y tarde e inseminación # 1


Día 9: Observación de celo mañana e inseminación # 2 Día 15: Colecta de embriones La dosis total de FSH fue de 200 mg por animal en dosis decrecientes por vía intramuscular profunda dividido en dos aplicaciones (mañana y tarde). La dosis de Prostaglandina fue de 2 ml en la tarde del día 6 y 1 ml en la mañana del día 7. Una vez observado el celo en el animal se procedía a inseminarlo 10 horas luego de la observación y se inseminaba nuevamente 12 horas después de la primera inseminación. A los siete días de la inseminación se realizó la recolección de los embriones por el método no quirúrgico, mediante lavado uterino utilizando un circuito cerrado (bolsa con PBS, tubo Y para recolección de embriones conectado a un filtro y a un catéter de Foley para lavado y jeringa de 20 ml para inflar el balón del catéter). Luego de efectuado la colecta en la vaca donante, el filtro con los embriones era llevado a un área del laboratorio de Fecundación In Vitro donde se les adicionaba PBS mantenido a temperatura de 37°C para eliminar mucosidades y conservar los embriones en condiciones favorables. Finalmente se pasaba el contenido de cada filtro a una placa de búsqueda de embriones en la cual se procedía por medio de visión estereoscópica a la búsqueda de los mismos Los embriones fueron mantenidos un plato petri pequeño en el que previamente se había colocado solución de PBS enriquecida (VIGRO

TM

Holding Plus), la cual permite la conservación óptima de los embriones hasta el momento de llevar a cabo la transferencia o como en nuestro caso, la realización de la criopreservación de los mismos. La producción in vitro de los embriones se realizó en el Laboratorio de Fecundación In Vitro del CIBA. La metodología utilizada para la producción de estos embriones fue la siguiente: Se utilizaron ovarios de matadero a partir de los cuales se obtuvieron los ovocitos necesarios para los procedimientos de FIV. La recolección de los mismos en el matadero se realizó dos horas antes de iniciar los procesos de laboratorio. Los ovarios una vez retirados del animal eran lavados dos veces con alcohol y solución salina para luego ser colocados en un termo que

contenía solución salina a una temperatura cercana a los 37°C y se llevaron al laboratorio con la mayor brevedad posible (nunca se sobrepasaron las 3 horas desde la colecta de los ovarios y el inicio de la punción en el laboratorio). Una vez en el laboratorio, los ovarios fueron lavados en solución fisiológica temperada a 37° C aproximadamente. Posteriormente los ovarios fueron mantenidos en Baño María a 37°C en esta misma solución, en un vaso químico de vidrio de 1000 ml de capacidad. Para la recuperación de los ovocitos, fueron aspirados todos aquellos folículos entre 2-8mm de diámetro que se observaron en la superficie ovárica. La aspiración se realizó en forma manual utilizando una jeringa de 10 ml con una aguja de 18 G a la cual se le adicionaba 3 ml del medio de colección de ovocitos. El contenido aspirado con la jeringa fue vertido en tubos cónicos graduados de vidrio de 15 ml, mantenidos en Baño María a 37°C. Una vez finalizado el proceso de aspiración los tubos fueron transportados a una platina temperada para vaciar su contenido (sedimento) a placas Petri cuya superficie inferior se encontraba cuadriculada, para facilitar la búsqueda de los ovocitos. Estas placas fueron mantenidas sobre una platina temperada a 37° C. Los ovocitos fueron buscados bajo visión estereoscópica y una vez localizados fueron depositados en una placa Petri la cual contenía medio de colección de ovocitos, utilizando para tal fin una micropipeta de 5 µl y que era mantenida sobre la platina temperada a 37º C. El protocolo utilizado para la producción de embriones incluia: a. Maduracion: esta etapa se realizò por un

periodo de 20 horas, en medio TCM 199 al cual se le adicionaba FSH.

b. Fertilización: el semen utilizado se procesó mediante la técnica de gradientes de Percoll, se adicionó semen a los platos de acuerdo a la concentración obtenida y se dejo en el medio de fertilización por un periodo de 16 horas.

c. Cultivo in vitro: el cultivo se realizó en medio SOF por un periodo de 7-9 dias al cabo de los cuales se estuvieron obteniendo los embriones aptos para los procesos de criopreservación.


Durante todo el proceso, la incubadora utilizada se mantuvo con una temperatura de 38.5°C, 5 % de CO2 en aire y atmósfera saturada de humedad. Los medios utilizados han sido descritos por Koyner y Pino (2010) los cuales incluían: medio de colección de ovocitos, medio de maduración, medio de fertilización, medio de lavado de semen, medio de separación de semen, medio de desnudación, medio de cultivo, aceite mineral para cultivo embrionario y FSH. El semen empleado para la fertilización provenía de un mismo toro de la raza Holstein. La clasificación morfológica de los embriones producidos tanto in vivo como in vitro se desarrolló de acuerdo a criterios morfológicos descritos por Palma (2008):

Grado 1: excelentes. No existen defectos visibles. Los blastómeros son claramente visibles, de color y estructura uniforme, simétricos, de forma esferoide y la zona pelúcida está intacta.

Grado 2: bueno, el embrión tiene muy pocos blastómeros desprendidos de la masa celular y/o posee una pequeña cantidad de detritus celulares. Su forma puede ser ligeramente irregular.

Grado 3: regular, el embrión posee varios defectos: detritus celulares, forma irregular, de color muy oscuro o muy claro y/o ligero agrietamiento en la zona pelúcida.

Grado 4: malo, el embrión posee muchos defectos: los correspondientes al grado 3 más desarrollo retardado, seria ruptura de la zona pelúcida –el embrión puede encontrarse parcialmente fuera de ella-, forma muy asimétrica, tendencia a la desintegración como granulación o fragmentación de los blastómeros. Incluye también a los estadíos hasta 8 células y clara degeneración. En esta investigación, sólo se utilizaron para el procedimiento de criopreservación los que coincidían con los grados 1 y 2 tal como recomiendan Palma (2008) y de Armas (2007). Luego de la clasificación de los embriones obtenidos ya sea por procedimientos in vivo o in vitro, se procedió a la criopreservación de los mismos utilizando un protocolo de congelación

lenta y dos de vitrificación, los cuales se describen a continuación: 1. Congelación de embriones: se realizó de

acuerdo al protocolo descrito por Voelkel y Hu (1992):

Se expusieron los embriones a una solución 1.5 M de etilenglicol durante 10 minutos

Luego los embriones fueron envasados en pajuelas de 0.25 ml.

Seguidamente se colocaron en un equipo de congelación marca CRYOLOGIC modelo CL 2000 Standard System, a -7°C por 10 minutos.

El seeding se indujo a los dos minutos.

Luego se llevaron a una segunda fase de enfriamiento a una tasa de 0.5 °C/minuto hasta los -32 °C.

Finalmente, se sumergieron en nitrógeno líquido.

La descongelación se realizó exponiendo las pajuelas a la intemperie por 10 segundos para luego sumergirlas en agua a 37°C por 10 segundos más.

Luego se colocaron en un plato petri que contenga 2 ml de medio de mantenimiento (PBS + BSA), para su evaluación morfológica y posterior puesta en cultivo.

2. Protocolo 1 de vitrificación: Los embriones fueron incluidos en una solución al 6.5 M de glicerol más 6 % de suero fetal bovino en PBS, y embalados en pajuelas de 0.25 cc, esto se aplicó en un solo paso durante 2 minutos. Transcurrido este tiempo fueron sumergidos en N2.

3. Protocolo 2 de vitrificación: En este caso la solución crioprotectora consistió en 25% de glicerol, más 25 % de etilenglicol en PBS, durante 2 minutos en un solo pase. y embalados en pajuelas de 0.25 cc. Transcurrido este tiempo fueron sumergidos en N2 .

La descongelación en ambos se realizó en agua corriente a 30

0C por 30 segundos. En ambos

protocolos, la extracción del crioprotector se llevó a cabo en una solución 0.5 M de sucrosa + 1’% de suero fetal bovino durante 5 minutos. Luego de realizada la descongelación, los embriones se trasladaron a medio TCM 199 para


su cultivo y evaluar el desarrollo y eclosión de los mismos por 72 horas. Fueron colocados para tal efecto en grupos de 10 y cultivados simultáneamente según el tratamiento correspondiente. Las condiciones generales de cultivo fueron 38.5°C, 5% CO2 y atmósfera saturada de humedad. Finalmente se procedió a evaluar los embriones por medio de visión estereoscópica para ser clasificarlos en eclosionados y degenerados. De acuerdo a los métodos de obtención y de congelación a utilizar, se categorizaron 6 tratamientos con 30 embriones para cada uno, con el siguiente ordenamiento: T1 = Obtención In Vivo y Congelación lenta con

glicerol T2 = Obtención In Vivo y Vitrificación con 6.5 M

de glicerol T3 = Obtención In Vivo y Vitrificación con 25 %

de etilenglicol y 25 % de glicerol

T4 = Obtención In Vitro y Congelación lenta con glicerol

T5 = Obtención In Vitro y Vitrificación con 6.5 M de glicerol

T6 = Obtención In Vitro y Vitrificación con 25 % de etilenglicol y 25 % de glicerol

Para el análisis estadístico se utilizó un Diseño Completamente al Azar y los datos obtenidos fueron analizados utilizando el paquete estadístico SAS, utilizando para tal fin el procedimiento CHI CUADRADO el grado de significancia utilizado fue del 95 %. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A partir de la descongelación y cultivo, y la evaluación morfológica transcurridas 12 y 24 horas para evidenciar la reconstitución del blastocele o degeneración celular, el ensayo arrojó los resultados que se pueden observar en el cuadro I.

CUADRO I. RECONSTITUCIÓN DEL BLASTOCELE Y DEGENERACIÓN DE EMBRIONES A LAS 12 Y

24 HORAS DE CULTIVO.

Trat. embriones

cultivados Reconstitución del blastocele

Degenerados

12 h 24 h 12 h 24 h

n % n % n % n %

T1 30 26 86.67 24 80 4 13.3 6 20 T2 30 24 80 21 70 6 20 9 30 T3 30 20 66.67 21 70 10 33.3 9 30 T4 30 24 80 19 63.3 6 20 11 36.7 T5 30 17 56.67 15 50 13 43.3 15 50 T6 30 18 60 13 43.3 12 40 17 56.7

Se apreció claramente que en la evaluación a las 12 horas, los tratamientos con mayor tasa de reconstitución del blastocele fueron el T1, T2, que corresponden a embriones producidos in vivo utilizando congelación lenta en el primer caso y vitrificación con 6.5M de glicerol como criopreservante en el segundo, seguido del T4 que incluía embriones producidos in vitro criopreservados mediante congelación lenta. Estos resultados se pueden sustentar de acuerdo a estudios realizados por Martínez et al,. (2002), quienes explican que el proceso que posibilita la efectividad de la criopreservación, está relacionado con la superficie de contacto y

el tiempo de exposición del embrión con el criopreservante, siendo el caso de los tratamientos de congelación lenta un tiempo de exposición mayor comparado con los de vitrificación que requieren un paso rápido por el criopreservante para evitar el daño tóxico por la alta concentración del mismo en estos protocolos. Al evaluar este mismo parámetro a las 24 horas de cultivo, se constató una mayor reconstitución de blastocele en los tres tratamientos que utilizaban embriones obtenidos mediante procedimientos in vivo (T1, T2 y T3) que en aquellos obtenidos in vitro (T4, T5, T6).


Si tomamos en cuenta el método de criopreservación utilizado y analizamos por separado los embriones obtenidos in vivo de los obtenidos in vitro, observamos que los mejores resultados a las 12 horas se dieron sobre los embriones que se sometieron a congelación convencional (T1, T4), más que sobre aquellos que se aplicó procesos de vitrificación (T2, T3, T5, T6). Comparando esto con el ensayo realizado por Serrano et al., (2002), que evaluaron tasas de expansión a las 12 horas post cultivo utilizando embriones producidos in vitro criopreservados mediante congelación lenta (1.4 M Glicerol) y vitrificación (25 % glicerol + 25 % etilenglicol en tres pasos), sus resultados fueron de 46.7 % de embriones expandidos al utilizar congelación lenta y 38.1 % al utilizar vitrificación, se puede observar que los embriones en nuestro ensayo presentaron un comportamiento similar en cuanto al método de criopreservación pero con tasas de expansión superiores ( 80 % para congelación lenta y 60 % para vitrificación). En el caso del parámetro degeneración embrionaria, es notorio que tanto a las 12 como a las 24 horas de cultivo, sin importar la procedencia de los embriones, los tratamientos que se sometieron al proceso de vitrificación (T4, T5, T6), fueron los que presentaron un mayor número de embriones degenerados y este efecto es aún más notorio en los embriones producidos in vitro y sometidos a vitrificación (T5, T6), con

más de un 50% de los embriones degenerados a las 24 horas de cultivo. En el estudio de Serrano et al., (2002), con embriones obtenidos in vitro, los porcentajes de embriones degenerados fueron de 36.6% para criopreservación lenta y 40.2 % para vitrificación a las 12 horas de cultivo, siendo menor en nuestro estudio para los embriones criopreservados por congelación lenta (20%) pero coincidía en los protocolos de vitrificación (40%). A nuestro criterio y de acuerdo con Lonergan (1994), esto puede deberse a que los embriones producidos in vitro presentan menos cantidad de blastómeros que los producidos in vivo, por otra parte Long (1998) sustenta que los embriones in vitro se caracterizan por alteraciones en la organización del citoesqueleto, mayor sensibilidad a la manipulación y a la criopreservación y un detrimento en su competencia para el desarrollo posterior, siendo esta la posible causa de la alta tasa de degeneración post descongelación de los mismos. Finalmente, se evaluó la tasa de eclosión a las 48 y 72 horas de cultivo lo cual era el indicativo de que el embrión fue capaz de reconstituir su estructura y seguir su desarrollo normal y por ende, que el método de criopreservación utilizado permitía mantener su viabilidad, obteniéndose las tasas de eclosión que se observan en los cuadros II y III.

Cuadro II. RESULTADOS OBTENIDOS POST

DESCONGELACIÓN Y CULTIVO CON EMBRIONES PRODUCIDOS IN VIVO E IN VITRO SOMETIDOS A CONGELACIÓN LENTA.

Tratamiento #

cultivados Eclosionados 48h 72 h

n % n %

T1 30 20 66.67 23 76.67a

T4 30 15 50 17 56.67b

Total 60 35 58.33 40 66.66

Letras diferentes en una misma columna evidencian diferencias estadísticas P<0.05

Si observamos los resultados expuestos en el cuadro II, se tiene que las mejores tasas de eclosión se dan en aquellos embriones obtenidos in vivo, lo cual es coincidente con lo que plantea Voektel y Hu (1992) y Leibo (1984), que obtuvieron tasas de eclosión de 70 y 67 % usando como criopreservantes 1.5 M etilenglicol

y 1.8 M glicerol respectivamente. En tanto que, utilizando embriones producidos in vitro, Sommerfield y Niemann (1999), utilizando etilenglicol 1.8 M obtuvieron tasas de eclosión del 30%. Este comportamiento se observa claramente en el estudio de Khurana y Niemann (2000), los cuales aplicando un protocolo de congelación lenta con Glicerol 10% obtuvieron un 80% de eclosión para los embriones obtenidos in vivo contra solo un 36% para aquellos obtenidos in vitro. En contraste, Pugh et al., (1998) y Abe et al., (2002), obtuvieron tasas de eclosión de 60.9 y 75% con 1.8 M de Etilenglicol como criopreservante con embriones in vitro, cuyos resultados contrastan en gran manera con los resultados de los autores enunciados anteriormente. Al realizar el análisis estadístico para este parámetro se tuvo que la aplicación de


congelación lenta presenta diferencias estadísticamente significativas (P <0.05), siendo más efectiva su aplicación sobre embriones

obtenidos in vivo que sobre los obtenidos in vitro con una tasa de eclosión de 76.67% para los primeros versus un 56.67% en el segundo caso.

Cuadro III. RESULTADOS OBTENIDOS POST

DESCONGELACIÓN Y CULTIVO CON EMBRIONES PRODUCIDOS IN VIVO E IN VITRO SOMETIDOS A DOS

PROTOCOLOS DE VITRIFICACIÓN.

Vitrificación # de embriones cultivados

Eclosionados 48h 72 h

n % n %

T2 30 17 56.67 20 66.67a

T3 30 16 53.33 18 60a

T5 30 9 30 11 36.67b

T6 30 11 36.67 12 40b

120 53 44.26 61 50.83

Letras diferentes en una misma columna evidencian diferencias estadísticas P<0.05

En el caso de la vitrificación (cuadro III), hubo un comportamiento bastante similar al que se obtuvo con el procedimiento de congelación lenta en cuanto a que las tasas de eclosión fueron mayores en aquellos tratamientos que utilizaban embriones obtenidos in vivo (T2, T3) que en aquellos que utilizaban embriones obtenidos in vitro (T5, T6). En este sentido los resultados enunciados por algunos autores son bastante contradictorios entre sí, por ejemplo, para el caso de embriones producidos in vitro, Dinnyès et al., (1996) usando como crioprotector 6.5 M de glicerol, aseveran haber logrado tasas de eclosión del 53 %, Tachikawa et al., (1993) con el empleo de Propilenglicol al 40 % + Ficol 30 % + sacarosa 0.5 M obtuvieron 24 % de eclosión, Kaidi et al., (1999) utilizando 25 % etilenglicol + 25 % glicerol reportaron 53 % y Martínez et al., (2002) también con el uso de 25 % etilenglicol + 25 % glicerol, pero adicionando 0,5 M de sacarosa obtuvieron tasas de eclosión de 45 %. En el caso de embriones producidos in vivo, Ishimori et al., (1993) quienes ensayaron etilenglicol 25 % + DMSO 25 % obtuvieron tasas de eclosión de hasta un 80%. En nuestro estudio se observó el mismo comportamiento al hacer el análisis estadístico correspondiente al tipo de embriones empleados, donde se encontró diferencia estadística significativa (P<0.05), entre los tratamientos que usaban embriones obtenidos in vivo sobre aquellos que utilizaron embriones obtenidos in

vitro, mas no hubo diferencias cuando se comparó dentro de cada tratamiento de criopreservación para un mismo tipo de embriones (in vivo o in vitro). Con relación a que los embriones obtenidos in vitro fueron más susceptibles a la criopreservación que los obtenidos in vivo, podemos explicar este comportamiento relacionándolo a características embrionarias publicadas en estudios de diferentes autores (Dorland et al., 1995; Thompson et al., 1994; Leibo et al., 1993), quienes indicaron que en los embriones producidos in vitro, hay mayor presencia de micro gotas citoplasmáticas de lípidos, las cuales modifican las características de comportamiento físicas y funciones de membranas, lo cual según Gudayer-Joly (1998) puede tener un efecto directo sobre la supervivencia de la célula al proceso de enfriamiento y congelación. Esto también se relaciona con el medio de cultivo empleado en la producción de los embriones que en nuestro caso fue el SOF (Kim et al., 1993), ya que autores tales como Larocca et al., (2010) y Lehninger et al., (1975) afirman que el tipo de medio de cultivo y los componentes del mismo tienen su efecto sobre el número de embriones obtenidos y la calidad de los embriones producidos.

CONCLUSIONES

De acuerdo a nuestros resultados arribamos a las siguientes conclusiones:

Los protocolos de congelación lenta ensayados tuvieron una mayor efectividad que los de vitrificación tanto para embriones producidos in vivo como in vitro.

Los embriones producidos in vivo muestran una mayor tolerancia a los procesos de criopreservación practicados en nuestro estudio.

Al evaluar la interacción entre el método de criopreservación y modo de obtención de los embriones, concluimos que el método de congelación lenta y los embriones producidos in vivo son los más eficientes.


RECOMENDACIONES

Al momento de implementar un programa de criopreservación de embriones tanto producidos in vivo como in vitro, se recomienda que se emplee el protocolo de congelación lenta utilizando 1.5 M de etilenglicol.

En el caso de embriones producidos in vivo, es factible emplear la vitrificación como método de criopreservación en trabajos de campo donde no se disponga de equipos de congelación programables.

Se recomienda realizar otras investigaciones que desarrollen los protocolos propuestos en el estudio aplicando transferencia de los embriones para evaluar tasas de gestación y comparar si esta no difiere en gran medida con los resultados obtenidos mediante cultivo in vitro.

En el caso de los embriones producidos in vitro es recomendable ensayar nuevos protocolos de criopreservación que permitan encontrar un sistema más eficiente y viable que la comercialización a gran escala de este tipo de embriones.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abe, h.; Yamashita, S.; Satoh, T ; Hoshi, H. 2002. Acumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serum-free o serum-containing media. Mol. Reprod. Dev. 61:57-66.

De Armas, R., Solano, R. 1995. Manual Práctico de Transferencia de Embriones y Fertilización in Vitro. Publicaciones CIMA. Cuba. 118 p.

De Armas, R. 2007. Transferencia de embriones en el ganado bovino. Panamá: Universidad de Panamá, 117 p.

Dinnyes, A Fair, T; Lonergan, P;.; Cottell, D. C.; Hyttel, P; Ward, EA. 2001. Ultrastructural of bovine blastocysts following cryopreservation: effect of method of blastocysts production. Mol. Reprod. Dev. 58:186-195.

Dorland M, Gardner DK, Trounson AO. 1995. Serum in synthetic oviduct fluid causes mitochondrial degeneration in ovine embryos. J Reprod Fert. ; Abstr. Ser. 13: 70.

Fogarty, N..; Maxwell, W.; Eppleston, J.; Evans, G. 2000. The viability of transferred sheep embryos after long-term cryopreservation. Reprod. Fertil. Dev., 12:31-37.

García, M.; Baselga, M.; Viudes, M.; Vicente, J. 2000. Reconstitución de una línea de conejos a partir de embriones crioconservados. Arch. Zootec., 49:81-86.

Gordon, I. 1994. Storage and cryopreservation of oocytes and embryos. En:

Laboratory production of cattle embryos (I. Gordon, eds.). Cab International, Cambridge, UK, Capítulo 6, pp. 293-328

Gordon, I. 1996. Transferencia de embriones y técnicas asociadas en el ganado

vacuno. En: Reproducción controlada del ganado vacuno y búfalos (I. Gordon, eds.). Acribia, Zaragoza, España, Capítulo 7, pp. 255-385

Guyader-Joly C. 1998 Activité métabolique et aptitude à la congélation de l’embryon bovin produit in vitro. Elevage et Insémination 288: 3-23.

Ishimori, H.; Miki, Y.; Kishi, M.; Saeki, K.; Seike, N.; Kainuma, H. 1993. Vitrification of bovine embryos. The-riogenology 40:427-433.

Kaidi, S.; Van Iangnedonckt, A.; Massip, E; Dessy, E; Donnay. 1999. Cellular alteration after dilution of cryoprotective solutions used for vitrification of in vitro bovine embryos. Theriogenology 52:515-252.

Koyner, P.; Pino, J. 2010. Estudio y aplicación de las técnicas de maduración, fertilización y cultivo in vitro, en la producción de embriones bovinos en Panamá. Tesis: Universidad de Panamá, 120 p.

Khurana, K.; Niemann, H. 2000a. Effects of cryopreservation on glucose metabolism and survival of morulae and blastocysts derived in vitro or in vivo. Theriogenology 54:313-326.

Larocca, C., Filipiak, J. 2010. Fertilización in vitro en bovinos, manual teórico-práctico. Uruguay: Universidad de la República-Facultad de Veterinaria, 26 pags.

Leibo, S.P. 1984. Equilibrium and nonequilibrium cryopreservation of embryos.

Theriogenology, 31:85-93.

Leibo, S.P.; Songsasen, N. 2002. Cryopreservation of gametes and embryos of non domestic species. Theriogenology, 57:303-326.

Lonergan, P. 1994. Growth of preimplantation bovine embryos. Acta Vet. Scand.,

35:307-320.

Long, C.R. 1998. Dual labelingof the cytoskeleton and DNA strand breaks in porcine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod and Develop. 51:59-65.

Martínez, A.; Valcarcel, A.; De Las Heras, M.; De Matos, D.; Furnus, C.; Brogliatti, G. 2002. Vitrification of in vitro produced bovine embryos: in vitro and in vivo evaluations. Anim. Reprod. Sci. 73:11-21.

Mazur, P. 1984. Fundamental aspects of the freezing of cells, with emphasis on mamalian ova and embryos. Anim. Repr. Sci. 28: pp 239-245.

Palma, G. 2008. Biotecnología de la reproducción. 2da. Edición, Argentina, 668 p.

Pugh, P.; Trevit, H. R.; Niemann, H. 2000. Effects of vitrification medium composition on the survival of bovine in vitro produced embryos, following in straw-dilution, in vitro and in vivo following transfer. Anim. Reprod. Sci. 58:9-22.


Sommerfeld, V., H. Niemann, 1999. Cryopreservation of bovine in vitro Produced Embryos Using Ethylenglicol in Controlled Freezing or Vitrification. Cryobiology 38: pp 95-105

Serrano C., Sierra R., Sanchez J.,Restrepo L., Olivera M.. 2002. Evaluación de dos métodos de criopreservación sobre la Calidad de embriones producidos in vitro. Rev col cienc pec vol. 15: 3, pp. 286-292.

Tachikawa, S.; Otoi, T; Kondo, S.; Machida, T; Kasai, M. 1993. Successful vitrification of bovine blastocysts,

derived by in vitro maturation and fertilization. Mol. Reprod. Dev. 34:266-271.

Thompson JG, Gardner DK, Pug, PA, McMillan WH, Tervit HR. 1994. Lamb birth weight following transfer is affected by the culture system used for pre-elongation development embryos. J Repr Fert; Abstract Series 13: 25

Voelkel, S. A.; Hu, Y. X. 1992. The use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology 37:687-697.


TRANSFERENCIA DE EMBRIONES Y SU ACEPTACIÓN EN LA GANADERÍA

PANAMEÑA

Reinaldo de Armas1

RESUMEN

El presente trabajo tiene el objetivo el exponer la necesidad de empleo de los programas

de transferencia de embriones, como herramienta de mejora genética en nuestro país.

Primeramente trata de resumir de forma concreta las técnicas de producción de

embriones bovinos (superovulación y fecundación in vitro), para su transferencia, sus

ventajas y desventajas. Se comentan las posibilidades que abre la conservación

congelada de embriones, tanto para la importación de material genético elite con fines de

mejoramiento de nuestro rebaño, como para la comercialización interna o para la

exportación de nuestra genética. Finalmente se estiman costos con los resultados

alcanzados en el país y se hace una reflexión sobre el estado actual de la aceptación y la

aplicación de la técnica de transferencia de embriones en la ganadería panameña.

Palabras claves: transferencia de embriones, superovulación, fecundación in vitro,

mejora genética.

ABSTRACT

The present work has the objective exposing the necessity of use of the programs of

transference of embryos, like tool of genetic improvement in our country. Firstly it tries to

summarize of form makes specific the production techniques of bovine embryos

(superovulation and fertilization in vitro), for its transference, its advantages and

disadvantages. The possibilities comment that the congealed conservation of embryos

opens, as much for the import of genetic material elite with aims of improvement of our

flock, like for the internal commercialization or the export of our genetics. Finally costs with

the results reached in the country are considered and a reflection becomes on the present

state of the acceptance and the application of the technique of transference of embryos in

the Panamanian cattle ranch.

Key words: transference of embryos, superovulation, fertilization in vitro, genetic

improvement.

1 PhD. Profesor Regular, Cátedra de Reproducción y Biotecnología Animal. Departamento de

Zootecnia, Coordinador Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá.


INTRODUCCIÓN

El objetivo fundamental de la ganadería

moderna, es el incremento de la productividad

de los rebaños, de tal forma que el empleo de

las Biotecnologías de la Reproducción como

herramientas para lograr saltos en el

mejoramiento genético, ha representado un

importante logro. A pesar de que la técnica de

transferencia de embriones (T.E.), data de los

trabajos realizados por Walter Heape a finales

del siglo XIX y de la creciente popularidad en

su uso, basada en las bondades de la misma

para la reproducción intensiva de los animales

de mayor valor productivo, con un gran

impacto en la mejora genética. También logra

acelerar el reemplazo, con los descendientes

de la elite del rebaño, lo que sin dudas

permitiría aumentar los niveles de producción

en un intervalo de tiempo relativamente corto,

así como facilita el intercambio de este

material genético (embriones congelados),

entre diferentes fincas e incluso entre países.

Además, sin relegar a un segundo plano se

debe tener en cuenta la importancia que

posee el emplear esta técnica en la

reproducción intensiva de las hembras más

productivas del rebaño nacional, ya que estos

animales han demostrado su productividad

bajo las condiciones locales, lo que evidencia

su adaptabilidad al medio ambiente donde se

han desarrollado.

La TE es empleada en los países

desarrollados como técnica rutinaria en la

producción de sementales y madres de toros,

por lo que no es raro, que mas del 80% del

semen que se comercializa en la actualidad es

producido a partir de toros logrados por TE. y

también es conocido que esta técnica ha sido

empleada con gran éxito, en los programas de

mejora genética en ganado de carne, pero

más intensamente en ganado de leche.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES POR

SUPEROVULACIÓN.

En sentido general la técnica se basa en la

inducción hormonal de ovulaciones múltiples,

para obtener un número considerable de

embriones, en vez de uno solo, como ocurre

normalmente durante el ciclo estral. Una vez

realizada la estimulación, se procede a la

fecundación de los óvulos liberados, por medio

de la monta natural o la Inseminación Artificial.

Luego de 7 días se realiza un lavado del útero

para colectar los embriones, los que pueden ser

transferidos a otras vacas previamente

sincronizadas o conservados por congelación

para su posterior transferencia Generalmente los

resultados son entre 4 y 6 embriones por

donante superovulada e índices de preñez de 50

y 70% para embriones congelados o transferidos

en fresco, respectivamente. Esto sin dudas nos

dice, que podemos estar obteniendo entre 3 a 4

crías por donante en cada tratamiento

superovulatorio, si a esto le sumamos que es

posible realizar 3 superovulaciones al año,

estaríamos hablando que en un solo año

tendríamos más crías de nuestra mejor vaca que

en toda su vida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES POR FIV

La FIV trata de imitar los procesos fisiológicos

que acontecen in vivo, durante la maduración

ovular y la capacitación espermática como

pasos previos para la fertilización y el posterior

desarrollo de los óvulos fecundados hasta

estadios de desarrollo en que pudieran ser

transferidos exitosamente. Aquí se obtienen los

ovocitos por aspiración de los folículos (ya sea

en ovarios post mortem o en animales in vivo con

la ayuda de la ecografía) y estos son sometidos

a condiciones de cultivo pre-establecidas en el

laboratorio, para que se verifiquen in vitro los

eventos antes mencionados.


POSIBILIDAD DE LA CONSERVACIÓN

CONGELADA DE LOS EMBRIONES

Una de las posibilidades más interesantes que

brinda la transferencia de embriones es que los

embriones que nos pueden sobrar por falta de

receptoras, o por que deseemos transferirlos en

otro momento o simplemente venderlos, pueden

conservarse de manera congelada por largo

tiempo. Por otra parte abre la posibilidad de

importación de embriones del extranjero, sin

peligro de diseminar enfermedades, al ser

previamente tratados con enzimas que eliminan

la contaminación con agentes patógenos. Esto

permite introducir razas exóticas o de zonas

distantes, salvando los costos de transportación

y cuarentena, que limitan la importación de

animales vivos. Así también, salva los problemas

relativos a la adaptación al nuevo ambiente, ya

que los terneros producidos a partir de

embriones congelados nacerán en vientres

autóctonos del lugar donde van a desarrollar,

comenzando su adaptación desde el mismo

útero y recibiendo al nacer (vía madre

receptora), las inmunoglobulinas necesarias para

iniciar su vida.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBAS

TÉCNICAS

Ambas técnicas tienen como objetivo su

utilización en los programas de mejora genética

con menores costos y/o con resultados más

rápidos que los logrados con las metodologías

tradicionales disponibles (monta natural,

controlada o inseminación artificial).

La producción de embriones in vitro a partir de

ovarios de matadero nos permitiría a través de la

inducción de mellizos, producir 30-40% más de

terneros por vaca y una ganancia neta superior

al 20%, con respecto a un sistema clásico.

También es posible realizar cambios de raza o

cruzamientos, con bajos costos relativos y en

cortos períodos, así como crear bancos de

germoplasma con costos competitivos a nivel

internacional.

Tanto la Superovulación como la FIV nos

permiten hacer un mayor aprovechamiento con

el menor costo del semen de mayor calidad y

precio disponible en el mercado. Pero

indudablemente la FIV supera a la producción de

embriones por superovulación en este sentido.

Con el empleo de la aspiración folicular guida por

ecografía y la FIV, es posible aprovechar vacas

de alto valor descartadas de la reproducción, que

significan una pérdida genética permanente. A

su vez es posible producir crías a partir de

hembras gestantes o impúberes, lo que acelera

la mejora genética y de las hembras que no

responden a la superovulación.

Ambas técnicas requieren de un personal

especializado y altamente calificado, más aun en

el caso de la FIV, al que se le adiciona la

necesidad de un laboratorio de alta complejidad

operativa.

Si bien la conservación congelada de los

embriones producidos por superovulación hace

que los resultados de preñeces disminuyan en

alrededor del 20% (40 a 50%), con los

embriones producidos in vitro los resultados post

descongelación son menores y se encuentran

entre un 25 a 30%.

ESTADO DE ACEPTACIÓN DE LA

TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN

PANAMÁ

En nuestro país se han realizado importantes

adquisiciones tanto de semen, embriones y

animales, para ser empleados en la mejora

genética del rebaño nacional. A pesar de esto

el empleo de estas técnicas a nivel de campo

mantiene bajos niveles. Esta realidad es

motivada por los altos precios del semen,

embriones y animales, así como altos costos

de las técnicas (insumos y mano de obra

especializada) y la falta de programas

adecuados para la producción de semen y

embriones a nivel local.

En Panamá, durante la última década, se ha

venido observando un incremento en la

aplicación de programas de superovulación y

más recientemente de producción in vitro y


transferencia de embriones a nivel de finca. A

su vez se han realizado importaciones de

embriones congelados de Alemania, Australia,

Brasil, Canadá y USA. Sin embargo, resulta

contrastante que la mayoría de estos trabajos

se han practicado en explotaciones de ganado

de carne, quedando la ganadería de leche

enclaustrada mayormente en el empleo de la

inseminación artificial. Analizando estos

hechos, nos es difícil encontrar una respuesta

a la realidad Nacional, de que no se exploten

adecuadamente las potencialidades de la TE.

Podemos expresar sin temor a equivocarnos,

que la simplificación de la técnica, el

incremento en los resultados y la

disponibilidad de profesionales entrenados en

la misma dentro de nuestro país, ofrecerian

una gran oportunidad a la industria lechera y

carnicera en Panamá, la cual deberá en los

próximos años lograr un incremento en su

nivel de rentabilidad, como única respuesta a

la globalización del mercado y a los nuevos

tratados comerciales con otros países. Es

posible que la poca información disponible en

publicaciones sobre los resultados obtenidos

en el país sean la causa de esta realidad.

Hagamos una aproximación con nuestros

resultados del costo de la producción de una

preñez por superovulación en Panamá.

Produciendo una media de 6 embriones por

donante y 66.6% de preñez (4), en la

transferencia estaríamos hablando de un

costo aproximado que oscila entre 260.00 a

300.00 B/. Desglosado sería: Superovulación

(hormonas y mano de obra en 190 B/.) + I.A.

(materiales y mano de obra: 10.00 B/. +

semen 150.00 B/.)+ Colecta, Búsqueda y

Selección de los embriones: (medios y

materiales 80.00 B/.+ Mano de obra

100.00B/). Dividido entre 6 embriones = 88.33

B/. (costo por embrión)

Para lograr la preñez necesitamos 1.33

embriones o sea 118.00 B/. (en embriones) +

Sincronización de 2 receptoras por preñez

(hormonas y mano de obra: 28.00 B/.) + 1.33

Transferencias (materiales 8.00 B/.)+ Mano de

obra por preñez. (100.00 B/).= 260.00 B/.

costo final aproximado de la preñez.

Ahora, a pesar de que la producción in vitro

de embriones, resulta más barata en cuanto a

los gastos que se incurren. Esto es debido a

que se reducen los gastos en hormonas de

sincronización y superovulatorias en la

donadora, así como los medios y materiales

para la colecta, siguiendo fijos los de las

receptoras y transferencia. Debemos plantear

que los mas bajos resultados de preñez de los

embriones producidos in vitro y el costo del

personal (mano de obra altamente

especializada) y funcionamiento del

laboratorio de FIV, hoy por hoy hacen que el

costo por preñez en Panamá esté entre

450.00 y 600.00 B/. Sin dudas esto debe

cambiar en un futuro próximo, equilibrándose

ambos costos.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se concluye que es necesario incrementar el

trabajo de docencia para dar a conocer y

diseminar, la importancia y necesidad del empleo

de estas biotecnologías de la reproducción, en el

mejoramiento genético de nuestro rebaño

nacional.

Recomendamos que se deben continuar con las

investigaciones que permitan incrementar los

resultados y abaratar los costos, para que las

mismas puedan tener más accesibilidad y por

ende mayor impacto económico en los pequeños

y medianos productores. Por otra parte las

Instituciones del estado (MIDA; IDIAP,

Universidad de Panamá entre otras), deberán

tratar de brindar estos servicios a precios

módicos para programas de desarrollo en áreas

estratégicas del país.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

De Armas, R. y Solano, R. (1995). Manual Práctico de Transferencia de Embriones y Fertilización In Vitro. Ed. CIMA., La Habana, Cuba.


De Armas, R. y Pérez, L, F. (2002). Resultados de la Transferencia de embriones congelados y frescos en novillas Holstein x Cebú en la Región de Azuero. Ciencia Agropecuaria. 11. 75-86. De Armas, R. (2007). Transferencia de embriones en el ganado bovino. Ed. Facultad de ciencias Agropecuarias. UP. De Armas, R., Berroa, D., Colmenares, A. y Aparicio, N. (2010). Empleo de biotecnologías de la reproducción en la producción de reproductores. Investigación Agropecuaria. Investigación Agropecuaria. Ed: FCA-UP. 1: 152-159.

Guerra, R., Solís, A., Sandoya, G y De Armas, R. (2011). Producción de embriones In Vitro a partir de ovocitos obtenidos mediante punción folicular (OPU-FIV). Actualidad Agropecuaria. 144: 16-18.

