Avances en genética y discapacidad: Avances en genética y discapacidad:

Los retos de las nuevas tecnologías

Eduardo Tizzano

Hospital Sant Pau Barcelona y

CIBERER U-705

Investigación en enfermedades

genéticas

• Investigación básica: en general no tiene

aspectos prácticos de aplicación a los

pacientes sino que sirve para entender las pacientes sino que sirve para entender las

causas o conocer mejor sus mecanismos

• Investigación clínica: se realiza en pacientes

con pruebas de laboratorio o ensayos

terapéuticos

Investigación traslacional

• Es un puente entre ambas investigaciones (básica y clínica) • Es un puente entre ambas investigaciones (básica y clínica)

que se genera a través de los avances en los conocimientos

de la patología molecular (descubrimiento de genes

responsables y de su alteración en los pacientes) así como

de los adelantos en el desarrollo de modelos celulares y

animales.

• Su objetivo es definir dianas terapéuticas en las

enfermedades

Investigación

traslacional

Protocolos de

tratamientos

2000

EVOLUCION EVOLUCION

CONOCIMIENTO EN CONOCIMIENTO EN

ENFERMEDADES ENFERMEDADES

GENETICAS GENETICAS

NEUROMUSCULARESNEUROMUSCULARES???

Descripción

enfermedad

Diagnóstico clínico

Diagnóstico genético 1985-1999

1950-80

1850-1890

Investigación traslacional en

enfermedades genéticas

• Conocimiento de la historia natural de la enfermedad

• Estudio determinantes genéticos y los posibles

modificadores del fenotipo

• Validar marcadores biológicos para el seguimiento de la • Validar marcadores biológicos para el seguimiento de la

evolución de la enfermedad y de protocolos

terapéuticos

• Elucidar los mecanismos patogénicos de la

enfermedad

• Definir dianas terapéuticas

Diagnóstico molecular por

amplificación selectiva del DNA

• PCR clásica o cualitativa

• PCR a tiempo real o cuantitativa relativa• PCR a tiempo real o cuantitativa relativa

• PCR digital

PCR convencional (cualitativa)PCR convencional (cualitativa)

RESULTADOS

COMIENZO

CICLOS

PCR a tiempo real (cuantitativa)PCR a tiempo real (cuantitativa)

FINAL

RESULTADOS

COMIENZO

CICLOS

FINAL

PCR digitalPCR digital

PCR digital

PCR digital

• PCR digital

– para cuantificación absoluta,

– detección de alelos raros poco representados– detección de alelos raros poco representados

– diagnóstico prenatal no invasivo

– detección de células circulantes tumorales.

Diagnóstico prenatal no invasivo

• Detección de DNA fetal en circulación

materna

• 95% del DNA libre en plasma o suero es • 95% del DNA libre en plasma o suero es

materno y menos de un 5% es fetal.

• Posibilidad de determinar cromosoma Y por

PCR a tiempo real.

• No es posible determinar los alelos

maternos que hereda el feto (todavía...)

Determinación cromosoma Y en sangre materna

Dos determinaciones:

una a partir de la semana 7 -8

embarazo

y otra en la 9-10

A=secuencia Y, B=secuencia control

Estudio de pérdidas o ganancias de

material genético

• Citogenética clásica y bandeos.

• FISH (Fluorescent in situ hybridization)• FISH (Fluorescent in situ hybridization)

• MLPA (Multiple ligation-dependent probe

hybridization)

• Array CGH (Comparative Genomic

Hybridization)

94-368Multiple ligation-dependent probe hybridization (MLPA)94-368

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

X-153.8FVIIIExon01A

X-153.8FVIIIExon01B

X-153.8FVIIIExon02

X-153.8FVIIIExon03A

X-153.8FVIIIExon03B

X-153.8FVIIIExon04

X-153.8FVIIIExon05

X-153.8FVIIIExon06

X-153.8FVIIIExon07A

X-153.8FVIIIExon07B

X-153.8FVIIIExon08

X-153.8FVIIIExon09

X-153.8FVIIIExon10

X-153.8FVIIIExon11

X-153.8FVIIIExon12A

X-153.8FVIIIExon12B

X-153.8FVIIIExon13

X-153.8FVIIIExon14A

X-153.8FVIIIExon14B

X-153.8FVIIIExon14C

X-153.8FVIIIExon15

X-153.8FVIIIExon16

X-153.8FVIIIExon17

X-153.8FVIIIExon18

X-153.8FVIIIExon19

X-153.8FVIIIExon20

X-153.8FVIIIExon21

X-153.8FVIIIExon22

X-153.8FVIIIExon23

X-153.8FVIIIExon24

X-153.8FVIIIExon25

X-153.8FVIIIExon26A

X-153.8FVIIIExon26B

c c c c c c c c c c

94-368

Multiple ligation-dependent probe hybridization (MLPA)

