Beta Ciclodextrina Utilizada Para Conservar Manzana Fresca

Efecto de las ciclodextrinas en la inhibición de la polifenol oxidasa de manzana, como

herramienta en la conservación de manzana fresca cortada

Emilio Alvarez-Parrilla, Laura A. de la Rosa, Joaquín Rodrigo, Karla A. Salazar, Rene Escobedo González, Gilberto Mercado Mercado, Edgar Moyers Montoya y Alma Vázquez

Flores.

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Instituto de Ciencias Biomédicas. Departamento de Ciencias Básicas. Programa de Química. Anillo Envolvente del PRONAF y Estocolmo s/n. 32300,

Cd. Juárez, Chihuahua, México. e-mail: [email protected]

Simposium “Nuevas tecnologías de conservación y envasado de frutas y hortalizas. Vegetales frescos cortados” La Habana, Cuba. Marzo 2005 81

Proyecto XI.22 Desarrollo de tecnologías para la conservación de vegetales frescos cortados

Introducción

En los últimos años, ha existido una tendencia creciente a consumir frutas y vegetales frescos cortados, debido al acelerado ritmo de vida aunado a una mayor preocupación por mantener una alimentación saludable. Uno de los principales problemas para la comercialización de los productos frescos cortados, es el pardeamiento enzimático ocasionado por la actividad de la enzima polifenol oxidasa (PPO, EC 1.14.18.1). Actualmente se utilizan diferentes sustancias de origen natural, entre los que destacan el 4-hexilresorcinol y el metil jasmonato, para evitar el pardeamiento enzimático y aumentar la vida de anaquel de estos productos. Las ciclodextrinas son un conjunto de moléculas cíclicas naturales, constituidas por 6, 7 u 8 unidades de a-D-glucosa, que tienen la capacidad de albergar moléculas orgánicas en su interior (formación de un complejo de inclusión). Por ello, existen algunos estudios en los cuales se ha demostrado que son capaces de inhibir la actividad de la PPO, al formar complejos de inclusión con los sustratos de la enzima, evitando así su oxidación.

Existen pocos trabajos en los que se estudia el efecto combinado de la acción de la ciclodextrina con otros inhibidores del pardeamiento, por ello, en el presente trabajo se presentan los resultados

de la acción combinada de la ciclodextrina con estos dos inhibidores, sobre la actividad de la PPO de manzana Red Delicious. Estos resultados demuestran que la mezcla de la ciclodextrina con los inhibidores de la PPO tiene un mayor efecto inhibitorio que el inhibidor o la ciclodextrina solos.

Las unidades de a-D-glucosa de las ciclodextrinas están unidas entre sí mediante enlaces glicosídicos a (1,4), que se denominan a, b- y g-ciclodextrina, respectivamente (Figura 1).

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

HO

H

HO

H

H

OH

O

O

H

H OH

HO

HO

H

H

OHO

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

OH

H

H

HO

O

O

H

HHO

H

OOH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

OH

H

O

HO

H

H

OH

O

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OHH

H

HO

O

H

H OH

H

OHO

H

H

OH

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

HO

H

O

HO

H

H

OH

O

HH

OH

HHO

H

H

OH

O

O

H

HOH

H

O

HO

H

H OHO

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

O

HH

HO

HO H

H

H

HO

O

O

H

HHO

H

OOH

H

HHO

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

HO

H

HO

H

H

OH

O

O

H

H OH

HO

HO

H

H

OHO

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

OH

H

H

HO

O

O

H

HHO

H

OOH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

OH

H

O

HO

H

H

OH

O

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OHH

H

HO

O

H

H OH

H

OHO

H

H

OH

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

HO

O

H

H

HO

H

O

OH

H

H

OH

O

H

H

HO

H

O

HO

H

H

OH

O

HH

OH

HHO

H

H

OH

O

O

H

HOH

H

O

HO

H

H OHO

H

H

OH

H

O

HO

H

H

HO

O

H

H

OH

H

O

OH

H

H

HO

O

HH

HO

HO H

H

H

HO

O

O

H

HHO

H

OOH

H

HHO

4.7 – 5.3 Å 6.0 – 6.5 Å 7.5 -8.3 Å

(a) (b) (c)

Figura 1. Representación esquemática y diámetro interno de la

a- (a), b- (b) y g-ciclodextrina (c).

