Avances en genética y discapacidad: Avances en genética y discapacidad:
Los retos de las nuevas tecnologías
Eduardo Tizzano
Hospital Sant Pau Barcelona y
CIBERER U-705
Investigación en enfermedades
genéticas
• Investigación básica: en general no tiene
aspectos prácticos de aplicación a los
pacientes sino que sirve para entender las pacientes sino que sirve para entender las
causas o conocer mejor sus mecanismos
• Investigación clínica: se realiza en pacientes
con pruebas de laboratorio o ensayos
terapéuticos
Investigación traslacional
• Es un puente entre ambas investigaciones (básica y clínica) • Es un puente entre ambas investigaciones (básica y clínica)
que se genera a través de los avances en los conocimientos
de la patología molecular (descubrimiento de genes
responsables y de su alteración en los pacientes) así como
de los adelantos en el desarrollo de modelos celulares y
animales.
• Su objetivo es definir dianas terapéuticas en las
enfermedades
Investigación
traslacional
Protocolos de
tratamientos
2000
EVOLUCION EVOLUCION
CONOCIMIENTO EN CONOCIMIENTO EN
ENFERMEDADES ENFERMEDADES
GENETICAS GENETICAS
NEUROMUSCULARESNEUROMUSCULARES???
Descripción
enfermedad
Diagnóstico clínico
Diagnóstico genético 1985-1999
1950-80
1850-1890
Investigación traslacional en
enfermedades genéticas
• Conocimiento de la historia natural de la enfermedad
• Estudio determinantes genéticos y los posibles
modificadores del fenotipo
• Validar marcadores biológicos para el seguimiento de la • Validar marcadores biológicos para el seguimiento de la
evolución de la enfermedad y de protocolos
terapéuticos
• Elucidar los mecanismos patogénicos de la
enfermedad
• Definir dianas terapéuticas
Diagnóstico molecular por
amplificación selectiva del DNA
• PCR clásica o cualitativa
• PCR a tiempo real o cuantitativa relativa• PCR a tiempo real o cuantitativa relativa
• PCR digital
PCR convencional (cualitativa)PCR convencional (cualitativa)
RESULTADOS
COMIENZO
CICLOS
PCR a tiempo real (cuantitativa)PCR a tiempo real (cuantitativa)
FINAL
RESULTADOS
COMIENZO
CICLOS
FINAL
PCR digitalPCR digital
PCR digital
PCR digital
• PCR digital
– para cuantificación absoluta,
– detección de alelos raros poco representados– detección de alelos raros poco representados
– diagnóstico prenatal no invasivo
– detección de células circulantes tumorales.
Diagnóstico prenatal no invasivo
• Detección de DNA fetal en circulación
materna
• 95% del DNA libre en plasma o suero es • 95% del DNA libre en plasma o suero es
materno y menos de un 5% es fetal.
• Posibilidad de determinar cromosoma Y por
PCR a tiempo real.
• No es posible determinar los alelos
maternos que hereda el feto (todavía...)
Determinación cromosoma Y en sangre materna
Dos determinaciones:
una a partir de la semana 7 -8
embarazo
y otra en la 9-10
A=secuencia Y, B=secuencia control
Estudio de pérdidas o ganancias de
material genético
• Citogenética clásica y bandeos.