Larocca, C. y Filipiak, J. (2010). Fertilización in vitro en bovinos, manual teórico-práctico. Uruguay: Universidad de la República-Facultad de Veterinaria, 26 p.

Palma, G. 2008. Biotecnología de la reproducción. 2da.

Edición, Argentina, 668p. Solís, A, Guerra, R. Sandoya, G y De Armas, R. (2011).

Aspiración folicular transvaginal guiada por ecografía en el bovino. Actualidad Agropecuaria.144: 24-26.

Nava, H. y Hernández, H. (2005). Aspiración folicular

transvaginal (en línea). Maracaibo, V. Universidad de Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Consultado 25-Junio-2011. Disponible en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/ manualganaderia/seccion8/articulo3-s8.pdf.

http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/%20manualganaderia/seccion8/articulo3-s8.pdf

http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/%20manualganaderia/seccion8/articulo3-s8.pdf


BIOTECNOLOGÍA REPRODUCTIVA: SITUACIÓN ACTUAL Y PERSPECTIVAS FUTURAS PARA EL MEJORAMIENTO DE LA PRODUCCIÓN ANIMAL.

Reinaldo De Armas, R.1

RESUMEN El presente trabajo no pretende hacer una recopilación bibliográfica sobre el desarrollo de las biotecnologías reproductivas, solo queremos hacer un breve recorrido por aquellas que están disponibles en la actualidad, para ser empleadas en el mejoramiento de de la producción animal. Muchas de ellas son conocidas por los productores pero su adopción en la mayoría de los casos es muy limitada, ya sea por sus costos, la falta de personal técnico capacitado o por falta de difusión. Entre los temas a tratar se encuentran la sincronización e inducción de la ovulación, inseminación artificial y congelación de semen, producción de embriones por superovulación, producción in vitro de embriones, congelación de ovocitos y embriones, micromanipulación de embriones para producir gemelos idénticos y quimeras, determinación y selección del sexo de embriones y espermatozoides, clonado de animales por medio de transferencia nuclear y transgénesis. Abordaremos sus motivaciones y limitaciones actuales las cuales nos indican que nos queda mucho por investigar para elevar sus resultados, hacerlas sostenibles y evitar los problemas éticos que su aplicación pueden provocar. PALABRAS CLAVE: Sincronización, embriones, quimeras, clonado, transgénesis.

ABSTRACT The present work does not pretend to do a bibliographic compilation about reproductive biotechnology development; we only want to make a short overview from those that are available for animal production improvement at the present. Most of them are well known by most of the animal producers, but their adoptions are limited due to prices, lack of expert technicians or pour diffusion. Among the subjects included in this article are those related to ovulation induction and synchronization, artificial insemination, semen freezing, embryo production by superovulation or in vitro, oocyte and embryo freezing, embryo micromanipulation for producing identical twins and chimeras, sperm and embryo sexing, cloning and transgenesis. We will deal with motivations and current limitations which show us that there is much to do in research, for improving sustainable results and prevent inherent ethic problems related to its application. Key words: synchronization, embryos, chimeras, cloning, transgenesis.

1 PhD. Dr. M.V. Profesor de la Cátedra de Biotecnología y Reproducción Animal. Departamento de Zootecnia. Coordinador del

Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. Apartado Postal 0426-00002, David, Chiriquí, Panamá.e-mail: [email protected]

mailto:[email protected]


INTRODUCCIÓN Las biotecnologías de la reproducción agrupan técnicas que van desde el manejo hormonal del ciclo estral, la inseminación artificial (IA), hasta la transgénesis y clonación, las cuales pueden aumentar la eficiencia reproductiva y productiva de los animales de importancia zootécnica. Todas ellas deben ser empleadas como valiosas herramientas, en la producción animal y no un como desafío al bolsillo de los que quieran mostrar su solvencia económica o adoptarlas por estar a la moda. Con los logros de la genética poblacional y de los métodos genético- estadísticos ha sido posible el desarrollo programas de evaluación y selección de reproductores por medio de las pruebas de progenie con un alto grado de confiabilidad. Esto ha estimulado la aplicación de las técnicas de IA, producción in vivo e in vitro de embriones, conservación de gametos y embriones, producción de gemelos idénticos y clonación. Estas biotecnologías sin duda alguna, pueden salvar el inconveniente del largo intervalo inter parto en nuestros rebaños y aprovechar el potencial gamético de tanto machos como hembras, logrando incrementar significativamente el progreso genético en comparación con los programas convencionales de reproducción. Ejemplo de esto es que en los últimos 50 años la producción de leche por vaca por año (producción de leche, grasa y proteína) se duplicó a través del mejoramiento genético de las razas lecheras, situación semejante se ha observado en el incremento productivo del ganado de carne (disminución de la edad al sacrificio, rendimiento por canal y calidad de la carne). Este progreso genético se ha estado logrando con la aplicación de programas de mejoramiento, con el empleo de la técnicas como inseminación artificial y la TE, por medio de la selección de toros y vacas mejoradoras a partir de las poblaciones elites. (Palma 2008) A pesar de que en nuestro país se han realizado importantes adquisiciones tanto de semen, embriones y animales, para ser empleados en la mejora genética del rebaño nacional, el empleo de estas técnicas a nivel de campo mantiene bajos niveles. Esta situación es motivada por los altos precios del semen, embriones y animales, así como altos costos de las técnicas, falta de personal capacitado y programas de mejoramiento genético adecuados, para la

producción de semen y embriones a nivel local. (de Armas 2011). BIOTECNOLOGÍAS DE LA REPRODUCCIÓN Cuando hablamos de biotecnologías de la reproducción, debemos hacer una diferenciación entre las trabajan a nivel de los genes del animal y las que no alteran el genoma. Las técnicas génicas o transgénicas se ocupan de los genes en particular y aunque utilizan en su ejecución técnicas reproductivas no son incluidas dentro de las que son aplicadas de forma masiva o práctica. Sin embargo se justifica su existencia y su desarrollo científico, particularmente de las más modernas, por las necesidades que aún presenta la producción de tanto alimentos de origen animal, como de proteínas y enzimas de importancia biomédica. Es así, que la inyección de ADN en pronúcleos de cantidades masivas de cigotos bovinos u ovinos es posible gracias a la maduración y fecundación in vitro previas, establecidas en la producción in vitro de embriones. En la actualidad, la baja eficiencia de la transgénesis para producir terneros, puede compensarse satisfactoriamente cuando el animal obtenido es reproducido en forma idéntica, a través de la clonación. De esta manera permite llevar a la práctica el concepto de gene farming o granja biológica productora de proteínas. (Palma 2008). Ahora cuando hablamos de biotecnologías reproductivas nos referimos a aquellas que no trabajan a nivel genómico, entre las que abordaremos las siguientes:

Sincronización e inducción de la ovulación

Inseminación artificial y congelación de semen

Producción de embriones por superovulación

Producción in vitro de embriones

Congelación de ovocitos y embriones

Micromanipulación de embriones para producir gemelos idénticos y quimeras

Determinación y selección del sexo de embriones y espermatozoides

Clonado de animales por medio de transferencia nuclear

Transgénesis. SINCRONIZACIÓN E INDUCCIÓN DE LA OVULACIÓN La necesidad de los sistemas de explotación intensivos de implementar la IA, han sido el


motor impulsor de las investigaciones desarrolladas en cuanto al desarrollo de técnicas de sincronización e inducción del celo. Estos tratamientos han permitido el agrupamiento de los partos de acuerdo a la planificación productiva, disminución de costos por mantenimiento de contenedores, aprovechamiento del personal dedicado al celaje, aportándonos ventajas en comparación con el sistema convencional de IA todo el año el cual es poco aplicable en grandes explotaciones de ganado de carne. (de Armas y Abrego 2010) Entre los sistemas de sincronización del celo los más conocidos son: Empleo de las Prostaglandinas: Para que este medicamento ejerza su acción resulta necesario la presencia de un cuerpo lúteo (CL) activo en uno de los ovarios de la hembra (fase media luteal, entre los días 8 y 16). La aplicación de la prostagladina (PG), provoca la regresión del CL con la consiguiente caída en la progesterona y el desencadenamiento de un nuevo celo ovulatorio entre las 48 y 72 horas siguientes. Puede aplicarse en una dosis (25mg), si conocemos el celo precedente o en dos aplicaciones a 11 días de intervalo. Una de las desventajas de este tratamiento es la dispersión de la presentación de los celos, pero sus resultados de gestación son altos (~60%). (Nebel y Jobst 1998). Empleo de Progestágenos y Estradiol: Los sistemas más conocidos que emplean estos principios hormonales son los implantes subcutáneos (Crestar y Sinchromate B), espirales y las Y intravaginales (CIDR). Hay otros tratamientos que solo emplean progestágenos, como las inyecciones seriadas de progesterona (P4) o suministro en la dieta (MAP o CAP). Todos estos productos crean una fase luteal artificial, la cual finaliza con la terminación del tratamiento, provocando una retro alimentación positiva para la descarga de FSH y LH hipotalámica necesaria para la ovulación (celo y ovulación). El tratamiento más utilizado en la actualidad con el CIDR, consiste en administrar 2 mg de BE al momento de la inserción del dispositivo en el Día 0, remover el dispositivo en el Día 7 u 8 y administrar PGF2α y 24h después 1 mg de BE para sincronizar la ovulación. Los resultados de gestación están alrededor del 50%. (Baruselli et al 2004)

Ovsynch (GnRH, PGF2α, GnRH): Aplicación de GnRH (100mg de hormona liberadora de las gonadotropinas), con el objetivo de sincronizar la onda folicular (inducir la ovulación del folículo dominante y promover una nueva ola folicular), 7 días más tarde se aplica PGF2α (25mg, inductor de la luteolisis) y una 2

da dosis de GnRH (100

mg), en el momento de la IA, para inducir el pico preovulatorio de LH (el celo aparece entre las 36 y 48 h después de la PGF2α y se insemina 12 h después de detectado el celo, o sea como promedio a las 56 h). Se pueden lograr resultados de preñez que oscilan entre 33 y 55%.(Atkins et al 2008). IATF: En muchos rebaños se han estado incluyendo la IATF (inseminación artificial a tiempo fijo) como práctica rutinaria, por la disminución de costos de personal al eliminar la necesidad de detección del celo, no obstante los resultados ligeramente más bajos que son logrados por los mismos. Co-Synch+CIDR: Aquí se emplea una fuente exógena de P4 entre la 1

ra GnRH (inducir la

ovulación o luteinización del folículo dominante y promover una nueva ola folicular) y entre las 50 y 60h antes de la 2

da GnRH se retira el CIDR y se

aplica la PGF2α , la 2da GnRH se aplica el día 7 y se brinda la IATF. En este caso las vacas que están ciclando pueden presentar dos cuerpos lúteos, uno espontáneo o natural, proveniente del ciclo previo a la 1

ra GnRH y otro producto de

la ovulación del folículo dominante al momento de la 1

ra GnRH. Aquí se citan resultados de

preñez alrededor de 45% (Dobbins et al 2009) 5-d Co-Synch+CIDR: En este esquema se coloca el CIDR y la 1

ra GnRH (día 0), al cabo de

5 días se retira el CIDR y se aplican 25mg de PGF2α, repitiéndose la aplicación a las 12h. Pasadas 72h se aplica la 2da GnRH. Se han alcanzado resultados de hasta un 50%.(Crupe y Day 2011) A pesar de disponer de un gran número de esquemas de sincronización sigue existiendo limitantes como la respuesta individual el efecto raza, estado reproductivo, nutricional y productivo. Por otra parte hay regulaciones en diferentes países sobre el empleo de determinadas hormonas, lo que puede limitar el uso de los diferentes tratamientos descritos.


INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Y CONGELACIÓN DE SEMEN

Haciendo un recuento histórico tenemos que citar que los orígenes de la I.A. se remontan a la época pastoril, de acuerdo con citas presentes en la Biblia. Las mismas hacen referencia a prácticas mediante las cuales se inseminaron ovejas en celo con semen de un macho semental, pero no se conocen los métodos empleados. Ya en el siglo XIV, cuenta la leyenda que un árabe extrajo, en un paño, semen de un padrillo famoso, para luego introducirlo en la vagina de una yegua en celo, consiguiendo fecundarla. Las primeras investigaciones sobre inseminación artificial en animales domésticos se deben al monje italiano Lázaro Spallanzani, quien en 1780 logró preñar una perra con semen obtenido por emisión espontánea de un perro. En Rusia, país pionero en la técnica, Elías Ivanov inseminó con éxito 500 yeguas en el año de 1890. Pero fue el veterinario danés Sand en 1902 el cual reconoció el método de la inseminación artificial como un sistema zootécnico en la mejora de las crías destacando que “El factor más importante de la inseminación artificial es el uso económico y eficiente de reproductores valiosos”. En 1942, Salisbury, de la escuela americana, idea un diluyente a base de citrato de sodio y yema de huevo, que resulta de fundamental importancia y al que se debe la extensión de la IA. El gran paso de la inseminación artificial se inició en 1952 con el descubrimiento hecho por los norteamericanos Polge y Smith, relativo a que el semen de toro podía conservarse congelado por largo tiempo. (Palma 2008).

Con el uso de la inseminación artificial se ha conseguido la regresión de genes letales recesivos y un mejor control sanitario de transmisión de ciertas enfermedades venéreas como la trichomoniasis y la leptospirosis. En otras especies domésticas, su uso no ha sido tan intensivo por problemas ajenos a la técnica como pueden ser la dificultad para atravesar el canal cervical (ovejas, cabras y cerda), desarrollándose técnicas que emplean la laparoscopia y la inseminación intrauterina. Asimismo en porcinos, el progreso de la inseminación artificial en los últimos diez años ha sido vertiginoso y hoy en día podemos decir que más del 50% de las cerdas gestantes a nivel mundial han sido inseminadas. En otras especies animales como la yegua, la inseminación artificial

no se emplea tanto porque dependiendo de la raza las asociaciones no permiten inscribir en el libro de registros a los animales nacidos por inseminación artificial. (Foote 2002)

Esta técnica que no es más que la introducción del semen (material fecundante del macho o semilla), por medio de instrumentos, desarrollados en dependencia de las características del tracto reproductivo de las hembras cada especie. En la actualidad el procedimiento de IA en bovinos ha cambiado muy poco desde que Cassou (1964), diseñó su sistema de IA con pajuelas. (Hafez 2002).

La técnica de IA ha sido motivo de numerosas investigaciones, las cuales han logrado simplificar y elevar considerablemente sus resultados en la práctica. Una confirmación de esto lo representan los millones de inseminaciones que se realizan anualmente a nivel mundial. En contraste, en nuestro país solo se insemina menos del 5% de los vientres del rebaño nacional. Esta realidad está influida en parte, por poca proyección del sector sobre el empleo y alcance de esta técnica.

Para poder seleccionar los toros candidatos para la Inseminación artificial no solamente es importante su valor genético, ya que hay características que a pesar de ser de baja heredabilidad, como son las reproductivas, tienen un efecto importante en el rebaño. No obstante el estado sanitario general y de salud reproductiva, determinan en primera instancia la selección de un macho para ser congelado su semen. (Foote 2002)

La evaluación de la Capacidad Reproductiva de los toros (aptitud física, calidad seminal, libido, habilidad de servicio), deben ser práctica rutinaria en los hatos de cría, detectando los toros que posean alta fertilidad potencial y aquellos que tengan problemas (subfértiles o infértiles). Existen gran cantidad de toros que poseen baja fertilidad y otros que son calificados como dudosos o cuestionables, los cuales no deberían ser descartados hasta comprobada su efectividad o no, mediante la repetición posterior del examen. Asumiendo un estado de salud satisfactorio los sementales requieren cumplir 3 atributos para mostrar una fertilidad adecuada: buena condición física, buen desempeño sexual (libido) y buena calidad seminal. En nuestro país se ha comprobado mediante exámenes andrológicos y seminales, que en poblaciones no controladas de toros, entre 3 a 4 de cada 10


tienen problemas de fertilidad (provocada por la poca habilidad en la monta o pobre calidad seminal). Todo esto se traduce en bajas tasas de preñez o largos períodos de servicio, de lo que se infiere una baja productividad del rebaño (de Armas et al 2004).

Una vez satisfechos estos requerimientos, tendremos los candidatos a sementales para la Inseminación Artificial. Decimos candidatos, ya que no todos los toros seleccionados producirán semen capaz de resistir el proceso de congelación y descongelación.

El proceso de congelación consiste en la adición, al semen obtenido (por electroeyaculación o vagina artificial, después de su evaluación) de una sustancia (crioprotector), que le provee nutrientes, protege contra los daños del enfriamiento rápido, mantiene el pH, presión osmótica y el balance electrolítico, impide el crecimiento bacterial, aumento del volumen para obtener múltiples dosis, protege a la célula espermática durante la congelación. La adición de este crioprotector se realiza de forma lenta y la cantidad del mismo depende de la concentración del semen fresco y la concentración final de la dosis de semen que según, en la norma internacional, están en un rango de 10 y 12 millones de espermatozoides vivos por cc. Una vez concluida la dilución, se procede al embalaje del semen en pajillas.

Posteriormente se somete a un proceso de equilibración (4 a 5

0C), por un período de 2 a 4

h, para luego ser sometido a la congelación en vapores de nitrógeno, por unos 15 minutos y finalmente se sumergen las pajillas en el nitrógeno líquido a –196°C. No es hasta después de su evaluación post descongelación (que de ser satisfactorio el proceso), serán almacenadas en un contenedor con nitrógeno líquido, hasta su empleo en la Inseminación Artificial. Esta preservación puede ser por tiempo aún no definido. (Aparicio y de Armas 2004).

Actualmente, se han desarrollado numerosas investigaciones, las cuales han logrado desarrollar diferentes diluentes criopreservantes, que han eliminado la transmisión de enfermedades emergentes, sustituyendo los componentes de origen animal (leche o yema de huevo), por otros de origen vegetal, como es el caso del Andromed

®.

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES POR SUPEROVULACIÓN

A pesar de que la técnica de transferencia de embriones data de los trabajos realizados por Walter Heape a finales del siglo XIX y de la creciente popularidad de esta técnica, alcanzada por las bondades de la misma en la reproducción de los animales de mayor valor productivo con su incuestionable impacto en la mejora genética. En Panamá se han desarrollado numerosos trabajos, pero sin seguir programas estratégicos de mejoramiento genético y hasta el momento hay muy pocos resultados publicados de los mismos.

Erickson en 1966, señaló que los ovarios de las hembras están capacitados para producir cientos de miles de ovocitos durante su vida reproductiva; sin embargo, el número de crías que se obtienen es muchísimo menor. La transferencia de embriones obtiene un mayor rendimiento, de la producción ovárica de esas hembras. En la década de los 80 y principios de los años 90 numerosos fueron los estudios que se realizaron para conseguir que hembras de alta calidad genética, ovularán ovocitos después de un tratamiento hormonal (hiper-estimulación ovárica o superovulación), se las inseminara con semen de un macho también de alta calidad genética y se lograra su fertilización. (Palma 2008)

Como ha sido planteado por diferentes autores (Niemann 1991, Palma 1993, de Armas y Solano 1996), una de las posibilidades más interesantes que brinda la transferencia de embriones es la importación de embriones en forma congelada. Esta permite introducir razas exóticas o de zonas distantes, salvando los costos de transportación y cuarentena que limitan la importación de animales vivos. Así también, disminuye los riesgos de introducción de enfermedades no existentes en el área y salva los problemas relativos a la adaptación al nuevo ambiente, ya que los terneros producidos a partir de embriones congelados nacerán en vientres autóctonos del lugar donde van a desarrollarse, comenzando su adaptación desde el mismo útero y recibiendo al nacer vía madre receptora, las inmunoglobulinas necesarias para iniciar su vida. Además, sin relegar a un segundo plano se debe tener en cuenta, la importancia que posee el emplear esta técnica en la reproducción intensiva de las hembras más productivas del


rebaño nacional, ya que estos animales han demostrado su productividad bajo las condiciones locales, lo que evidencia su adaptabilidad al medio ambiente donde se han desarrollado.

En sentido general la técnica se basa seleccionar vacas altamente valiosas desde el punto de vista genético productivo, como donadoras de embriones para la inducción hormonal de ovulaciones múltiples. para obtener un número considerable de embriones, en vez de uno solo, como ocurre normalmente durante el ciclo sexual. Una vez realizada la estimulación, se procede a la fecundación de los óvulos liberados, por medio de la monta natural o la Inseminación artificial. Luego de 7 días se realizará un lavado del útero, para colectar los embriones, los cuales deberán de ser aislados del medio de lavado y clasificados morfológicamente. Los embriones aptos pueden ser transferidos a otras vacas previamente sincronizadas o conservados por congelación para su posterior transferencia. Generalmente los resultados son entre 4 y 6 embriones por donante superovulada y resultados de preñez de 50 y 70% para embriones congelados o transferidos en fresco, respectivamente. (Bo et al 2010).

Existen numerosos esquemas de superovulación entre los cuales podemos citar:

Inicio en fase media luteal: Sobre la base del diagnóstico transrectal de un CL, ya sea con una sola dosis de PMSG o dosis múltiples de FSH (4 días a intervalos de 12h), con la aplicación de PGF2α, 48h después de la aplicación de PMSG o en la 6ta y 7ma aplicación en el tratamiento con FSH. (Mapletoft et al. 2011).

Manipulación de la onda folicular (sin la necesidad de detección del celo):

- Con estradiol y progesterona: Se administra de 5 a 2.5mg de 17β estradiol o 2.5mg de Benzoato de estradiol y 100 o 50 mg de P4 (IM)+ CIDR o Crestar. El día 4 en coincidencia con la emergencia de una nieva onda se inicia el tratamiento con FSH de la forma convencional. El dispositivo liberador de progestágeno se retira en la 6

ta

aplicación de FSH y se administra 25mg de PGF2α (IM), la cual es repetida en la 7

maFSH. (Bo et al 2006).

- Por punción folicular: Ablación de todos los folículos > o = 5mm + CIDR o Crestar. Se inicia el tratamiento superovulatorio (FSH) entre 1 a 2d después. El resto es idéntico al anterior. (Baracaldo et al. 2000).

- Aplicación de GnRH o LH: Se coloca un CIDR o Crestar y 2 días después GnRH o LH (IM). Luego de otros 2 días se inicia la superovulación (FSH) con el mismo patrón descrito anteriormente. (Wock et al 2008).

- Estimulación de la 1ra

onda folicular: Al día siguiente del celo se coloca un CIDR o Crestar + inicio de la superovulación (se aplica FSH durante 5 días a intervalos de 12h). El 5

to día en la 9

na y

10ma

aplicación de FSH se suministra PGF2α y en la última aplicación se retira el dispositivo liberador de progestágenos. 24h después se administra GnRH y al día siguiente se realiza la IA am y pm. (Bo et al 2010).

- Estimulación de los folículos subordinados: Se inicia el tratamiento con la inserción de un dispositivo liberador de progestágenos (día 0 del tratamiento). Pasados 2 días se hace una pre estimulación con 500UI de PMSG en dosis única o se aplica FSH (10mg, 2 veces al día) y al siguiente día (20mg, 2 veces al día). El día 4 del tratamiento Se inicia la Superovulación la cual se aplicara con doble dosis diaria por 4 días en forma decreciente (60, 40, 20 y 10mg de FSH en cada día). El día 6 del tratamiento se aplica PGF2α en conjunto con las dosis de FSH am y pm. En la penúltima última aplicación de FSH (am), se retira el dispositivo liberador de progestágenos y 24 h más tarde se aplica GnRH (am) inseminándose este mismo día (pm) y repitiéndose el próximo día (am).(Bo et al 2008).

Superovulaciones repetidas: Se puede ensayar este tratamiento una vez que se verifique la primera ovulación post superovulatoria reprogramando la onda folicular. Por ejemplo se inicia con un tratamiento de estimulación de los folículos subordinados como se describió anteriormente. El día de la colecta se aplica PGF2α. Alrededor del día 22 de haber


iniciado del tratamiento superovulatorio la donante debe presentar celo o sele repite una PGF2α. El día 30 se inserta nuevamente un CIDR o CRESTAR y el día 32 se inicia el nuevo tratamiento con una nueva prestimulación y se continúa con el protocolo ya explicado anteriormente. (Mapletoft et al 2009).

Utilización de PMSG al final del tratamiento superovulatorio: Se Comienza el día 0 con la administración de 5 a 2.5mg de 17β estradiol o 2.5mg de Benzoato de estradiol y 100 o 50 mg de P4 (IM)+ CIDR o Crestar. Al día 4

to se inicia la aplicación de

FSH dos veces al día (am y pm) por 3 días (días 4, 5 y 6 del tratamiento) en el día 6 se aplica PGF2α, en conjunto con las dosis de FSH am y pm. El día 7 se retira el dispositivo liberador de progestágenos (am) y se aplican 2 inyecciones de 200 UI de PMSG (am y pm, sustituyendo a la FSH). El 8

vo día se suministra GnRH o LH (am) y se

da la 1ra

IA (pm) repitiéndose la 2da al día siguiente (am, del 9no día).(Barros et al 2008).

Una o dos aplicaciones de FSH: Aplicación subcutánea de una dosis de FSH de 400mg NHI-FSHp el día 10 del ciclo (fase media luteal con diagnóstico transrectal de un CL) y se aplica PGF2α a las 48 h. En el caso de dos aplicaciones de FSH la 1

ra sería el día 10

mo

(75% de la dosis, vía SC) y la 2da

el día 12vo

(el 25% restante de la dosis, vía SC) + PGF2α. El celo aparece el día14 en la mañana y se da la 1

ra IA (pm) repitiéndose la

2da al día siguiente (am, del día 15). (Lovie et al 1994).

Formulaciones de FSH de liberación lenta: Se han ensayado múltiples retardadores de la absorción de la FSH con los que se mezcla la dosis superovulatoria, entre los que se pueden citar al polivinilpirrolidon, gel de hidróxido de aluminio o el hialuronato. Estos tratamientos tiene muy poca repetitividad en sus resultados por lo que son poco consistentes. Mapletoft et al 2011).

Dos inyecciones de FSH en concentraciones reducidas de hialuronato: Se inicia am con la inserción de un dispositivo liberador de progestágenos (CIDER o Crestar, día 0) + 2.5mg de Benzoato de estradiol y 50 mg de P4 (IM). El

4to día am, se administra 2/3 de la dosis de

FSH, diluida en 5 mg/ml de hialuronato (MAP-5).Al 6

to día, se suministra el 1/3

restante de la dosis de FSH, diluida en 5 mg/ml de hialuronato (MAP-5) y se retira el dispositivo (pm). En el (8

vo día am, se aplica

GnRH o LH y pm se brinda e 1er

servicio de IA. Al día siguiente (día 9

no am, se da el 2

do

servicio de IA). (Tribulo et al 2011).

No obstante a todo el desarrollo alcanzado en las

investigación es sobre superovulación, los

resultados de la misma son impredecibles y poco

repetibles. De forma tal que la misma es

afectada por múltiples factores dentro de los que

podemos citar: nutrición, edad, raza, categoría,

estado lactacional, manejo, tipo de hormona

empleada, entre otros. Estos factores son

difíciles de controlar por el técnico, frente al

interés genético que pueda presentar el

productor por reproducir un animal en particular.

PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO.

Para poder producir embriones in vitro, primero tenemos que conseguir la maduración de los ovocitos, la capacitación del semen que vamos a utilizar para fecundar y después el cultivo de los embriones obtenidos hasta estadios preimplantatorios.

Desde 1935 Pincus y Enzman descubrieran que ovocitos de coneja inmaduros eran capaces de completar su maduración in vitro sin la inhibidora influencia de los folículos que los contenían. En julio de 1978 nació en Gran Bretaña el primer bebé probeta (Steptoe y Edwards, 1978). Años más tarde fue (Brackett et al.1980) quienes consiguieron que naciera la primera ternera por fecundación in vitro (FIV). El conjunto de los estudios realizados en los últimos 30 años ha conseguido notables avances y han explicado numerosas incógnitas que hace unos años eran imposibles de descifrar. Si bien en realidad de hoy en día de la técnica de FIV es que es que los ovocitos madurados, fecundados y cultivados in vitro, cuando son transferidos a hembras receptoras no se producen más de un 30-40% de gestaciones; por lo tanto, a pesar de todos los avances realizados hay que conseguir unos mejores resultados, de gestación (Hansel 2003).


La metodología para conseguir la fecundación in vitro es la siguiente:

Obtención de los ovocitos post mortem (ovarios de animales sacrificados) o in vivo (aspiración folicular guiada por ecografía).

Maduración de los ovocitos in vitro

Separación de fracción espermática motil (swim up o gradientes de percol) y capacitación in vitro de los espermatozoides, bien procedentes de semen fresco o de semen congelado.

Inseminación in vitro de los ovocitos madurados en el laboratorio con el semen capacitado. El tiempo de inseminación varía dependiendo de la especie animal de que se trate.

Cultivo in vitro, con una duración variable y dependiendo de dónde se realice la transferencia de embriones: en el oviducto (hasta el estadio de mórula), y en cuerno uterino (mórula o blastocisto).

Transferencia de los embriones producidos in vitro, bien a hembras receptoras o bien se criopreservan (congelación o vitrificación) y son almacenados en los bancos de embriones para su posterior transferencia.

Dependiendo de la especie animal, los resultados son muy variables, si bien en ovejas y vacas la fecundación in vitro funciona bien, en la cerda, durante muchos años ha presentado un gran problema como ha sido la polispermia en la fecundación. En contraste con la FIV de ovocitos colectados post mortem, la FIV de ovocitos colectados in vivo por aspiración folicular permite realizar colectas hasta tres veces por semana (cuatro embriones por colecta 16 mensuales) y los costos de producción son bajos y estables (solo la inversión inicial es relativamente alta). Esta técnica consisten en realizar la punción ovárica de los folículos guiada por ultrasonido para facilitar la captación de gran cantidad de ovocitos primarios con capacidad para ser madurados y fecundados (con semen concentrado y capacitado); y mediante un ambiente controlado de humedad, temperatura y niveles de CO2 , ser cultivados hasta el nivel de blastocistos jóvenes o expandidos (7 días), estadios en que pueden ser transferidos en hembras receptoras previamente seleccionadas y sincronizadas. A su vez un mayor número de gestaciones (60%) se obtienen cuando se recogen ovocitos preovulatorios directamente del ovario por esta

técnica (se maduran, fecundan y desarrollan in vitro (Pieterse et al 1992), (Kane 2003). A pesar de los resultados de maduración, fecundación y cultivo in vitro de embriones, los de preñez dejan mucho que desear, porque no se superan unas cifras de nacimientos de animales superiores al 40% y aún más bajos cuando son sometidos a congelación (Hansel, 2003). CONGELACIÓN DE OVOCITOS Y EMBRIONES. En el caso de los bovinos, constituye una herramienta útil para la industria de la transferencia de embriones, ya que el número de embriones puede ser fácilmente correlacionado con el número de receptoras disponibles en un momento apropiado del ciclo estral (Rall 1992). También posibilita la transferencia de algunos embriones y la conservación del resto en bancos de germoplasma, hasta poder analizar los registros de producción de la descendencia. Por otra parte permite el intercambio comercial a largas distancias con un material libre de enfermedades contagiosas si estos son tratados adecuadamente (Cabodevila y Teruel, 2001).

En el campo de la investigación, cabe destacar las numerosas aportaciones que los equipos de Polge y Rowson en Inglaterra, Graham y más tarde (Leibo 1989), en Estados Unidos, realizaron desde los primeros años de la crioconservación, investigando la cinética de la deshidratación celular, la acción de los crioprotectores y la variación de permeabilidad de las membranas, a la congelación.

La congelación de ovocitos resultó ser, en sus inicios, técnicamente más problemática de lo esperado. El ovocito maduro se encuentra en una fase de la división celular en la que el aparato microtubular que dirige el correcto reparto de los cromosomas a las células hijas tras la fecundación está ya formado, y es muy sensible a los cambios de temperatura. Por esta razón, resultaron negativos los primeros intentos de congelación de ovocitos, ya que la célula no sobrevivía a la congelación o, en caso de hacerlo, se afectaba su aparato microtubular, dando lugar a la formación de blastómeros cromosómicamente anormales. (Guerra 2011). En cuanto a las perspectivas de futuro inmediato se refiere, cabe citar los esfuerzos por validar


métodos ultrarrápidos de crioconservación para desarrollar eficaces protocolos en la conservación de ovocitos (Kane 2003, Tucker et al 2004). En inicios fueron ensayados en la congelación de embriones crioprotectores tales como el glicerol y DMSO los cuales debían ser añadidos antes de la congelación y retirados post descongelación en varios pases lo que hacía el proceso algo tedioso, la principal problemática encontrada, fue que los mismos eran sumamente embriotóxicos. En la actualidad ya se han logrado estabilizar protocolos que emplean congeladores programables que ejecutan todo el procedimiento de congelación lenta y permiten obtener resultados alrededor del 50% de preñez después de la descongelación y transferencia directa sin remoción del crioprotector (un paso o transferencia directa). Estos emplean etilenglicol al 20% en PBS con un procedimiento de descenso de la temperatura igual al empleado con el glicerol:

Estabilización entre -6 a -70C / 3 min.

Seeding.

Estabilización post seeding entre -6 a -70C /

3 min.

Descenso de la t0C de -7

0C a -32

0C a una

velocidad de 0.3 0C / min.

Estabilización a -320C / 3 min.

Introducir y depositar en N2. liq. -196 0C.

En el caso de la vitrificación la descongelación se realiza de igual forma pero si es imprescindible retirar el crioprotector del embrión, lo cual ha determinado el poco uso práctico de la misma. Es necesario acotar que los resultados de gestación logrados con embriones producidos in vitro son menores que los obtenidos por superovulación (25 a 30%. vs 40 a 50%), por tales razones se ensayan actualmente nuevos protocolos que salven esta dificultad dado el vertiginoso auge que está alcanzando la producción de embriones por FIV.(de Armas 2011). DETERMINACIÓN Y SELECCIÓN DEL SEXO DE EMBRIONES Y ESPERMATOZOIDES Históricamente, los primeros intentos en diagnosticar el sexo de embriones se realizaron a través de anticuerpos que reconocen un antígeno específico del embrión masculino (Antígeno H-Y), descrito por Anderson en 1987. así como análisis citológicos que detectaban el cuerpo cromático (Van Vliet et al 1989). Sin

embargo, estas metodologías ofrecían resultados poco precisos, alta mortalidad embrionaria y eran muy laboriosas. Con las modernas técnicas de biología molecular y la identificación de secuencias de ADN específicas del cromosoma Y en varias especies de animales, se han logrado grandes avances para el diagnóstico del sexo en embriones. Para esto, se han ensayado varias técnicas moleculares entre las que tenemos la hibridación in situ (Kobayachy et al 1998), el Southern blotting y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), (Peura et al 1991), logrando así, mantener la viabilidad y un alto grado de precisión para el diagnóstico del sexo de embriones preimplantatorios. El diagnóstico molecular del sexo, se fundamenta en identificar secuencias de ADN específicas del cromosoma Y. Uno de los requisitos para el diagnóstico del sexo en embriones, es obtener una pequeña biopsia del embrión, sin que se afecte su desarrollo posterior. No obstante, el nivel de éxito depende de distintas variables dentro de la técnica, pero su principal limitante es su aplicación práctica, ya que solamente estaremos frente a un proceso ya consumado y que no podemos gobernar. De forma tal que al poder separar los espermatozoides X e Y sin destruir muchas células espermáticas y reducir la fertilidad, sería el sueño de las empresas de inseminación artificial, porque existe un enorme interés económico en seleccionar el sexo de la descendencia para aumentar la eficacia productiva. Varios son los métodos de separación de espermatozoides estudiados en los últimos años y podríamos resumirlos en dos: aquellos que intentan separar espermatozoides sobre la base de sus características físicas o cinéticas, y aquellos que actúan sobre las diferencias nucleares de los espermatozoides que transportan el cromosoma X o el Y. Para separar espermatozoides es necesario conocer que el núcleo del espermatozoide que transporta el cromosoma X es más grande y contiene una mayor cantidad de ADN que el espermatozoide que transporta el cromosoma Y. La citometría, desarrollada por el Dr. Lawrence Johnson en el año de 1992, que dicho sea de paso, consigna un 90 % de seguridad en el sexado del semen, toma base en esas diferencias del ADN expuestas, para hacer dicho


sexado. Para el proceso en cuestión, el semen tiene que ser teñido con un colorante fluorescente, el cual se unirá a cada espermatozoide individual según su contenido de ADN. Se hacen pasar luego los espermatozoides a la manera de una corriente o flujo muy delgado a través de la máquina separadora, la misma utiliza un rayo láser, que lo que esencialmente hace es iluminar el colorante. Ahora bien, como el espermatozoide "X" contiene 3.8 % más de ADN, éste atrapa más colorante y hace que resplandezca más brillantemente. Posteriormente una computadora clasifica los espermatozoides en tres grupos: 1) los que llevan cromosoma "X", 2) los que portan "Y", y 3) una población mixta de portadores de "x" e "y" que no pudieron ser clasificados con absoluta claridad. Aquél flujo fino de espermatozoides se fracciona entonces en gotitas pequeñísimas conteniendo un espermatozoide cada una de ellas, pasando las mismas por un dispositivo que les asigna una carga eléctrica positiva o negativa, según la clasificación previa efectuada por la computadora. Se les hace pasar luego por un campo magnético donde aquéllas con carga positiva son atraídas hacia el lado negativo, y las que poseen carga negativa lo son hacia el lado positivo. Una vez que los espermatozoides han sido apartados en tal forma, el semen fresco deberá usarse dentro de las siguientes 24 horas. Es posible también su congelación para ser utilizado con posterioridad. (Garner 2006) Aún los resultados alcanzados en la IA, con semen sexado son más bajos que los que se logran semen convencional (se disminuye la tasa de preñez a la IA, entre un 15 y 20%) y no se recomienda su uso para inseminación de donadoras para la transferencia de embriones, pero ha sido empleado con éxito en la FIV. (Garner y Seidel 2008) MICROMANIPULACIÓN DE EMBRIONES PARA PRODUCIR GEMELOS IDÉNTICOS Y QUIMERAS Los primeros trabajos en esta temática, fueron realizados en la década del 60, pero no fue hasta 1979 que Willadsen obtuvo los primeros animales idénticos, nacidos después de una

manipulación microquirúrgica. Posteriormente un gran número de investigadores han trabajado en el desarrollo y extensión de la división de embriones para la producción de animales idénticos (Ozil et al. 1983, Voelkel et al. 1984, Warfiel et al. 1986, de Armas y Gonzales, 1988, Picard y Betteridge, 1989). Esta técnica permite duplicar el número de embriones disponibles y posibilita la inducción de partos dobles de igual sexo, eliminando el riesgo del freemartinismo y brindarle al productor una posibilidad de incremento en la tasa de natalidad. Estos animales genéticamente idénticos, tienen a su vez gran importancia para el desarrollo de investigaciones sobre comportamiento fisiológico, ya que los mismos son un material difícil de obtener en la naturaleza. Existen diferentes formas en las cuales los embriones pueden ser divididos satisfactoriamente y hay gran variación en las técnicas, producto fundamentalmente de hábitos y experiencias individuales. Estas técnicas pueden ser divididas en tres grupos, en relación con el estadio de desarrollo con que se trabaje: Separación de blastómeros, división de mórulas antes de la compactación y división de mórulas compactas o blastocitos. Las principales diferencias entre cada procedimiento se basan fundamentalmente en: Instrumentos empleados y medios de cultivo (tanto para realizar la manipulación, como para la conservación o cultivo). (de Armas 1990). La producción de quimeras es otro ejemplo práctico del uso de la micromanipulación en la obtención de invidividuos por combinación o agregación de células de 2 ó más embriones, es decir de 2 ó más pares parentales. Esta técnica resulta ser el procedimiento inverso al realizado en la producción de individuos idénticos u homocigóticos. Gearhart y Oster-Granite (1981) obtuvieron los primeros individuos quiméricos, para lo cual utilizaron estadios tempranos de desarrollo 2 ó 4 células intercambiando blastómeros de 2 ó más embriones entre sí e introduciéndolos nuevamente en zonas pelúcidas, de acuerdo a la técnica de cultivo in-vivo y transferencia descrita por Willadsen, (1981) para la producción de gemelos idénticos. De acuerdo con Seidel (1983) el éxito de esta técnica es probablemente


influenciado por tener 4 veces más células por embrión que en el caso de los hemiembriones. Brem et al. (1984) demostraron la posibilidad de obtener quimeras derivadas de embriones de 4 diferentes razas y en estados de desarrollo más avanzados (5-6 días), uniendo los hemiembriones y transfiriéndolos por vía no quirúrgica directamente sin necesidad de cultivarlos. Polzin et al. (1987) ensayaron con éxito la producción de quimeras inter especies ovino-caprino para lo cual utlizaron blastocitos obtenidos entre el día 5 y 6, inyectando dentro de un blastocito, botones embrionarios separados de su trofoblasto, obteniendo un 59.1% de nacimientos quiméricos después de la transferencia. Las quimeras como hemos planteado tienen tejidos de cada embrión que la originó, por lo cual poseen cuatro ó más padres. A su vez si uno de los embriones originales era hembra y el otro macho, el sexo de la quimera resultará indudablemente macho. Desgraciadamente los tejidos que se desarrollan de cada embrión, no pueden ser hasta ahora controlados, de aquí que la contribución de cada embrión original es usualmente desigual y no es raro obtener un 5% proveniente de un animal y un 95% del otro. Las investigaciones que se realizan en la actualidad se encaminan a poder dirigir y controlar de la forma deseada la mezcla de genotipos de acuerdo a los intereses perseguidos. Por ejemplo, para lograr animales con el sistema mamario de un vaca lechera, la musculatura y corpulencia de un animal de carne y poder de adaptación de la raza Cebú. No obstante esta técnica ha logrado una mayor aplicabilidad en la producción de animales quiméricos transgénicos. (de Armas 2008). CLONACIÓN.