Summary of Microdeletion syndromes tested for by the P245 MLPA

microdeletion kit (www.mrc-holland.org)

Loci TestedAssociated Microdeletion/duplication Syndrome

1p36.33 1p36 Deletion syndrome

2p16.1 2p16 Deletion syndrome

3q29 3q29 Deletion syndrome

4p16.3 Wolf-Hirschhorn syndrome

5p15.33 Cri-du-Chat syndrom

5q35.3 SOTOS syndrome

7q11.2 Williams syndrome/7q11.23 duplication

8p23.1 8p23 Deletion syndrome8p23.1 8p23 Deletion syndrome

8q24 Langer-Gideon syndrome

9q22.33 9q22 Deletion syndrome

10p14 DiGeorge syndrome region

11p13 WAGR syndrome

15q11.2 Prader-Willi/Angelmans syndrome

15q24.1 15q24 Deletion syndrome

16p13.3 Rubinstein-Taybi syndrome

17p11.2 Smith-Magenis syndrome/17p11.2 duplication

17p13.3 Miller-Dieker syndrome

17q11.2 NF1 Deletion17q21.3117q21 Deletion syndrome

22q11.2 DiGeorge syndrome/22q11.2 duplication

22q13.3 Phelan-McDermid syndrome

Xq28 MECP2 duplication syndrome

jun-15

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

X-153.8FVIIIExon01A

X-153.8FVIIIExon01B

X-153.8FVIIIExon02

X-153.8FVIIIExon03A

X-153.8FVIIIExon03B

X-153.8FVIIIExon04

X-153.8FVIIIExon05

X-153.8FVIIIExon06

X-153.8FVIIIExon07A

X-153.8FVIIIExon07B

X-153.8FVIIIExon08

X-153.8FVIIIExon09

X-153.8FVIIIExon10

X-153.8FVIIIExon11

X-153.8FVIIIExon12A

X-153.8FVIIIExon12B

X-153.8FVIIIExon13

X-153.8FVIIIExon14A

X-153.8FVIIIExon14B

X-153.8FVIIIExon14C

X-153.8FVIIIExon15

X-153.8FVIIIExon16

X-153.8FVIIIExon17

X-153.8FVIIIExon18

X-153.8FVIIIExon19

X-153.8FVIIIExon20

X-153.8FVIIIExon21

X-153.8FVIIIExon22

X-153.8FVIIIExon23

X-153.8FVIIIExon24

X-153.8FVIIIExon25

X-153.8FVIIIExon26A

X-153.8FVIIIExon26B

c c c c c c c c c c

jun-15

Mujer con

deleción

exón 1

08-657

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

X-153.8FVIIIExon01A

X-153.8FVIIIExon01B

X-153.8FVIIIExon02

X-153.8FVIIIExon03A

X-153.8FVIIIExon03B

X-153.8FVIIIExon04

X-153.8FVIIIExon05

X-153.8FVIIIExon06

X-153.8FVIIIExon07A

X-153.8FVIIIExon07B

X-153.8FVIIIExon08

X-153.8FVIIIExon09

X-153.8FVIIIExon10

X-153.8FVIIIExon11

X-153.8FVIIIExon12A

X-153.8FVIIIExon12B

X-153.8FVIIIExon13

X-153.8FVIIIExon14A

X-153.8FVIIIExon14B

X-153.8FVIIIExon14C

X-153.8FVIIIExon15

X-153.8FVIIIExon16

X-153.8FVIIIExon17

X-153.8FVIIIExon18

X-153.8FVIIIExon19

X-153.8FVIIIExon20

X-153.8FVIIIExon21

X-153.8FVIIIExon22

X-153.8FVIIIExon23

X-153.8FVIIIExon24

X-153.8FVIIIExon25

X-153.8FVIIIExon26A

X-153.8FVIIIExon26B

c c c c c c c c c c

08-657

Varón con

duplicación

exones 2-10

Venceslá et al., (sometido)

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

ex1

ex2

ex3

ex5

ex7

ex8

ex10

ex12

ex13

ex14

ex15

ex17

ex19

ex21

ex23

ex25

ex26

Xp21

Xp22

Xq22

Xq26

Xq28

Doble duplicación en varón hemofílico de los exones 14 y 23-25

Array CGH(hibridación genómica

comparada)

• Array CGH

– para determinar pérdidas o ganancias de material genético y reordenamientos no equilibrados en el genoma completo de un equilibrados en el genoma completo de un individuo.