Simposium “Nuevas tecnologías de conservación y envasado de frutas y hortalizas. Vegetales frescos cortados” La Habana, Cuba. Marzo 2005


Son obtenidas a partir de la degradación enzimática del almidón por la acción de la enzima ciclodextrin-transglicosilasa (CTGasa, E. C. 2.4.1.19), proveniente del microorganismo Bacillus macerans. Esta enzima produce, mediante una reacción intramolecular, la ciclación de una cadena de glucosas del almidón, con eliminación de una molécula de agua (Szejtli, 1988).

Las ciclodextrinas poseen una conformación tridimensional en forma de cono truncado, en la que todos los hidroxilo primarios (unidos al carbono 6) de las unidades de glucosa están situados en uno de los bordes del cono (parte estrecha del mismo) y todos los hidroxilo secundarios (unidos a los carbonos 2 y 3) en el otro (parte ancha). El interior de la cavidad posee un carácter hidrofóbico debido a la presencia de los hidrógenos 3 y 5 de las glucosas que se encuentran orientados hacia la parte interna de la misma. Esta doble característica, por un lado tener un exterior hidrofílico y por el otro una cavidad hidrofóbica, hace que tengan la capacidad de albergar moléculas orgánicas en su interior, formando los denominados complejos de inclusión.

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

+K11

Figura 2. Representación esquemática de la formación de un complejo de inclusión.

Durante la formación de los complejos de inclusión se modifican las propiedades fisicoquímicas de las moléculas huésped, hecho que ha sido aprovechado en la industria de alimentos con la finalidad de modificar diversas propiedades, organolépticas o nutricionales de los alimentos. Así, las ciclodextrinas se han utilizado para evitar la pérdida de compuestos volátiles como aromas; elaboración de alimentos bajos en colesterol; reducir el pardeamiento enzimático de jugo de manzana, entre otras aplicaciones (Szejtli, 1998).

Uno de los principales problemas en la elaboración y comercialización de frutos y

vegetales frescos cortados, es el pardeamiento enzimático que se desarrolla en el alimento como consecuencia de los procesos de manipulación. Este pardeamiento es producido principalmente por la acción de la polifenol oxidasa (PPO, EC 1.14.18.1), enzima que cataliza la oxidación de fenoles a o-quinonas en presencia de oxígeno, utilizando al cobre como grupo prostético (Janovitz-Klapp y col., 1990). Inicialmente, la PPO cataliza la hidroxilación en posición orto de los fenoles para producir o-difenoles (actividad cresolasa), y posteriormente oxida dichos difenoles para formar las o-quinonas (actividad catecolasa). El pardeamiento final de los vegetales frescos cortados es consecuencia de la síntesis de compuestos coloreados (melaninas) producidos por la polimerización de las quinonas, en presencia de aminoácidos y proteínas (Figura 3).

El método más utilizado para evitar el pardeamiento enzimático en alimentos es el uso de sulfitos. Sin embargo, debido a sus efectos adversos sobre la salud, la FDA ha prohibido su uso para la conservación de frutas y vegetales frescos (Mar Sojo y col., 1999). Dentro de los principales inhibidores de la PPO se encuentra el 4-hexilresorcinol (4HR), compuesto reconocido como GRAS (generalmente reconocido como seguro, por sus siglas en inglés) que se utiliza principalmente en la prevención del pardeamiento de la carne de camarón, y que recientemente se ha utilizado para conservar manzanas frescas cortadas (Monsalve-González y col., 1995). A diferencia de los sulfitos, que inhiben el pardeamiento mediante una reacción de reducción de las o-quinonas formadas, el 4HR actúa directamente sobre la PPO, impidiendo la formación de los productos de oxidación de los fenoles.