Clonar significa crear un ser vivo idéntico a otro, a partir de una célula del individuo original. Hasta hace poco tiempo, los únicos clones que se podían obtener en el laboratorio eran los de células embrionarias. Todas las células o blastómeros que componen un embrión son totipotentes, capaces de regenerar todo el embrión y todas contienen la misma información genética. Cuando llegan al estadio de blastocisto, es cuando comienza la diferenciación celular, ya que las células del trofoblasto darán lugar a la formación de la placenta y las otras, las llamadas del nódulo embrionario o de la masa

celular interna, son las que originaran el ectodermo, mesodermo, y el endodermo. Éstas son células diferenciadas y darán lugar a la formación del órgano o tejido para el cual están programadas. Para poder formar clones los requisitos mínimos son: núcleo de una célula donante y ovocitos previamente enucleados. La clonación de células somáticas por transferencia nuclear (TN), ha permitido la propagación de animales élites y la generación de animales transgénicos para fines agrícolas y biomédicos. La TN implica la enucleación de un ovocito receptor, seguido de la fusión con una célula donante del núcleo. Luego su activación para continuar su desarrollo hasta estadios transferibles. Esto ha sido logardo pos multiples autores (ovejas: Wilmut et al 1997, cabras y vacas: Cibelli et al 1998, Wells et al. 1999 entre otras especies). Factores como métodos de enucleación, fusión, activación, tipo de célula donante, sincronía del ciclo celular donante/ receptora influyen en los resultados de la TN, los cuales a un resultan en una baja supervivencia de los embriones y los fetos clonados (Heyman et al 2002). Las principales técnicas de clonación son:

Por separación de blastómeros en los embriones (Willadsen 1979).

Por transferencia nuclear, que fue el método utilizado para clonar a la oveja Dolly. (Campbell et al 1996, Willmut et al 1997)

Agregación de embriones clonados para incrementar los resultados de preñez (Salomone et al 2011).

La clonación por TN es hoy una realidad pero aún hay mucho por investigar en cuanto a incrementar la eficiencia de las técnicas, resultados de preñez y sobrevida de los fetos producido, así como trastornos en su desarrollo hasta adultos.

TRANSGÉNESIS

La transgénesis que significa la introducción de ADN exógeno en el genotipo de un animal es una herramienta importante tanto para la agricultura, como para la farmacología, la biomedicina y la biotecnología. Una gran variedad de métodos han sido desarrollados para introducir ADN, entre ellos la inyección de ADN en embriones y la transfección de células


somáticas seguidas del transplante nuclear o clonación. Las técnicas de trangénesis permitirán la creación de fenotipos totalmente novedosos, que confieren a las especies de interés zootécnico características beneficiosas para la producción, tales como la resistencia a enfermedades, una mayor eficiencia en la obtención de energía, o la producción de proteínas de interés industrial o biomédico entre otras. MÉTODOS DE INDUCIR TRANSGÉNESIS EN EMBRIONES

Microinyección de ADN exógeno en los pronúcleos (Gordon et al 1980). Ha demostrado ser útil en especies de importancia zootécnica, pero presenta dificultades en el bovino por la baja visualización de los pronúcleos (Eyestone 1999).

Transgénesis por clonación (TN). Esta tecnología ha ido reemplazando a la anterior y se han aprovechado las células somáticas de los animales transgénicos para ser estos clonados por TN. (Salamone et al 2006).

Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Se microinyecta un espermatozoide transfectado o una c con ADN foráneo, pero es indispensable la posterior activación para el inicio de las divisiones ya sea por estímulos físicos o químicos. (Pereyra Bonet et al 2011).

Inyección intracitoplasmática de células o espermatozoides transfectados con ADN foráneo seguido de inseminación. Esta técnica posee un alto índice de mosaisismo o puede que el transgen quede extra cromosómico al no integrarse en el ADN del embrión. (Smith y Spadafora 2005).

Transferencia de genes por microinyección citoplasmática de células o fragmentos: La inyección intracitoplasmáticamente en ovocitos en metafase II, de células somáticas o fragmentos de ellas previa coincubación con ADN externo y luego al someter los ovocitos a FIV se pueden lograr embriones que expresen el transgen. La eficiencia es aceptable pero hay gran cantidad de mosaisismo. (Vichera et al 2010).

En la actualidad se están desarrollando trabajos que han logrado clonar incluso células gaméticas (ovocitos y embriones), lo cual sin dudas permitirá elevar la eficiencia de la transgénesis disminuyendo el frecuente mosaisismo encontrado, de forma tal que ambos gametos puedan portar el transgen deseado. Las aplicaciones de estas tecnologías están solo limitadas por nuestras capacidades de imaginación e innovación. Por tales razones podemos decir que están abiertos nuevos caminos hacia el futuro.

CONCLUSIONES El empleo de todas estas biotecnologías reproductivas, va estar condicionado a la posibilidad de constar con la infraestructura necesaria y el personal capacitado para ejecutarlas. Resulta indispensable que nos preocupemos realmente por buscar los fondos requeridos para poder implementar aquellas, que nuestro sector pecuario necesita en la brevedad posible para poder enfrentar los retos del presente siglo y finalmente salir airosos con una ganadería altamente productiva. Sin dudas de que a pesar de disponerse en la actualidad de un gran parque de biotecnologías reproductivas listas para su empleo en la producción pecuaria, nos queda mucho por investigar para elevar sus resultados, hacerlas sostenibles y evitar los problemas éticos que su aplicación pueden provocar.

BIBLIOGRAFÍA

Anderson, G. B. 1987. Identification of embryonic sex by detection of H-Y antigen. Theriogenology. 27:81-98.

Aparicio, N. y de Armas, R. Examen andrológico y congelamiento de semen. Folleto FCA-UP. 2004.

Atkins, J.A., Busch, D.C., Bader, J.F., Keisler, D.H., Patterson, D.J., Lucy, M.C., and Smith, M.F. 2008. Gonadotrophin-releasing hormone induced ovulation and luteinizing hormone release in beef heifers: effect of day of the cycle. J. Anim. Sci.

Barros, C.M., Barcelos, A.C.Z., Gouvea, L.M., Meneghel, M., Barcelos, D.S., Barcelos, L.N., and Trinca, L.A. 2008. Improvement of a superovulatory protocol in Nelore cows: replacing the last two doses of pFSH by eCG. Reprod. Fertil. Dev. 20: 152.

Baruselli, P.S., Reis, E.L., Marques, M.O., Nasser, F.L. and Bo, G.A. 2004. The use of treatments to improve the reproductive performance of anestrus beef cattle in tropical climates. Anim.Reprod. Sci. 82-83: 479-486.


Bo, G.A., Basuirelli, P.S., Chesta, P. and Martins, C.M. 2006. The timing of ovulation and insemination schedules in superestimulated cattle. Theriogenology. 65:89-101.

Bo, G.A., Carballo Guerrero, D. and Adams, G.P. 2008. Alternative approaches to setting up donor cows for super stimulation. Theriogenology. 69: 81-87.

Bo, G.A., Carballo Guerrero, D., Tribulo, A., Tribulo, H., Tribulo R., Rogan, D. and Mapletof, R. J. 2010. New approaches to superovulation in the cow.. Rep. Fertil. Dev. 22: 106-112.

Brackett, B.G., Oh, Y.K., Evans, J.F. and Donawick, W.J.1980. Fertilization and early development of cow ova. Biol Reprod. 23(1):189-205.

Brem, G., Tenhumbeg, J. and Krausslich,H. 1984. Chimerism in cattle through microsurgical agregation of morulae. Theriogenology. 22: 609-613.

Cabodevila, J.; Teruel, M. 2001. Criopreservación de embriones bovinos. En:Biotecnología de la reproducción (G.A.Palma, eds.).Ed: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Balcarse, Argentina, Capítulo X, pp. 49-174.

Campbell, K.H., McWhir, J., Ritchie, W.A. and Wilmut, I. 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64–66.

Cassou, R. 1964. La méthode des paillètes en plastique adaptée a`la généralisation de la congélation. In: Proc. 5th Int. Congr. Anim. Reprod. Trento, Italy. 4:540–546.

Cibelli, J.B., Stice,S.L., Golueke, P.J., Kane, J.J., Jerry, J., Blackwell, C., Ponce de León, F.A. and Rolb, J.M. 1998. Cloned transgenic calves produced from non quiescent fetal fibroblasts. Science. 280: 1256-1258.

Crupe, L.H. y Day, M.L. 2011. Maximización de las tasas de inseminación artificial a tiempo fijo con el programa Co-synch+CIDR de 5 días. IX Simposio Internacional de Reproducción Animal - IRAC 2011, Córdoba, Argentina.192-222.

De Armas, R.1990. Producción de gemelos idénticos por micromanipulación de embriones. Tesis para la opción del grado de phd. Escuela Superior de Medicina Veterinaria de Brno. Rep. Checa. P.1-184.

De Armas, R. 2008. Empleo de las biotecnologías de la Reproducción como herramientas de mejoramiento genético. X Congreso Científico Agropecuario. Facultad de Ciencias Agropecuarias UP. Chiriquí.

De Armas, R. Transferencia de embriones y su aceptación en la ganadería Panameña. Resumenes Congreso del Instituto PROMEGA. Ciudad Panamá, Panamá. 2011.

De Armas, R. Y Abrego, S. 2010. Evaluación de técnicas de inducción y sincronización de los celos en vacas y novillas de cría. Investigación Agropecuaria. Ed: FCA-UP. 1: 176-184.

De Armas, R., Aparicio, N. Y Nader, C. 2004. ¿Examen Andrológico? O Evaluación de la Salud Reproductiva de Toros Sementales. Ecos del Agro. No.94.

De Armas, R. Y González, F. Algunos aspectos sobre la micromanipulación de embriones en el bovino. En: Transferencia de embriones. Ed. CIDA., La Habana, 1988. P. 171-196.

De Armas, R. y Solano, R. Manual práctico de transferencia de embriones y fertilización in vitro. Ed: CIMA, La Habana. 1996.

Dobbins, C.A., Eborn, D.R., Tenhouse, D.E., Johnson, S.K., Marston, T.T. and Stevenson, J.S. 2009. Insemination timing affects pregnancy rates in beef cows treated with Co-Synch protocol including an intravaginal progesterone insert. Theriogenology. 72: 1009-1016.

Eyestone, W.H. 1999. Production and breeding of transgenic cattle using in vitriol production technology. Theriogenology. 51:509-517.

Foote, R. H. 2002.The history of artificial insemination: Selected notes and notables. J. Anim. Sci.. Biography and History Series. 1-9.

Garner,D.L. 2006. Flow cytometric sexing for mammalian sperm. Theriogenology. 65: 943-957.

Garner, D.L. and Seidel, Jr.G.E. 2008. History of commercializing sexed semen for cattle. Theriogenology.69: 886-895.

Geahart, J. and Oster-Granite. M.L. 1981. Reproduction in a population of chimeric mice: relationship of chromosomal sex to functional germ cell and proportions of chimeric components in several tissues. Biol. Reprod. 24: 713-722.

Gordon, J.W.; Scangos, G.A.; Plotkin, D.J.; Barbosa, J.A.; Ruddle, F.H. 1980. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Nat. Acad. Sci., 77:7380-7384.

Guerra, R. 2011. Evaluación de tres protocolos de criopreservación de embriones bovinos obtenidos in vivo e in vitro. Tesis para optar por el Grado de MSc. en Ciencias Pecuarias. UP-SENACYT. Panamá.

Hafez, E. S.E. Reproducción e Inseminación Artificial. 7ma Edición. Ed. Mcgraw-Hill, Mexico D.F. 2002. 293p

Hansel, W. 2003. The potential for improving the growth and development of cultured farm animal oocytes. Anim. Reprod. Sci. 79: 191-201.

Heyman, Y.P., Chavatte-Palmer, D., LeBourhis, S., Camous, X. Vignon. And Renard, J.P. 2002. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos. Biol. Reprod. 66: 6-13.

Kane, M.T. 2003. A review of in vitro gamete maturation and embryo culture and potential impact on future animal biotechnology. Anim Reprod Sci 79: 171-190.

Kobayashi J, Sekimoto A, Uchida H, Wada T, Sasaki K, Sasada H, Umezu M, Sato. 1998. Rapid detection of male-specific DNA sequence in bovine embryos using fluorescence in situ hibridation. Mol. Reprod .Dev. 51:390-394.

Leibo, S.P. 1989. Equilibrium and nonequilibrium cryopreservation of embryos. Theriogenology, 31:85-93.

Lovie, M., García, A., Hackett, A. and Mapletoft, R.J. 1994. The effect of dose schedule and route of administration on superovulatoy response to Folltropin in Holstein cows.Theriogenology.41: 241.

Mapletoft, R.J., Bo, G.A. and Buserelli, P.S. 2009. Control of ovarian function for assisted reproductive technologies in cattle. Anim. Reprod. 6: 114-124.

Mapletoft, R.J., Tribulo, A. y Bo., G.A. 2011. Evolución de los protocolos de superovulación en Bovinos. IX Simposio Internacional de Reproducción Animal - IRAC 2011, Córdoba, Argentina. 285-304.

Nebel, R.L. and Jobst, S.M. 1998.Evaluation of Systematic Breeding Programs for Lactating Dairy Cows: A Review. J. Dairy Sci. 81: 1169-1174.

Niemann, H. Cryopreservation of ova and embryos from livestock: Current status and research needs. Theriogenology. 35: 109-124.(1991).

Ozil, J.P.1983. Production of identical twins by bisection of blastocyst in the cow. J. Reprod. Fertil. 69: 463-468.

Palma, G.A. Biotecnología de la Reproducción. 2da Edición. Ed Reprobiotec, Cordoba, Argentina. 2008.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brackett%20BG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oh%20YK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Evans%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Donawick%20WJ%22%5BAuthor%5D


Palma, G.A. y Brem,G. Transferencia de Embriones y biotecnologías de la reproducción en la especie bovina.. Ed: Emisferio Sur, Buenos Aires, Argentina. 1993.

Pereyra-Bonnet, F., Bevacqua, R., La Rosa, I., Sipowicz, P., Radrizzani, M., Fernandez-Martin, R. and Salamone, D. 2011. Novel methods to induce exogenous gene expression in SCNT, parthenogenic and IVF preimplantation bovine embryos. Transgenic Research . 20(6): 1379-1388.

Peura, T., Hyttinen, J.M., Turunen, M. and Janne, J. 1991. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polimerase chain reaction. Theriogenology. 35:547-555.

Picard, L. and Betteridge, K.J. 1989. The micromanipulation of farm animal embryos. In: Animal Biotechnology. (eds). Babiuk, L.A. and Phillips, J.P., Pergamon Press, Oxford,. pp 141-178.

Pieterse, M.C., Vos, P., Kruip, T.,Wurth, Y.A., Van Beniden, T.H.,Williamse, A.H. and Taverne, M. 1992. Repeated transvaginal ultrasound-guided ovum pick-up in CG treated cows. Theriogenology 37, 273 abst.

Polzin, V.J., Anderson, D.L., Anderson, G.B., BonDurant, R.H., Butler, J.E., Pashem, R.L., Penedo, M.C.T. and Rowe, J.D.1987. Production of sheep-goat chimeras by inner cell mass transplantation. J. Anim. Sci. 65:325-330.

Rall, W.F. 1992. Cryopreservation of oocytes and embryos: methods and applications. Anim. Reprod. Sci., 28:237-245

Salamone, D., Barañao, L., Santos, C., Bussmann, L., Artuso, J., Werning, C., Prync, A., Carbonetto, C., Dabsys, S., Munar, C., Salaberry, R., Berra, G., Berra, I., Fernández, N., Papouchado, M., Foti, M., Judewic, N., Mujica, I., Muñoz, L., Fenández Alvarez, S., González, E., Zimmermann, J., Criscuolo, M. and Melo,

C. 2006. High level expression of

bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow. Journal of Biotechnology. 124, (2) : 469-472.

Salamone, D., Bevacqua, R., Pereyra Bonnet, F., Gambuni, A., Canel, N., Hiriart, I.M., Vichera, G., Moro, L., Jarazo, J. y Gibbons, A. 2011. IX Simposio Internacional de Reproducción Animal - IRAC 2011, Córdoba, Argentina. 262-279

Smith, K. and Spadafora, C. 2005. Sperm mediated gene transfer: applications and implications. Bioessays. 27(5): 551-562.

Steptoe P. C. and R. G. Edwards.(1978).Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, 312: 366

Tribulo, A., Dragan, R., Tribulo, H., Tribulo, R., Mapletoft, R.J. and Bo, G.A. 2011. Superovulation of beef cattle with a split intramuscular administration of Folltropin-V in two different concentrations of a slow release formulation. Submited to Theriogenology. (Personal communication).

Tucker M , P Morton, J Liebermann. (2004). Human oocyte cryopreservation: a valid alternative to embryo cryopreservation?, European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 113, Suppl 1, S24-S27.

Van Vliet, R.A., Verrinder Gibbins, A.M. and Alton, J.S. 1989. Livestock embryo sexing: a review of current methods, with emphasis on Y-specific DNA probes. Theriogenology. 32:421-438.

Vichera, G., Moro, L. and Salamone, D. 2010. Efficient method to produce IVF and partenogenic bovine embryos by intracitoplasmatic injection of DNA-liposome complexes. J. Reprod. Domest. Anim. 46(2):214-220.

Voelkel, S.A., Amborski, G.F., Hill, K.G. and Godke, R.A.1984. Use of a uterine cell monolayer system for micromanipulated bovine embryo culture. Theriogenology. 21: 271 abstr.

Wardfield, S.J., Seidel, G.E. Jr. and Elsden, R.P.1986. Transfer of bovine demi-embryos with and without zonae pellucidae. Theriogenology. 25: 212 abstr.

Wells, D.N., Misica, P.M. and Tervit, H.R. 1999. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulose cells. Biol. Reprod. 60: 996-1005.

Willadsen, S.M. 1979. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins. Nature. 277:298-300.

Willadsen, S.M., Lehn-Jensen, H., Fehilly, C.B. and Newcomb, R. 1981. The production of monozygotic twins of preselected parentage by micromanipulation of non-surgically collected cow embryos. Theriogenology. 15: 23-29.

Wilmut, I., Schineke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. and Campbell, K.H. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385: 810-823.

Wock, J.M., Lyle, L.M. and Hockett, M.E. 2008. Effect of gonadotropin releasing hormone compared with estradiol 17β at the beginning of a superestimulation protocol on superovulatory response and embryo quality. Reprod. Fertil. Dev. 20: 228.

http://www.springerlink.com/content/?Author=Federico+Pereyra-Bonnet

http://www.springerlink.com/content/?Author=Romina+Bevacqua

http://www.springerlink.com/content/?Author=Isabel+La+Rosa

http://www.springerlink.com/content/?Author=Pablo+Sipowicz

http://www.springerlink.com/content/?Author=Martin+Radrizzani

http://www.springerlink.com/content/?Author=Rafael+Fernandez-Martin

http://www.springerlink.com/content/?Author=Daniel+Salamone

http://www.springerlink.com/content/0962-8819/

http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681656

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_hubEid=1-s2.0-S0168165606X03218&_cid=271109&_pubType=JL&view=c&_auth=y&_acct=C000228598&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=5606c15305a301cc44218e4ae2e225a7


RESULTADOS PRELIMINARES DEL EMPLEO DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN LA RAZA SENEPOL EN PANAMÁ

Reinaldo De Armas, R.1

RESUMEN

El presente estudio se desarrolló para evaluar la posibilidad de emplear la TE en la multiplicación del pequeño rebaño Senepol importado por Panamá. Sobre esta premisa se estudió su comportamiento frente a la superovulación y la transferencia de embriones en comparación con otras razas de carne que se son trabajadas también con esta técnica de reproducción asistida. En el presente trabajo se realizaron un total de 22 superovulaciones. De estas 12 fueron en novillas y 10 en vacas de acuerdo al procedimiento descrito a continuación. Para la sincronización de las donantes previo a la superovulación se emplearon implantes Crestar retirados a los 9 días. Para la superovulación se aplicaron 8 inyecciones IM de FSH comenzando el día 9 del ciclo, en fase luteal, a intervalos de 12h durante 4 días. En coincidencia con la 6ta aplicación de FSH se suministraron 500µg de PGF2α y se repitió en la 7ma aplicación de FSH otra dosis de PGF2α (250µg). La IA se practicó a las 60 y 72h de la 1ra aplicación de PG, con una sola dosis de semen por servicio de IA. En las novillas se aplicó una dosis total de 200mg de FSH (Foltropin V) mientras que en las vacas la dosis fue de 260mg. La colecta de los embriones fue practicada el día 7 después de la presentación del celo superovulatorio, por el método no quirúrgico transcervical. La búsqueda y clasificación de los embriones se llevo a cabo bajo visión estereoscópica y criterio morfológico. Como receptoras se emplearon hembras de cruzas lecheras (Cebu X Holstein y Cebú X Pardo Suizo). La transferencia se realizo el día 7, en sincronía de 0 días donante - receptoras y la vía empleada fue la transferencia no quirúrgica de un embrión por receptora. Como se pudo observar, las razas indianas brindaron los resultados más bajos en huevos producidos (7 y 6.4, para Brahman y Nelore respectivamente), al igual que en el porcentaje de huevos transferibles (4 y 4.1 respectivamente), mientras que la raza Senepol aportó resultados satisfactorios (6 embriones transferibles). Aquí se puso de manifiesto que las razas bos taurus poseen mayores rendimientos a la superovulación que las bos indicus. Los porcentajes de preñez logrados por las diferentes razas no difirieron estadísticamente entre ellos, no obstante la raza Senepol logró los más altos resultados (65.4%). Se concluye que la raza Senepol brinda resultados satisfactorios tanto en la producción de embriones transferibles, como índices de preñez satisfactorios después de ser transferidos a hembras receptoras y que la técnica de transferencia de embriones, puede ser utilizada con éxito en esta raza como una valiosa herramienta en la multiplicación del hato nacional.

PALABRAS CLAVES: Senepol, donantes, superovulación, colecta de embriones, transferencia de embriones, receptoras.

1 PhD. Dr. M.V. Profesor de la Cátedra de Biotecnología y Reproducción Animal. Departamento de Zootecnia. Coordinador

del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. Apartado Postal 0426-00002, David, Chiriquí, Panamá.e-mail: [email protected]



ABSTRACT This study was conducted to evaluate the possibility of using embryo transfer (ET), in multiplication of small Senepol herd imported by Panama. Taking this into consideration, it was studied their behavior in superovulation and embryo transfer compared with other beef breeds that performed well with this technique of assisted reproduction. In this paper we conducted a total of 22 superovulations. Of these 12 were in heifers and 10 cows according to the procedure described below. For synchronization of the donor prior to superovulation Crestar implants, removed after 9 days, were used. Superovulation was applied with 8 injections of FSH IM starting on day 9 of oestral cycle (luteal phase), at intervals of 12 hours for 4 days. Coinciding with the 6th FSH application 500μg of PGF2α were supplied and repeated on the 7th application of FSH another dose of PGF22α (250μg). The AI was performed at 60 and 72h of the 1st application of PGF2 PGF2α, with a single dose of semen for AI service. In heifers was applied a total dose of 200 mg of FSH (Foltropin V) while in cows the dose was 260mg. The collection of embryos was practiced on day 7 after superovulatory estrus presentation, by the nonsurgical transcervical method. The search and classification of embryos was carried out using a stereoscopic magnification microscope and applying morphological criteria. Females used as recipients were dairy crossbreds (Cebu X Holstein and Zebu x Brown Swiss). The transfer was performed on day 7, in a synchronization donor – recipient of 0 days and the technique used was the non-surgical transfer of one embryo per recipient. As shown, Indian races provided the lowest results in eggs produced (7 and 6.4, for Brahman and Nelore, respectively), as well as with the percentage of eggs transferable (4 and 4.1, respectively), while Senepol provided satisfactory results (6 transferable embryos). Here we corroborate that bos taurus breeds produce higher yields of embryos in superovulation compared to bos indicus. Pregnancy rates achieved by the different breeds did not differ among them; however Senepol achieved the highest result (65.4%). It is concluded that Senepol provides satisfactory results in production of transferable embryos, as well as satisfactory pregnancy rates after transfer to recipient females and these results support that embryo transfer technique can be used successfully in this breed as a valuable tool in the multiplication of the national herd.

KEYWORDS: Senepol, donor. superovulation, embryo collection, embryo transfer, recipients.

INTRODUCCIÓN ¿Por qué Ganado Senepol? El ganado Senepol es una raza sintética formada en la Isla de ST. Croix a partir del cruzamiento de otras dos razas, N´Dama y Red Poll. La isla de St. Croix está ubicada en la parte central del Caribe, es la más grande de las Islas Vírgenes Americanas y dista 1900 kilómetros al Suroeste de Florida. Hacia fines del siglo XIX, fue importada a la

isla desde Senegal (Oeste de África) la raza N’Dama. El Senepol por ser una raza Bos Taurus, posee carne más tierna que las razas Bos Indicus. Bajo condiciones de explotación lechera, en las condiciones subtropicales de las Islas Vírgenes. Las vacas Senepol obtuvieron un promedio de 11.3 kilos de leche por día y lactancia promedio de 268 días. Este estudio evaluó la producción lechera y el crecimiento de los becerros Senepol. De tal forma el ganado Senepol se


ha caracterizado como de doble propósito (carne - leche), pero en años recientes ha sido seleccionado como una raza maternal de carne. PRINCIPALES BONDADES DE ESTA RAZA Resistencia al calor: El ganado Senepol es la única raza Bos taurus que tiene la suficiente resistencia al calor para la producción eficiente de carne de regiones tropicales y subtropicales. El pelaje corto de color rojo le permite pastorear al calor del medio día, mientras otras razas buscan la sombra de los árboles. Carácter sin cuerno: El carácter "sin cuernos" del ganado Senepol hace innecesario el descorné, facilitando el manejo y evitando complicaciones como gusaneras, etc. Docilidad: El temperamento dócil del ganado Senepol es otra de las ventajas de la raza pues facilita el manejo. Fertilidad: La composición genética de la raza Senepol en base a dos razas Bos taurus ha resultado en un animal reproductivamente superior. Las hembras presentan un cuello uterino más recto que hace la inseminación artificial más fácil en comparación con el cuello uterino "curvo" de las hembras Cebú. También, exhiben signos bien visibles de celo, favoreciendo su inseminación artificial o la monta natural. En transferencia de embriones, promedian 6.5 embriones transferibles en cada colección. Los machos Senepol son sementales vigorosos con excelente circunferencia escrotal, produciendo semen de alta fertilidad a partir de los 12 a 14 meses de edad. El prepucio es corto, lo que ayuda a prevenir la acrobustitis e incapacidad para la monta consiguiente tan común en toros de prepucio largo (Godfrey y Dodson, 2005). Habilidad materna y producción de leche: La excepcional habilidad materna y productora de leche del Red Poll es evidente en la hembra Senepol. En un rebaño de la isla Saint Croix, la producción de leche de estas vacas promedió 12 Kg. por día en 268 días de lactancia.

El peso de la vaca adulta es de 500 a 544 Kg., destetando terneros con más del 50% de su peso y manteniendo un eficiente intervalo entre partos. Ubres altas y bien sujetas, con pezones de tamaño adecuado y bien colocado, aseguran la necesaria longevidad y permanencia de las vacas Senepol en los rebaños, reproduciéndose muchas de ellas hasta los 15 - 18 años de edad. Facilidad de parto: En 400 observaciones, los pesos al nacer (el día del parto) de ganado puro Senepol promedian 31 kilos. El parto fácil de las crías previene problemas como la falta de oxígeno al cerebro del ternero recién nacido, resultando en excelente vigor y supervivencia. Vigor híbrido: Todos los intentos de cruzar Senepol con otras razas han sido totalmente exitosos en la producción de insuperables crías F1. En programas de cruzamiento multirracial (2, 3 y 4 razas) el ganado Senepol ha resultado con la calificación de “cruce universal”. Calidad y rendimiento en canal: Rinde bien en el engorde, con excelentes ganancias de peso, alto rendimiento en canal y en el desposte final. En el mercado de ganado en pié, esta raza alcanza los mejores precios, pues su superior calidad y rendimiento es fácil de distinguir. El genotipo del Senepol fue estudiado en la Unidad Experimental Brooksville (Sur de Florida). Los resultados sugieren que el Senepol, trasmite niveles similares de adaptación y eficiencia productiva a las progenies mestizas obtenidas del Brahman. Estos resultados señalan a la raza Senepol como una posible alternativa al Brahman en climas tropicales y ambientes subtropicales para productores que deseen cambios positivos en características reproductivas del ganado. Un programa de producción de la raza Senepol pura y sus cruzas derivadas permite aprovechar las características inherentes a las razas componentes, a saber: mayor productividad, precocidad y fertilidad, además de una mejora sustancial en la calidad sensorial de la carne (sabor, terneza y jugosidad. (datos brindados cordialmente por la Asociación SENEPOL de Panamá).


Hoy en día luego de años de experiencias y los resultados así lo evidencian, los ganaderos deben tener acceso al Cruzamiento como herramienta de mejoramiento genético en sus rebaños. De aquí sin dudas esta raza puede ser una alternativa interesante en nuestro país, tanto para la producción de carne como para leche en áreas de poca precipitación como lo es el Arco Seco de las Provincias de Herrera y los Santos.

¿PORQUÉ TRANSFERENCIA DE EMBRIONES?

Desde la década de los 60 se conoce, que los ovarios de las hembras bovinas están capacitados para producir cientos de miles de ovocitos durante su vida reproductiva; sin embargo, el número de crías que se obtienen es muchísimo menor. La transferencia de embriones permite obtener un mayor rendimiento, de la producción ovárica de esas hembras. En la década de los 80 y principios de los años 90 numerosos fueron los estudios que se realizaron para conseguir que hembras de alta calidad genética, ovularán ovocitos después de un tratamiento hormonal (hiperestimulación ovárica o superovulación), se las inseminara con semen de un macho también de alta calidad genética y se lograra su fertilización de forma consistente y repetida (De Armas 2007). En sentido general la técnica se basa seleccionar vacas altamente valiosas desde el punto de vista genético productivo, como donadoras de embriones para la inducción hormonal de ovulaciones múltiples. Para obtener un número considerable de embriones, en vez de uno solo, como ocurre normalmente durante el ciclo sexual. Una vez realizada la estimulación, se procede a la fecundación de los óvulos liberados, por medio de la monta natural o la Inseminación artificial. Luego de 7 días se realizará un lavado del útero, para colectar los embriones, los cuales deberán de ser aislados del medio de lavado y clasificados morfológicamente. Los embriones aptos pueden ser transferidos a otras vacas previamente sincronizadas o conservados por congelación para su posterior transferencia. Generalmente los resultados son entre 4 y 6 embriones por donante superovulada y resultados de preñez

de 50 y 70% para embriones congelados o transferidos en fresco, respectivamente (Betteridge, 2003, Van Arendock y Bilma 2003). Como ha sido planteado por diferentes autores (Mapletoft et al 2002, Galli et al.2003, Palma y Brem 1993), una de las posibilidades más interesantes que brinda la transferencia de embriones es la importación de embriones en forma congelada. Esta permite introducir razas exóticas o de zonas distantes, salvando los costos de transportación y cuarentena que limitan la importación de animales vivos. Así también, disminuye los riesgos de introducción de enfermedades no existentes en el área y salva los problemas relativos a la adaptación al nuevo ambiente, ya que los terneros producidos a partir de embriones congelados nacerán en vientres autóctonos del lugar donde van a desarrollarse, comenzando su adaptación desde el mismo útero y recibiendo al nacer vía madre receptora, las inmunoglobulinas necesarias para iniciar su vida. Además, sin relegar a un segundo plano se debe tener en cuenta, la importancia que posee el emplear esta técnica en la reproducción intensiva de las hembras más productivas del rebaño nacional, ya que estos animales han demostrado su productividad bajo las condiciones locales, lo que evidencia su adaptabilidad al medio ambiente donde se han desarrollado. En nuestro país hace ya algunos años se realizó la importación de un núcleo de animales de la raza Senepol, demostrando en las condiciones de explotación pecuarias de Panamá las aptitudes que anteriormente habíamos descrito. Esto ha despertado un interés manifiesto en los ganaderos en poder disponer de animales Senepol puros para programas de cruzamiento, lo cual se ha visto frenado por restricciones sanitarias en la importación de animales vivos. Por esta razón la técnica de transferencia de embriones se ha incorporado como una herramienta para multiplicar los animales puros del rebaño nacional ya sea mediante la producción local de embriones por superovulación o con la importación de embriones congelados. (asenepolpanama.com)


MATERIALES Y MÉTODOS

En el presente trabajo se realizaron un total de 22 superovulaciones. De estas 12 fueron en novillas y 10 en vacas de acuerdo al procedimiento descrito a continuación. Para la sincronización de las donantes previo a la superovulación se emplearon implantes Crestar iniciando con la aplicación de una combinación de estrógenos y progesterona (valerato de estradiol y norgestomet) que producen en la fase luteal inicial la regresión del CL y a su vez inducen la regresión del folículo dominante y el consiguiente inicio de una nueva onda de crecimiento folicular. El implante se colocó el la oreja de forma subcutánea y se aplicó la mezcla de estrógenos y progesterona intramuscularmente el día de inicio del tratamiento y el implante fue retirado a los 9

días, con la consiguiente presentación del estro a las 48 h como promedio. El esquema de la superovulación (Fig.1), consistió en aplicar 8 inyecciones IM de FSH comenzando temprano en la mañana (día 9 del ciclo, fase luteal determinada por el diagnóstico de un CL típico), con intervalos de 12h (6:00am – 6:00pm) durante 4 días. En coincidencia con la 6

ta aplicación de FSH

(72h de iniciado el tratamiento) se suministraron 500µg de PGF2α y se repitió en la 7

ma aplicación de FSH (84h) otra dosis de

PGF2α pero esta vez la mitad de la primera (250µg), para garantizar una luteolisis completa, de manera que el animal entraría en celo aproximadamente 24 horas después de la última aplicación de PG. La IA se practicó a las 60 y 72h de la 1

ra aplicación de

PG, con una sola dosis de semen en cada aplicación.

PG Celo e IA Col

Imp RImp. Celo

FSH____ __________________________________________ ____________________________ 0 9 11 22 23 24 25 26 27 33 Fig.1. Esquema de Superovulación con Imp + FSH + PG empleado en el presente estudio.