– Detecta desequilibrios geneticos a mayor resolución (60Kb) comparado con el cariotipo (5-10Mb), lo que representa unas 1000 veces incremento en la resolución.

Efectividad diagnóstica en trastornos

aprendizaje y retardo mental

inespecífico

• Cariotipo 3-4%

• MLPA 8%

• Array CGH 15-20%

From the 1st April 2012

Array Comparative

Genomic Hybridization

(array CGH) will replace

karyotyping and MLPA as

a first line service for a

defined cohort of patients.

No permite diagnóstico de reordenamientos

Indicaciones: TEA, RM, MC

No permite diagnóstico de reordenamientos

cromosómicos equilibrados ni mosaicismos

de bajo porcentaje (40%)

CODIGO

GENETICO

DISCRIMINACIÓN ALÉLICA DE “PEQUEÑA ESCALA”

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO

II. Secuenciación clásica (Sanger)

1 cap. -> 1 muestra/ 7 días lab8 cap. 24 cap. ->1 muestra (5,50h)

Ej – Beta globina

- Análisis mutacional de los genes de gran tamaño:

· susceptibilidad al CMOH (BRCA1 y BRCA2), aprox. 80 amplicones = 160 reacc sec.

· Hemofilia A

· Distrofina (DMD) (ARN)

Cambio G>ACambio G>A

CGC>CACCGC>CAC

Secuenciación Secuenciación

automáticaautomática

Arginina x HistidinaArginina x Histidina

Secuenciación Masiva

• Permite el estudio de todo el genoma o

regiones muy extensas (por ejemplo

exomas) en un corto período de tiempo. exomas) en un corto período de tiempo.

• Es útil para identificar nuevos genes,

mutaciones intrónicas o para secuenciar a la

vez un número de genes establecidos.

· Como el genoma humano es tan largo, debe ser cortado en pequeños fragmentos y leerlos uno por uno, para luego ensamblarlos usando ordenadores.

· Pero, no basta con secuenciar una vez el genoma ya que pueden haber fragmentos que se pierdan en el

1000 genomes: analizó todo el genoma de 179 individuos, generando uncatálogo de más de 8 millones de SNPs y más de 1 millón de variantesestructurales (indels).

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO

II. SECUENCIACIÓN

que pueden haber fragmentos que se pierdan en el proceso, otros que sean mal secuenciados y otros que se secuencien repetidas veces. Estos problemas pueden generar vacíos al momento de ensamblar el genoma. Así que para tener un genoma completo, sin errores y espacios en blanco, la profundidad de la secuenciación debe ser mayor.

· Se debe secuenciar el ADN de una persona unas 28 veces (28X) para obtener un genoma sin espacios vacíos o errores. Además, se debe contar con genomas patrones para poder hacer el ensamblaje de los pequeños fragmentos generados.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO

Sistemas de alto rendimiento – NGS (“Next Generation Sequencing”)

iPSCs (induced Pluripotent Stem

Cells)

• Una nueva metodología que permite

reprogramar las células del paciente

(generalmente fibroblastos o queratinocitos (generalmente fibroblastos o queratinocitos

de piel) para transformarlas en distintos

tipos celulares (nervioso, hepático,

cardíacas, musculares).

Fibroblastos

Lentivirus (+ 4 Lentivirus (+ 4 genes)

iPS (induced pluripotent stem cells)

Diferenciación

-

In collaboration with Royal Holloway Hospital London.

Behaviour and phenotype of motor neurons

Response to drugs

Expression analysis

RNA NGSBoza et al., unpublished results

(Ebert & Svendensen, 2010) Boza et al., unpublished results

Nuevos medios para viejos fines

• PCR digital

• Array CGH

• Secuenciación Masiva• Secuenciación Masiva

• Generación de iPSCs (induced

pluripotential stem cells) de pacientes

Nuevos medios para viejos fines

• Mejores herramientas y metodologías que

complementan y completan el diagnóstico

genético. (PCR digital,Array CGH, genético. (PCR digital,Array CGH,

Secuenciación Masiva)

• Mejores modelos celulares que nos

permiten estudiar el tejido o las células

directamente involucradas en la enfermedad

(Generación de iPSC de pacientes)