Sustrato + Ciclodextrina Complejo

o-Quinonas

Pardeamiento

PPO

o-Quinonas

Pardeamiento

PPO

Aminoácidos

K11

Figura 3. Representación esquemática del efecto de las ciclodextrinas en la actividad de la PPO.

82

Alvarez Parrilla E. y col.

Diversos autores han demostrado que en presencia de b-ciclodextrina, los sustratos de la PPO forman complejos de inclusión (Fukuda y col., 1999; Meijide y col., 2001; Rodrigues y col., 2002; Alvarez-Parrilla y col., 2005). Al estar el sustrato en el interior de la cavidad de la ciclodextrina, la PPO no es capaz de oxidarlo, con lo cual se observa una inhibición de la actividad de esta enzima (Fayad y col., 1997; Mar Sojo y col., 1999; Nuñez-Delicado y col., 2003), al disminuir la concentración de sustrato disponible, tal como se muestra en la figura 3.

Existen pocos estudios en los que se haya analizado el efecto combinado sobre la actividad enzimática de ciclodextrinas y otros inhibidores. Mar Sojo y col. (1999), observaron que en presencia de un sustrato hidrosoluble, la ciclodextrina no tuvo un efecto inhibitorio sobre la actividad de la PPO de plátano. Por otra parte, al combinar ciclodextrina con inhibidores de la PPO (ácido cinámico y 4-Yodo fenol), la PPO fue inhibida en menor grado que en la ausencia de ciclodextrina. Estos autores atribuyen este comportamiento contrario a lo descrito anteriormente para PPO de otros frutos, a que la ciclodextrina compleja a los inhibidores, con lo cual, al no estar disponibles disminuyen su actividad.

Sin embargo, en estudios desarrollados con jugo de manzana, se ha observado que al utilizar las ciclodextrinas combinadas con otros inhibidores del pardeamiento (ácido ascórbico, cítrico, entre otros), la mezcla de ambos compuestos produce un mayor efecto inhibitorio que el de la ciclodextrina o inhibidores por separado (Sapers y Douglas 1987).

Debido a la falta de mayor información sobre el efecto combinado de ciclodextrinas e inhibidores de la PPO, el objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de la ß-ciclodextrina, 4-hexilresorcinol (4HR) y metil jasmonato (MJ) solos y combinados sobre la actividad de la PPO de manzana.

Metodología.

2.1. Reactivos e instrumental. La ß-ciclodextrina (CAVAMAX C-7, Donada

por Wacker Biochem Corp., México) se secó a

vacío a 60°C sobre pentóxido de fósforo hasta peso constante. El ácido clorogénico (AC), 4-hexilresorcinol (4HR), metil jasmonato (MJ), polivinil polipirrolidona (PVPP), reactivo de Bradford, albúmina de suero bovino (BSA), así como todas las sales, fueron adquiridos a SIGMA, y utilizados sin purificación previa. Las manzanas de la variedad Red Delicious fueron adquiridas en supermercados de Ciudad Juárez, y almacenadas a 4°C hasta su uso.

2.2 Extracción de la Polifenol Oxidasa (PPO). La extracción de la PPO de manzana se realizó

de acuerdo a la metodología propuesta por Soliva-Fortuny y col., (2001), tal como se muestra en la figura 4. Veinticinco g de manzana pelada se homogenizaron con 25 mL de amortiguador McIlvaine pH 6.5 (ácido acético 0.03 M; fosfato monoácido de potasio 0.14 M; cloruro de sodio 1 M) y 5% (p/p) de PVPP (para precipitar fenoles) durante 5 min. A continuación se centrifugó a 2500 rpm por 30 min. a 4ºC (Centrífuga IEC NH-SII centrifuge). El sobrenadante se filtró a través de un filtro Whatman No. 1 y la concentración de proteína se determinó mediante el método de Bradford. Para ello se utilizó BSA como estándar, y las mediciones se realizaron en un lector de microplacas (BioRad Benchmark Plus). Una vez cuantificada la proteína, ésta se almacenó a -20ºC hasta su uso (menos de una semana).