En el caso de las novillas se aplicó una

dosis total de 200mg de FSH (Foltropin V) mientras que en las vacas la dosis fue mayor (260mg de FSH), en ambos casos se suministró en cantidades decrecientes como aparece a continuación:

Día Novillas Vacas Mañana Tarde Mañana Tarde

1er 28mg 28mg 1.8mg 1.8mg 2do 26mg 26mg 1.6mg 1.6mg 3er 24mg 24mg 1.4mg 1.4mg 4to 22mg 22mg 1.2mg 1.2mg

La colecta de los embriones fue practicada el día 7 después de la presentación del celo superovulatorio por el método no quirúrgico transcervical empleándose un catéter de colecta tipo Folley conectado a un circuito cerrado con un filtro para aislar los embriones del medio de colecta (PBS). La colecta fue practicada con 500 ml de medio

por cuerno, los cuales fueron lavados de forma independientes. La búsqueda y clasificación de los embriones se realizó bajo visión estereoscópica y criterio morfológico, siendo transferidos los embriones de categoría A y B. Como receptoras se emplearon hembras de cruzas lecheras (Brahman X Holstein y Brahman X Pardo Suizo), las cuales fueron sincronizadas previamente con el mismo tratamiento que emplea los implantes de Crestar como se describió previamente. La transferencia se realizó el día 7 en sincronía de 0 días donante - receptoras y la vía empleada fue la transferencia no quirúrgica de un embrión por receptora colocado en el cuerno uterino ipsilateral al cuerpo luteo.


El diagnóstico de gestación fue practicado a los 60 días post transferencia por vía transrectal. Para que la comparación con los resultados obtenidos en otras razas fuera pertinente los procedimientos y hormonas empleados fueron básicamente los mismos. En el análisis estadístico de los resultados se utilizo el programa SAS, para la comparación de las medias y resultados porcentuales, con un nivel de significación del 95%.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como se puede apreciar en la tabla No.1 la respuesta superovulatoria no difirió entre vacas y novillas a pesar de que las novillas mantuvieron una ligera tendencia a producir tanto menos huevos totales (9.8 vs 10.2), como embriones transferibles (5.8 vs 6.2). Muchos autores (Palma y Brem 1993, De Armas 2007, Mapletoft et al. 2002), han planteado que las novillas brindan resultados

muy variables a la superovulación y generalmente su rendimiento en embriones transferibles son inferiores a los producidos al superovular vacas, lo que se pudiera deber a las altas dosis de hormonas (FSH) empleadas en la estimulación ovárica en la superovulación, las cuales afectan más a las novillas en las que su eje hipotálamo – hipófisis – ovario, aun no está completamente maduro (De Armas 2001). No obstante este estudio muestra la factibilidad de emplear hembras nuliparas de la raza Senepol en programas de MOET a nivel de fincas para incrementar el rebaño, sin la necesidad de esperar a que las hembras disponibles para donadoras tengan que poseer al menos un parto.

Tabla.1. RESULTADOS SUPEROVULATORIOS EN

NOVILLAS Y VACAS SENEPOL.

CATEGORIA CANTIDAD DE SUPER

OVULACIONES

HUEVOS COLECTADOS # MEDIA

TRANSFERIBLES # MEDIA %

NOVILLAS 12 118 9.8 70 5.8 59.3

VACAS 10 102 10.2 62 6.2 60.8 TOTALES 22 220 10 132 6 60

La tabla No. 2 muestra los resultados superovulatorios en forma comparativa en diferentes razas de carne, obtenidos por nuestro equipo de trabajo bajo condiciones similares en nuestro país. Como se puede observar las razas indianas brindaron los resultados más bajos en huevos producidos (7 y 6.4, para Brahman y Nelore respectivamente). En cuanto al porcentaje de huevos transferibles no se apreciaron diferencias estadísticas, pero también fueron las razas Brahman y Nelore las que aportaron las medias mas bajas de embriones transferibles (4 y 4.1 respectivamente), mientras que la raza

Senepol brindó resultados satisfactorios (6 embriones transferibles) en coincidencia con los resultados publicados para la misma por Hernandez 2007, y resultados publicados en Internet. En nuestro estudio se puso de manifiesto que las razas Bos taurus poseen mayores rendimientos a la superovulación que las Bos indicus y como se pudo apreciar, la raza Criolla y la Simbrah aportaron los más altos resultados, aspectos en los cuales coincidimos con autores como Bo et al (2002), De Armas (2004), Krininger et al. (2003), Mapletoft et al. (2002).

Tabla.2. RESULTADOS SUPEROVULATORIOS EN RAZAS DE CARNE.

RAZA SUPER OVULACIONES

HUEVOS COLECTADOS

# MEDIA

TRANSFERIBLES # MEDIA %

Brahman 20 140 7 a 80 4 d 57.1 c

Nelore 20 128 6.4 a 82 4.1 d 64.1 c

Criollo 16 160 10 b 107 6.7 e 66.9 c Simmental 16 144 9 b 85 5.3 e 61.5 c

Simbrah 22 242 11 b 150 6.8 e 62 c Senepol 22 220 10 b 132 6 e 60 c

Letras diferentes en una misma columna muestran diferencias estadísticas p < 0.05


En lo concerniente a los resultados de la transferencia de los embriones en fresco podemos observar como se expresa en la tabla No.3, los porcentajes alcanzados por las razas comparadas en el estudio no difirieron estadísticamente entre ellas y los resultados se corresponden con los alcanzados por otros grupos de transferencia de embriones que trabajan en condiciones

tropicales similares a las de Panamá (De Armas y Solano 1995, Fonseca. et al. 2001, Peixoto et al. 2002). No obstante la raza Senepol logró los más altos resultados de preñez, lo cual habla a favor de la capacidad de los embriones Senepol de sobrevivir al ser transferidos a hembras receptoras.

Tabla 3. RESULTADOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN FRESCO DE DIFERENTES RAZAS.

RAZA TRANFERENCIAS PREÑECES A 60 DÍAS

# %

Brahman 251 153 61

Nelore 122 78 63.9

Senepol 52 34 65.4

Simbrah 32 20 62.5

Holstein 35 20 57.1

C0NCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo podemos llegar a las siguientes conclusiones.

La raza Senepol brinda resultados satisfactorios tanto en la producción de huevos como de embriones transferibles e índices de preñez satisfactorios después de ser transferidos los embriones a hembras receptoras.

La técnica de transferencia de embriones puede ser utilizada con éxito en esta raza como una valiosa herramienta en la multiplicación del hato nacional.

BIBLIOGRAFÍA BETTERIDGE K.J. 2003. A history of farm animal

embryo transfer and some associated techniques. Anim Reprod Sci; 79:203-244.

BO, G.A, BARUSELLI, P.S. and MORENO, D, 2002.

The control of follicular wave development for self-appointed embryo transfer programs in cattle. Theriogenology; 57, 53-72.

DE ARMAS, R. 2001. Superovulatory response in bos

indicus breeds, borders or lack of knoledge. 8th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction (ICBAR). Bernburg, Germany, September 24-26, 2001. Abst. P:163.

DE ARMAS, R. 2004. Algunos resultados superovulatorios en ganado de cría en la Provincia de Chiriquí. VI Congreso Nacional de Medicina Veterinaria. David, Chiriquí, 2004.

DE ARMAS, R. 2007. Transferencia de embriones en el

bovino. Ed. FCA. UP. Panamá 2007. p.125. DE ARMAS, R. y SOLANO, R. Manual Práctico de

Transferencia de Embriones y Fertilización In Vitro. Ed. CIMA., La Habana, Cuba. 1995.

FONSECA. J.F., SILVA FILHO

J.M

, PINTO NETO,

A.

and PALHARES, M.S. 2001. Superovulated zebu cows embryonic developmental stages. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. .53 (6): 23-31.

GALLI, C., DUCHI, R., CROTTI, G., PONDERETO, N., COLLEONI, S., LAGUTINA, I. and LAZZARIL, G. 2003. Bovine embryo technology. Theriogenology. 59: 599-617.

GODFREY, R.W. and DODSON, R.E. 2005. Breeding

soundness evaluations of Senepol bulls in the US Virgin Islands. Theriogenology; 63: 831–840

KRININGER III , C.E., BLOCK, J. , Al-KATANANI, Y.M.,

RIVERAi, R.M., CHASE Jr. C.C. y HANSEN, P.J. 2003. Differences between Brahman and Holstein cows in response to estrus synchronization, superovulation and resistance of embryos to heat shock Animal Reproduction Science 2003; 78: 13–24.

MAPLETOFT, R.J, StTEWAR, K.B. DAMS and

ADAMS, G.P. 2002. Recent advances in the superovulation of cattle. Reprod Nutr Dev; 42:1- 11.

PALMA, G.A. y BREM, G. Transferencia de embriones y

biotecnologías de la reproducción en la especie bovina. Ed: Emisferio Sur, Buenos Aires, Argentina. 1993.


PEIXOTO , M.G.C.D., FONSECA, C.G. PENNA, V.M. and. ALVIM, M.T.T. 2002. Multivariate analysis of multiple ovulation followed by embryo transfer results from zebu donors Arq. Bras. Med. Vet. Zootec.54 (5): 64- 73.

VAN ARENDOCK, J.A.M. and BILMA, P. 2003. Factors affecting commercial application of embryo technologies in dairy cattle in Europe – a modeling approach. Theriogenology. 59: 635-650.

Internet: Foros de Ganadería de Carne - Genética -

Reproducción - Engormix.com Artículo: Factores que afectan la superovulación en

bovino ... Cruzamiento Brahman con Senepol Ruben Hernandez (Panamá), 26/09/2007, 10, 3069 ...

64.76.120.161/forumslist_GDC-103_ref2.htm Ganadería de Carne - Ganado de raza Senepol -

Genética - Estados ...

Nuestras experiencias con el ganado Senepol importado de St. Croix (Islas .... El objetivo principal de los tratamientos de superovulación en el ganado ...Disponible en línea www.engormix .com/s_forums_view.asp?valor=1957

Razones y fundamentos para el desarrollo de Razas

Compuestas ... Si es así creo que seria interesante la utilización de un

torete simpol (simmental-senepol) o uno de .... (Protocolo de Superovulación del Bubalis Bubalis) ...Disponible en línea. www.ovinos.info/.../Razones%20y%20fundamentos%20para%20el%20desarrollo%20de%20Razas%20Compuestas.html

Senepol. El ganado Senepol resultante fue apareado

en el mismo sistema de cría pura ... En transferencia de embriones, promedian 6.5 embriones transferibles en cada ... Disponible en línea.www.ppca.com.ve/vb/razasyganaderias/historiasenepol.html

http://64.76.120.161/forumslist_GDC-103_ref2.htm

http://64.76.120.161/forumslist_GDC-103_ref2.htm

http://www.engormix.com/s_forums_view.asp?valor=1957

http://www.engormix.com/s_forums_view.asp?valor=1957

http://www.ovinos.info/050%20Manejo/050%20Reproduccion/040%20Reproduccion%20Asistida%20Comparada/030%20Reproduccion%20Asistida%20en%20Vacunos/Razones%20y%20fundamentos%20para%20el%20desarrollo%20de%20Razas%20Compuestas.htm

http://www.ovinos.info/050%20Manejo/050%20Reproduccion/040%20Reproduccion%20Asistida%20Comparada/030%20Reproduccion%20Asistida%20en%20Vacunos/Razones%20y%20fundamentos%20para%20el%20desarrollo%20de%20Razas%20Compuestas.htm

http://www.ppca.com.ve/vb/razasyganaderias/historiasenepol.html


INFLUENCIA DE LA DILUCIÓN SEMINAL PRE CONGELACIÓN, SOBRE LA VIABILIDAD ESPERMÁTICA POST DESCONGELACIÓN.

Reinaldo de Armas1, Abdul Castillero2 y Neftalí Aparicio3.

RESUMEN

Con el objetivo de estudiar la influencia de la dilución seminal pre-congelación, sobre los parámetros de viabilidad después de la descongelación, se emplearon dos toros de la raza Simbrah (edades de 24 meses y pesos de 950 a 1000 lbs), a los que se les realizaron extracciones cada cuatro días (obtenidas por electroeyaculación). En las muestras de semen se evaluaron tanto antes, como después de la congelación: concentración, motilidad, vigor, patologías espermáticas y porcentaje de espermatozoides vivos y muertos. Los eyaculados empleados contaban con más de 550 x 106esp./ml, motilidad superior al 65%, porcentaje de patologías menor del 20% y más de 60% de espermatozoides (esp.) vivos. En la congelación del semen se utilizó el diluente comercial Triladyl, preparándose según las recomendaciones de la casa productora. La dilución se efectuó de acuerdo con los tratamientos a evaluar (T1:12, T2: 24, T3: 48 y T4: 96 x 106esp./ml). Seguidamente el semen se empacó en pajuelas de 0.5 ml y se equilibró entre 4 a 5 ºC, por 2h. Pasado este tiempo, las pajuelas fueron sometidas a congelación. Finalmente se almacenaron en un contenedor de nitrógeno líquido a -196oC, hasta su descongelación (en agua a 35ºC, por 30 segundos) y posterior evaluación. Los resultados del análisis de varianza mostraron diferencias estadísticas entre toros y entre tratamientos (p<0.001), para los porcentajes de espermatozoides vivos y muertos post descongelación. A pesar de esto, el comportamiento entre tratamiento mantuvo un patrón de decrecimiento similar en cada extracción y entre ellas. (T1: 50, 44.5 y 36.5%), (T2:44.5, 46 y 38.5%), (T3:43.5, 44.5 y 34%), (T4: 38, 39.5 y 30%). De forma tal, se evidenció, que en la medida que se incrementó el número de espermatozoides por pajuelas, se aumentó el porcentaje de espermatozoides muertos pos-descongelación. En el análisis de comparación de medias de espermatozoides vivos se encontró, que el T1 obtuvo la media más alta, la cual no difirió estadísticamente del T2, ni del T3. Sin embargo si difirieron significativamente del T4, el que obtuvo la media más baja. Estos resultados pudieran deberse a que en la medida que se eleva la cantidad de células, se hace necesario un incremento en la concentración de sustancias crioprotectoras en el medio de congelación (glicerol). Basándonos en estos resultados podemos concluir que al utilizar concentraciones mayores a 96x106 espermatozoides/ml se puede comprometer la calidad final del semen congelado, por lo que recomendamos utilizar concentraciones espermáticas que se encuentren entre 24 y 48x106 esp./ml para la congelación de semen con el diluente Triladyl, para asegurar un número de células vivas pos descongelación capaces de garantizar una fertilización exitosa.


del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. Apartado Postal 0426-00002, David, Chiriquí, Panamá. e-mail: [email protected]

2 Ing. Agrónomo Zootecnista, Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias

Agropecuarias, Universidad de Panamá. 3 MSc. Profesor Titular, Departamento de Zootecnia. Investigador del Centro de Investigaciones en Biotecnología

Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá.



PALABRAS CLAVE: dilución seminal, descongelación, crioprotectores, espermatozoide, fertilización.

ABSTRACT

In order to study the influence of pre-freeze semen dilution on the parameters of viability after thawing, we used two bulls of the Simbrah breed (24 months old and weights from 950 to 1000 pounds), semen extractions were performed every four days (obtained by electro ejaculation). In semen samples were evaluated before and after freezing for: concentration, motility, alive and dead cells, vigor, and percentage of sperm pathologies. The ejaculates registered more than 550 x 106 esp./ml, motility higher than 65%, percentage of pathologies less than 20%, over 60% of sperm alive, In semen freezing process was used a commercial diluent Triladyl, preparing as recommended by the producer. The dilution is performed according to the treatments to be evaluated (T1: 12, T2: 24, T3: 48 and T4: 96 x 106esp./ml). Then the semen was packed in 0.5 ml straws and equilibrated between 4 to 5 °C for 2 h and after this period of time, the straws were subjected to freezing. Finally stored in a liquid nitrogen container a temperature of -196oC until thawing (in water at 35 °C, 30 seconds) and subsequent evaluation. The results of the analysis of variance showed significant differences among bulls and between treatments (p <0.001) for the percentage of dead and alive spermatozoid after thawing. Despite this, the behavior among treatment maintained a similar pattern of decline in each extraction and among them. (T1: 50, 44.5 and 36.5%), (T2: 44.5, 46 and 38.5%), (T3: 43.5, 44.5 and 34%), (T4: 38, 39.5 and 30%). Furthermore, it was evident that as the number of spermatozoid per straw increase so it did the percentage of dead sperm after thawing. In the analysis of mean comparison for alive sperms it was found that the T1 obtained the highest average, which did not differ statistically from T2, or T3. However, they differ significantly from T4, which registered the lowest average. These results may be due to the extent that as the number of cells increases, it becomes necessary to increase the concentration of cryoprotectants in the freezing medium (glycerol). Based on these results we conclude that by using concentrations greater than 96x106 spermatozoid/ml can compromise the final quality of frozen semen, we recommend using sperm concentrations that are between 24 and 48x106 spermatozoid/ml for freezing semen diluent Triladyl, to ensure an alive cell number after thawing able to obtain a successful fertilization. KEY WORDS: semen dilution, thawing, cryoprotectant, sperm cells, fertilization.

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial, existe una creciente necesidad de adquirir alimentos de origen animal, esto obliga a los productores pecuarios, a utilizar técnicas más eficientes de producción. Con respecto a esto, diversas técnicas han sido implementadas en nuestro país. Desde hace ya varias décadas la inseminación artificial (IA) se ha posicionado como una importante herramienta, al lograr

elevar la genética ganadera de nuestro país. Sin embargo nos resulta conveniente mencionar que en la obtención de resultados favorables al momento de implementar un programa de IA se deben tomar en cuenta una serie de factores que garanticen este cometido entre los que podemos mencionar la utilización de un semen de alta calidad, como un factor determinante en el éxito de estos programas.


No obstante, se conoce que la calidad seminal del eyaculado, determina su empleo para la congelación y su posterior utilización en programas de IA, donde sementales con valores sub óptimos no pueden ser utilizados para la congelación. En tanto que la evaluación de semen pos descongelación es sin dudas un reflejo en gran mediad de la correcta ejecución de las técnicas de crioconservación (Parks y Graham, 1992, citados por Andrade, 2005). Tal es el caso, que al utilizar una incorrecta concentración seminal, se pueden obtener resultados desfavorables al momento de la descongelación, en cuanto al parámetro de espermatozoides vivos se refiere (Catena et al. 1999). Algunos autores han reportado la importancia que tienen los diluentes en la conservación de las características fecundantes del semen (Cole y Cupps 1989; y Palma 2008), ya sea si este es fresco o congelado. A su vez, afirman que la tasa de dilución del semen debe ser la más adecuada para asegurar la eficiencia del diluente, afirmando que el nivel óptimo de dilución debe estar entre 1/2 y 1/3 del total de la solución. Si bien es cierto que todos estos parámetros han sido estudiados en numerosas investigaciones (Aguirre et al. 1980, Hafez 2002 y Vera y Muños 2005), aun en el país no se cuentan con datos que se adapten a nuestras condiciones. Por tales motivos y fundamentándonos en la necesidad de obtener mayor información que nos permita incrementar la efectividad de la técnica de IA, es que realizó esta investigación sobre la influencia causada al emplear diferentes concentraciones espermáticas en las dosis seminales a congelar, sobre los resultados de espermatozoides vivos y muertos al momento de la descongelación.


El Presente estudio se desarrolló en los Laboratorios del Centro de Investigación en Biotecnología Agropecuaria de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, de la Universidad de Panamá, en la Sede de Chiriquí. La unidad experimental estuvo compuesta por 2 toros de la raza Simbrah, con edades

de 24 meses y pesos de 950 a 1000 libras. A los cuales se les realizó 3 extracciones con la ayuda de un electroeyaculador (12V, 150Am). El intervalo entre cada extracción fue de cuatro días, tratando de evitar periodos muy cortos entre extracción o periodos muy prolongados de descanso. A cada muestra obtenida se le realizó un análisis, espermático donde se evaluó: Concentración, motilidad, vigor, patologías espermáticas y porcentaje de espermatozoides vivos y muertos. Para la estimación de la concentración espermática de cada muestra se empleó el método del hemocitómetro (cámara de Neubaüer). La motilidad fue calculada por un método subjetivo bajo visión microscópica (campo claro y magnificación de 100X), valorando el porcentaje de células con movimiento rectilíneo del total de células estimadas. El vigor de los espermatozoides se calculó igualmente de manera subjetiva bajo visión microscópica (campo claro y magnificación de 100X), en una escala pre establecida de 5 puntos (donde 5 fue la de mayor vigor de movimiento). Las patologías espermáticas se determinaron por análisis morfológico después de haber sido teñidos con la técnica de Hancock (P/N HCS-101) y calculado el porcentaje de las mismas. Para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, se realizó un conteo de 200 células por muestra. Este conteo se efectuó bajo visión microscópica (campo claro y magnificación de 400X), con el apoyo de la tinción de Hancock (P/N HCS-101), que es específica para determinar morfología y espermatozoides vivos y muertos. Solo se emplearon en la investigación aquellos eyaculados con más de 550 x 10

6 esp/ml, motilidad superior al

65%, vigor de 3 o más, porcentaje de patologías menor del 20% y más de 60% de espermatozoides vivos. En este experimento se utilizaron dos toros de la raza Simbrah, con las siguientes características generales en sus eyaculados: Toro 1 (77/6) Características del semen

Concentración: 950 Millones Color: Blanco Marfil Volumen: 10 ml


Motilidad Rectilínea: 80% Vigor: 3 Vivos y Muertos: 70/30% Patología: 10%

Toro 2 (72/6) Características del semen

Concentración: 550 Millones Color: Blanco Claro Volumen: 10 ml. Motilidad Rectilínea: 65% Vigor:3 Vivos y Muertos:60/40% Patología:15%

Después de tomada y evaluadas las muestras de semen, se preparó el diluente, a base de Triladyl, con cantidades pre-establecidas de agua bidestilada, Triladyl, y yema de huevo (60, 20 y 20% respectivamente de acuerdo con la casa productora). El semen después de diluido de acuerdo a los tratamientos a evaluar, se empacaron en pajuelas de 0.5 ml, y se equilibraron a una temperatura entre 4 a 5

ºC, por 2 horas en una refrigeradora. Pasado este tiempo, las pajuelas fueron expuestas a los vapores de nitrógeno a una altura de 5 cm sobre la superficie del nitrógeno líquido, dentro de un contenedor de poliuretano, por 15 minutos. Posteriormente se sumergieron directamente en el nitrógeno liquido (-196ºC), para subsiguientemente ser almacena-das en un contenedor de nitrógeno líquido a -196ºC hasta su descongelación. Para realizar la descongelación se utilizó un termo con agua a 35ºC, donde las pajillas fueron sumergidas por 30 segundos. En la siguiente tabla (Tabla 1) se resumen los esquemas de tratamiento empleados en el estudio. Se utilizaron 2 toros, a cada toro se les realizó 3 extracciones y por cada extracción se aplicaron 4 tratamientos congelándose 5 pajillas por cada uno de los tratamientos.

Tabla 1. TOROS /EXTRACCIONES /TRATAMIENTOS /NÚMERO DE PAJILLAS

Nº de Toros

Nº de Ext.

Nº Trat x

Ext.

Nº Pajillas x

Trat.

1 4 5 pajillas. X4 Ttos. =20 Toro1 1 4 5 pajillas. X4 Ttos =20

1 4 5 pajillas. X4 Ttos. =20

1 4 5 pajillas. X 4 Ttos. =20 Toro 2 1 4 5 pajillas. X 4 Ttos. =20

1 4 5 pajillas. X 4 Ttos. =20 TOTAL 6 24 Total= 120 pajillas

Ext. = extracción Trat. = tratamiento

La tabla 2 muestra las diferentes concentraciones de los tratamientos y en qué momentos fueron analizados.

Tabla 2. CONCENTRACIONES SEMINALES/ TRATAMIENTO

Trat. Concentración Seminal(millones/ml)

Momentos de análisis

T1 12 millones/ml FR-AD-AE-ADE




Trat. = tratamiento FR: Fresco sin diluir AD: Al Diluir AE: Al Equilibrar AL: Al Descongelar


Para el análisis de los resultados se utilizó el siguiente modelo estadístico:

Modelo Estadístico (Factorial)

Yijk= µ + Ti + Ci + (TxC)ij + Eijk

Donde: Yijk = % de vivos ó muertos observados en la muestra Kth con la concentración seminal Jth en cada pajilla de cada toro

ith.

µ = Media poblacional por la media general.

Ti = Efecto del toro ith

. Cj = Efecto de la concentración seminal J

th.

(TxC)ij = Efecto de interacción Toro x concentración seminal. Eijk = Error Experimental. Los parámetros evaluados fueron número de espermatozoides vivos y muertos en cada etapa del proceso de congelación y número de espermatozoides vivos y muertos al

momento de la descongelación en cada tratamiento.


Como se puede apreciar en la Tabla 3, el análisis de varianza mostró, que se encontraron diferencias estadísticas significativas entre toros y entre tratamientos (p<0.001), para los porcentajes de espermatozoides vivos y muertos post descongelación. A pesar de esto, el comportamiento de cada tratamiento por separado mantuvo un patrón de decrecimiento para esta característica, similar en cada extracción y entre ellas. (T1:

50, 44.5 y 36.5), (T2:44.5, 46 y 38.5), (T3:43.5, 44.5 y 34), (T4: 38, 39.5 y 30). De forma tal, que fue evidente, que en la medida que se incrementó el número de espermatozoides por pajilla a partir de la concentración inicial, se aumentó el porcentaje de espermatozoides muertos pos-descongelación.

Tabla 3. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA LA CALIDAD SEMINAL EN BASE AL PORCENTAJE DE

ESPERMATOZOIDES VIVOS Y MUERTOS.

FV GL SC CM FC Pr > F

Toro 1 5840.74 5840.74 199.80 <0.001** Trata 3 1132.29 377.43 12.91 <0.001**

Toro* Trata

3 147.29 49 1.68 0.1756

Extracción 1 1711.25 1711.25 58.54 <0.001** Extracción* toro 1 4805.00 4805.00 164.36 <0.001**

Error 110 3215.75 29.23 Total 119 12061.80 C.V.= 13.25%

** = indica diferencia significativa al nivel de probabilidad del 1 %. Estos resultados a nuestro criterio, pudieran deberse a que en la medida que se eleva la cantidad de células, se hace necesario un incremento en la concentración de sustancias crioprotectoras en el medio de congelación (glicerol). Algunos autores (Parks y Graham, 1992, citados por Andrade, 2005), coinciden en que la deshidratación osmótica, más que la formación de hielo intra-celular, es la principal causa de las alteraciones ultraestructurales de la membrana, en donde

una de sus consecuencias es la pérdida de la selectividad. Basados en este principio en donde todas las células muertas pierden dicha capacidad, permitirán el acceso de las sustancias crioprotectoras en los espermatozoides muertos (glicerol, proteínas y buffers). De tal forma reducen su disponibilidad para las células vivas que en realidad lo requieren. Esto concuerda con lo expuesto por otros autores, cuando aducen que los efectos dañinos del choque térmico


pueden ser reducidos a través de un enfriamiento controlado entre los intervalos críticos de cambios de temperatura, por medio de la adición de lípidos (yema de huevo) o proteínas (leche) en el diluyente de semen. (Cole y Cups 1975 y Palma 2008). Según Cole y Cupps (1975), la concentración óptima que confiere una buena habilidad de sobrevivir de los espermatozoides es de 11% para leche descremada ó de 7 a 9.5% para yema de huevo. Tabla 4. MEDIAS DE LOS PORCENTAJES DE

ESPERMATOZOIDES VIVOS POR TRATAMIENTO POST- DESCONGELACIÓN.

Tratamiento Medias de Células Vivas (%)

(+) Conc. Esperm./Tto.

T1 43.67 a 12 x106/ml

T2 43.00 a 24 x106/ml

T3 40.67 a 48 x106/ml

T4 35.83 b 96 x106/ml

(+) = Las medias seguidas por letras diferentes difieren entre si, de acuerdo con la prueba de Tukey.

En el análisis de comparación de medias del porcentaje de espermatozoides vivos se observo, que el tratamiento T1 mostró la media más alta, la cual no difirió significativamente del T2 ni del T3. Sin embargo estos si difirieron significativamente de los resultados logrados en el T4, ya que este expresó una media de espermatozoides vivos post descongelación mucho más baja. Esto corrobora lo anteriormente planteado en la tabla 9, en donde se encontró que en la medida que se eleva la cantidad de células, se hace necesario un incremento en la concentración de sustancias crioprotectoras en el medio de congelación, para lograr una adecuada deshidratación celular y prevenir

los daños celulares por formación de cristales de hielo y choques osmóticos de acuerdo a lo planteado por diferentes autores. (Cueto 1993 y Cole y Cupps 1989). En los tratamientos T1 y T2, encontramos que las medias porcentuales de espermatozoides vivos post descongelación fueron las más altas y similares entre si, por estas razones podemos deducir que los resultados obtenidos son a consecuencia de una mayor disponibilidad de glicerol en la solución del diluente. En estos tratamientos se encontraban las concentraciones espermáticas iníciales más bajas (12 millones/ml y 24 millones/ml, respectivamente), el T3 no difirió de significativamente del T1 ni del T2. Mientras que en el T4, se demostró que al existir una menor disponibilidad de glicerol por cada célula se pueden obtener resultados desfavorables en lo que a espermatozoides vivos pos descongelación se trata. Vera y Muños (2005) aseguran que la concentración final de espermatozoides por dosis puede variar según el centro de inseminación y de acuerdo con la fertilidad del semen de cada toro, a su vez recomiendan un mínimo de 10 a 12 millones de espermatozoides móviles por dosis, después de la descongelación, lo que implica calcular entre 40 y 50 millones de espermatozoides móviles por ml, precongelación. Habitualmente se utilizan 30 millones de espermatozoides por dosis de 0,5 ml de semen diluido. Por su parte Palma (2008), encontró que al parecer, en la inseminación de yeguas es más importante la concentración seminal que el volumen y que al inseminar con concentraciones bajas y volúmenes altos se disminuía los índices de recolección de embriones.


Gráfica 1. Resultados porcentuales de espermatozoides vivos por extracción en cada toro Según se aprecia en la gráfica 1, los resultados de espermatozoides vivos recién extraídos aumentaron en el toro 2 en la medida que se avanzó en el número de las extracciones de semen, esto concuerda con lo expuesto por algunos autores donde expresan que se logra disminuir los espermatozoides muertos acumulados en el epidídimo en toros normales con un incremento en la actividad sexual y se evidenció una diferencia individual entre los toros empleados en el estudio. El toro 1 presentó una leve disminución en el número de espermatozoides vivos pre- dilución.

El intervalo de colección de semen es de importancia debido a que una alta frecuencia puede afectar la concentración espermática y la madurez de los espermatozoides; por el contrario una baja frecuencia de colección puede afectar la motilidad espermática y su vitalidad según Vera y Muños (2005). Por su parte otros autores comentan que el volumen y la concentración espermática están relacionados a la frecuencia de extracción, (Palma, 2008), y esta a su vez se realiza en dependencia de la libido, condición corporal y temperamento del macho (Cueto, 1993).

Gráfica 2. Comparación de medias porcentuales para espermatozoides vivos en cada tratamiento pos-

descongelación.


La gráfica 2 muestra que el T1 presentó el porcentaje más alto de espermatozoides vivos post descongelación (43.67 %), mientras que el T2 y el T3 obtuvieron porcentajes muy similares al T1 aunque ligeramente menores (43.0 y 40.67 respectivamente). Sin embargo en el T4 se observa una disminución notable en el porcentaje de sobrevivencia de las células (35.83%), lo cual se puede corresponder con la baja en la disponibilidad de agentes criopreservantes. Las normas o estándares de calidad aceptados para el semen bovino comercial

congelado en evaluación, son del 70 por ciento de células viables o células aptas para alcanzar el óvulo, (Catena et al. 1999). La concentración óptima para una determinada especie representa siempre un compromiso entre los efectos protectores y los efectos tóxicos, también parece ser que después del tratamiento con glicerol el espermatozoide desarrolla una dependencia al mismo, y que en su ausencia se reduce la capacidad de penetración al ovocito (Jeyendran et al. 1985; citados por Andrade, 2005).

Grafica 3. Comparación de de porcentajes de espermatozoides vivos post-descongelación entre cada toro

En la gráfica 3 se aprecia claramente que el toro 1 presentó medias porcentuales por encima del toro 2 en cuanto a espermatozoides vivos, post descongelación, sin embargo, los resultados del toro 2, no muestran una diferencia muy amplia con respecto al toro 1. Esto guarda semejanza con lo expuesto por Hidalgo (2005), cuando comenta que existe una gran variabilidad entre la concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro, siendo importante conocer el número de espermatozoides por eyaculado. Thomas et al (1998) hace referencia a la importancia que tiene la evaluación de las características reproductiva para determinar el potencial de un toro en comparación con otro. También menciona,

que para lograr realizar estas predicciones se utilizan varios criterios individuales tales como, desarrollo testicular, lívido, capacidad de montar las hembras y ciertas características del semen. Gadea (2004), planteó que de manera tradicional los machos han sido clasificados como “buenos congeladores” o “malos congeladores” y que recientemente se han encontrados las posibles causas de esta variabilidad, de manera que la única solución viable es la de optimizar los procesos de congelación para reducir al máximo la variabilidad y descartar aquellos machos realmente malos congeladores. Cole y Cupps (1989), comentan que las diferencias en la habilidad para la


congelación de los espermatozoides entre toros son obvias de forma individual, y que la habilidad para la congelación de semen, es afectada por varios factores como son el clima, dieta, nivel de producción y la edad del toro, afirmando que los machos que están entre 1 a 1.5 años es baja, mientras que en animales de 2 o más años empieza a ser alta y ésta decae en animales de más de 6 años. Por su parte Glauber (1990), asegura que ciertos factores como el manejo nutricional, líneas genéticas, edad, raza y peso corporal pueden afectar el tamaño testicular y por ende la capacidad reproductiva propia del animal.

Johnson (1985), citado por Gadea (2004), menciona en que existen grandes diferencias en la capacidad de congelación en los espermatozoides de machos diferentes, en donde se ven afectado tanto la viabilidad espermática como la fertilidad in vivo de los espermatozoides tras la manipulación y los procesos de congelación. Cabe mencionar que los toros que conformaban la unidad experimental eran machos jóvenes que se encontraban en condiciones similares de manejo y hasta el momento no habían sido utilizados ni en monta natural ni en programas de inseminación artificial.

Gráfica 4. Comportamiento del Porcentaje de Espermatozoides Vivos en 3 Etapas Diferentes de la Congelación. La gráfica 4 nos expone la manera en que disminuyó el número de espermatozoides vivos, durante las diferentes etapas del procesos de congelación (al diluir, al equilibrar y al descongelar), de esta manera se pudo establecer que a medida que se avanzó en el proceso, el número de espermatozoides muertos aumento, estos resultados concuerdan con lo expuesto por Palma (2008), cuando declara que los espermatozoides críopreservados sufren una gran sobrecarga asociada a la congelación/descongelación. Esta sobre carga se encuentra relacionada con los cambios de temperatura, la formación de hielo y sus consecuencias. La mayoría de las alteraciones de la estructura de la membrana son consecuencias del choque térmico,

deshidratación, toxicidad de las sales, formación de hielo intracelular, fluctuaciones del volumen, superficie celular o alteraciones del equilibrio metabólico. Por su parte Andrade (2005), comenta que la reducción de la temperatura por debajo de los 37

oC y principalmente, de los 20

oC,

induce una serie de alteraciones de naturaleza biofísica en el espermatozoide, a su vez nos menciona que en el enfriamiento por debajo de los 0

oC, se produce una

cadena de procesos nocivos para la célula, que se acentúa entre los -15 y -60

oC. Estas

alteraciones en los espermatozoides son consecuencias de lo estresante que son algunas fases del proceso de congelación, como

es el caso de la refrigeración y la congelación

(Watson et al 1992).


CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Apoyándonos en los resultados obtenidos en nuestra investigación podemos concluir que:

Al utilizar concentraciones mayores a

96x106

espermatozoides/ml se puede

comprometer la calidad final del semen

congelado, pudiéndose obtener

porcentajes de espermatozoides vivos

pos-descongelación por debajo del 30%.

Las concentraciones espermáticas que

se encontraron entre 24 millones y 48

millones espermatozoides/ml,

evidenciaron un mayor porcentaje de

células vivas pos descongelación para

semen congelado.

En tal sentido recomendamos:

Utilizar concentraciones espermáticas

que se encuentren entre 24x106 y 48x10

6

espermatozoides/ml para semen

congelado con el diluente Triladyl, ya que

en este rango de concentraciones se

puede asegurar la presencia de un

número aceptable de células vivas pos

descongelación, las cuales garantizan

una fertilización exitosa .

Realizar más investigaciones sobre el

efecto de la concentración seminal inicial

y su efecto en los parámetros de vigor y

motilidad pos descongelación.

BIBLIOGRAFÍA Aguirre M, M.C.; Anderson, S.; Huertas Vega, E. 1980.

Factores que intervienen en el procesamiento del semen bovino durante su congelación. Información Express. Genética y Reproducción. 4(6): 22-24.

Andrade A. 2005. Influencia en la Calidad Espermática

de la Adición de Distintas Concentraciones de Crioprotectores para la Conservación del Semen Canino. (En línea). Universidad Complutense de Madrid. Consultado el 20 de junio del 2009. Disponible en: http://eprints.ucm.es/tesis/vet/ucm-t28575.pdf

Catena, M. 1999. Evaluación del semen bovino

congelado. (En línea). Tandil, Argentina.

Consultado el 23 de agosto de 2008. Disponible en: http://www.vet-uy.com/articulo/bovino/150/0127/bov127.htm

Cole, H. H.y Cupps, P. T. Reproducción de los animales

domésticos. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza, España. 1989; p.551.

Cole H; y Cupps, P. 1975. Reproducción de los Animales

Domésticos. Editorial ACRIBIA. Zaragoza, España. 345 Pág.

Cueto, M. 1993. Procesamiento y conservación del

semen ovino. (En línea). Consultado el 13 de septiembre del 2008. Disponible en: http://www.INTA.org/08-obtencion-semen.pdf.

Gadea J. 2004. El Uso de Semen Porcino Congelado.

Mundo Ganadero. (En línea). Depto. Fisiología, Fac. de Veterinaria, Universidad de Murcia, España. Disponible en http://www.produccionbovina.com/produccion_porcina/64-semen_congelado.pdf

Glauber C. E (1990). Med. Vet., Depto. De Zootecnia,

Fac. Agronomía; U.B.A. El Toro en el Rodeo de Cría: Aporte a la Eficiencia Reproductiva y Propuesta para su Evaluación. Producción Bovina de carne. Argentina. Vol 70. Pp 690 – 698. Disponible en: http: //WWW. Producción bovina.com /información_ técnica /cría _toros / 18-evaluacion_toro.htm.