• FISH (Fluorescent in situ hybridization)• FISH (Fluorescent in situ hybridization)
• MLPA (Multiple ligation-dependent probe
hybridization)
• Array CGH (Comparative Genomic
Hybridization)
94-368Multiple ligation-dependent probe hybridization (MLPA)94-368
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
X-153.8FVIIIExon01A
X-153.8FVIIIExon01B
X-153.8FVIIIExon02
X-153.8FVIIIExon03A
X-153.8FVIIIExon03B
X-153.8FVIIIExon04
X-153.8FVIIIExon05
X-153.8FVIIIExon06
X-153.8FVIIIExon07A
X-153.8FVIIIExon07B
X-153.8FVIIIExon08
X-153.8FVIIIExon09
X-153.8FVIIIExon10
X-153.8FVIIIExon11
X-153.8FVIIIExon12A
X-153.8FVIIIExon12B
X-153.8FVIIIExon13
X-153.8FVIIIExon14A
X-153.8FVIIIExon14B
X-153.8FVIIIExon14C
X-153.8FVIIIExon15
X-153.8FVIIIExon16
X-153.8FVIIIExon17
X-153.8FVIIIExon18
X-153.8FVIIIExon19
X-153.8FVIIIExon20
X-153.8FVIIIExon21
X-153.8FVIIIExon22
X-153.8FVIIIExon23
X-153.8FVIIIExon24
X-153.8FVIIIExon25
X-153.8FVIIIExon26A
X-153.8FVIIIExon26B
c c c c c c c c c c
94-368
Multiple ligation-dependent probe hybridization (MLPA)
Summary of Microdeletion syndromes tested for by the P245 MLPA
microdeletion kit (www.mrc-holland.org)
Loci TestedAssociated Microdeletion/duplication Syndrome
1p36.33 1p36 Deletion syndrome
2p16.1 2p16 Deletion syndrome
3q29 3q29 Deletion syndrome
4p16.3 Wolf-Hirschhorn syndrome
5p15.33 Cri-du-Chat syndrom
5q35.3 SOTOS syndrome
7q11.2 Williams syndrome/7q11.23 duplication
8p23.1 8p23 Deletion syndrome8p23.1 8p23 Deletion syndrome
8q24 Langer-Gideon syndrome
9q22.33 9q22 Deletion syndrome
10p14 DiGeorge syndrome region
11p13 WAGR syndrome
15q11.2 Prader-Willi/Angelmans syndrome
15q24.1 15q24 Deletion syndrome
16p13.3 Rubinstein-Taybi syndrome
17p11.2 Smith-Magenis syndrome/17p11.2 duplication
17p13.3 Miller-Dieker syndrome
17q11.2 NF1 Deletion17q21.3117q21 Deletion syndrome
22q11.2 DiGeorge syndrome/22q11.2 duplication
22q13.3 Phelan-McDermid syndrome
Xq28 MECP2 duplication syndrome
jun-15
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
X-153.8FVIIIExon01A
X-153.8FVIIIExon01B
X-153.8FVIIIExon02
X-153.8FVIIIExon03A
X-153.8FVIIIExon03B
X-153.8FVIIIExon04
X-153.8FVIIIExon05
X-153.8FVIIIExon06
X-153.8FVIIIExon07A
X-153.8FVIIIExon07B
X-153.8FVIIIExon08
X-153.8FVIIIExon09
X-153.8FVIIIExon10
X-153.8FVIIIExon11
X-153.8FVIIIExon12A
X-153.8FVIIIExon12B
X-153.8FVIIIExon13
X-153.8FVIIIExon14A
X-153.8FVIIIExon14B
X-153.8FVIIIExon14C
X-153.8FVIIIExon15
X-153.8FVIIIExon16
X-153.8FVIIIExon17
X-153.8FVIIIExon18
X-153.8FVIIIExon19
X-153.8FVIIIExon20
X-153.8FVIIIExon21
X-153.8FVIIIExon22
X-153.8FVIIIExon23
X-153.8FVIIIExon24
X-153.8FVIIIExon25
X-153.8FVIIIExon26A
X-153.8FVIIIExon26B
c c c c c c c c c c
jun-15
Mujer con
deleción
exón 1
08-657
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
X-153.8FVIIIExon01A
X-153.8FVIIIExon01B
X-153.8FVIIIExon02
X-153.8FVIIIExon03A
X-153.8FVIIIExon03B
X-153.8FVIIIExon04
X-153.8FVIIIExon05
X-153.8FVIIIExon06
X-153.8FVIIIExon07A
X-153.8FVIIIExon07B
X-153.8FVIIIExon08
X-153.8FVIIIExon09
X-153.8FVIIIExon10
X-153.8FVIIIExon11
X-153.8FVIIIExon12A
X-153.8FVIIIExon12B
X-153.8FVIIIExon13
X-153.8FVIIIExon14A
X-153.8FVIIIExon14B
X-153.8FVIIIExon14C
X-153.8FVIIIExon15
X-153.8FVIIIExon16
X-153.8FVIIIExon17
X-153.8FVIIIExon18
X-153.8FVIIIExon19
X-153.8FVIIIExon20
X-153.8FVIIIExon21
X-153.8FVIIIExon22
X-153.8FVIIIExon23
X-153.8FVIIIExon24
X-153.8FVIIIExon25
X-153.8FVIIIExon26A
X-153.8FVIIIExon26B
c c c c c c c c c c
08-657
Varón con
duplicación
exones 2-10
Venceslá et al., (sometido)
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
ex1
ex2
ex3
ex5
ex7
ex8
ex10
ex12
ex13
ex14
ex15
ex17
ex19
ex21
ex23
ex25
ex26
Xp21
Xp22
Xq22
Xq26
Xq28
Doble duplicación en varón hemofílico de los exones 14 y 23-25
Array CGH(hibridación genómica
comparada)
• Array CGH
– para determinar pérdidas o ganancias de material genético y reordenamientos no equilibrados en el genoma completo de un equilibrados en el genoma completo de un individuo.