Homogenizar 25 g de manzana con 25 mL de amortiguador McIlvaine, pH 6.5

Adicionar 5% p/v de PVPP para precipitar fenoles

Centrifugar a 4°C durante 30 min.

Filtrar y cuantificar proteína

50 mg/mL

Figura 4. Diagrama de flujo para la extracción de PPO de manzana Red Delicious.






2.3 Actividad Enzimática. La actividad enzimática se determinó

espectroscópicamente (Agilent 8453), a partir de la medición de la oxidación del AC a 400 y 420 nm, en presencia de 6 µg/mL de proteína, a 25ºC, pH 5 (amortiguador citrato 0.1 M). Las medidas se realizaron en una cubeta de cuarzo de 1 cm. de espesor con capacidad para 1 mL. Se ajustó la concentración de proteína de manera que en todos los experimentos se adicionaran 100 µL de extracto a 900 µL de amortiguador citrato con diferentes concentraciones de AC (10, 5, 2, 1 y 0.5 mM). Para determinar la influencia de los inhibidores se prepararon disoluciones de 4HR (0.5 mM), ß-CD (5 mM) y mezcla de inhibidores (4HR 0.5 mM + ß-CD 5 mM) en citrato, las cuales se utilizaron para preparar los 900 µL de AC a las diferentes concentraciones. La velocidad inicial (V0) se determinó a cada concentración de sustrato a partir de la región lineal del cambio de absorbancia en función del tiempo.

Los datos de velocidad inicial frente a concentración de sustrato, en ausencia de inhibidores, se utilizaron para calcular los parámetros cinéticos KM y Vmax, mediante un ajuste no lineal (Sigma Plot 8.0) a la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 1) y un ajuste lineal, según el método de Lineweaver-Burk (ecuación 2):

En presencia de inhibidores competitivos, se calculó la constante aparente () mediante las ecuaciones 1 y 2. A partir de estos valores, se determinó la constante de disociación enzima-inhibidor (Ki), por medio de la ecuación 3:

donde [I] es la concentración (mM) de inhibidor

2.4 Análisis Estadístico. Todos los experimentos se realizaron un

mínimo de cuatro veces, y los resultados se presentan como media ± ESM. Para cada concentración de sustrato, el efecto de los inhibidores se determinó mediante un análisis de varianza de una vía, y las diferencias entre tratamientos se analizaron por medio de un estudio de mínima diferencia significativa (LSD) con un a 0.05. Los análisis se realizaron en el programa estadístico SPSS 12.0.

Resultados y Discusión.

La PPO de manzana Red Delicious fue parcialmente purificada a partir de la pulpa de manzana pelada, de acuerdo al método descrito por Soliva-Fortuny y col., (2001) utilizando sistema amortiguador McIlvaine a pH 6.5 y PVPP al 5% (p/p) para eliminar los fenoles presentes en la manzana. Al final de la extracción se obtuvo una concentración de proteína de aproximadamente 50 a 60 mg/mL. Al ser al AC uno de los principales sustratos de la PPO en manzana, en este trabajo se decidió utilizarlo para llevar a cabo los estudios de inhibición.