Hafez, E.S.E. Reproducción e Inseminación Artificial en

Animales. Ed. Mcgaw Hill, Mexico. 2002. p. 927. Hidalgo, C. 2005. Análisis del semen bovino. (En línea).

Consultado el 22 de septiembre del 2008. Disponible en: http://www.serida.org/publicacionesdetalle. php?id=01495

Palma G.A. 2008. Biotecnología de la Reproducción. 2a

Ed. Córdoba, Argentina. Mar del Plata. 669 p. Thomas CA, Garner DL, DeJarnette JM, Marshall CE.

1998. Effect of cryopreservation on bovine sperm organelle function and viability as determined by flow cytometry. Biol Reprod; 58:786–93.

Vera, M.O & Muños G. 2005. Como mejorara la

colección, manejo y calidad microbiológica del semen. (En línea). Manual de ganadería doble propósito. Consultado el 9 de septiembre del 2010. Disponible en: http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/manualganaderia/seccion6/articu19-s6.pdf

Watson P. F., Critser J. K., Mazur P. 1992. Sperm

preservation: fundamental cryobiology and practical implications. In: Templeton AA, Drife JO. (Editors). Infertility. Springer, London. P 102-114.

http://eprints.ucm.es/tesis/vet/ucm-t28575.pdf

http://eprints.ucm.es/tesis/vet/ucm-t28575.pdf

http://www.cababstractsplus.org/abstracts/SearchResults.aspx?cx=011480691189790707546:cops6fzdyna&cof=FORID:9&ie=UTF-8&q=COLE,%20H.%20H.&sa=Search

http://www.cababstractsplus.org/abstracts/SearchResults.aspx?cx=011480691189790707546:cops6fzdyna&cof=FORID:9&ie=UTF-8&q=Cupps,%20P.%20T.&sa=Search

http://www.inta.org/08-obtencion-semen.pdf

http://www.produccionbovina.com/produccion_porcina/64-semen_congelado.pdf

http://www.produccionbovina.com/produccion_porcina/64-semen_congelado.pdf

http://www.serida.org/publicacionesdetalle.%20php?id=01495



http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/manualganaderia/seccion6/articu19-s6.pdf

http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/libros_online/manualganaderia/seccion6/articu19-s6.pdf


EFECTO DEL RETIRO DEL CRIOPROTECTOR EN CUATRO PASOS VS TRANSFERENCIA DIRECTA SOBRE LA TASA DE PREÑEZ CON EMBRIONES

BOVINOS CONGELADOS EN ETILENGLICOL

Reinaldo de Armas1, Adolfo Zambrano2 y Gerardo Sandoya3.

RESUMEN Esta investigación se realizó en el Centro de Investigaciones de Biotecnologías Agropecuarias de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá, con el objetivo de conocer si era posible incrementar la tasa de preñez postransferencia, variando el método de retiro del crio protector post descongelación. Para esto se evaluaron dos tratamientos, T1: transferencia directa y T2: cuatro pasos de retiro del crioprotector). Para este estudio se utilizaron embriones que fueron producidos por superovulación y obtenidos in vivo de 9 donadoras de la raza Simbrah (Simmental X Brahman), para luego ser congelados (etilenglicol 10 % enPBS) y 78 novillas del cruzamiento F1 Simbrah, como receptoras Para descongelar los embriones en todos los casos se empleó agua a 30°C durante 30 seg. En el T1, luego de la descongelación los mismos fueron transferidos a hembras receptoras (sin ser extraídos de la pajuela donde se congelaron o sea transferencia directa). Los embriones destinados al T2 una vez descongelados, se extrajeron de las pajuelas y se colocaron en un plato petri con 10% de etilenglicol en PBS, seguidamente fueron trasladados por concentraciones descendentes donde permanecieron por 5 minutos en cada paso (7.5%, 5.0%, 2.5%), hasta llegar PBS libre de crioprotector. Posteriormente se evalúo su calidad morfológica, antes de embalarse nuevamente en pajillas para su transferencia. Se sincronizaron grupos de cinco receptoras para cada día destinado a la transferencia de embriones post descongelación. Aquellas receptoras que por segunda vez no obtuvieron Cuerpos Luteos aptos para la transferencia, no fueron resincronizadas posteriormente. La verificación de preñez se realizó a partir de los 19 dias y repetida a los 45 días de efectuada la transferencia (por ultrasonido y palpación rectal). Nuestros resultados arrojaron que en cuanto al porcentaje de preñeces alcanzadas hubo diferencias en tendencia matemática, pero esto no se pudo probar estadísticamente, probablemente debido al pequeño tamaño de la muestra (T1: 50 vs T2: 40). Por lo tanto no podemos avalar el procedimiento descrito en el T2, por lo que recomendamos continuar con la transferencia directa (T1) y ampliar el número de observaciones en próximas investigaciones.

PALABRAS CLAV E: superovulación, criopreservación, descongelación.


del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. Apartado Postal 0426-00002, David, Chiriquí, Panamá. e-mail: [email protected] 2 Profesor Asistente, Departamento de Zootecnia, Investigador del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. 3 MSc. Profesor Especial, Investigador del Centro de Investigaciones en Biotecnología Agropecuaria. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. Director del Centro de Enseñanza, Investigación y Aprendizaje de Chiriquí (CEIACHI).



ABATRACT

The present research was carried out in the Agricultural Biotechnology Research Center, Agricultural Sciences Faculty from Panamá University, with the aim of knowing the possibility of increasing pregnancy rates post transfer, varying the method of cryoprotectant remove post thawing. Therefore two treatments were evaluated. T1: direct transfer and T2: remove of cryoprotectant in four steps. In this study were employed embryos produced by superovulation obtained in vivo, from 9 Simbrah donors (Simmental X Brahman), for later being frozen (10% ethylene glycol in PBS), and 78 heifer from the F1 crossbreed Simbrah as recipients. In all cases water at 300C for 30 sec. was employed as thawing procedure. In the T1 embryos were transferred in to recipient females after thawing (without been extracted from the straws in which were frozen, direct transfer). Embryos from the T2 after thawing were extracted from the straws and placed in petri dishes with 10%. Ethylene glycol in PBS, after that, embryos were washed in decreasing concentrations of ethylene glycol in PBS for 5min. in each step (7.5%, 5.0%, and 2.5%). until arrive to PBS free of cryoprotectant. After that, morphologically quality was evaluated before reintroduction in straws for transfer. Groups of five recipients were synchronized per day for transferring embryos post thawing. Those recipients witch do not shown corpora lutea good for transfer for two times do not being resynchronized. The pregnancy diagnosis was performed 19 and 45 days after transfer (ultrasonography and rectal palpation). Our results shown a mathematical tendency in the percentage of pregnancies, but could not been evidenced any statistically differences between treatments (T1: 50% vs T2: 40%), probably due to an small size sample. For this reason we cannot support the procedures described in T2, and recommend continuing with direct transfer (T1), also an increase in size sample should be taken in account in next researches. Key words: Superovulation, cryopreservation, thawing.

INTRODUCCIÓN

El principal objetivo del trasplante de embriones es el incremento de la tasa reproductiva de una hembra de excelentes características, fecundada con un toro de un alto valor genético probado, lo que incrementa la ganancia genética del producto por el aporte de la madre. Como conocemos las vacas normalmente tienen solamente una cría por parto y la preñez dura alrededor de 285 días. Por lo tanto, se puede esperar un máximo de 8 a 10 crías por vaca, durante toda su vida, independientemente de que sea una vaca superior. Además, el sexo de las crías se divide biológicamente en una mitad de machos y otra de hembras, lo que resulta en que solo pueden producir entre 4 ó 5 hijas. Por esta razón, se necesitaba el desarrollo de técnicas que permitieran producir muchos embriones para ser recolectados y transferidos a úteros de otras vacas y garantizar muchas crías a la vez.

Sin embargo, los mayores inconvenientes que se presentan en los programas de trasplante de embriones es su alto costo vs. porcentaje de efectividad, de tal forma que si logramos aumentar este porcentaje en la transferencia de embriones post descongelación podríamos disminuir los costos de esta tecnología. Por otro lado los resultados de la superovulación son poco predecibles, por lo que en algunos casos no colectamos todos los embriones necesarios para ser transferidos a las receptoras disponibles mientras que en otras ocasiones, disponemos de menos receptoras que embriones producidos (de Armas 2007). Esto hace que perdamos la inversión realizada en la preparación de las receptoras o tengamos que desechar embriones de alto valor, lo cual sería una considerable pérdida económica que encarecería aun más el desarrollo de los programas de transferencia de embriones, de no contar con la posibilidad de la


conservación congelada de los mismos. Desde el punto de vista de la comercialización de reproductores y reproductoras, la criopreservación permite a los dueños de fincas progresar genéticamente a un bajo costo, comparando los valores del embrión y de su transporte con el de los animales vivos en transporte aéreo o terrestre. Además hace posible el control de enfermedades, reemplazando la importación de animales en pie, por la de embriones criopreservados libres de enfermedades, inclusive de aquellos lugares donde las hay. Por lo cual la congelación de embriones se ha convertido en un tema de investigación constante, con miras de mejorar los resultados de viabilidad, recordando que la criopreservación en una herramienta insustituible en la aplicación de la transferencia embrionaria. Actualmente el porcentaje de preñez con embriones congelados como promedio es alrededor del 40% (de Armas 2007). El mejorar estos índices traería como consecuencia la disminución de costos y pérdidas económicas, sobre todo en aquellos embriones de alto valor importados a nuestro país. En las transferencias de embriones los porcentajes de preñez que se obtienen se han incrementado de manera significativa en las últimas décadas (Rodríguez et al 2007), no obstante, se considera factible mejorar la eficiencia de la técnica en la que intervienen factores relacionados con el embrión, con la receptora y con la transferencia propiamente dicha, produciéndose además interacciones entre ellos (Palma 2008). También influyen el tipo de donadora, el manejo de la receptora y el profesional que efectúa la técnica de transferencia, entre otros factores. Dentro de los factores embrionarios, la calidad influye claramente en el resultado de la transferencia, independientemente de que los embriones sean frescos, criopreservados, micromanipulados y/o producidos in vitro (Greve et al 1993, Beal et al 1998, Cutini et al 2000). Sin dudas la congelación afecta la viabilidad de los embriones producidos in vivo, también los embriones producidos in vitro y/o micromanipulados poseen menor viabilidad, la cual es marcadamente inferior y tales diferencias se incrementan cuando dichos embriones son criopreservados. En todos los casos esto se produce por la

pérdida de células embrionarias en estos procedimientos (Gordon 1994, de Armas y Solano 1995). Además como es de esperar los cambios osmóticos durante la descongelación producen un estrés al metabolismo celular y morfológico (Acker y McGann 2001). Así el retiro del crioprotector en forma decreciente pudiera disminuir este fenómeno lo cual pudiera incrementar los índices de preñez en la transferencia.

MATERIALES Y MÉTODOS Este proyecto se realizó en la Unidad de Biotecnología de La Universidad de Panamá, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Escuela de Ciencias Pecuarias, corregimiento de Chiriquí, distrito de David, provincia de Chiriquí. Se utilizaron animales de raza Simbrah con una edad entre los de 18 meses a 30 meses. se seleccionándose las Donadoras y las Receptoras de embriones. Las mismas se manejaron en cuadras aledañas al laboratorio sin ninguna suplementación especial. Ante todo se escogió animales, con buen aspecto físico y salud con una condición corporal mayor a 2.75. Todas las donadoras de embriones se tomaron por su importancia genética y las receptoras por su capacidad materna, carácter y condición corporal. Se emplearon un total de cuarenta y cuatro (44) embriones, los cuales fueron congelados en etilenglicol al 10%, adicionado en un solo paso, donde permanecieron por 10 minutos para que se produjera la deshidratación celular necesaria antes de ser introducidos en el congelador. En el mismo se inició el proceso de congelación de -6 a -7

0C, se espero cinco

minutos y se hizo el seeding, dando una equilibración de otros 5 min. A partir de aquí el software del equipo se encargó de controlar el descenso de la temperatura a rangos entre 0.3

0C/ min., hasta una

temperatura final de -32 0C, de la cual fueron

sumergidos en nitrógeno líquido a -196 0C.

La descongelación de los embriones se realizó en agua a 25

0C en todos los casos.

El tratamiento uno (T1) con un total de 20 embriones consistió en la transferencia directa a las receptoras después de la descongelación y el tratamiento dos (T2) también con 20 embriones, se les procedió a retirar el etilenglicol en cuatro pasos según explicamos a continuación:


Descongelación del embrión y deposición en un plato petri con solución al 10% de etilenglicol. Seguidamente se trasladaron a otro plato petri con solución de al 7.5% de etilenglicol, donde se mantuvieron por 5 min. Repitiéndose el procedimiento bajando la concentración de etilenglicol a 5%, 2.5% y 0% en PBS equilibrando el embrión en cada paso por 5 min. Una vez en el último paso se realizó la evaluación morfológica bajo visión estereoscópica y se montó en una pajilla para ser transferido a la receptora. La transferencia fue realizada en hembras previamente sincronizadas (día: 7), por el método no quirúrgico transcervical, por un mismo operador en todos los casos. La verificación de preñez en ambos grupos se realizó a partir de los 19 días de efectuada la transferencia por ultrasonido y reconfirmada a los 45 días por palpación transrectal. La evaluación de los resultados se verificó por la comparación biológica de cómo se comportaron los resultados de preñez post-transferencia en el T1 vs. T2 . Adicionalmente se utilizo una prueba de Xc² para asociar los tratamientos utilizados con las respuestas en términos de preñez (Positivo y Negativo)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En términos generales, cuando los embriones que son congelados y descongelados con crioprotectores con bajos coeficientes de permeabilidad como el glicerol o propilenglicol, son colocados directamente en una solución isotónica, donde ocurre un daño celular irreversible debido al shock osmótico que se produce como consecuencia del rápido pase del agua hacia el interior de las células. Este shock osmótico, puede ser sensiblemente reducido si se utilizan crioprotectores con altos coeficientes de permeabilidad como el etilenglicol (Szel et al 1989). A nuestro criterio, aunque éste fuera de alto coeficiente de permeabilidad presumimos que al retirarlo gradualmente, lograríamos una mejora en los resultados de preñez. La evaluación morfológica después de la descongelación nos permitió rechazar cuatro embriones que habían sufrido daños celulares producto de la congelación (Tabla 1), representados por destrucción de múltiples blastómeras y cambios de coloración, los que evidenciaban muerte embrionaria (4/44═ 9.09 %). Esto sin dudas favoreció el porcentaje de preñez para el tratamiento dos (T2).

Tabla.1. EVALUACIÓN MORFOLÓGICA POST DESCONGELACIÓN Y RETIRO DEL

CRIOPROTECTOR.

Embriones descongelados No aptos para la transferencia No. %

Cambios de coloración No. %

Blastómeras degeneradas No. %

44 4 9.09 1 2.27 3 6.82

Se pudo apreciar que durante el proceso de retiro del crioprotector se lograba una rehidratación paulatina del mismo, en correspondencia con la disminución de la cantidad de etilenglicol en el medio. Esto fue un comportamiento similar a lo observado en este tipo de procedimiento con embriones congelados en glicerol. No se apreciaron daños de choque osmótico y el tamaño final de los embriones fue similar al de estos, antes de la congelación (Fig. 1, 2, 3 y 4).

Evaluación luego de 5min en 7.5% de etilenglicol en PBS.





En nuestro estudio se alcanzaron resultados de preñez del 50% (Graf. No.1), con embriones congelados en etilenglicol y transferencia directa después de la descongelación (T1), resultados similares a los que obtuvieron Voelkel y Hu (1992), quienes iniciaron la transferencia directa de embriones bovinos sin extracción del crioprotector (etilenglicol).

Gráfica. 1. Resultados de preñez alcanzados en el

estudio.

Estos resultados fueron superiores a los logrados con aquellos embriones descongelados retirando el crioprotector (etilenglicol) en cuatro pasos (T2), en donde se obtuvo solo un 40% de preñez (Graf. No.1). Dicha diferencia fué solamente una tendencia matemática, pues aparentemente no existe relación estadística entre el uso de un protocolo u otro, lo que se corresponde con lo publicado por diferentes autores (Tabla No.2) Tabla

Tabla 2. RESULTADOS OBTENIDOS EN LA TRANSFERENCIA DIRECTA POST DESCONGELACIÓN PUBLICADOS POR DIFERENTES AUTORES (Método Directo).

UTILIZANDO EL MÉTODO DE TRANSFERENCIA DIRECTA Embriones trasferidos Receptoras preñadas Referencias

n n %

Glicerol + sucrosa

38 16 42,1 Massip y col. (1987)

4846 2352 48,5 Nibart y Humblot (1997)

Promedio 45,3

Etilenglicol

550 285 51,8 Hill (1996)

1239 626 50,5 Nibart y Humblot (1997)

780 465 59,6 Beal y col. (1998)

418 187 44,7 Dochi y col. (1998)

1808 1016 56,2 Munar y col (1998)

Promedio 52,6

De acuerdo a los resultados en la tasa de preñez post transferencia publicados por diferentes autores (Tablas No. 2 y 3), comparando solo aquellos congelados en glicerol, podemos apreciar una media en la cual si al descongelar se hace el retiro del crioprotector en varios pases, se obtiene un

resultado mayor en casi el 10%, como promedio cuando se transferían directamente.

0

10

20

30

40

50

60

To

tal

en

%

1 2

Control Experimental

Resultados del Estudio

Preñez Vacia


Tabla.3. RESULTADOS OBTENIDOS POR DIFERENTES AUTORES EN LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES CONGELADOS (Método estándar, remoción en 4 pasos).

Utilizando el método estándar. Glicerol Embriones

transferidos Receptoras preñadas Referencias

n n (%)

550 297 (54,0) Pettit (1985)

456 268 (58,8) Munar y col. (1988)

883 443 (50,1) Hill (1996)

455 214 (47,0) Dochi y col. (1998) 646 403 (62,3) Munar y col. (1998)

Promedio (54,4)

Tomando en cuenta lo anteriormente planteado, el promedio de preñeces publicado por diferentes autores y que se refieren en la Tabla No. 2, donde se utilizaron embriones congelados en etilenglicol en un solo paso y transferencia directa, el promedio indicó un 52.6 %, similar a nuestros resultados (50%). Contradictoriamente con lo esperado por nosotros; en nuestro trabajo en el cual debía

ocurrir un aumento en la tasa de preñez, basándonos en las observaciones publicadas para embriones congelados en glicerol, solo obtuvimos el 40 % al utilizar el método de descongelación con extracción del crioprotector (etilenglicol) en cuatro pasos (T2). El análisis estadístico de nuestras observaciones aparece a continuación:

Tabla 4. PRUEBA DE CHI-CUADRADO (X²)

Grupo Control Experimental Total de columna

Resultado Positivo fo 10 (ft 9) fo 8 (ft 9) 18 Negativo fo 10 (ft 11) fo 12 (ft 11) 22

Total de fila 20 20 GT= 40

No se encontró asociación estadística (p< 0.05), entre el uso de protocolo de remoción del crioprotector en 4 pasos del estudio y el protocolo de transferencia directa en su relación con el resultado, el porcentaje de preñez post implante. En cuanto al porcentaje biológico de preñez, se observó diferencia pero no se pudo probar estadísticamente. Para esto, en una prueba de t de student se necesitarían más réplicas de este mismo estudio. De tal forma los estudios realizados pudieron verse afectados por el reducido tamaño de la muestra, de modo que es permisible que aún las diferencias no sean concluyentes.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en esta investigación condujeron a las siguientes conclusiones:

La descongelación en cuatro pasos de embriones preservados en etilenglicol como crioprotector disminuyó la taza de preñez post descongelación. No obstante debido a ciertas limitaciones técnicas y económicas, no fue posible determinar si esta disminución fue significativa desde el punto de vista estadístico.

Entre las técnicas de descongelación utilizadas (T1 y T2), se observó una pequeña diferencia biológica de acuerdo al método empleado, por lo tanto resulta de interés y es necesario realizar más estudios tendientes a encontrar las


condiciones óptimas para mejorar este método.

El nivel de conocimiento, adiestramiento y especialización del estudiante en las técnicas de selección de donadoras y receptoras, sincronización, superovulación, colecta, selección de embriones, métodos de congelamiento y descongelamiento de los mismos, celaje, inseminación artificial, palpación y manejo de personal de campo, incrementó de manera extraordinaria.

Estos estudios estuvieron basados en la transferencia de un número muestral relativamente pequeño de embriones, hecho que pudo limitar el alcance de las inferencias.

RECOMENDACIONES

Realizar estudios futuros mucho más especializados incluyendo factores que no fueron evaluados en esta investigación tales como: raza, peso, edad, cantidad de partos, cuerno de la implantación, temperatura del animal y época del año, todo esto en las receptoras.

Realizar los estudios basándose en grupos de embriones por donadora y padre.

Considerar en estudios futuros, el desarrollo embrionario al momento de la congelación.

Concienciar a las autoridades de la Universidad de Panamá de la importancia y necesidad de profundizar en este tipo de investigaciones biotecnológicas en pro del beneficio de la ganadería tanto nacional como internacinal.

Utilizar más réplicas en estudios, futuros, a fin de obtener inferencias más confiables basadas en un mayor nivel de precisión.

Posibilidad de accesar a financiamientos del sector privado para el desarrollo de

este tipo de investigaciones por medio de la Universidad.

La Necesidad de que la universidad tenga acceso a publicaciones científicas por medio de la Web relacionadas en el área de investigación.

BIBLIOGRAFÍA Acker, J. P; McGann, L. E. 2001. Membrane damage oc-

curs during the formation of intracellular ice. Cryo-letters 22:241-254.

Beal, W.E., Hinshaw, R.H. and Whitman, S.S. 1998. Evaluating embryo freezing method and the site of embryo deposition on pregnancy rate in bovine embryo transfer. Theriogenology, 49:241.

Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevilla, J. 2000. Factores que determinan el resultado de la transferencia no quirúrgica de embrionesbovinos. Taurus, 2(7):28-39

de Armas, R. Solano Roberto. 1995. Manual Práctico de Transferencia de Embriones y Fertilización in Vitro. Publicaciones CIMA. Cuba. 118 p.

de Armas, R. 2007. Transferencia de Embriones en el Ganado Bovino. 1er curso Internacional de Transferencia de embriones en el bovino. Facultad de Ciencias Agropecuaris, Universidad de Panamá. 125 p.

Dochi, O., Yamamoto, Y., Saga, H., Yoshiba, N., Kano, N., Maeda, J., Miyata, K., Yamauchi, A., Tominaga, K., Oda, Y., Nakashima, T. and Inohane, S. 1998. Direct transfer of bovine embryos frozen-thawed in the presence of propylene glycol or ethylene glycol under on-farm conditions in an integrated embryo transfer program. Theriogenology, 49:1051-1058.

Gordon, I. 1994. Storage and cryopreservation of oocytes and embryos. En: Laboratory production of cattle embryos (I. Gordon, eds.). Cab International, Cambridge, UK, Capítulo 6, pp. 293-328.

Greve, T., Avery, B., Callesen, H. 1993. Viability of in vivo and in vitro-produced bovine embryos. Reprod. Domest. Anim. (28): 645-654

Hill, B.R. 1996. Ensayos a campo con embriones congelados con glicerol vs etilenglicol. CABIA 27:30-33.

Massip, A.; Van Der Zwalmen, P; Ecotrs, E 1987. Recent progress in cryopreservation of cattle embryos. Theriogenology 27:69-79.

Munar, C., Valdez, A.M. y Crespo, P.J. 1998. Transferencia de embriones bovinos criopreservados con etilenglicol y con glicerol. 1er Simposio Internacional de Biotecnologías Aplicadas en Reproducción Animal, 12 - 13 y 14 de Agosto de 1998, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Lomas de Zamora, Buenos Aires, pp. 108 114.


Nibart, M. and Humblot, P. 1997. Le tranfer direct des embryons bovine congelés. M. Elev. et Insem. Fev., 2:3-11.

Palma G.A. 2008. Biotecnología de la Reproducción. 2a

Ed. Córdoba, Argentina. Mar del Plata. 669 p.

Pettit, W. 1985. Commercial freezing of bovine embryos in glass ampules. Theriogenology, 23:13-16.

Rodríguez, JM., Giraldo, C. Castañeda, S., Ruiz, T. Olivera, M. (2007). Análisis multifactorial de las tasas de preñez en programas de transferencia de

embriones en Colombia. Rev. MVZ Córdoba 12 (2), 978-984.

Széll, A., Shelton, J.N. and Szell, K. 1989. Osmotic characteristics of sheep and cattle embryos. Cryobiology, 26:297-301.

Voelkel, S. A.; Hu, Y. X. 1992. The use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing di-rect transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology 37:687-697.


INFLUENCIA DE LA UTILIZACIÓN DE DOS BACTERICIDAS Y DIEZ VARIANTES DE MEDIOS DE CULTIVO SOBRE EL ESTABLECIMIENTO Y

MULTIPLICACIÓN IN VITRO DEL OTOE Xanthosoma violaceum

Simón A. Vásquez W.1

RESUMEN

Con el fin de evaluar la influencia de la utilización de dos bactericidas y diez variantes de medios de cultivo sobre el establecimiento y multiplicación In vitro del otoe Xanthosoma violaceum, a partir de tejido meristemático, se realizó esta investigación entre marzo y septiembre del 2010, en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agropecuarias (Sede Chiriquí) de la Universidad de Panamá. Este trabajo de dividió en dos etapas. En la primera etapa se evaluó el efecto simple y la interacción de los antibióticos Agrigent Plus® (Sulfato de Gentamicina + Clorhidrato de Oxitetraciclina, a 15 g.L-1) y Agrimycin® (Sulfato de Estreptomicina + Terramicina, a 20 g.L-1) sobre el establecimiento y crecimiento In Vitro del otoe (Xanthosoma violaceum Schott). Estos tratamientos fueron disueltos en medios de cultivo constituidos por las sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) suplementado con 6-Benzilaminopurina (0.1 mg.L-1) sacarosa (30g.L-1) Gelrite® (3.5g.L-1) y pH de 5.8. A los 30 días se evaluaron la longitud de los explantes (LE), ancho de los explantes (AE), el número de explantes contaminados (EC) y la sobrevivencia (EV). La segunda etapa consistió en cuantificar el efecto simple y la interacción de diferentes niveles de auxinas y citocininas en la etapa de multiplicación In vitro de otoe. Se utilizaron las sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962). Se compararon los efectos del uso de tres niveles del Ácido Indol Acético (AIA) (0.0, 0.25 y 0.5 mg.L-1) en combinación con tres niveles de 6-Benzilcilaminopurina (BAP) (1.0, 2.0 y 3.0 mg.L-1). Se utilizó como testigo absoluto para esta etapa el medio compuesto por las sales minerales y vitaminas MS exento de AIA (0.0 mg.L-1) y BAP (0.0mg.L-1). Las variables evaluadas en esta etapa fueron; número de brotes (NB), longitud de brotes en cm. (LB) y la tasa de multiplicación (TM) luego de tres sub cultivos (cada 25 días). Los resultados indicaron que la inclusión de los antibióticos en el establecimiento In Vitro del otoe reduce significativamente los niveles de contaminación de los medios de cultivo, lo que está directamente relacionado con la sobrevivencia de los explantes, además que no se encontraron efectos significativos en la utilización de la combinación de los antibióticos sobre los niveles de contaminación In Vitro en la etapa de establecimiento del otoe. La utilización del medio de cultivo constituido por las sales minerales y vitaminas MS y suplementado con 0.50 mg/l de AIA y entre 1 a 2 mg.L-1 de BAP, ofrece las mejores respuestas en la etapa de multiplicación In Vitro del otoe para las variables número de brotes, largo de los brotes y tasa de multiplicación

PALABRAS CLAVES: Medios de cultivo, bactericidas, tejido meristemático,

antibióticos

1 Mgter. Biotecnología Vegetal. Profesor Regular Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad

de Panamá.


ABSTRACT

In order to evaluate the influence of the use of two bactericides and ten variants of culture media on establishment and In vitro propagation of otoe Xanthosoma violaceum, using meristem tissue, was conducted this research between March and September 2010, at the plant biotechnology laboratory, in the Faculty of Agricultural Sciences (Chiriqui branch) of the University of Panama. This work is divided into two stages. The first was to evaluate the simple effect and interaction of antibiotics Agrigent Plus ® (gentamycin sulphate + hydrochloride oxytetracycline 15 g.L-1) and Agrimycin ® (streptomycin sulphate + Terramycin 20 g.L-1) on the establishment and growth In Vitro of Xanthosoma violaceum, Schott. These treatments were dissolved in culture media comprising the mineral salts and vitamins MS (Murashige and Sgook, 1962) supplemented with 6-Benzylaminopurine (0.1 mg.)L-1) sucrose (30 g)L-1) Gelrite ® (3.5.)L-1) and a pH of 5.8. Thirty days after were evaluated: length of the explants (LE), width of explants (AE), number of contaminated explants (EC) and survival (EV). The second stage was to quantify the simple effect and the interaction of different levels of auxins and cytokinins in the stage of In vitro propagation of X. violaceum. The mineral salts and vitamins MS (Murashige and Sgook, 1962) were used. It was compared the effects of the use of three levels of indoleacetic acid (IAA) (0.0, 0.25 and 0.5 mg.)L-1) in combination with three levels of 6- Benzylaminopurine (BAP) (1.0, 2.0, and 3.0 mg.)L-1). It was used as the absolute control for this stage, the medium composed of mineral salts and vitamins MS -free of IAA (0.0 mg.)L-1) and BAP (0.0mg.)L-1). The variables evaluated at this stage were: number of sprouts (NB), length of sprouts in cm (LB), multiplication rate (TM), after three consecutive subcultures (every 25 days). The results indicated that the inclusion of antibiotics in the “In Vitro” establishment of X violaceum significantly reduces the levels of contamination of the culture media, which is directly related to the survival of explants, also no significant effect was found with the use of antibiotic combinations related to the levels of contamination in the “In Vitro” establishment of the X. violaceum. The use of the culture medium composed of mineral salts and vitamins MS and supplemented with 0.50 mg/l of IAA and 1 to 2 mg.L-1, BAP, offers the best response in the stage of In Vitro propagation of X. violaceum for the variables: number of sprouts, length of sprouts and its multiplication rate.

KEYWORDS: Antibiotics, media culture, bactericidal, meristematic tissue

INTRODUCCIÓN

El otoe (Xanthosoma violaceum Schott) es una especie de raíz de tradicional producción y consumo en Panamá, sin embargo cifras preliminares de la Dirección de Agricultura del Ministerio de Desarrollo Agropecuario indican que durante el ciclo productivo 2007-2008, la superficie sembrada de otoe fue de 529.8 hectáreas, lo que representa la mitad

del promedio de la superficie sembrada en los últimos ocho años (MIDA 2009). Todavía más dramático es el hecho que de las 529.8 hectáreas sembradas, se logró cosechar en el mismo período productivo (2007-2008) 183.6 hectáreas lo que representa apenas el 34.65 % de la superficie sembrada (MIDA, 2009). Conociendo la situación productiva de esta especie, la realidad antes planteada es consecuencia de la diseminación y


consecuente contaminación de las semillas y campos de producción con el conocido complejo del mal seco del otoe. El mal seco se produce por el ataque asociado de hongos y bacterias: Fusarium sp., Phytium sp., Rhyzoctonia solani, Sclerotium sp., Erwinia caratovora (mag.go.cr/bibioteca virtualciencia/mal_seco_tiquisque.pdf 2006.) Como consecuencia de lo anteriormente plasmado, la única vía de producción de material de plantación sano y vigoroso es la propagación In vitro, por lo tanto es importante investigar el efecto que pueden tener algunas estrategias conducentes a evaluar la utilización de antibióticos y distintas composiciones de medios de cultivo sobre el establecimiento y multiplicación In vitro del otoe, de manera que nuestra institución y otras similares cuenten con información comprobada que les permitan implementar programas de propagación masiva de plantas sanas de esta importante especie alimenticia.


El material vegetal utilizado se obtuvo de parcelas de productores de los distritos de Bugaba y Boquerón de la provincia de Chiriquí, en donde se evidenció afecciones causadas por el complejo del mal seco del otoe. El mismo fue llevado al invernadero del Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias en su sede de Chiriquí en donde se redujo hasta alcanzar secciones de 4 cm. de largo, las cuales fueron lavadas con agua corriente y jabón antibacterial líquido al 10 % durante diez minutos. Después de escurridas con agua destilada estéril (ADE) se trataron con una solución comercial de hipoclorito de sodio (Cloro 5.25%) al 5 % v/v durante 20 minutos y se enjuagaran tres veces con agua destilada estéril. Etapa de Establecimiento La etapa de establecimiento In vitro constituye la etapa fundamental en la micropropagación, pues de ella depende su

eficiencia o posible mantenimiento de las plantas así como la eliminación de las contaminaciones (Hurtado y Merino. 1987). En la cámara de flujo laminar de aire se eliminó 1.5 cm. del pseudotallo y entre 3 a 4 mm. de la parte basal. Luego de un segundo enjuague con ADE y con la utilización de pinzas y escarpelos se siguió reduciendo el explante hasta obtener el meristema con un tamaño aproximado de 2.5 mm. para luego ser sembrado individualmente en condiciones asépticas en frascos tipo mayonesa de 4 onz. con 20 ml. de medio de cultivo para establecimiento. La composición de los medios para la etapa de establecimiento (Tabla 1) fue la siguiente: Medio 1. Sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) suplementado con 6-Benzilaminopurina (BAP) 0.1 mg.L

-1

agregándole 15 g.L-1

de Agrigent Plus®

(Sulfato de Gentamicina + Clorhidrato de Oxitetraciclina), azúcar refinada 30g.L

-1, 3.5

% de Gelrite®

y pH de 5.8. Medio 2. Sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) suplementado con 6-Benzilaminopurina (BAP) 0.1 mg.L

-1

(Salazar, 1991) agregándole20 g.L-1

de Agri mycin

® (Sulfato de Estreptomicina +

Terramicina), azúcar refinada 30g.L-1

, 3.5 % de Gelrite

® y pH de 5.8.

Medio 3. Sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) suplementado con 6-Benzilaminopurina (BAP) 0.1 mg.L

-1

(Salazar, 1991) agregándole 15 g.L-1

de Agrigent Plus

® (Sulfato de Gentamicina +

Clorhidrato de Oxitetraciclina) más 20 g.L-1

de Agri mycin


Terramicina), azúcar refinada 30g.L-1

, 3.5 % de Gelrite

® y pH de 5.8.

Medio 4. (Testigo) Sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) suplementado con 6-Benzilaminopurina, azúcar refinada 30g.L

-1, 3.5 % de Gelrite

® y

pH de 5.8.


Tabla 1. COMPOSICIÓN DE LOS TRATAMIENTOS UTILIZADOS EN LA ETAPA DE ESTABLECIMIENTO

Tratamiento

MS

Agrigent Plus

®

15 g.L-1

Agri mycin

®

20 g.L-1

Agrigent Plus®

15 g.L-1

+ Agri mycin®

20 g.L-1

1 Completo + 0 0 2 Completo 0 + 0 3 Completo 0 0 + 4 Completo 0 0 0

MS = Sales minerales y vitaminas (Murashige y Sgook, 1962) Agrigent Plus

® = (Sulfato de Gentamicina + Clorhidrato de Oxitetraciclina)

Agri mycin® = (Sulfato de Estreptomicina + Terramicina)

Las condiciones y tiempo de incubación fueron las recomendadas usualmente para esta especie por Salazar (1991). En cada medio se implantaron 24 meristemas (uno por cada frasco) y a los 30 días se evaluaron la longitud de los explantes (LE), ancho de los explantes (AE), el número de explantes contaminados (EC) y la sobrevivencia (EV). Los datos resultantes se sometieron a un análisis de varianza siguiendo un diseño completamente aleatorizado. Se compararon las medias utilizando la prueba de comparación múltiple de Duncan en los casos que fueron necesarios Etapa de Multiplicación. En la etapa de multiplicación se utilizaron las sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962). Se compararon los efectos del uso de tres niveles del Ácido Indol Acético (AIA) (0.0, 0.25 y 0.5 mg.L

-1) en combinación

con tres niveles de 6-Benzilcilaminopurina (BAP) (1.0, 2.0 y 3.0 mg.L

-1) Se utilizó como

testigo absoluto para esta etapa el medio compuesto por las sales minerales y vitaminas MS exento de AIA (0.0 mg.L

-1) y

BAP (0.0mg.L-1

) L Tabla 2. CONCENTRACIONES DEL ÁCIDO

INDOLACÉTICO (AIA) Y DE BENCILAMINOPURINA (BAP) EN LOS TRATAMIENTOS UTLIZADOS EN LA FASE DE MULTIPLICACIÓN

Medio de cultivo MS (1962)

Reguladores de crecimiento

AIA (mg.L-1

) BAP (mg.L-1

)

1 0.00 0.00 2 0.00 1.00 3 0.00 2.00 4 0.00 3.00 5 0.25 1.00 6 0.25 2.00 7 0.25 3.00 8 0.50 1.00 9 0.50 2.00 10 0.50 3.00

Las variables evaluadas en esta etapa fueron; número de brotes (NB), longitud de los brotes en cm. (LB) y la tasa de multiplicación (TM) luego de tres sub cultivos (cada 25 días). Las valoraciones estadísticas en esta etapa se realizaron siguiendo un diseño completamente al azar con arreglo factorial, teniéndose nueve tratamientos factoriales (3 X 3) más el testigo lo que dará un total de diez tratamientos con cinco repeticiones de cada uno de ellos (Tabla 2).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Etapa de Establecimiento. Los resultados encontrados durante la fase de estableci-miento indican que se encontraron diferen-cias significativas (α= 0.05) entre los trata-mientos que incluyeron los bactericidas, (T1, T2 y T3) con respecto al tratamiento exento de los mismos (T4). El tratamiento que registró el menor porcentaje de contami-nación fue el tratamiento 2, (28.34%), segui-do por los tratamientos 1 (35.25%) y 3 (37.50%) respectivamente, aunque la prueba de amplitud múltiple de Duncan indicó que entre los mismos no existen diferencias significativas por lo que todos los tratamientos en los que se incluyó antibióticos tienen el mismo efecto (Tabla 3). La misma prueba indicó que el tratamiento exento de antibióticos (T4) registro niveles de contaminación de 67.50% ubicándolo en un grupo Duncan diferente a los tres tratamientos anteriores. Se observa claramente con estos resultados que la utilización de los antibióticos Agrigent Plus

® y

Agri mycin®

tienen un efecto favorable en el

control de la contaminación durante la etapa de establecimiento in Vitro del otoe, lo que favorece la sobrevivencia de los explantes, ya que la misma está directamente


relacionada con reducción de la contaminación. (Tabla 3). Esto se aprecia claramente con la conformación de los grupos Duncan en donde los tratamientos en los cuales se incluyeron antibióticos (T1, T2 y

T3) no reflejan diferencias significativas entre sí, contrario al tratamiento 4, que se ubica en un grupo Duncan diferente con el menor porcentaje de sobrevivencia (42.50 %)

Tabla 3 LONGITUD Y ANCHO DE LOS EXPLANTES, PROMEDIOS DE EXPLANTES CONTAMINADOS Y

EXPLANTES VIVOS Tratamiento Longitud

del Explante (cm)

Ancho del

Explante (cm)

Explantes contaminados (%)

Explantes vivos (%)

1 2.89 b 1.34 b 31.25 a 68.75 a 2 1.78 a 1.78 ab 28.34 a 71.66 a 3 1.91 a 1.91 a 37.50 a 62.50 a 4 1.53 a 1.53ab 67.50 b 32.50 b

CV % 17.15 20.67 49.10 24.77

Letras distintas difieren estadísticamente entre sí, para la prueba de rangos múltiples de Duncan α= 0.05

Para la variable longitud del explante, se encontraron diferencias significativas (α= 0.05). Las mayores longitudes se registraron con la utilización de los tratamientos 2, 3 y 4 y la menor con el tratamiento 1. La variable ancho de los explantes registró un rango entre 1.34 hasta 1.91 centímetros. La misma también presentó diferencias significativas (α= 0.05) agrupándose los tratamientos 2, 3 y 4 en el grupo Duncan a y los tratamientos 1, 2 y 4 en el grupo Duncan

b. No se pueden inferir relaciones entre las variables longitud del explante y ancho del explante con respecto a la inclusión o no de antibióticos en el medio de cultivo. Etapa de multiplicación. En la etapa multiplicación se encontraron diferencias significativas (α= 0.05) en todas las variables (Tabla 4)

Tabla 4. NÚMERO DE BROTES, LONGITUD DE BROTES Y TASA DE MULTIPLICACIÓN OBTENIDOS DESPUÉS DEL

TERCER SUBCULTIVO.