– Detecta desequilibrios geneticos a mayor resolución (60Kb) comparado con el cariotipo (5-10Mb), lo que representa unas 1000 veces incremento en la resolución.
Efectividad diagnóstica en trastornos
aprendizaje y retardo mental
inespecífico
• Cariotipo 3-4%
• MLPA 8%
• Array CGH 15-20%
From the 1st April 2012
Array Comparative
Genomic Hybridization
(array CGH) will replace
karyotyping and MLPA as
a first line service for a
defined cohort of patients.
No permite diagnóstico de reordenamientos
Indicaciones: TEA, RM, MC
No permite diagnóstico de reordenamientos
cromosómicos equilibrados ni mosaicismos
de bajo porcentaje (40%)
CODIGO
GENETICO
DISCRIMINACIÓN ALÉLICA DE “PEQUEÑA ESCALA”
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO
II. Secuenciación clásica (Sanger)
1 cap. -> 1 muestra/ 7 días lab8 cap. 24 cap. ->1 muestra (5,50h)
Ej – Beta globina
- Análisis mutacional de los genes de gran tamaño:
· susceptibilidad al CMOH (BRCA1 y BRCA2), aprox. 80 amplicones = 160 reacc sec.
· Hemofilia A
· Distrofina (DMD) (ARN)
Cambio G>ACambio G>A
CGC>CACCGC>CAC
Secuenciación Secuenciación
automáticaautomática
Arginina x HistidinaArginina x Histidina
Secuenciación Masiva
• Permite el estudio de todo el genoma o
regiones muy extensas (por ejemplo
exomas) en un corto período de tiempo. exomas) en un corto período de tiempo.
• Es útil para identificar nuevos genes,
mutaciones intrónicas o para secuenciar a la
vez un número de genes establecidos.
· Como el genoma humano es tan largo, debe ser cortado en pequeños fragmentos y leerlos uno por uno, para luego ensamblarlos usando ordenadores.
· Pero, no basta con secuenciar una vez el genoma ya que pueden haber fragmentos que se pierdan en el
1000 genomes: analizó todo el genoma de 179 individuos, generando uncatálogo de más de 8 millones de SNPs y más de 1 millón de variantesestructurales (indels).
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO
II. SECUENCIACIÓN
que pueden haber fragmentos que se pierdan en el proceso, otros que sean mal secuenciados y otros que se secuencien repetidas veces. Estos problemas pueden generar vacíos al momento de ensamblar el genoma. Así que para tener un genoma completo, sin errores y espacios en blanco, la profundidad de la secuenciación debe ser mayor.
· Se debe secuenciar el ADN de una persona unas 28 veces (28X) para obtener un genoma sin espacios vacíos o errores. Además, se debe contar con genomas patrones para poder hacer el ensamblaje de los pequeños fragmentos generados.
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO GENOTÍPICO
Sistemas de alto rendimiento – NGS (“Next Generation Sequencing”)
iPSCs (induced Pluripotent Stem
Cells)
• Una nueva metodología que permite
reprogramar las células del paciente
(generalmente fibroblastos o queratinocitos (generalmente fibroblastos o queratinocitos
de piel) para transformarlas en distintos
tipos celulares (nervioso, hepático,
cardíacas, musculares).
Fibroblastos
Lentivirus (+ 4 Lentivirus (+ 4 genes)
iPS (induced pluripotent stem cells)
Diferenciación
-
In collaboration with Royal Holloway Hospital London.
Behaviour and phenotype of motor neurons
Response to drugs
Expression analysis
RNA NGSBoza et al., unpublished results
(Ebert & Svendensen, 2010) Boza et al., unpublished results
Nuevos medios para viejos fines
• PCR digital
• Array CGH
• Secuenciación Masiva• Secuenciación Masiva
• Generación de iPSCs (induced
pluripotential stem cells) de pacientes
Nuevos medios para viejos fines
• Mejores herramientas y metodologías que
complementan y completan el diagnóstico
genético. (PCR digital,Array CGH, genético. (PCR digital,Array CGH,
Secuenciación Masiva)
• Mejores modelos celulares que nos
permiten estudiar el tejido o las células
directamente involucradas en la enfermedad
(Generación de iPSC de pacientes)