N° trat AIA BAP Número Longitud Tasa

(mg/l) de brotes de brotes de (cm) Multip

1 0.00 0.00 1.35 c 1.34 b 1.9 e 2 0.00 1.00 1.90 b 1.74 a 2.8 d 3 0.00 2.00 2.15 a 1.79 a 2.7 d 4 0.00 3.00 2.30 a 2.04 a 3.3 cd 5 0.25 1.00 2.35 a 1.71 ab 4.6 b 6 0.25 2.00 2.45 a 1.90 a 4.7 b 7 0.25 3.00 2.40 a 2.00 a 3.5 c 8 0.50 1.00 2.10 a 1.94 a 5.5 a 9 0.50 2.00 2.25 a 1.77 a 5.6 a

10 0.50 3.00 2.15 a 1.66 ab 4.7 b

Letras distintas difieren estadísticamente entre sí, para la prueba de rangos múltiples de Duncan α= 0.05

Como se aprecia en la tabla 4, el número de brotes después del tercer subcultivo fluctuó entre 1.35 (tratamiento 1) hasta un máximo de 2.45 (tratamiento 6). La prueba de amplitud múltiple de Duncan mostró que los tratamientos comprendidos entre el 3 y el 10 no presentan diferencias significativas en lo que respecta al número de brotes obtenidos

en esta investigación. Podemos inferir entonces que para la etapa de multiplicación con el uso de 2 mg.L

-1de BAP es suficiente

para obtener un rendimiento de brotes óptimo, pues de acuerdo a estos resultados la inclusión de AIA no tiene ningún efecto en el número de brotes. Estos resultados se asemejan a lo reportado por Matehus Et al


(2006) donde se obtuvo un promedio de 2.43 brotes por explante utilizando una combinación de 1 mg.L

-1 de BAP más 3

mg.L-1

de ácido giberélico (AG3). Para la variable longitud de los explantes se encontraron diferencias significativas (α= 0.05) entre los tratamientos. La prueba de amplitud múltiple de Duncan indica que los tratamientos en donde se registraron los mejores promedios de longitud de brote (grupo a) fueron los tratamientos comprendidos del 2 al 10, cuyos rangos de longitud oscilaron entre 1.66 a 2.04 cm. Se encontraron diferencias significativas (α= 0.05) para la variable tasa de multiplicación, en donde los tratamientos 8 (0.50 mg.L

-1 de

AIA + 1.00 mg.L-1

de BAP) y 9 (0.50 mg.L-1

de AIA + 2.00 mg.L

-1 de BAP) produjeron un

promedios entre 5.5 y 5.6 plantas por explante después del tercer subcultivo (grupo a) superando lo indicado por Matehus Et al (2006) quienes reportan una tasa de rendimiento de 4.6 a 4.7 plantas por explante con la utilización de 1 mg.L

-1 de BAP. Los

tratamientos 5, 6 y 10 (grupo b) registraron una tasa promedio de multiplicación entre 4.6 y 4.7 plantas por explante. El resto de los tratamientos (1, 2, 3, 4, y 7) registraron tasas de multiplicación inferiores (grupos c, d y e), que fluctuaron entre 1.9 y 3.5 plantas producidas por explante. Considerando los efectos de los tratamientos sobre las diferentes variables evaluadas en la etapa de multiplicación, se puede infereir que la utilización de los tratamientos 8 (0.50 mg.L

-

1 de AIA + 1.00 mg.L

-1 de BAP) o 9 (0.50

mg.L-1

de AIA + 2.00 mg.L-1

de BAP) produce las mejores respuestas en términos de número de brotes, longitud de los brotes y tasa de multiplicación.

CONCLUSIONES

1. La inclusión de los antibióticos Agrigent

Plus®

(Sulfato de Gentamicina + Clorhidrato de Oxitetraciclina) o Agri mycin


Terramicina) al medio de cultivo constituido por las sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) más 0.1 mg.L

-1 de BAP en el

establecimiento In Vitro del otoe reduce significativamente los niveles de

contaminación en los medios de cultivo, lo que está directamente relacionado con la sobrevivencia de los explantes.

2. No se encontraron efectos significativos

en la utilización de la combinación de los antibióticos Agrigent Plus

® (Sulfato de

Gentamicina + Clorhidrato de Oxitetraciclina) o Agri mycin

® (Sulfato de

Estreptomicina + Terramicina) sobre los niveles de contaminación In Vitro en la etapa de establecimiento del otoe.

3. La utilización del medio de cultivo

constituido por las sales minerales y vitaminas MS (Murashige y Sgook, 1962) y suplementado con 0.50 mg/l de AIA y entre 1 a 2 mg.L

-1 de BAP, ofrece las

mejores respuestas en la etapa de multiplicación In Vitro del otoe para las variables número de brotes, largo de los brotes y tasa de multiplicación.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS GARCÍA, M., S. RODRÍGUEZ, V. MEDERO, J. LÓPEZ,

J. VENTURA, M. CABRERA, A RAYAS y D. GONZÁLEZ. 1999. Investigación Participativa en Fitomejoramiento y Producción de Semilla de Aráceas (Xanthosoma y Colocasia) Aplicando la Biotecnología. In: Simposio Internacional y Talleres sobre Fitomejoramiento Participativo en América Latina y el Caribe. http://www.prgaprogram.org/cds/fmp/NADINE-PDF/ GARCIA.pdf

HURTADO, A., MERINO, E. 1987. Cultivo de tejidos

vegetales. Editorial trillas. México MATEHUS, J., ROMAY, G., SANTANA, M. 2006.

Multiplicación in vitro de ocumo y taro. Agronomía Trop. 56(4): 607-613

MONTALDO, A., J. MANTILLA, C. ZAMBRANO y P.

ZÁRRAGA. 2004. Las aráceas comestibles: Ocumo y Taro. Luis Fuenmayor Toro, Editor. UCV. Ediciones OPSU. Primera Edición. Caracas, Venezuela. 1-250 pp.

MURASHIGE, T. and F. SKOOG. 1962. A revised

medium for rapid growth and bio- assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-496.

SALAZAR, S. 1991. Micropropagación de aráceas

comestibles. In:Roca, W y L. Mroginski (eds). Cultivo de tejidos en la Agricultura. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia. p. 469-480.

http://www.prgaprogram.org/cds/fmp/NADINE-PDF/

http://www.prgaprogram.org/cds/fmp/NADINE-PDF/


CUANTIFICACIÓN DEL CARBONO SECUESTRADO EN UN SISTEMA AGROFORESTAL DE CAFÉ ARBOLADO, EN EL DISTRITO DE BOQUETE,

CHIRIQUÍ

Christopher González R.1 Felícita González2

RESUMEN

El estudio se realizó en la Hacienda Bárbara, ubicada en el Corregimiento de Jaramillo arriba, distrito de Boquete, provincia de Chiriquí. El objetivo del estudio fue de cuantificar mediante modelos alométricos el secuestro de carbono en un sistema agroforestal de café arbolado. Para estimar la biomasa aérea total del café, árboles de sombra y la hojarasca, se establecieron tres parcelas de muestreo temporal de forma cuadrada con un área de 100 m2 (10 m x 10 m) cada una; para el muestreo se tomaron 12 árboles de sombra, con clases diamétricas de cinco, 10 y 15 centímetros y nueve plantas de café (mayor a 2.5 centímetros de diámetro). Las especies de sombra seleccionadas fueron: Mangle de montaña (Gordonia fruticosa), Amarillito (Lafoensia punicifolia), Canillo (Miconia argentea) y Guayaba (Psidium guajava). Los árboles y las plantas de café fueron seleccionadas de forma aleatoria, se cortaron y se pesaron las plantas de café y los árboles de sombra; se peso por separado cada componente (hojas, ramas y tallo /tronco) para determinar el peso freso en campo. Para medir la biomasa de la hojarasca, dentro de las parcelas de 100 m2 se utilizó un marco de metal de 0.25 m2 (0.5 m x 0.5 m), tirándose el marco dos veces al azar en cada parcela de muestreo; se tomo una muestra de 115 gramos. Para calcular el contenido de carbono en toneladas por hectárea (TC ha-1), para plantas de café, árboles de sombra y hojarasca, se utilizó el factor de 0.5, establecido por el Laboratorio de Productos Forestales del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, s.f). El modelo alométrico que mejor se ajusto a la biomasa aérea total de las plantas de café fue: Log10 (BT) = a + b Log10 (h), (R² = 0.9955). Para los árboles de sombra fue: Log10 (BT) = a + b Log10 (dap), (R² = 0.9987); donde: Log10 = logaritmo con base 10, BT = Biomasa aérea total en kilogramos, d = diámetro (cm), h = altura (m), (a) y (b) = parámetros del modelo a estimar. La fuente de mayor importancia que contribuyó al secuestro o almacenamiento de carbono en el estudio, fueron los árboles de sombra con 6.275 TC ha-1 (87.94 %), seguidamente de la hojarasca con un contenido de carbono de 0.6258 TC ha-1 (8.77 %) y las plantas de café con un menor aporte de 0.235 TC ha-1 (3.29 %). PALABRAS CLAVES: secuestro de carbono, biomasa aérea, cafè arbolado,

agroforestería, hojarasca, modelos alométricos.

ABSTRACT

The study was conducted in the Barbara Ranch, located in the Corregimiento of Jaramillo, district of Boquete, Province of Chiriqui. The objective of the study was to quantify carbon sequestration using allometric models in a wooded coffee agroforestry system. To estimate the aboveground biomass total of coffee trees shade and leaf litter, three plots

1 Tesis Ingeniero en Manejo Ambiental. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. 2 Ingeniero en Manejo Ambiental, Facultad de Ciencias Agropecuarias,, Panamá.2007.


with a area each one of 100 m² (10 m x 10 m) were established for temporary sampling. The sample was taken from 12 shade trees with diametric classes of 5,10 and 15 centimeters and nine plants of coffee with a diameter higher to 2.5 centimeter. The selected species for shade were: mangrove mountain (Gordonia fruticosa), Amarillito (Lafoensia punicifolia), Canillo (Miconia argentea) and guava (Psidium guajava). Trees for shade and coffee plants were selected at random and they were cut and weighed to measure the fresh weight of leaf, branches and stem. A metal frame with an area of 0.25 m² is used to measure the biomass of leaf litter within the plots of 100 m² (0.5 m x 0.5 m). The frame was thrown twice at random in each sampling plot. The weight of the sample taken was 115 grams. To calculate the content of carbon in tons per hectare (TC-1) for the plants of coffee, litter leaf and shade trees, the factor of 0.5 established by the Forestry Laboratory of the Department of Agriculture of the United States (USDA) was used. The allometric model that better adjust to the total aboveground biomass of plants of coffee was Log10 (BT) = at + b (h) Log10 (R² = 0.9955). For shade trees was Log10 (BT) = at + b Log10 (dap), (R² = 0.9987); where: Log10 = logarithm with base 10, BT = total aboveground biomass in kilograms, d = diameter (cm), h = height (m). The model parameters to be estimated are a and b. The major source that contributed to carbon storage in the study were the shade trees with 6275 TC ha-1 (87.94%), followed by the litter leaf with a carbon content of 0.6258 TC-1 (8.77%) and the coffee plants with a lower supply of 0.235 TC-1 (3.29%).

Keywords: carbon sequestered, coffee trees, agroforestey, models allometric. INTRODUCCIÓN

El moderno estilo de vida con el constante crecimiento económico, junto con la creciente industria y el aumento de la población, estarán siempre generando emisiones que causan el efecto invernadero y el cambio climático. La reducción de las emisiones puede y debe ser complementada por la “limpieza de la atmósfera”, como es por ejemplo la fijación intencional del dióxido de carbono (CO2) de la atmósfera a la biomasa aérea de las plantas

Para las regiones tropicales de alta producción primaria, ofrecen una posibilidad importante de establecer y manejar plantaciones forestales y plantaciones de cultivos agrícolas, para así vender el carbono fijado en la biomasa producida por los mismos (bonos de carbono).

Espinoza, (2005) sustenta que actualmente, debido a la deforestación de aproximadamente 17 millones de hectáreas por año, se emiten 1.8 giga toneladas (Gt) de

dióxido de carbono (CO2) hacia la atmósfera, el gas de efecto invernadero más importante. Esto representa el 25% del total de las emisiones de dióxido de carbono causadas por el hombre.

El concepto de fijación o secuestro de

carbono ha requerido una explicación más

amplia, ya que el mismo se visualiza o se

aplica con la idea de que este proceso

constituye un servicio ambiental. Se sustenta

que las emisiones de carbono hechas por la

actividad humana en su que hacer social y en

la industria, entran a la atmósfera como parte

de un macro proceso, y que alguna finca o

industria puede “secuestrar” dicho carbono

en troncos, hojas, ramas y en el suelo al

implementar proyectos donde se desarrollan

árboles, pastos y cultivos agrícolas, o bien, el

conjunto de los mismos: sistemas

agroforestales.

En nuestro país, no existen estudios relacionados con la captura de carbono en el sector agrícola, implementando el uso de modelos alométricos en relación a la biomasa área de las plantas. Sin embargo, al


desarrollar temas de investigación en ésta área, estaríamos ayudando a encontrar soluciones al problema de los gases de efecto invernadero, específicamente el dióxido de carbono. Países de Centroamérica como Costa Rica, ya ha utilizado estos modelos alométricos que expresan la biomasa de la planta, como una función de parámetros fácilmente medibles, tales como el diámetro del tallo, la altura total, o bien una combinación de estos.

La cuantificación de la biomasa en los diferentes usos de la tierra es un componente esencial para la estimación del almacenamiento y fijación de carbono. Actualmente, los proyectos de carbono, requieren de herramientas prácticas para la estimación de los contenidos de éste en sus diferentes componentes (biomasa aérea, biomasa en hojarasca y suelos). (CATIE, 2006).

Návar et al, (2001) desarrollo modelos alométricos que relacionan la biomasa o sus componentes (hojas, raíces, ramas y fuste), con las características dasométricas de los árboles. Algunos de estos modelos incluyeron la estimación de la biomasa o una función de la biomasa como el volumen, sus componentes o algunos parámetros relacionados, para establecer los flujos del gas CO2 entre la vegetación, el suelo y la atmósfera.

Los valores de la altura del pecho (dap) y altura (h) se deben convertir a biomasa con ayuda de modelos. Es preferible usar modelos de biomasa directamente que usar valores de la densidad de la madera para transformar valores de volumen de madera de fuste en biomasa, debido a que la densidad de la madera varía significativamente entre árboles de una especie (MacDiken, 1997)

Estudios del Instituto Nacional de Ecología de México, (2005) demuestran que “el cambio de uso de la tierra de las áreas de pastura hacia sistemas agroforestales contribuyen a mejorar la calidad de los suelos, a mejorar la productividad de las fincas y a beneficiar el medio ambiente”. Ejemplo de este último beneficio es la

captura y almacenamiento de carbono que puede lograrse en sistemas agroforestales.


El estudio se realizó en la Hacienda Bárbara, ubicada en la comunidad de Jaramillo Arriba, perteneciente al corregimiento de Jaramillo, Distrito de Boquete, Provincia de Chiriquí, República de Panamá. Geográficamente, el área de estudio se ubica entre las coordenadas 8° 47’ 35’’ de latitud Norte y 82° 24’ 07’’ de latitud Oeste. Los suelos son de textura areno – francoso, Orden Molisoles, son suelos profundos con alto contenido de materia orgánica, de color oscuro y con una alta fertilidad natural que los hace aptos para la actividad agrícola. Según la clasificación de Holdridge, el área de estudio pertenece a la zona de vida denominada: Bosque muy húmedo pre-montano.(Instituto Tommy Guardia, 1978).

El clima es templado muy húmedo de altura (Cfh). La temperatura media anual es 18.9 º C, siendo la máxima 26.2 ºC y la mínima 11.7 ºC. La precipitación promedio anual es de 2625.7 milímetros. (Contraloría General de la República, 2002-2003). Son frecuentes los árboles de los géneros Quercus, Alnus y Podocarpus y especies nativas del área como: cedro (Swiettenia sp.), sangrillo (Peterocarpus sp.), guayabo de montaña (Terminalia oblonga), poró (Erythrina berteroana), saíno (Caesalpinia eriostachys), sigua (Ocotea sp.), aguacatillo (Ocotea austinii), leucaena (Leucaena leucocephala), guayaba (Psidium gajava).

El manejo de la finca se caracteriza por cultivos de café con sombra orgánico, debidamente certificados, de diversas variedades tales como Bourbón, Catuaí, Typica (Arábigo o Criollo), y Geisha. La altura sobre el nivel del mar es de aproximadamente 1,500 metros.

La metodología utilizada en esta

investigación se basa en la estimación de la

biomasa del árbol a partir de modelos

alométricos, como una función de parámetros


fácilmente medibles, tales como el diámetro

del tallo a la altura del pecho (dap), altura

total (h) o el área basal del tallo (AB; πdap²/4)

o bien una combinación de estos. (Suárez et

al, 2004).

Para estimar la biomasa aérea total del

cultivo, árboles de sombra y la hojarasca, se

establecieron en total tres parcelas de

muestreo, de forma cuadrada, con un área

de 100 m2 (10 m x 10 m) cada una. Éstas se

encontraban ubicadas sobre el área de café

asociado con los árboles de sombra. El

criterio para ubicar las parcelas de muestreo

se basó en seleccionar un área uniforme con

una variedad de café específica. En cada

parcela, se muestrearon tres plantas de café

para un total de nueve plantas,

posteriormente cada componente (hojas,

ramas y tronco) se dividió y se peso en

campo; la hojarasca producida por la

deposición de las hojas del cultivo de café y

las hojas de los árboles de sombra, fue

muestreada al azar con dos repeticiones por

parcela.

Se incluyeron plantas de café y árboles de

sombra mayor a 2.5 centímetros de diámetro.

Se les midió la altura total (h) y el diámetro

del tronco a quince centímetros del suelo

(d15). De cada planta de café se tomó

aproximadamente de 200 a 500 gramos de

hojas, ramas y tronco; todas las muestras se

secaron al horno a 65 ºC por 72 horas para

determinar la materia seca (%MS) y calcular

la biomasa seca por componente.

Para los árboles de sombra, se realizó un

inventario de las especies existentes. Se

seleccionaron tres individuos, de las cuatro

especies más representativas: Mangle de

montaña (Gordonia fruticosa), Amarillito

(Lafoensia punicifolia), Canillo (Miconia

argentea) y Guayaba (Psidium guajava) para

un total de 12 individuos, distribuidos en

diferentes clases diamétricas. De igual

manera, se les midió el diámetro a la altura

del pecho (dap) y la altura (h) Se cortaron y

pesaron por separado los componentes

hojas, ramas y fuste, según la metodología

referida por Suárez, et al (2004). Luego se

procedió a tomar muestra de 500 gramos de

cada componente por árbol; se secaron al

horno a 65 ºC por 72 horas para determinar

el porcentaje de la materia seca producida,

para posteriormente calcular la biomasa seca

por componente y biomasa seca total (BT).

Para estimar la hojarasca o el mantillo,

dentro de las parcelas de 100 m2 se utilizó un

marco de metal de 0.25 m2 (0.5 m x 0.5 m), el

cual fue lanzado dos veces al azar en cada

parcela de muestreo, para un total de seis

muestras.

Para estimar el contenido de carbono en Tha-

1, se utilizo la fórmula:

Contenido de Carbono Tha-1

= materia

seca (MS%) x 0.5*

* Factor establecido por el Laboratorio de

Productos Forestales del Departamento de

Agricultura de los Estados Unidos (USDA,

1993).

Con las variables dasométricas diámetro y

altura total, junto con la información de

porcentaje de materia seca (%MS) por cada

individuo se procedió a realizar el ajuste de

las ecuaciones alométricas para las plantas

de café y los árboles de sombra, con el

objetivo de emplear el modelo más

predecible que estime la BT en función del

dap y/o la altura.

El modelo utilizado para generar las

ecuaciones alométricas, es el que proviene

de la función de crecimiento alométrico y que

expresado en su forma exponencial es:

Y = aXb

Donde:

Y = biomasa en toneladas

X = diámetro en centímetros (cm)

a, b = parámetros a estimar

En su forma lineal la función se expresa de la

siguiente manera:

Log10 (Y) = Log10 (a) + b Log10 (X)

La ecuación que se ajusta será la expresión

lineal, de tal forma que es necesario obtener

el logaritmo de base diez (Log10) tanto de la

variable dependiente (biomasa), como de las

variables independientes (diámetro y altura).


De esta forma, al hacer el ajuste de este

modelo quedan expresadas las siguientes

ecuaciones:

Ecuación Modelo

1 Log10 (BT) = a + b Log10 (d)

2 Log10 (BT) = a + b Log10 (h)

3 Log10 (BT) = a + b Log10 (d15) + c Log10 (h)

Donde:

Log10 = logaritmo con base 10

h = altura (m)

BT = Biomasa aérea total en toneladas

a, b = parámetros del modelo a estimar

d = diámetro (cm)

c = biomasa área total estimada

Parámetros evaluados:

Biomasa por componente

Diámetro a la altura del pecho: (DAP)

Biomasa aérea total

Diámetro a 15 centímetros del suelo (d15)

Porcentaje de materia seca

Altura total (h)


Biomasa aérea estimada (BT) en plantas

de café (Coffea arabica)

Las plantas de café seleccionadas al azar

dentro de las tres parcelas de medición,

registraron rangos de altura entre 1.23 y 2.19

metros, con un promedio de 1.65 metros;

para la variable diámetro (d15) los valores

fueron de 3.0 y 5.2 centímetros, con un

promedio de 4.0 centímetros. En la biomasa

seca de las plantas de café, se registraron

promedios de 471.85 gramos; 377.96 gramos

y 342.68 gramos para los componentes

hojas, ramas y tronco respectivamente. La

biomasa seca aérea total de las plantas de

café, registro un promedio de 1,192.5

gramos. Estos valores obtenidos se

asemejan a los investigados por Suárez et al,

(2004) el cual registro valores en plantas de

café, entre 0.3 y 3.3 metros de altura con un

promedio de 1.6 metros; para la variable

diámetro (d15) 0.3 y 7.40 centímetros con un

promedio de 3.0 centímetros. Las hojas,

ramas y tronco de las plantas de café

representan el 39.56, 31.70 y 28.74 %

respectivamente; siendo las hojas las que

contribuyen el mayor porcentaje de la

biomasa seca.

El modelo alométrico utilizado para estimar la

biomasa aérea total de las plantas de café,

en función del d15 y/o la altura (h), es el que

se muestra a continuación:

Ecuación Modelo Parámetros

a b

1 Log10 (BT) = a + b Log10 (dap) 0.01 0.41

2 Log10 (BT) = a + b Log10 (h) 0.01 0.41

Biomasa aérea real (BR) en plantas de café

(Coffea arabica)

El modelo alométrico utilizado para calcular

la biomasa aérea total real (BR) en plantas de

café (Coffea arabica) empleado las variables:

diámetro, altura total y biomasa real, es el

siguiente:


a b

3 Log10 (BT) = a + b Log10 (d15) + c Log10 (h) 0.01 0.41

La biomasa total real de mayor valor

registrada fue de 0.94 kilogramos, con

valores de 1.88 kilogramos de biomasa real,

5.2 centímetros de diámetro y 2.19 metros de

altura; muy seguido se registro una biomasa

total real de 0.70 kilogramos, a partir de

valores de 1.68 kilogramos de biomasa real,

4.7 centímetros de diámetro y 1.77


centímetros de diámetro. Se puede observar

que existe un efecto directo de los valores de

biomasa real, diámetro y altura, sobre la

biomasa total estimada.

Sin embargo, se registraron otros valores

como 0.66 y 0.57 kilogramos de biomasa

total real, presentando el primero una

biomasa real de 1.46 kilogramos y una altura

de 1.83 metros; a comparación del segundo,

que mostró una menor biomasa real, 0.96

kilogramos y una altura de 2.03 metros. En

este caso las variables altura y biomasa real

incidieron en estos resultados, notándose de

esta manera, que el incremento o el

descenso de los valores en las variables

pueden tener significancia en la obtención de

los resultados.

Suárez et al. (2004) afirma que en el cultivo

de café es importante considerar el

tratamiento de poda que reciben las plantas

de café, como parte del manejo cultural de la

plantación. Este manejo influye en el

aumento de la variabilidad de los datos y los

ajustes de los modelos, especialmente para

plantas de mayor d15 (mayor biomasa) y

mayor altura. En el estudio realizado por este

autor, las plantas sin poda (sin recepa)

representaron el 81% de la muestra total, y

las podadas (con recepa) contribuyeron con

el 31% de la biomasa total.

Se puede simplificar, que de las tres

ecuaciones utilizadas para estimar biomasa

en plantas de café, la ecuación 2 [Log10 (BT)

= a + b Log10 (h)], con transformación

logarítmica de su variable altura (h), es la que

mejor se ajusta a la BT de las plantas de café

muestreadas, con el valor más alto de R² de

0.9955.

Biomasa en árboles de sombra

Para obtener la biomasa en árboles de

sombra, se realizó un muestro en el lote

número cinco (Sendero Los Lirios), para

identificar las especies de sombra más

abundantes. Se encontraron 12 especies

arbóreas en el estrato sombra, de las cuales

cuatro especies fueron las dominantes:

Mangle de montaña (Gordonia fruticosa),

Amarillito (Lafoensia punicifolia), Canillo

(Miconia argentea) y Guayaba (Psidium

guajava). Los árboles seleccionados

registraron valores promedios de 4.7 metros

de altura y 10.36 centímetros de diámetro. La

biomasa en hojas, ramas y tronco de los

árboles de sombra, registraron valores

promedios de 2,282.22; 1,866.08 y 8,024.20

gramos respectivamente y la biomasa aérea

total promedio de éstos árboles fue de

12,197.50 gramos.

Las hojas, ramas y fustes de los árboles de

sombra representaron el 18.71, 15.30 y 65.79

% respectivamente; siendo los fustes los que

contribuyen el mayor porcentaje de la

biomasa. Muy relacionado a este resultado

Suárez et al, (2004) en su estudio, determino

que la biomasa de los fustes contribuyó en

un 52% de aporte a la biomasa total de los

árboles, seguido de las ramas con un 33% y

por último las hojas que representaron 8%.

El modelo alométrico para estimar la biomasa

aérea total de los árboles de sombra, en

función del d15 y/o la altura (h), es el que se

muestra a continuación:


a b

1 Log10 (BT) = a + b Log10 (dap) 0.04 0.55

2 Log10 (BT) = a + b Log10 (h) 0.04 0.55

La biomasa aérea total estimada (kg) con

valores de diámetro y altura, en árboles de

sombra, registro para la clase diamétrica 15.6

centímetros una BT estimada de 0.70

kilogramos; para la variable altura el valor fue

de 8.1 metros con una BT estimada de 0.54

kilogramos. En este caso se puede decir que

árboles con mayor diámetro tienden a

producir una mayor biomasa total, en relación

con la altura. Esto es corroborado por Suárez


et al, (2004), quien encontró una alta relación

entre la BT estimada y el dap, similar a otros

estudios realizado por Saldarriaga et al.

(1994). El hecho de que la altura no explique

la variabilidad de la BT en árboles podría

deberse a la arquitectura de copas y la edad

de los árboles.

El modelo alométrico que se utilizó para

estimar la biomasa área total real (BR) en

árboles de sombra de acuerdo a variables:

diámetro, altura total y biomasa aérea real es

el siguiente:


a b

3 Log10 (BT) = a + b Log10 (d15) + c Log10 (h) 0.04 0.55

En el cuadro 1 se presentan los resultados

de la biomasa aérea total real (kg) a partir de

la ecuación 3, con valores de dap, altura y

biomasa real en árboles de sombra. Al

observar estos resultados, se puede

considerar que de las especies

seleccionadas, la clase diamétrica de 10.6

con una altura de 8.1 metros, registró 31.29

kilogramos de biomasa total real; y la clase

diamétrica de 15.0 con una altura de 7.8

metros, registró 28.13 kilogramos de biomasa

total real. En este mismo sentido se puede

observar que los mayores valores en

producción de biomasa se registran con

medidas diamétricas comprendidas entre dap

de 10 a 15 centímetros y alturas entre 5.0 a

8.0 metros, esto para árboles de sombra.

Al comparar las tres ecuaciones con

diferentes variables para estimar biomasa en

árboles de sombra, se resume que la

ecuación 1 [Log10 (BT) = a + b Log10 (dap)],

con transformación logarítmica de su variable

dap, es la que mejor se ajusta a la BT de los

árboles de sombra muestreadas, con el valor

más alto de R² que es de 0.9987.

Cuadro 1. BIOMASA AÉREA TOTAL ESTIMADA (KG)

POR ÁRBOL, CON VALORES DE DAP,

ALTURA Y BIOMASA REAL EN ÁRBOLES

DE SOMBRA. BOQUETE, CHIRIQUÍ.

Nº

Árbol

Biomasa real (kg)

Dap

(cm)

Altura

(m)

Biomasa estimada

(kg)

1 10,34 5,0 6,8 9.03 2 33,78 10,6 8,1 31.29 3 30,76 15,0 7,8 28.13 4 3,31 5,3 4,0 2.43 5 6,66 10,3 4,75 5.10 6 10,81 15,5 8,0 10.45

7 3,25 5,6 3,5 2.22 8 6,67 10,2 4,6 5.02

9 9,48 15,1 7,0 8.70

10 6,27 5,7 3,8 4.09 11 10,75 10,5 5,55 8.60 12 13,95 15,6 5,0 10.44

En el estudio realizado por Suárez et al.

(2004), la ecuación [Log10 (BT) = a + b Log10

(d15) + c Log10 (h)] fue la de mejor ajuste, con

el R² más alto, lo cual indica que la diferencia

entre los valores observados de la biomasa y

los estimados por el modelo es menor en

comparación con la ecuación Log10 (BT) = a +

b Log10 (dap) y el resto de los modelos.

La figura 1 muestra la relación entre la

biomasa aérea total estimada versus la

biomasa aérea total real de las cuatros

principales especies arbóreas de sombra.

Fig 1. Relación entre biomasa aérea total .timada – biomasa aérea total real de cuatro especies arbóreas de sombra, Lote Nº 5 Senderos Boquete, Chiriquí.

Biomasa en Hojarasca

El muestreo para hojarasca arrojó un valor de

1251.6 kilogramos de materia seca por


hectárea; este muestreo de hojarasca

corresponde al aporte de todo el sistema

(café y árboles de sombra).

Estimación de la cantidad de carbono total

capturado o secuestrado

Los resultados encontrados, en el sistema

agroforestal de café con sombra ó arbolado,

indican una mayor contribución en cuanto a

la captura o secuestro de carbono de 6.275

TCha-1

en los árboles de sombra en primer

orden, seguido por la hojarasca y por último

el aporte del cultivo de café. Estos

resultados concuerdan con Etchevers et al.

(2001), el cual encontró que los componentes

aéreos de los sistemas de vegetación natural

(bosques) y de los agrícolas permanentes

(café), fue de 2.5 a 5.0 TCha-1

.

Lapeyre et al. (2004), afirma que los sistemas

agroforestales secuestran entre 19 a 47

toneladas de carbono por hectárea,

dependiendo de la cantidad de especies

forestales, tipo de cultivo, edad y tipo de

suelo y recuperan el potencial de captura en

forma productiva. Los sistemas agrícolas

capturaron poco carbono (5 toneladas de

carbono por hectárea), además generan

fugas de gases efecto invernadero (GEI)

cuando se usan agroquímicos y quema de

rastrojos, entre otros.

El contenido de carbono capturado o

secuestrado de todas las fuentes medidas,

biomasa arriba del suelo (plantas de café,

árboles de sombra y hojarasca), se muestra

en la figura 2.. Es importante notar que la

fuente de mayor importancia como

contribuyente al carbono secuestrado son los

árboles de sombra con 6.275 TCha-1

,

aportando el 87.94%; seguidamente de la

hojarasca con 0.6258 TCha-1

, aportando el

8.77 %; y las plantas de café con un menor

aporte de 0.235 TCha-1

, aportando 3.29 %.

La obtención de estos valores en los

resultados pueden darse, por factores como

la cantidad ó número de muestras tomadas

en campo, la edad de los árboles, la edad de

la plantación de café, la descomposición de

la hojarasca, entre otros.

Fig. 2. Contenido de carbono capturado o

secuestrado en todas las fuentes medidas,

biomasa arriba del suelo. Hacienda

Bárbara, Boquete, Chiriquí.

Al comparar resultados obtenidos del

secuestro de carbono, con estudios previos

en SAF realizados en el trópico podemos

señalar, el estudio realizado por Callo-

Concha et al. (2001), en SAF de café con

sombra que aportó 23.44 TCha-1

y 0.88

TCha-1

en hojarasca. . El Instituto Nacional

de Ecología de México (2005), reportó la

captura unitaria de carbono para café bajo

sombra con Inga sp. de 43 a 68 TCha-1

. Soto-

Pinto et al. (2005), en su experiencia

agroforestal de café con árboles de sombra

en tres niveles de producción encontró 2.11,

2.76 y 3.14 TCha-1

en el sistema.

CONCLUSIONES

De acuerdo con los resultados obtenidos

en esta investigación, se rechaza la

hipótesis verdadera que indica Ha = El

café es un cultivo que contribuye al

secuestro de carbono y se acepta la

hipótesis nula Ho = El cultivo de café no

juega un papel preponderante en el

secuestro de carbono; ya que al

cuantificar el carbono almacenado se

encontró que los árboles de sombra

contribuyen significativamente en

relación con las plantas de café y

hojarasca.


El modelo alométrico dos [Log10 (BT) = a

+ b Log10 (h)], con transformación

logarítmica de su variable altura (h), es la

que mejor se ajustó a la biomasa total

estimada (BT) de las plantas de café

muestreadas, presentando un alto valor

de su R² de 0.9955.

El modelo alométrico uno [Log10 (BT) = a

+ b Log10 (dap)], con transformación

logarítmica de su variable dap, es la que

mejor se ajustó a la biomasa total

estimada (BT) de los árboles de sombra

muestreados, presentando un alto valor

de su R² de 0.9987.

Al comparar los valores de la biomasa

real con los valores de biomasa

estimada, en árboles de sombra, siendo

introducidas las variables dap, h y BT

real, en la ecuación tres [Log10 (BT) = a +

b Log10 (d15) + c Log10 (h)] los resultados

nos indicaron que la mayor parte de los

valores estimados están muy cerca del

valor real.

La hojarasca para este sistema

agroforestal de café arbolado contribuye

en secuestro de carbono en 0.6258

TCha-1

. Los árboles de sombra tiene una

mayor contribución en cuanto a la

captura o secuestro de carbono de 6.275

TCha-1

. La fuente de mayor importancia

como contribuyente al carbono

secuestrado o almacenado en el estudio,

fueron los árboles de sombra con 87.94

%, seguidamente de la hojarasca con

8.77 % y las plantas de café con un

menor aporte de 3.29 %.

LITERATURA CITADA

CALLO-CONCHA, D.; KRISHNAMURTHY, L.;

ALEGRE, J. 2001. Cuantificación del Carbono

Secuestrado por algunos SAF’s y Testigos, en tres

pisos ecológicos de la Amazonia del Perú.

Simposio Internacional Medición y Monitoreo de la

Captura de Carbono en Ecosistemas Forestales.

(en línea) Valdivia, Chile. Consultado el 17 de

febrero de 2007. Disponible en

http://www.uach.cl/procarbono/simposio/trabajos/5

3%20-%20Callo-Concha.PDF

CATIE. (Centro Agronómico Tropical de

Investigación y Enseñanza,CR). 2006.

Herramientas para el Monitoreo del Secuestro de

Carbono en Sistemas de uso de la Tierra. (en

línea). Turrialba, Costa Rica. Consultado el 27 de

octubre de 2006. Disponible en: www.catie.ac.cr.

CONTRALORÍA GENERAL DE LA REPÚBLICA. 2002-

2003. Estadística y Censo. Estadística Panameña.

Situación Física - Meteorología. 57 p.

ESPINOZA, Y. 2005. Secuestro de Carbono en el Suelo.

(en línea). Revista Digital CENIAP HOY Número 7

enero-abril 2005. Maracay, Aragua, Venezuela.

Consultado el 27 de octubre de 2006. Disponible

en

www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n7/arti/espi

noza_y/arti/espinoza_y.htm.

ETCHEVERS, J.; ACOSTA, M.; MONREAL, C.;

QUEDNOW, K.; JIMÉNEZ, L. 2001. Los Stocks de

carbono en diferentes compartimientos de la parte

aérea y subterránea en sistemas forestales y

agrícolas de laderas en México: Simposio

Internacional Medición y Monitoreo de la Captura

de Carbono en Ecosistemas Forestales. (en línea)

Valdivia, Chile. 19 p. Consultado el 10 de marzo

de 2007. Disponible en

http://www.uach.cl/procarbono/simposio/trabajos/.

INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGÍA DE MÉXICO.

2005. La Convención Marco de las Naciones

Unidas sobre Cambio Climático. (en línea).

Coyoacán, México D.F. Consultado el 26 de

octubre de 2006. Disponible en:

http://www.ine.gob.mx/dgicurg/cclimatico/cmnucc.h

tml.

INSTITUTO NACIONAL GEOGRÁFICO TOMMY

GUARDIA. 1978. Atlas de la República de

Panamá. 3 ed. Panamá, República de Panamá.

222 p.

LAPEYRE, T.; ALEGRE, J.; ARÉVALOS, L. 2004.

Determinación de las reservas de carbono de la

biomasa aérea, en diferentes sistemas de uso de

la tierra en San Martín, Perú. (en línea). Ecología

aplicada. Vol 3. Consultado el 17 de febrero de

2007. Disponible en

http://www.uach.cl/procarbono/simposio/trabajos/53%20-%20Callo-Concha.PDF

http://www.uach.cl/procarbono/simposio/trabajos/53%20-%20Callo-Concha.PDF

http://www.catie.ac.cr/

http://www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n7/arti/espinoza_y/arti/espinoza_y.htm

http://www.ceniap.gov.ve/ceniaphoy/articulos/n7/arti/espinoza_y/arti/espinoza_y.htm

http://www.uach.cl/procarbono/simposio/trabajos/


http://www.lamolina.edu.pe/ECOLAPL/Articulo6vol

3.pdf

MACDIKEN, K. 1997. A Guide to Monitoring Carbon

Storage in Forestry and Agroforestry Projects. (en

línea) Winrock International, 1611 N. Kent St.,

Suite 600, Arlington, VA 22209, USA. 87 p.

Consultado el 26 de octubre de 2006. Disponible

en

www.virtualcentre.org/es/ele/conferencia3/artículo5

.htm

NÁVAR, J., GONZÁLEZ, N., GRACIANO, J. 2001.

Ecuaciones para estimar componentes de

Biomasa en Plantaciones Forestales: Simposio



Valdivia, Chile. 12 p. Consultado el 27 de enero


http://www.uach.cl/simposiocarbono/Programa%20

.htm.

SALDARRIAGA, J.G. 1994. Sesgos en modelos log-

normales alométricos y linealizados utilizados para

la estimación de la biomasa: Simposio



Valdivia, Chile. 20 p. Consultado el 10 de marzo


www.uach.cl/procarbono/simposio-trabajos.

SUÁREZ, D.; SEGURA, M.; KANNINEN, M. 2004.

Estimación de la biomasa aérea total en árboles de

sombra y plantas de café en sistemas

agroforestales en Matagalpa, Nicaragua, usando

modelos alométricos. Presentado en: Revista

Agroforestería de las Américas Nº 41-42 2004.

(CATIE. Centro Agronómico Tropical de

Investigación y Enseñanza. Turrialba, Costa Rica.)

112 - 118 p.

http://www.lamolina.edu.pe/ECOLAPL/Articulo6vol3.pdf

http://www.lamolina.edu.pe/ECOLAPL/Articulo6vol3.pdf

http://www.virtualcentre.org/es/ele/conferencia3/art�culo5.htm

http://www.virtualcentre.org/es/ele/conferencia3/art�culo5.htm

http://www.uach.cl/simposiocarbono/Programa%20.htm

http://www.uach.cl/simposiocarbono/Programa%20.htm

http://www.uach.cl/procarbono/simposio-trabajos


UTILIZACIÓN DE LOMBRICOMPUESTO EN LA REHABILITACIÓN DE SUELOS DEGRADADOS PARA USO AGRÍCOLA

Felícita González

1

RESUMEN

Con el objeto de evaluar cinco niveles de lombricompuesto, en la rehabilitación de suelos degradados, se efectuó un ensayo comparativo en la Centro de Enseñanza e Investigaciones Agropecuarias de Chiriquí (CEIACHI). Se dispuso de un diseño experimental de bloques completos al azar con tres repeticiones los tratamientos empleados fueron de 0, 2.5, 5.0, 7.5, y 10.0 Tha-1 de lombricompuesto. La fuente de lombricompuesto fue producto de la crianza de la lombriz roja californiana (Eisenia foetida). Se realizaron muestreos de suelo antes y después del ensayo, se evaluaron parámetros físico y químicos del suelo. La propiedad física de suelo densidad aparente registro cambios en los tres años de estudio, con una disminución de 0.50 g/cc entre el primer y segundo año de estudio; y para el tercer año se registró un valor de 0.58 g/cc. El aporte de 7.5 t ha-1 de lombricompuesto, disminuyó la densidad aparente y fomentó los rendimientos del cultivo, con un incremento de 898.8 kg ha-1 con respecto al año uno, y 948.71 kg ha-1 entre el año dos y tres. La aplicación de lombricompuesto estimuló la creación de cobertura mejorando las características ambientales del sitio. La utilización de esta enmienda orgánica es una alternativa a mediano y largo plazo en la rehabilitación de suelos agrícolas degradados. PALABRAS CLAVES: Lombricompuesto, lombriz roja californiana, degradación

acelerada, mineralización de nutrientes

ABSTRACT

In order to evaluate five levels of composting in the rehabilitation of degraded soils was made a comparative testin the Center for Teaching and Agricultural Research of Chiriqui (CEIACHI). The experimental design used was a complete randomize blocks with three replications. The treatments were 0, 2.5, 5.0, 7.5, and 10.0 tons ha-1 of composting. Composting source was a product of the raising the Californian Red worm (Eisenia foetida). Sampling of soil before and after the test was made. It was evaluated the soil chemical and physical parameters. The bulk density a physical property of the soil changes in the three years of study. The bulk density decrease 0.50 g/cc between the first and second year of study and for the third year was registered a value of 0.58 g/cc. The contribution of 7.5 t ha-1 of composting, decreased bulk density and enhance the yields of the crop with an increase of 898.8 kg ha-1 for year one and 948.71 kg ha-1 between year two and three. The application of composting stimulated the creation of coverage improving the environmental characteristics of the site. The use of this organic soil amendment is an alternative in the medium and long term in the rehabilitation of degraded agricultural soils. KEYWORDS: Composting, Californian Red worm, degraded soils, nutrient

mineralization, physical and chemical properties of soil.

1 M.Sc. Agroforestería. Profesora Investigadora. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Panamá.


INTRODUCCIÓN En regiones tropicales como nuestro país, la pérdida acelerada de la materia orgánica, por prácticas inadecuadas de uso de tierra, son causas de la degradación de suelos. Tradicionalmente, en el manejo agronómico de los cultivos básicos no se contempla la utilización de enmiendas y correctivos (químicos, orgánicos y/o biológicos) que permitan mejorar la calidad del suelo sobre todo en suelos de baja fertilidad; por el contrario los residuos de cosechas son extraídos fuera de los campos de cultivos dejando desprovisto de cubierta vegetal al suelo. Por consiguiente esto con lleva a una degradación acelerada y deterioro de este recurso, la degradación puede darse por sobre pastoreo, la quema inmoderada, tala de especies de leñosas; reflejándose y caracterizándose por la pérdida de materia orgánica, deterioro de la estructura de suelo, compactación y erosión acelerada. La pérdida de la materia orgánica implica la reducción de la fertilidad del suelo, mayor exposición del suelo e incremento de las temperaturas diurnas y nocturnas, al igual implica que al perderse la estructura aumente la compactación la capacidad de infiltración disminuya y decrezca la humedad del suelo. El reciente interés en mantener la calidad del suelo ha sido estimulado por un conocimiento renovado de la importancia de la condición del suelo para la sostenibilidad de los sistemas de producción agrícola y la calidad del medio ambiente. La materia orgánica es un componente importante de la calidad del suelo que determina muchas características como la mineralización de nutrientes, la estabilidad de los agregados, la captación favorable de agua y las propiedades de retención (Doran et al. ,1998). Amézquita, (1992); nos indica que la erosión es uno de los procesos de degradación física, que consiste en el desprendimiento y arrastre acelerado de partículas de suelo. Pudiendo ser hídrica o eólica, la primera es más frecuente en zonas húmedas y en terrenos con pendientes y la erosión eólica

causa mayores daños en regiones secas y sobre terrenos planos. Estudios realizados por INTA (2000), han demostrado que la utilización de los bioabonos, mejoran las condiciones químicas del suelo tanto en la retención de elementos como el potasio, calcio y magnesio; como también en el mantenimiento de la estructura del suelo. En Panamá el uso y producción de abonos orgánicos va tomando cada vez mayor impulso, es una forma de producción sostenible que minimiza el uso de insumos externos, como la clase y cantidad de fertilizantes y plaguicidas usados. El principal beneficio de la utilización de lombricompuesto radica en el aporte de una elevada flora bacteriana; Brown et al (1998), indica que la calidad de los residuos orgánicos y la actividad de las lombrices puede modificar los efectos del lombricompuesto sobre el suelo. Los abonos orgánicos se han usado desde tiempos remotos y su influencia sobre la fertilidad de los suelos ha demostrado, aunque su composición química, el aporte de nutrimentos a los cultivos y su efecto en el suelo varían según su procedencia, edad, manejo y contenido de humedad (Romero et al., 2000). En consideración a lo anterior, los objetivos de la investigación tuvieron como finalidad, Cuantificar los contenidos de nutrimentos disponibles en el suelo provenientes de la enmienda orgánica., al igual que evaluar el efecto de la enmienda orgánica (lombricompuesto), sobre las propiedades físicas y químicas en suelos ácidos. El presente escrito recoge los resultados finales de tres años de investigación de campo y laboratorio; con el propósito de contribuir con una agricultura más limpia. MATERIALES Y MÉTODOS El estudio se realizó en la Facultad de Ciencias Agropecuarias – Universidad de Panamá en la provincia de Chiriquí, ubicado

a 8 24´ de latitud norte, elevación de 25


msnm ,bajo condiciones de Bosque Húmedo Tropical Basal; el clima es isotérmico con una temperatura promedio anual de 27.0

o C y

una precipitación promedio de 2828.6 mm. Según Presa (1980), estos suelos corresponden al orden Ultisol, gran grupo Haplohumult, sub-grupo Plintic (USDA), son suelos de color rojo, ácidos, bien drenados con fertilidad natural baja. Se estableció un diseño experimental de bloques al azar con 32 plantas por tratamiento y tres repeticiones cada uno. Se evaluaron cinco dosis de enmienda orgánica (Lombricomuesto); la aplicación se realizo cuando el cultivo registró un 75% de germinación, colocándose a cada parcela el tratamiento correspondiente sin su incorporación directa. Para medir la efectividad de los tratamientos se utilizo maíz (Zea mays) variedad T-7428. Se realizaron tres muestreos de fertilidad de suelos, a 5.0 centímetros de profundidad. El primero antes de la aplicación de los tratamientos y siembra del cultivo, otro en el segundo año y el último al tercer año del estudio, el muestreo se realizo por tratamiento en forma de zig – zag, tomándose 5 sub-muestras para formar una muestra compuesta. La preparación de suelo fue semi – mecanizada en el primer año de establecimiento del ensayo, durante dos años posteriores no se utilizo maquinaria, todas las labores fueron de forma manual. Las evaluaciones del ensayo se basaron en muestreos de la biomasa aérea total a los 40 DDS, las propiedades físico – químicas de suelo se estimaron mediante análisis químico de laboratorio, y las pruebas físicas de suelo como lo son densidad aparente, se estimaron antes del establecimiento de las parcelas y posteriormente por dos años continuos. Tratamientos

T1 = Testigo - Control 0 t/ha (sin lombricompuesto).

T2 = Enmienda orgánica. 2.5 t/ha ó 3000g de lombricompuesto.




RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados de tres años de investigación de la aplicación del lombricompuesto, sobre suelos degradados se muestran a continuación. Efecto de los tratamientos sobre las propiedades físico - químicas de suelo.

Existe un efecto de los tratamientos sobre las propiedades químicas, en este sentido los cambios registrados en los tres años de estudio aunque no fueron significativos muestran incremento en algunas variables, correspondiendo así para el pH de suelo un ligero cambio, de valores de muy ácido a valores ácidos, siendo este de 0.4. La materia orgánica, potasio, magnesio, calcio y nitrógeno según los niveles críticos muestran promedios de altos a medios; estos incrementos se atribuyen a los tratamientos, y su efecto en el tiempo; concordando con investigación realizadas por Celadu (1992); quien observo aumentos en la materia orgánica en un 15% y en nitratos y fósforo, en tratamientos después de la siembra.

El aporte de enmiendas orgánicas al suelo puede ayudar a conservar y fomentar la estructura debido a que la materia orgánica es considerada como un agente activo que favorece la agregación a través de mecanismos físicos químicos.

Es muy importante cuando se utilizan abonos orgánicos considerar las fuentes utilizadas para la elaboración del lombricompuesto, ya que esto tendrá gran influencia sobre los resultados finales. Sin embargo se observan algunos valores altos en aquellos nutrimentos que pueden ser tóxicos al cultivo, por lo que sería oportuno en estos suelos ácidos realizar un encalado, y considerar este factor en investigaciones posteriores. Densidad aparente Para la medición de esta variable se procedió a realizar muestreos a las parcelas antes y después del ciclo de cultivo, obteniéndose


valores iniciales (año 2004) de 1.65 gramos por centímetros cúbicos (g/cc), en el segundo año el valor fue de 1.15 g/cc, fig.1. Para el año 2006 ultimo año del estudio, se realizo un muestreo por tratamiento y repetición, con el propósito de predecir con mayor exactitud cual tratamiento influía sobre esta variable física del suelo, encontrándose que el tratamiento cuatro correspondiente a 7.5 Tha

-

1, mostró un valor de 1.07 g/cc.

Estos valores mostraron cambios en los tres años de estudio, con una disminución de 0.50 g/cc entre el primer y segundo año de estudio; y para el tercer año se registro un valor de 0.58 g/cc; lo anterior es corroborado por Castellanos (1982) quien observó que el contenido de humedad aumenta debido a prácticas de aplicación de abonos orgánicos, ya que disminuye la densidad aparente; se incrementa la porosidad y se ,modifica la estructura al mejorar la formación de agregados, todo ello influye en un aumento en la retención de humedad.

Fig, 1. Valores de densidad aparente de

tres años de estudio.

En este mismo sentido Ruiz (1996), sugirió que una labor importante para mejorar las propiedades de suelos compactados es el aporte de materiales orgánicos; con esto se busca mejorar la estructura y hacer más eficiente los flujos internos. Al respecto Mora et al. (2001) señalaron que los aportes de materia orgánica a los suelos agrícolas permiten incrementar el carbono orgánico así como la biomasa microbiana, dando como resultado, a través del tiempo, una mejor fertilidad, agregación y estabilidad estructural. Podemos entonces asegurar que el lombricompuesto tiene un efecto benéfico a largo plazo sobre propiedades físicas de suelo. Efecto de los tratamientos sobre el

rendimiento del cultivo. La comparación de medias de los tratamientos para los tres años de cultivo son presentados en el cuadro 1. Al observar los promedios de rendimiento para el año 1, se encontró que no hubo diferencia significativa entre los tratamientos; sin embargo el tratamiento cuatro (Enmienda orgánica. 7.5 t ha

-1) fue el mejor.

En el año dos, muestra diferencia significativa para el tratamiento cuatro (Enmienda orgánica. 7.5 t ha

-1) superando a

los demás tratamientos, siendo el testigo (0 t/ha) el que mostró menor rendimiento.

Cuadro 1. VALORES DE RENDIMIENTO PARA TRES AÑOS DE CULTIVO (Zea mayz).

TRATAMIENTO RENDIMIENTO

AÑO 1. kg ha-1

AÑO 2. kg ha-

AÑO 3. kg ha-

1-Testigo (0 t/ha) 1049.4 a 1340.1 d 1615.87d

2-Enmienda orgánica. 2.5 t/ha

1049.4 a 1711.0 cd 2410.61c

3- Enmienda orgánica. 5.0 t/ha

1053.0a 1878.7 bc 2772.20b


1635.0 a 2533.8 a 3497.25a


1127.0 a 2180.2 a 3482.51a

(Valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente. Duncan 5%).


En este mismo sentido podemos observar para el año tres que los mejores tratamientos fueron el cuatro y cinco; al comparar el año uno en relación a los dos últimos años se evidencia el efecto de los tratamientos en el tiempo, resultados similares obtuvieron Muñoz et al (1990) y Ruiz (1996) quienes coincidieron en que la descomposición de la materia orgánica produce sustancias y aglutinantes microbianos que pueden ayudar a estabilizar la estructura de suelo, favoreciendo la porosidad. Nos indica Núñez y Bisbal (1999), que la compactación del suelo afecta el rendimiento de cultivos debido a que la dureza superficial

limita el crecimiento radicular en la fase del crecimiento. El mejor tratamiento en cuanto a rendimiento por época, fue el cuatro observándose un incremento de 898.8 kg ha

-1 con respecto al

año uno, y de 948.71 kg ha-1

, entre el año dos y tres. En lo referente a los tres años, es notable el incremento de los rendimientos del año 2, si lo comparamos con el año1, esto se puede apreciar en la figura 2; poniendo de manifiesto que los tratamientos (enmienda orgánica - lombricompuesto) tienen su efecto en el tiempo, contribuyendo al mejoramiento de las propiedades físico - químicas de suelo.

1-Testigo (0 t ha-1) 2-Enmienda orgánica. 2.5 t ha-1 3- Enmienda orgánica. 5.0 t ha-1

4- Enmienda orgánica. 7.5 t ha-1) 5- Enmienda orgánica. 10.0 t ha-1

Fig. Rendimiento de maíz Tocumen 7428.

Efecto del tiempo y tratamientos sobre los rendimientos.

El efecto del tiempo y tratamientos, sobre los rendimientos se pueden apreciar en el cuadro 2. Al observar el análisis estadístico, es evidente que para el año uno, el efecto de los tratamientos sobre los rendimientos no

fue significativo, sin embargo los rendimientos fueron mejores para el tratamientos cuatro. En el año dos se observan valores significativos para el tratamiento dos contra el tratamiento uno, al compararlo contra el tratamiento tres año uno y tratamiento cuatro año uno. Si relacionamos el efecto del tiempo sobre los tratamientos se puede apreciar que el mejor


tratamiento fue el cuatro correspondiente a 7.5 t ha

-1 de lombricompuesto; de esta forma

se puede apreciar el efecto de la residualidad en el tiempo de los nutrimentos disponibles en el suelo. Coincidiendo con lo expuesto por Sánchez (1981), quien nos indica que los contenidos de materia orgánica en suelos tropicales es baja, debido a las altas temperaturas y rápidas tasas de

descomposición; por lo que hay que hacer esfuerzos para conservar la materia orgánica existente, lo cual se traduce en la productividad de los suelos tropicales. En este sentido nos indica que la tasa de conversión de materia orgánica fresca a carbono orgánico del suelo (humus) es del orden del 30 a 50% por año.

Cuadro 2. COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE PERSON (R) ENTRE TRATAMIENTOS Y TIEMPO (AÑO).

T1 A2

T1 A3

T2 A1

T2 A2 T2 A3 T3 A1 T3 A2 T3 A3 T4 A1 T4 A2 T4 A3 T5 A1 T5 A2 T5 A3

T1 A1

ns ns ns 0.0002

** 0.0001

** ns

0.0001 **

0.0001**

ns 0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001**

T1 A2

ns ns 0.0169

* 0.0027

** ns

0.0013 **

0.0001**

ns 0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001**

T1 A3

ns 0.0035

** 0.0023

** ns

0.0001 **

0.0001**

ns 0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001**

T2 A1

0.0002

** 0.0001

** ns

0.0001 **

0.0001**

ns 0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001**

T2 A2

ns 0.0002

** ns ns

0.0175*

0.0014**

0.0001**

0.0003**

0.0068**

0.0001**

T2 A3

0.0001

** 0.0001

** ns ns

0.0001**

0.0001**

0.0001 **

0.0017**

0.0001**

T3 A1

0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001**

ns 0.0001

** 0.0001

** T3 A2

ns 0.0013

** 0.0186

* 0.0024

** 0.0001

** ns

0.0028 **

T3 A3

0.0001

** 0.0096

** 0.0049

** 0.0001

** ns

0.0057 **

T4 A1

0.0001

** 0.0001

** ns

0.0001**

0.0001 **

T4 A2

ns 0.0001

** ns ns

T4 A3

0.0001

** ns ns

T5 A1

0.0001

** 0.0001

** T5 A2

ns

T5 A3

1-Testigo (0 t ha

-1) 4- Enmienda orgánica. 7.5 t ha

-1)

2-Enmienda orgánica. 2.5 t ha-1 5- Enmienda orgánica. 10.0 t ha

-1

3- Enmienda orgánica. 5.0 t ha-1

CONCLUSIONES

El mejor tratamiento en cuanto a rendimiento por época, fue el cuatro (7.5 t ha

-1 de lombricompuesto),

observándose un incremento de 898.8 kg ha

-1 con respecto al año uno, y de 948.71

kg ha-1

, entre el año dos y tres.

Los cambios registrados en los tres años de estudio aunque no fueron


significativos muestran incremento para la variable, pH de suelo.

La materia orgánica, potasio, magnesio, calcio y nitrógeno, muestran promedios de altos a medios; atribuyéndose a los tratamientos, y su efecto en el tiempo.

Para la densidad aparente, el tratamiento cuatro (7.5 Tha

-1) mostró un

valor de 1.07 g/cc. Los cambios en los tres años de estudio, fueron de 0.50 g/cc entre el primer y segundo año de estudio; y para el tercer año 0.58 g/cc.

LITERATURA CITADA

AMÉSQUITA, C.E. 1992. Procesos físicos de degradación de suelos en Colombia En memorias del Seminario: Manejo Integral de Suelos para una agricultura sostenida. S:C:C:S. , Palmira, agosto 26 al 28.

BROWN G. G., HENDRIX P. F., Y BEARE M. H. 1998.

Earthworms (Lumbricus Rebellus) and the fate of 15

N in surface-applied sorghum resides, Soil Biology & Biochemistry. Vol 30 Nº 13. p 1655-1661.

CASTELLANOS R, J.Z. 1982. La importancia de las

condiciones físicas del suelo y su mejoramiento mediante la aplicación de estiércoles. Seminarios Técnicos 7(8): 32. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales y Agropecuarias – Secretaria de Agricultura y Recursos Hidráulicos. Torreón,

CELADU. 1992. Temas de agricultura orgánica N°27.

Uruguay. DORAN, J.W., ELLIOTT, E. T., PAUSTIAN, K. 1998.

Soil microbial activity, nitrogen cycling, and long-term changes in organic carbon pools as related to

fallow tillage management, Soil & Tillage Research. 49, 3-18.

INTA.2000. Fertilizantes Órgano Minerales. Obtenido en

la red mundial el 15 de junio de 2003, Disponible en http://www.fertilizar.org.ar/index.htm

MORA, G,M., ORDAZ ChV., CASTELLANOS, JZ.,

AGUILAR, SA., GAVI, F, Y VOLKE., HV. 2001. Sistemas de labranza en algunas propiedades físicas en un vertisol, después de cuatro años de manejo. Terra 19:67-74.

MUÑOZ, VJ., TOVAR, SJL., Ortiz, RJZ, 1990. El uso de

estiércol como mejorador de algunas propiedades de suelos arcillosos de la comarca lagunera. Agrociencia ¡: 127-144.

NUÑEZ, UMC., de BISBAL., E. 1999. Efecto de la

compactación del suelo sobre algunos parámetros morfológicos del desarrollo radical del maíz. Agronomía Tropical. 49:93-106.

PRESA. (Proyectos, Estudios y Asesorias, S.A).

1980. Estudios agrològicos en las tierras patrimoniales de la Facultad de Ciencias Agropecuarias en la provincia de Chiriquì. Panamà. S.p.

REEVES, D. W. 1997. The role of soil organic matter in

maintaining soil quality in continuos cropping systems. Soil & Tillage Research. 43, 131-167.

ROMERO L., M DEL R, A. TRINIDAD S., R. GARCÍA

E.; R.FERRARA C. 2000. Producción de papa y biomasa microbiana en suelo con abonos orgánicos y minerales. Agrociencia 34: 261.269.

RUIZ, FJF. 1996. Los fertilizantes y la fertilización

orgánica bajo la óptica de un sistema de producción orgánico. En Zapata ARJ, Calderón AR (Eds.) Memoria del primer foro nacional sobre agricultura orgánica. UAM/CONARAO/INIFAP. Colima, México. Pp. 23-47.

SANCHEZ., P A. 1981. Suelos del trópico:

Características y manejo. Trad. Edilberto Camacho. San José, Costa Rica: IICA. 660p.

http://www.fertilizar.org.ar/index.htm


PRODUCCIÓN DE SEMILLAS DE Clitoria ternatea EN FUNCIÓN DE DISTANCIA DE SIEMBRA Y ÈPOCAS DE COSECHA

Edgar Alexis Polo L. 1.

RESUMEN Este experimento fue realizado en el Centro de Enseñanza e Investigación Agropecuaria de Tocumen (CEIAT) de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá, localizado a 9º 03´latitud norte y 79º 22longitud oeste y una altitud de 14 m.s.n.m. El experimento se condujo con la leguminosa Clitoria ternatea. El suelo del área experimental presento una textura franco arcillosa, pH de 5.9 y un contenido de materia orgánica de 2.0%. . La siembra fue en surcos distanciados (0.15, 0.30, 0.45 y 0.60 cm) a chorro continuo. El diseño experimental fue de bloques completos al azar en parcelas divididas con tres repeticiones. Los tratamientos fueron constituidos de cuatro espaciamientos entre líneas (15, 30, 45 y 60 cm) y ocho épocas de cosecha. La primera época de cosecha ocurrió cuando surgieron las primeras vainas maduras (coloración marrón). Posteriormente, se realizaron las cosechas con intervalos de siete días. La época de cosecha que resultó en mayor rendimiento de semillas, se situó entre los 14 y 16 días después del surgimiento de las vainas maduras. Las distancias de siembra entre líneas estudiadas no afecto el rendimiento de semilla de Clitoria ternatea. El aumento de las distancias de siembra resulto en incremento en el porcentaje de germinación, número de ramificaciones por plantas y la altura de inserción de las primeras vainas.

PALABRAS CLAVES: Clitoria ternatea, epoca de cosecha, germinación, distancia

de siembra, rendimiento.

ABSTRACT This experiment was conducted at the Center for Agricultural Research and Learning at Tocumen (CEIAT), School of Agricultural Sciences at the University of Panama, located at 9th and 79th 03'latitud 22longitud north west and an altitude of 14 meters The experiment was conducted with the legume Clitoria ternatea. The experimental area has a clay loam texture soil, pH of 5.9 and an organic matter content of 2.0%. . Planting was done in spaced rows of 0.15, 0.30, 0.45 and 0.60 cm in a continuous discharge in the soil. The experimental design was a randomized complete block split plot with three replications. Treatments were composed of four spacing among rows (15, 30, 45 and 60 cm) and eight harvests time. The first harvest time came when the first pods ripe (brown color). Subsequently, harvests were made at intervals of seven days. The harvest season that

resulted in higher seed yield, was between 14 and 16 days after emergence of mature pods. Planting distances among rows did not affect seed yield of Clitoria ternatea.

Increased plant spacing resulted in increased germination percentage, number of branches per plant and height of insertion of the first pod.

1 Ing. Agr. M.Sc. Pasturas. Instituto PROMEGA. Universidad de Panamá


KEYWORDS: Clitoria ternatea, harvest time, germination, planting distance,

performance.

INTRODUCCIÓN

La gran mayoría de la ganadería nacional se basa en la utilización de pastos nativos de baja productividad. La introducción de nuevas especies forrajeras es una alternativa para mejorar la calidad nutritiva de las pasturas para el ganado. Las leguminosas, debido a su alto contenido proteico y a su capacidad de fijar simbióticamente el nitrógeno atmosférico, pueden y deben ser usadas con el objetivo de mejorar la calidad de las gramíneas ya sea nativas como mejoradas, ya que estas plantas incrementan los rendimientos de Materia seca y el contenido proteico de la dieta animal (Monzote, Castillo, López y García, 1986). La Clitoria ternatea es una leguminosa forrajera originaria de Asia tropical. Esta planta se desarrolla en forma natural en África Tropical, Madagascar, Arabia, India, China, Indonesia, Islas del Pacífico Norte, Centro y Sudamérica, donde crecen además otras especies de esta planta forrajera. Es una leguminosa que se adapta muy bien a los climas cálidos, característicos de las regiones tropicales y subtropicales y se encuentra silvestre en pastizales y matorrales (Polo, 2004). Las leguminosas forrajeras tropicales presentan sin embargo problemas específicos relativos a la producción de semillas, como el extenso periodo de floración y la formación de las semillas, asociados a las maduraciones desuniformes y grandes pérdidas de semillas por la dehiscencia de las vainas, entre otros. El productor de semillas tiene que enfrentar muchos problemas y, generalmente, los más difíciles son los que surgen al momento de la cosecha, tal como sucede en los cultivos de consumo humano. Siempre es interesante resaltar que las operaciones de cosecha pueden representar hasta 50% del costo de producción (Toledo y Marcos Filho, 1977). Clitoria ternatea habito de crecimiento indeterminado y con gran dehiscencia de vainas maduras. El conocimiento de la maduración de semillas en especies

forrajeras es de suma importancia en la decisión del proceso de cosecha. El objetivo de este experimento fue el de obtener información básica del efecto de espaciamiento y épocas de cosecha de Clitoria ternatea sobre la producción de semillas de esta forrajera.

MATERIALES Y METODOS Este experimento fue realizado en el Centro de Enseñanza e Investigación Agropecuaria de Tocumen (CEIAT) de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá, localizado a 9º 03´latitud norte y 79º 22longitud oeste y una altitud de 14 m.s.n.m. El experimento se condujo con la leguminosa Clitoria ternatea. El suelo del área experimental presento una textura franco arcillosa, pH de 5.9 y un contenido de materia orgánica de 2.0%. El experimento se realizó en el periodo del 15 de mayo de 2006 al 30 de enero de 2008. El suelo fue preparado de forma convencional con arado y rastra. La siembra fue en surcos distanciados (0.15, 0.30, 0.45 y 0.60 cm) a chorro continuo. Al momento de la siembra se hizo una aplicación base de la formula completa 12-24-12 a razón de 2 qq/ha, a chorro continuo en cada surco. El diseño experimental fue de bloques completos al azar en parcelas divididas con tres repeticiones. Los tratamientos fueron constituidos de cuatro espaciamientos entre líneas (15, 30, 45 y 60 cm) y ocho épocas de cosecha. La primera época de cosecha ocurrió cuando surgieron las primeras vainas maduras (coloración marrón). Posteriormente, se realizaron las cosechas con intervalos de siete días. Las variables fueron sometidas a análisis de varianza y el efecto de distancias de siembra entre líneas y épocas de cosecha fueron evaluados por regresión lineal.



Número de ramificaciones por planta

Para el parámetro número de ramificaciones por planta, el análisis de variación reveló significancia para las distancias de siembra y épocas de cosecha (Tabla 1) (P<0.01).

Tabla 1. Análisis de varianza para el número de ramificaciones de Clitoria ternatea.

Causas de la variación GL QM Valor F Prob. > F

Bloques 2 Distancias de siembra 3 0,8033052 55,3631 0,00037 Residuo(a) 6 0,0145098

Parcelas 11 Épocas 7 0,1397846 4,2542 0,00105 Distancias x Épocas 21 0,0159112 1,0966 0,49365 Residuo(b) 56 0,0328582

Total 95

Media General= 1,64

Coeficiente de Variación (A) = 2,60% Coeficiente de Variación (B) = 11,05% Para el efecto de distancias de siembra entre líneas se observo un ajuste de la regresión lineal (Tabla 2 y Figura 1).

Tabla 2 - Regresión polinomial para el efecto de distancias sobre el número de ramificaciones de Clitoria ternatea.

Causas de Variación GL QM Valor F Prob. > F R2

Regresión Lineal 1 2,2598898 155,74956 0,00013 0,94 Regresión Cuadrática 1 0,1386820 9,55784 0,02103 0,99 Regresión Cúbica 1 0,0113437 0,78180 0,58584 - Residuo 6 0,0145098

Ecuación Polinomial: Ŷ0,01 + 1,30 = ن Xن (r2 = 0,94)

La mayor distancia de siembra resulto en menor número de plantas por área lo que posibilito mayor penetración de luminosidad y reducción en la competencia por nutrientes y agua, favoreciendo a las ramificaciones de las plantas. Resultados semejantes fueron encontrados por Fontana (1976), trabajando

con distancias de siembra diferentes en cultivares de soya.

Ŷ0,0091 + 1,2971 = ن Xن ( r2 = 0,94)

Medias Observadas


Fig. 1. Relación entre distancias de siembra y número de ramificaciones de Clitoria ternatea

Altura de inserción de las primeras vainas Para la altura de inserción de las primeras vainas, el análisis de varianza (Tabla 3)

revelo significancia estadística para los factores distancia de siembra entre líneas (P<0.05) y épocas de cosecha (P<0.01).

Tabla 3. Análisis de varianza para la altura de inserción de las primeras vainas (cm.) de Clitoria ternatea

Causas de la Variación GL QM Valor F Prob. > F

Bloques 2 Distancias de siembra 3 113,3437500 5,7118 0,03466 Residuo(a) 6 19,8437500 Parcelas 11 Épocas 7 32,1175595 3,2588 0,00589 Distancias x Épocas 21 12,5421627 0,6320 0,79883 Residuo (b) 56 9,8556548

Total 95

Media General = 37,70 Coeficiente de Variación (A) = 4,18% Coeficiente de Variación (B) = 8,33%

El análisis de regresión polinomial para los niveles de distancias de siembra (Tabla 4 y

Figura 2) indico significancia (P<0.05) para el efecto lineal.

Tabla 4. Regresión polinomial para el efecto de distancias sobre la altura de inserción de las primeras vainas de

Clitoria ternatea.

Causas de la Variación GL QM Valor F Prob. > F R2

Regresión Lineal 1 214,6687500 10,81795 0,01653 0,63 Regresión Cuadrática 1 52,5104167 2,64619 0,15324 - Regresión Cúbica 1 72,8520833 3,67129 0,10211 - Residuo 6 19,8437500

Ecuación Polinomial: Ŷ0,0892 + 34,3542 = ن Xن (r2 = 0,63)


A medida que aumentan las distancias de siembra entre líneas ocurrió reducción de número de plantas por área lo que resulto e mayor altura de inserción de las vainas. La altura de inserción de las primeras vainas vario de 35.69 cm para la distancia de siembra de 15 cm entre líneas, hasta 39.70 cm para la mayor distancia de siembra (60 cm). el comportamiento de Clitoria ternatea con relación a la altura de inserción de las primeras vainas difirió de aquellos observado con soja (Val et al., 1971) y con frijol (Schuch et al., 1993), en donde la altura de inserción de las primeras vainas disminuyó con el aumento de las distancias entre hileras. La diferencia en el comportamiento puede estar

relacionada con las características distintas de las plantas (morfológicas y fisiológicas) así como a las distancias de siembra y densidades de plantas distintos utilizados en los trabajos.

La altura de inserción de las primeras vainas reviste interés cuando se considera la posibilidad de cosecha mecanizada del cultivo, esto porque el aumento en las distancias de siembra podrá elevar la inserción de las vainas facilitando el trabajo de las maquinas cosechadoras. Ŷ0,0892 + 34,3542 = ن Xن (r

2 = 0,63)

Medias Observadas

Fig. 2. Relación entre las distancias de siembra y la altura de inserción de las primeras vainas (cm) de Clitoria

ternatea

Número de semillas por vainas En cuanto al número de semillas por planta el análisis de varianza mostró significancia

(P<0.01) para el efecto de épocas de cosecha (Tabla 5).

Tabla 5. Análisis de varianza para el número de semillas por vainas de Clitoria ternatea


Bloques 2 Distancias 3 0,6231835 1,2808 0,36333 Residuo(a) 6 0,4865762 Parcelas 11 Épocas 7 22,0568419 55,0583 0,00001 Distancias x Épocas 21 0,3061328 0,7642 0,74817 Residuo(b) 56 0,4006088

Total 95

Media General = 3,01

Coeficiente de Variación (A) = 8,19%, Coeficiente de Variación (B) = 21,01% El análisis de regresión revelo efecto lineal (P<0.01) para la épocas de cosecha (Tabla 6 y Figura 3).


Tabla 6. Regresión polinomial para el efecto de las épocas de cosecha sobre el número de vainas por planta de Clitoria ternatea. 1/


Regresión Lineal 1 128,3888198 320,48424 0,00001 0,83 Regresión Cuadrática 1 0,2901560 0,72429 0,59707 0,85 Regresión Cúbica 1 3,0928814 7,72045 0,00739 0,83 Residuo 6 0,4006088 Ecuación Polinomial: Ŷ0,0721 - 4,7795 = ن Xن (r2 = 0,83)

1/ Los datos fueron transformados para X + 1

Con el avance de las épocas de cosecha ocurrió reducción en el número medio de semillas por vainas. Este hecho fue debido al fenómeno de la dehiscencia de las vainas, a medida que lo que es una característica bastante común en las leguminosas forrajeras tropicales (Hopkinson, 1981). En la primera época de cosecha las vainas

tenían en media 21.8 semillas y este número se redujo a casi cero en la última época cuando casi todas las vainas se encontraban vacías.

Ŷ4,7795 = ن - 0,0721 Xن ( r

2 = 0,83)

Medias Observadas

Fig. 3. Relación entre épocas de cosecha y El número de semillas por vainas de Clitoria ternatea.

Germinación El análisis de varianza mostró significancia (P<0.05), para el factor distancia de siembra

entre líneas, y épocas de cosecha (P<0.01) (Tabla 7).

Tabla 7. Análisis de varianza para la germinación (%) de Clitoria ternatea.


Bloques 2 Distancias 3 30,7447846 6,4668 0,02668 Residuo(a) 6 4,7542490 Parcelas 11 Épocas 7 977,2536082 226,8450 0,00001 Distancias x Épocas 21 10,5103637 2,2107 0,16424 Residuo(b) 56 4,3080228

Total 95

Media General = 40 Coeficiente de Variación (A) = 1,93%, Coeficiente de Variación (B) = 5,20%


El análisis de regresión polinomial para distancias entre líneas mostró significancia

(P<0.01) para el efecto lineal (Tabla 8 y Figura 4).

Tabla 8. Regresión polinomial para el efecto de distancias de siembra sobre el porcentaje de germinación de

Clitoria ternatea.


Regresión Linear 1 87,7886650 18,46531 0,00556 0,95 Regresión Cuadrática 1 4,3906947 0,92353 0,62394 - Regresión Cúbica 1 0,0549942 0,01157 0,91432 - Residuo 6 4,7542490 Ecuación Polinomial: Ŷ0,0570 + 37,7695 = ن Xن (r2 = 0,95)

A medida que aumento la distancia de siembra (Figura 4) mejoro el porcentaje de germinación de las semillas (P<0.05). El porcentaje medio de germinación fue de 43% porque no fue realizada escarificación previa de las semillas. Considerándose que había alrededor de 40% de semillas duras en

media, en el análisis de germinación, el porcentaje de semillas viables se situó en torno de 83%. Ŷ0,0570 + 37,7695 = ن Xن (r

2 = 0,95)

Medias observadas

Fig. 4. Relación entre las distancias de siembra y el porcentaje de germinación (%) de Clitoria ternatea

El análisis de regresión reveló efecto cuadrático para las épocas de cosecha (Tabla 9 y Figura 5).

Tabla 9. Regresión polinomial para el efecto de las épocas de cosecha sobre el porcentaje de germinación de

Clitoria ternatea. 1/.


Regresión Lineal 1 5797,1634170 1345,66683 0,00001 0,84 Regresión Cuadrática 1 749,1646241 173,89987 0,00001 0,96 Regresión Cúbica 1 96,9664259 22,50834 0,00008 0,97 Residuo 56 4,3080228 Ecuación Polinomial: Ŷ0,1251 + 47,5108 = ن X0,0124 - ن X2ن (r2 = 0,96)

1/ Los datos fueron transformados para arc sen X/100


El máximo porcentaje de germinación fue encontrado en el quinto día y correspondió a 56% de germinación. A partir de ese punto, el porcentaje de germinación se redujo de forma lenta, por un cierto tiempo, alcanzando valores sobre el 50% de germinación alrededor de los 18 días después del surgimiento de las primeras vainas maduras. Este hecho demuestra la gran velocidad de

maduración de las semillas en esta especie forrajera.

Ŷن = 47.5108 + 0.1251 X ن - 0.0124 X ن

2

( r2 = 0,96) Medias Observadas.

Fig. 5. Relación entre las épocas de cosecha y La germinación (%) de Clitoria ternatea

Rendimiento de semillas El análisis de varianza para el rendimiento de semillas presento significancia (P<0.01) solo

para el factor época de cosecha de semillas (Tabla 10).

Tabla 10. Análisis de variación para el rendimiento de semillas (kg/ha) de Clitoria ternatea.


Bloques 2

Distancias 3 4,7256944444 1,1851 0,39206

Residuo(a) 6 3987,6527778

Parcelas 11

Épocas 7 67961,3571429 50,8201 0,00001

Distancias x Épocas 21 1034,3134921 0,7734 0,73798

Residuo(b) 56 1337,2931548

Total 95

Media General = 87,21

Coeficiente de Variación (A) = 25,60%, Coeficiente de Variación (B) = 41,93% El análisis de regresión polinomial mostró efecto

cuadrático significativo (P<0.01) (Tabla 11 y Figura 6).


Tabla 11. Regresión polinomial para el efecto de las épocas de cosecha sobre el rendimiento de semillas (kg/ha)

de Clitoria ternatea.

Causas de la Variación GL QM Valor F Prob. > F R2 Regresión Lineal 1 78250,7936508 58,51432 0,00001 0,16

Regresión Cúbica 1 189390,6746032 141,62241 0,00001 0,56

Regresión Cuadrática 1 131724,4898990 98,50083 0,00001 0,84

Residuo 6 1337,2931548 Ecuación Polinomial: Ŷ1,1190 - 24,8006 + 17,8346 = ن X2ن (r2 = 0,84)

La producción se semillas obtenida en la primera cosecha fue de aproximadamente 23.42 Kg/ha Esa producción aumento hasta alcanzar el máximo de 175.00 Kg/ha a los 14 días siguientes después del aparecimiento de las primeras vainas maduras. Ese hecho demuestra la gran velocidad de producción de semillas de esa especie en torno a 10.8 Kg/ha/día (Figura 6). Después de alcanzar el máximo de producción, el rendimiento se

mantenía alta por un periodo muy corto (en torno de una semana), cayendo de forma rápida posteriormente aproximadamente el día 43. La producción mínima fue de 10.08 a los 49 días.

Ŷ24.8006 + 17.8346 = ن Xن - 1.1190 Xن

2 ( r

2 = 0,84) Medias Observadas

Fig. 6. Efecto de las épocas de cosecha sobre el rendimiento de semillas (Kg/ha) de Clitoria ternatea

CONCLUSIONES

En las condiciones en que fue realizado el presente estudio y en base a los resultados obtenidos, fue posible llegar a las siguientes conclusiones: La época de cosecha que resultó en

mayor rendimiento de semillas con

porcentaje de germinación próximo al

máximo, se situó entre los 14 y 16 días

después del surgimiento de las vainas

maduras.

Las distancias de siembra entre líneas

estudiadas no afecto el rendimiento de

semilla de Clitoria ternatea.

El aumento de las distancias de siembra

resulto en incremento en el porcentaje de

germinación, número de ramificaciones

por plantas y la altura de inserción de las

primeras vainas.

BIBLIOGRAFIA

DE CASTRO TAVARES, C.; MANTOVANI E. 1995. Maturação de Sementes de Stylosanthes capitata VOG. Revista da Sociedade Brasileira de Zootecnia. V.24. Nº4. Julho/Agosto 1995.

FONTANA, G. 1976. Resposta de seis cultivares de soja (Glicine Max (L.) Merrill) a duas épocas de semeadura e três espaçamentos entre filas. Porto Alegre: Faculdade de Agronomia da Universidade


Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS. 67p. Dissertação (Mestrado em Agronomia – Fitotecnia).

HOPKINSON, J.M. 1981. Controle do desenvolvimento de culturas de leguminosas para sementes. Porto Alegre e Ijui. Produção e Tecnologia de Sementes de Forrageiras Tropicais e Subtropicais. COTRIJUI/UFRGS/FAO. PP. 29-67.

MONZOTE, M.; CASTILLO, E.; LÓPEZ, A. & GARCIA, M. 1986. Comparación de sistemas de alimentación basados en gramíneas puras o asociadas con leguminosas para la producción de carne. II. Comportamiento de los animales. Rev. Cubana Cienc. agric. 20:95.

POLO, E. A. Clitoria ternatea (L.), excelente leguminosa forrajera para El trópico panameño. Segmento Técnico. Revista PROMEGA, Instituto Pro Mejoramiento de la Ganadería. Universidad de Panamá. Año 2004. Nº1.

SCHUCH, L. O.; ANTUNES, I. F.; SILVERA, F. P.; VIEIRA, J.C.; HORN, F. L.; CARBONAR, J. J. 1993. Efeito do espaçamento entre linhas e da população de plantas sobre o feijoeiro – safrinha 91/92. In: REUNIAO TÉCNICA ANUAL DO FEIJAO E OUTRAS LEGUMINOSAS DE GRAOS ALIMENTÍCIOS, 26, Santa Maria. Anais... Santa Maria – RS. P.80.

TOLEDO, F. F.; MARCOS, F. J. 1977. Manual das sementes. Tecnologia da produção. São Paulo: Ed. Agronômica Ceres. 224 p.

VAL, W. M.; BRANDA0, S. S.; GALVAO, J. D.; GOMEL, F. R. 1971. Efeito do espaçamento entre fileiras e da densidade na fileira sobre a produção de grãos e outras características agronômicas da soja; (Glicine Max (L.) Merril) Experientiae. Universidade Federal de Viçosa, v.12, n.12, p.431-471.

89

Revista Investigación Agropecuaria, F.C.A./U.P.

EVALUACIÓN DEL RETRASO DE COSECHA Y CALIDAD MOLINERA EN LAS VARIEDADES DE ARROZ FCA 9738 Y FCA 97116.

Norberto Pitty, MSc.16, José Batista17

RESUMEN

El estudio se realizó en el Centro de Enseñanza e Investigaciones Agropecuarias de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá, ubicado en el corregimiento de Chiriquí, Distrito de David, provincia de Chiriquí, con una elevación de 25 msnm. En el estudio se evaluó el retraso de cosecha y la calidad molinera en las variedades FCA 97116 y FCA 9738, con la finalidad de obtener buenos resultados para integrar las variedades en la producción comercial. El diseño utilizado para el ensayo fue de bloques completamente al azar con cuatro repeticiones, con un arreglo factorial de dos por cuatro donde el factor A es la variedad a dos niveles ( V1 y V2) y el factor B es el de retraso con cuatro niveles ( 0, 5, 10 y 15 días ). La siembra se realizó manual a chorrillo, el manejo agronómico utilizado fue el mismo que se utiliza tradicionalmente en el cultivo de arroz, para llevar a cabo los niveles de retraso se tomo la humedad del grano en campo con un probador de humedad portátil y la primera cosecha se realizo cuando el grano estaba entre los 25 y 27 por ciento de humedad, valor determinado en ensayos previos como los óptimos para la cosecha. En este punto se toma como el retraso de cosecha de 0 días y se deja en campo 5, 10 y 15 días como los otros retrasos en donde se cosecha el tratamiento respectivo. La prueba de molinería se realizo en el Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Panamá (IDIAP), en la sede de Rio Hato. En esta prueba los mejores resultados los obtuvo la variedad FCA 97116, la cual presento el mejor porcentaje en rendimiento de molino con un 65.77% y en granos enteros con 53.7% a cero días de retraso, la FCA 9738 también presento buenos resultados (50.15%) esto indica que ambas tienen buen desempeño a nivel de molino. En general se encontró diferencia significativa del efecto principal del factor variedad y altamente significativo del factor retraso para las variables rendimiento total de molino, granos enteros, granos quebrados, arrocillo y no se encontró diferencias significativas para centro blanco. Los valores de granos enteros con cero retraso fueron de 53.7 % y bajaron a 16.27 con 15 días de retraso. En el caso de granos quebrados con cero días de retraso los valores fueron cuatro veces menores, disminuyendo de 32.4 % a 8.44%. Para la variable arrocillo, los valores altos de 11.5% se registraron con 15 días de retraso y con cero retraso los valores encontrados fueron de 2.5%. Sin embargo, para la variable centro blanco no hubo diferencias atribuibles a la variedad ni al retraso, indicando que esta variable puede responder más a diferencias genotípicas que a variaciones del medio ambiente, aunque en este experimento sólo se estudio dos variedades con algunas similitudes parentales. Se puede concluir que para obtener una buena calidad molinera se debe cosechar oportunamente cuando el grano alcanza porcentajes de humedad de 25-27%.

16 MSc. Profesor de Tecnología de semillas. Departamento de Fitotecnia, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá.

Apartado postal 0426-01031, David, Chiriquí. Panamá. e-mail: [email protected] 17 Ing. Agrónomo.


90


Palabras Claves: Arroz, cosecha, humedad, retraso, variedad, Calidad molinera, rendimiento de molino, granos enteros, granos quebrados, arrocillo, centro blanco, granos yesosos.

ABSTRACT

The research was carried out at the Center for Agricultural Research and Learning at the School of Agricultural Sciences of the University of Panama located in the Corregimiento de Chiriquí, David, Province of Chiriquí. This center has an elevation above the sea level of 25 meters. During the trial delay of the crop harvest was evaluated in the rice varieties FCA 9738 and FCA 97116 respectively. The experimental design used was randomize complete blocks with four replications. The treatments were arrange in a factorial 2x4 where factor A is the varieties at two levels (V1 and V2) and factor B is delay of the crop harvest at four levels (0, 5, 10 and 15 days of delay). Crop harvest at 0 days of delay correspond to a grain moisture content of 25 to 27 per cent which in previous research was the optimum grain moisture content to harvest the field rice. After that, begins to allow the crop harvest delay for 5, 10, and 15 days. The moisture content of the grain was measured with a portable moisture tester. Sowing was done by hand and the crop management followed the common practices in rice crop in the province of Chiriqui. The milling test for milling quality was done at the IDIAP Experimental Station of Rio Hato. The highest grain yield (65.77%) and whole grain yield (53.7%) was obtained with the cultivar FCA 97116 at 0 days crop delay. The cultivar 9738 was inferior as compared to 97116, but the results compare to the standards are good at 0 days of crop delay. The value for whole grain yield is 50.15% in the cultivar 9738. Therefore, these cultivars have good milling performance when they are harvest at the 25 to 27 moisture content of the grain corresponding to 0 days of crop delay. There was significant differences at 5% of probability for the factor cultivar and highly significant differences at 1% for the factor crop harvest delay. The variables milling grain yield, whole grain yield, broken grains and tips of the grain (arrocillo) were significant for cultivars and crop harvest delay. Whole grains at 0 days of crop delay were 53.7% and decrease to 16.27% at 15 days of crop harvest delay. The broken grains decreased four times when harvest at o days of delay. The same trend was observed for the variable tips of the grain (arrocillo). The variable white center of the grain, there was not significant differences between cultivars and there were not significant differences among crop harvest delays. In general, the best results can be achieved by crop harvest at the right grain moisture content which is in a range of 25 to 27 per cent of grain moisture. Keywords: Rice harvest, moisture content, cultivars, harvest delay, milling quality and yield, whole grain, broken grain, grain tips, white center and chalk grain.

INTRODUCCIÓN

El arroz es el alimento básico para más de la mitad de la población mundial y puede ser el más importante del mundo si se considera la extensión de la superficie en que se cultiva y la cantidad de gente que depende de su cosecha. A nivel mundial, el arroz ocupa el

segundo lugar después del trigo si se considera la superficie cosechada, pero si se considera su importancia como cultivo alimenticio, el arroz proporciona más calorías por hectárea que cualquier otro cultivo de cereales. Además de su importancia como alimento, el arroz proporciona empleo al mayor sector de la población rural de la

91


mayor parte de Asia, pues es el cereal típico del Asia meridional y oriental, aunque también es ampliamente cultivado en África y en América, y no sólo ampliamente sino intensivamente en algunos puntos de Europa meridional, sobre todo en las regiones mediterráneas (InfoAgro, 2009). En Panamá la superficie cultivada ha oscilado entre 55000 a 75000 hectáreas, siendo el país con el mayor consumo per cápita en América Latina con un consumo de 70 Kg. por año y un valor agregado directa e indirectamente de 300 millones de dólares anualmente (Puga, B. 2012). La Comisión Panameña de Normas Industriales y Técnicas (COPANIT), regula la calidad del arroz que se vende en el mercado panameño. Las normas establecen valores porcentuales para grano entero y quebrado. El arroz especial tiene 95 porciento de granos enteros y 5 porciento de granos quebrados (IMA, 2009). Los ingresos que recibe el agroindustrial al comercializar el arroz pilado se incrementan con el aumento de granos enteros en el rendimiento de molino de las variedades de arroz liberadas para uso por los productores. Por otro lado, un productor comercializa a mejor precio y con mayor oportunidad, arroz con un alto rendimiento de granos enteros por pilada. La pérdida de la calidad molinera en las variedades comerciales de arroz se atribuye a factores genéticos y de manejo de las variedades. En el presente ensayo se evalúo el efecto de dos variedades y el retraso de la cosecha en la calidad molinera de los cultivares FCA 9738 y 97116 generados en el Programa de Mejoramiento de Arroz de la Universidad de Panamá. REVISIÓN DE LITERATURA La calidad molinera de las líneas experimentales en evaluación en los programas de mejoramiento de arroz le da especial atención a este parámetro por las implicaciones que tiene en el gusto y preferencias del consumidor y de los establecimientos molineros que procesan y comercializan el arroz obtenido por los productores. Es un requisito que las nuevas variedades presenten un buen comportamiento en calidad molinera para que tenga buena aceptación de los

productores, procesadores y consumidores del grano. Sin embargo, aunque las variedades se liberan tomando en cuenta su rendimiento en molinería, los resultados en algunos casos son variables a nivel de productor comercial, es por ello que se hace necesario estudiar el efecto que tiene el retraso de la cosecha en la pérdida de calidad molineras de los cultivares de arroz. En el presente estudio se evalúan dos cultivares liberados en el Programa de Mejoramiento de Arroz de la Universidad de Panamá. El programa de mejoramiento de arroz de la Universidad de Panamá establecido en la Facultad de Ciencias Agropecuarias ha liberado dos cultivares de arroz que Gaona (2006), las describe como FCA 9738 y FCA 97116. La FCA 9738 presenta las siguientes características: es de ciclo intermedio (116 a 122 días de cosecha). Presenta buen vigor inicial, es de porte intermedio con altura que oscila entre 112 centímetros y 135 centímetros, excelente macollamiento. La floración ocurre entre 87 y 93 días, la longitud del grano es intermedia, sin aristas, de color pajizo y con un peso promedio de 27.8 gramos / 1000 granos. Tiene buen rendimiento en molino La variedad FCA 97116 es precoz, con un ciclo promedio de 112 días, sin embargo, se pueden esperar ciclos tan cortos como 106 días y tan largos como 119 días. Presenta buen vigor inicial, es de porte intermedio con altura que oscila entre 110 cm y 126 centímetros, su macollamiento va de bueno a muy prolífico. La longitud del grano es intermedia, sin arista, de color pajizo y con un peso promedio de 28.4 gramos /1000 granos. (Gaona J. 2006). La cosecha oportuna del grano reduce las pérdidas por desgrane natural, acame, pájaros, ratas y pérdida del valor comercial (calidad). Se considera que la humedad óptima de cosecha está entre 20 y 27 porciento. Por encima de 27 porciento hay menor rendimiento y mayor porcentaje de granos yesosos (FAO, 2003) Cuando la humedad del grano es menor de 18 porciento hay pérdidas de granos, calidad y mayor riesgo. En términos visuales se

92


considera el punto de cosecha cuando 80 por ciento de los granos de la panícula estén color paja; en este momento los granos de la porción superior de la panícula están claros y firmes y la mayoría de los de la base se encuentran en la etapa de endurecimiento (Gaona J. 2006). Se considera retraso, a la recolección tardía del grano después del periodo óptimo de la cosecha, el cual debe estar entre los 25 y 27 porciento de humedad. El retraso contribuye considerablemente a la deterioración del grano de arroz, debido a una serie de factores bióticos y abióticos. Algunos de los factores bióticos que influyen en el deterioro del grano de arroz en el periodo de retraso de la cosecha son los siguientes: roedores, aves, insectos (chinches, ácaros), hongos y bacterias (FAO, 2003). Algunos de los factores abióticos que influyen en el deterioro del grano de arroz en el periodo de retraso de la cosecha son los siguientes:

La precipitación: Cuando hay precipitaciones con fuertes vientos las plantas tienden a caerse y esto afecta considerablemente el rendimiento y la recolección del grano.

La intensidad de luz: Si en el periodo de retraso se presenta una sequia y la intensidad de luz solar es fuerte, influye en la cristalización del grano el mismo tiende a quebrarse.

La temperatura: Las altas y bajas temperaturas por encima y debajo de los limites críticos afectan el rendimiento del grano ya que inciden sobre la formación de espiguillas y la maduración. Las altas temperaturas le causa estrés a la planta de arroz y esto afecta considerablemente al rendimiento del grano de arroz.

La humedad: Esta ocasiona el llenado incompleto del grano e incide el ataque de plagas y enfermedades esto puede ser determinante en el rendimiento del grano en un periodo de retraso.(FAO, 2003)

Montero, O. (2003) encontró influencia de la variedad, contenido de humedad y retraso en la pérdida de calidad molinera en tres cultivares de arroz con rendimiento de molinería variables. Por su parte, Cano, E. 2007 evaluó tres variedades en el sur de Veraguas encontrando resultados similares a los obtenido por Montero, O. donde los mejores rendimientos de molinería se logro con cosecha oportuna con contenido de humedad de 25-27%.

MATERIALES Y METODOS El ensayo se realizó en el Centro de Enseñanza e Investigación Agropecuario de Chiriquí (CEIACHI), ubicado en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá, en el corregimiento de Chiriquí, provincia de Chiriquí, Panamá. La elevación es de 25 metros sobre el nivel de mar, con suelos aptos para el cultivo de arroz. El ensayo se realizo con dos nuevos cultivares, FCA 97116 y FCA 9738 que tienen buen rendimiento en molino. La preparación de suelo se realizó con varios pases de rastra pesada y motocultor, luego se marcaron las diferentes parcelas de 2x4 metros para una superficie de ochos metros cuadrados. Se sembraron diez surcos por parcela, siendo la parcela efectiva de seis surcos. Para la siembra por parcela se utilizo un sobre de 110 gramos de semilla básica. Al momento de la siembra se abono con 12-24-12 y a los 35 días después de la siembra se aplicó urea, lo mismo que al inicio de la floración. Los niveles de N-P-K fueron de 120, 60 y 30 de N, P₂O₅ y K₂O respectivamente. El control de malezas de hoja ancha se realizo en post emergencia con 2,4D a una dosis de 500cc haˉ¹. Para las calles en bloques y parcelas se utilizo glifosato a una dosis de 4.0 l haˉ¹ utilizando pantalla, también se controló las malezas manualmente con el uso del machete y azada. El control de plagas y enfermedades se realizo con el mismo procedimiento que se le hace al cultivo de arroz comercial. En

93


general el manejo agronómico del ensayo se realizo en la forma convencional del cultivo comercial. La cosecha se realizo tomando como referencia el porcentaje de humedad del grano de arroz, realizando la primera cosecha cuando este tenía entre 25 y 27 porciento de humedad, que es considerado como el momento adecuado para la cosecha, determinado en ensayos previos. Una vez se alcance este porcentaje de humedad se procede a retrasar la cosecha a 5, 10, y 15 días después de la primera cosecha y de acuerdo al tratamiento. Las pruebas de molinería se realizaron en el Centro de Investigación del IDIAP en Río Hato. El rendimiento de molino se determino después de secado y limpieza del grano. Para ello se peso 250 gramos de las muestras recolectadas y se vierten en la máquina descascaradora, luego se pasa a la pulidora y clasificadora, la cual separa los granos enteros de los quebrados y el arrocillo. Finalmente se pesan por separado los granos enteros, quebrados y el arrocillo. El rendimiento es la suma de granos quebrados, enteros y arrocillos. Además, se determinó centro blanco y granos yesosos o tiza. El centro blanco es aquel grano que es casi blanco y que tiene las puntas cristalinas, esta prueba se realizo visualmente y se tiene una escala de uno a cinco. Si pasa de 3 es arroz de descarte, de uno a dos es de una buena calidad. El grano tiza o yesoso es el que observamos de color blanco en su totalidad. Para determinar los granos yesosos se pesa 50 gramos de arroz y visualmente se clasifican los granos yesosos para calcular el porcentaje en base a peso. El diseño experimental usado es bloques completamente al azar con cuatro repeticiones donde los tratamientos se arreglaron en un factorial de 2 x 4 donde el factor A es la variedad a dos niveles y el factor B es retraso de la cosecha a cuatro niveles. El número de tratamientos es ocho y el total de unidades experimentales es 32. La unidad experimental está constituida de ocho metros cuadrados (2m x 4m), con diez

surcos. La parcela efectiva está formada de seis surcos. El número de unidades experimentales en el ensayo fueron 32 parcelas (2x4x4).La separación entre bloques es de un metro y entre parcelas es de 0.50m.

CUADRO I. FACTORES A Y B. Factor A. Variedades

Factor B. Días de retraso en cosecha

V1 : 97116 V2 : 9738

R1: 0 Días de retraso (25 a 27% de humedad) R2: 5 Días de retraso. R3:10 Días de retraso. R4:15 Días de retraso.

Las variables en estudio son:

Humedad del grano a la cosecha.

Rendimiento de molino.

Granos enteros

Granos quebrados

Arrocillos

Centro blanco

Granos yesosos

Para los análisis estadísticos se uso el programa SAS. El análisis estadístico consiste en el análisis de varianzas (anovas), comparación de medias para rendimiento de molino, granos enteros, granos quebrados, arrocillos, centro blanco y granos yesosos. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados del porcentaje medios de humedad obtenido en campo de los tratamientos, según cada retraso de cosecha se muestran en el cuadro II y en la figura I. La humedad de grano a nivel de campo al momento de la cosecha muestra valores porcentuales de 26.42 y 17.72 para V1 y 26.50 y 17.87 para V2. Los valores altos de humedad del grano corresponden a las variedades que se dejaron en campo poco tiempo una vez alcanzaron la humedad para permitir su cosecha y los valores bajos corresponden a los periodos más largos de tiempo de retraso de la cosecha. (Ver Cuadro II y Fig. I.) En la Fig. I se puede notar que las dos variedades tienen la misma tendencia en

94


relación a los contenidos de humedad de grano independiente del retraso.

CUADRO II. PORCENTAJE DE HUMEDAD MEDIO

EN CAMPO DE LA VARIEDAD 97116 Y 9738 CON CUATRO RETRASOS DE COSECHA.

Tratamiento % de humedad en campo

V1R0 26.42 V1R5 20.07 V1R10 17.72 V1R15 19.90 V2R0 26.50 V2R5 22.10 V2R10 17.87 V2R15 18.80

Figura I. Porcentaje de Humedad medio en campo

de la variedad 97116 y 9738 con cuatro retrasos de cosecha

Los resultados del porcentaje medio de humedad obtenido al momento del pilado en el molino de los tratamientos, según cada retraso de cosecha se muestran en el cuadro III y en la figura II. La humedad del grano seco al momento del pilado de ambas variedades con diferentes retrasos de cosecha muestra valores de 12.50 a 13.40 porciento indicando resultados similares indistintamente del nivel de retraso y la variedad. La humedad del grano para procesar en molino es similar debido al proceso de secado en piso de concreto del grano de cada variedad, es decir, las pequeñas diferencias en los valores se deben a las temperaturas ambientales y tiempo de exposición del grano al secado,

pero no es relevante la variación de menos de 1.0%. (Ver Cuadro III y Fig. II) CUADRO III. PORCENTAJE DE HUMEDAD

PROMEDIO DE GRANO SECO PARA PROCESO EN EL MOLINO DE LA VARIEDAD 97116 Y 9738 CON CUATRO RETRASOS DE COSECHA.

Trato % de Humedad en molino

V1R0 13.10

V1R5 13.40

V1R10 12.72

V1R15 12.77

V2R0 13.07

V2R5 13.20

V2R10 13.05

V2R15 12.50

Figura II. Porcentaje de Humedad promedio de

grano seco para pilado de las variedades 97116 y 9738 con cuatro retrasos de cosecha.

Los resultados del rendimiento total promedio obtenido en molino de los tratamientos, según cada retraso de cosecha se muestran en el cuadro V. El análisis de varianza de los rendimientos molineros de las dos variedades con cuatro retrasos de cosecha muestra que no hay diferencias significativas en las interacciones ni en los efectos principales.

95


CUADRO IV. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA RENDIMIENTO TOTAL DE PILADA.

FUENTES GL SC CM FC Pr > F

REPET 3 37.85560000 12.61853333 0.60 0.6196 NS RETRA 3 95.03320000 31.67773333 1.52 0.2395 NS VAR 1 77.37680000 77.37680000 3.70 0.0679 NS RETRA*VAR 3 109.87160000 36,62386667 1.75 0.1870 NS Error 21 438.71320000 20.89110476 - - Total 31 758.85040000 - - -

NS = Indica diferencias no significativas. C.V. = 7.38%.

El rendimiento total promedio en molino de las variedades 97116 y 9738 con diferentes retrasos de cosecha muestra un porcentaje por encima del 55%, llegándose a obtener hasta 65%, lo cual se considera bueno. Esto se puede atribuir a que ambas variedades presentan buen rendimiento molinero asociado a sus genotipos, y el retraso de la cosecha tiene poca influencia en el rendimiento total de molinería, siendo una característica altamente deseable por los molineros del país. Sin embargo hay que tomar en cuenta el rendimiento de granos enteros y los otros atributos molineros. Ver cuadro V.

CUADRO V. RENDIMIENTO TOTAL MEDIO EN

MOLINO DE LA VARIEDAD 97116 Y 9738 CON CUATRO RETRASOS DE COSECHA.

Trato Rendimiento total en molino

V1R0 65.77

V1R5 65.01

V1R10 62.49

V1R15 60.57

V2R0 62.56

V2R5 60.94

V2R10 60.85

V2R15 57.06

Los resultados del porcentaje medio de granos enteros obtenido en molino de los tratamientos, según cada retraso de cosecha se muestra en la figura III. El análisis de varianza para granos enteros muestra que hay diferencias significativas al 5% de probabilidad para el factor variedad y el retraso tiene efecto altamente significativo al 1% por ciento de probabilidad (Cuadro VI). Es importante señalar que a nivel de rendimiento molinero no hubo diferencias significativas, sin embargo, a nivel de granos enteros, que es importante en el rendimiento de arroz categoría especial si hay diferencias significativas. Es relevante indicar que el incremento en el retraso afecta negativamente el rendimiento de granos enteros, siendo un factor que puede ser controlado mediante muestreo de los campos y tomando la decisión de recoger el grano oportunamente (Fig. III). El genotipo tiene efecto en el rendimiento de granos enteros, por lo tanto se debe escoger variedades con buen rendimiento de granos enteros. Los coeficientes de variación son bajos lo que indica un buen control del error experimental.

CUADRO VI. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA GRANOS ENTEROS. FUENTES GL SC CM FC Pr > F

REPET 3 132.38855000 44.12951667 1.90 0.1606 NS RETRA 3 6780.72375000 2260.24125000 97.31 0.0001 ** VAR 1 175.78125000 175.78125000 7.57 0.0120 * RETRA*VAR 3 164.95855000 54.98618333 2.37 0.0998 NS Error 21 487.76625000 23.22696429 - - Total 31 7741.61835000 - - -

NS = Indica diferencias no significativas. (*) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 5%. (**) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 1%. C.V = 12.25%.

96


CUADRO VII. COMPARACIÓN DE MEDIAS A NIVEL DE RETRASO PARA GRANOS ENTEROS.

Agrupamiento Medias N Retraso

A 53.745 8 0

A 49.605 8 5 B 37.690 8 10 C 16.275 8 15

Figura III. Porcentaje medio de granos enteros en molino de la variedad 97116 y 9738 con cuatro retrasos de

cosecha.

Los resultados del porcentaje medio de granos quebrados obtenido en la pilada de los tratamientos, según cada retraso de cosecha muestra diferencias significativas para el efecto principal variedad y diferencias altamente significativas para el efecto principal retraso (Cuadro VIII).

El porcentaje de granos quebrados es bajo al recolectar el grano en el período óptimo de cosecha, a medida que se retrasa la cosecha el porcentaje de granos quebrados aumenta, esto debido a los factores abióticos y bióticos a los que son expuestos los granos en campo (Cuadros IX y Fig. IV).

CUADRO VIII. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA GRANOS QUEBRADOS. FUENTES GL SC CM FC Pr > F


NS = Indica diferencias no significativas. (*) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 5%. (**) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 1%.

C.V = 7.98%. CUADRO IX. COMPARACIÓN DE MEDIAS A NIVEL DE RETRASO PARA GRANOS QUEBRADOS.


A 32.4700 8 15 B 17.8700 8 10 C 8.8250 8 5 C 8.4450 8 0

97


Figura IV. Porcentaje medio de granos quebrados en molino de la variedad 97116 y 9738 con cuatro retrasos de

cosecha.

El análisis de varianza para la variable arrocillo muestra diferencias significativas para el factor variedad y diferencias altamente significativas para el efecto principal de retraso (Cuadro X). La prueba de Tukey indica que a mayor retraso en la cosecha mayor es el rendimiento de arrocillo, un factor negativo en el rendimiento del pilado del arroz. Se puede inferir que el

retraso aumenta considerablemente el rendimiento de arrocillo, pero si se cosecha oportuno, la producción de arrocillo esta alrededor de 2% en contraste con 10 a 12 por ciento en los retrasos de 15 días (Cuadro XI).

CUADRO X. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA ARROCILLO.



NS = Indica diferencias no significativas. (*) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 5%. (**) = Indica diferencias significativas al nivel de probabilidad del 1%. C.V = 14.42%. CUADRO XI. COMPARACIÓN DE MEDIAS DE LA VARIABLE ARROCILLO PARA RETRASO.


A 11.5300 8 15 B 6.2800 8 10 C 2.9750 8 5 C 2.5650 8 0

98


Figura V. Porcentaje medio de arrocillo en molino de la variedad 97116 y 9738 con cuatro retrasos de cosecha.

Los resultados del porcentaje medio de centro blanco obtenido en molino de los tratamientos, según cada retraso de cosecha muestra un rango muy similar en ambas variedades. El porcentaje de centro blanco no difiere al 5% ni al 1%, siendo muy similar entre la cosecha oportuna y los diferentes retrasos

indicando que el centro blanco estaría más vinculado al genotipo que al retraso de la cosecha. En este estudio solo se evaluó dos cultivares y no se puede evaluar claramente el efecto de genotipo en el rendimiento de granos con centro blanco. Sin embargo, los datos obtenidos sugieren la inferencia anterior. Ver cuadro XII y figura VI.

Cuadro XII. ANÁLISIS DE VARIANZA PARA CENTROS BLANCOS.


REPET 3 0.02375000 0.00791667 0.18 0.9117 NS RETRA 3 0.30375000 0.10125000 2.25 0.1126 NS VAR 1 0.06125000 0.06125000 1.36 0.2567 NS RETRA*VAR 3 0.04375000 0.01458333 0.32 0.8082 NS Error 21 0.94625000 0.04505952 - - Total 31 1.37875000 - - -

NS = Indica diferencias no significativas. C.V = 14.57%.

99


Figura VI. Porcentaje medio de centro blanco en molino de la variedad 97116 y 9738 con cuatro retrasos de cosecha.

CONCLUSIONES El retraso de la cosecha causa la pérdida de la calidad molinera de las variedades. La cosecha oportuna cuando el grano alcanza valores de humedad de 25 a 27 por ciento, resulta en buenos rendimientos de pilada, reducción de granos quebrados, granos tiza y arrocillo. Las variedades cosechadas oportunamente presentan buenos rendimientos en el molino indistintamente del cultivar, pero cuando hay retraso en la recolección, la perdida de la calidad molinera es variable en los cultivares y se relaciona al genotipo. No obstante, el retraso afecta negativamente a las variedades en su calidad molinera.

BIBLIOGRAFÍA AGUILERA, V. 1991. Manual de recomendaciones para la producción de arroz, Ministro de Desarrollo

Agropecuario, Dirección de extensión agropecuaria, Dirección de agricultura, Panamá. 81 páginas. APACH. Mayo. 2003. Arroz en Chiriquí. Panamá. 5-10. CANO, E. 2007. Determinación de la pérdida de la calidad del grano de arroz en función del manejo de post cosecha. Tesis. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá. 63p. FAO, 2003. Guía para identificar las limitaciones de campo en la producción de arroz. Comisión internacional de arroz, organización de las naciones unidas para la agricultura y la alimentación.84 páginas. GAONA, J. 2006 FCA 978 Nueva variedad de arroz ara los ecosistema de secano favorecido y riego de Panamá. GAONA, J. 2006 FCA 97116 Nueva variedad de arroz para Panamá y año al servicio del productor agropecuario y su familia. INFOAGRO, 2009. El cultivo de arroz 1ra parte. (En línea). Consultado 21/08/09. Disponible en: http://www.Infoagro.com. IMA, 2009. Normas oficiales COPANIT –74-2003 para arroz. (En línea). Consultado 28/08/09. Disponible en:www.ima.gob.pa/ima/noticias. JAGER, M. 2008. Análisis situacional del sector de arroz en Panamá, Ministerio de Comercio e Industria, Panamá, 57 páginas. PUGA, B. 2012. El arroz es vida. Dirección Nacional de Agricultura. Programa de Arroz. Ministerio de Desarrollo Agropecuario de Panamá. Conferencia en Seminario de Actualización de Cultivo de Arroz. Alanje, Abril 2012. PUZZI, D. 1986. Abastecimiento e Amazenagen de Graos. Instituto Campineiro de Ensino Agrícola, 602 páginas. MONTERO, O. 2002. Tesis Determinación de la pérdida de la calidad del grano de arroz en función de la variedad, humedad y retraso de la cosecha. 76 páginas. SALAZAR, L. 1984. Manual práctico para el manejo de experimentos agrícolas y pecuarios. Universidad de Panamá. Facultad de Agronomía. 140 páginas.

http://www.infoagro.com./

100


REVISTA CIENTÍFICA

Investigación Agropecuaria

Es una publicación de

Director: Mgter. Simón Vásquez

Revisión y traducción

Mgter. José Carlos Ureta Mgter. Norberto Pittí

Compilación

Mgtra. Magdalena Justavino L.

Diseño y diagramación Mgtra. Magdalena Justavino L.

Encuadernación

Tiraje 50 ejemplares

Impreso en la Facultad de Ciencias Agropecuarias,

Sede de Chiriquí

Impresión de Portada Unidad de Difusión

F.C.A./U.P. Año, 2012

Esta publicación fue financiada con fondos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias

101


ATERIALES Y MÉTODOSconsulta.up.ac.pa/ftp/2010/f_agropecuaria/document... · iii Autoridades...

Documents

Transcript of ATERIALES Y MÉTODOSconsulta.up.ac.pa/ftp/2010/f_agropecuaria/document... · iii Autoridades...