A pesar de que Richard-Forget y col. (1995), observaron que la o-quinona del AC presenta su máximo de absorción alrededor de los 325 nm, se decidió realizar los estudios cinéticos a 400 nm (longitud de onda donde la quinona presenta un pico de menor intensidad), ya que, como se muestra en la figura 5, al analizar la variación temporal de los espectros de absorción de una disolución de AC 10 mM en presencia de 6mg/mL de PPO de manzana, se observa que la mayor variación se presenta en torno a los 400 nm. Es importante destacar que a esta longitud de onda ni el 4HR, cuyo máximo de absorción esta en torno a los 290 nm, ni el MJ presentaron una absorbancia

(Ecuación 1)

(Ecuación 2)

(Ecuación 3)

84


l / nm

ab

so

rban

cia

300 320 340 360 380 400 420 4400.0

0.4

0.8

1.2

1.6

10 min

0 min

l / nm

ab

so

rban

cia

300 320 340 360 380 400 420 4400.0

0.4

0.8

1.2

1.6

300 320 340 360 380 400 420 4400.0

0.4

0.8

1.2

1.6

10 min

0 min

Figura 5. Variación temporal del espectro de absorción de AC (10 mM) en presencia de PPO de manzana (6 µg/mL). Sistema amortiguador citratos 0.1 M pH 5 a 25°C.

Pruebas preliminares mostraron que la actividad enzimática de la PPO de manzana fue muy rápida, motivo por el cual la cinética de oxidación de AC se monitorizó solamente durante 2 minutos, al cabo de los cuales, la coloración de la disolución en la cubeta pasó de incoloro a un color paja intenso. Esta cinética tan veloz concuerda con la rapidez con que la manzana Red Delicious se pardea una vez cortada. En la figura 6 se muestra el efecto de la b-CD (5 mM), 4HR (0.5 mM) y la mezcla de ambos inhibidores (b-CD 5 mM + 4HR 0.5 mM) sobre la velocidad de oxidación catalizada por la PPO de manzana Red Delicious, en presencia de diferentes concentraciones de sustrato (AC) así como el ajuste no lineal de los valores experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten (ecuación 1). Los valores representan el valor medio de por lo menos cuatro repeticiones, y en ellos es posible observar que hubo una gran variabilidad debido a la diferencia de actividad enzimática entre manzanas. También se observa que todos los tratamientos produjeron una inhibición en la actividad enzimática de la PPO.

[AC] / mM

0 2 4 6 8 100.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025control

Vo

/U

ab

sS

-1

4HR / 0.5 mM

BCD/ 5.0 mM

Mezcla (CD+ 4HR)

§§

* **

[AC] / mM

0 2 4 6 8 100.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025control control

Vo

/U

ab

sS

-1V

o/

Ua

bsS

-1

4HR / 0.5 mM

BCD/ 5.0 mMBCD/ 5.0 mM

Mezcla (CD+ 4HR)Mezcla (CD+ 4HR)

§§

* **

Figura 6. Efecto del 4HR, b-CD y mezcla sobre la velocidad de oxidación del AC por PPO de manzana Red Delicious (6µg/ mL). Los símbolos representan los valores experimentales (± ESM). Las líneas corresponden a los ajustes no lineales por mínimos cuadrados a la ecuación de Michaelis y Menten. *representa diferencia significativa (LSD, p = 0.05) de todos los tratamientos respecto al control. § representa diferencia significativa (LSD, p = 0.05) solamente de la mezcla respecto al control.

La concentración utilizada de 4HR esta en el mismo orden de magnitud que la utilizada por otros autores para inhibir el pardeamiento de productos de manzana minimamente procesados (Monsalve-González y col., 1995). Cabe destacar que el porcentaje de inhibición producido por el 4HR que se observó en el presente trabajo, es menor al descrito por Monsalve-González y col., sin embargo, esto se puede deber a la variedad de manzana utilizada, ya que la manzana Red Delicious es una de las que presenta mayor concentración y actividad de la PPO (Janovitz-Klapp y col., 1990).

Al analizar el efecto de la b-CD y del 4HR, se observa que a las concentraciones estudiadas, ambos compuestos inhibieron la actividad de la PPO de manera muy similar. Esta inhibición es mayor a concentraciones bajas de sustrato, lo que hace suponer que actúan como inhibidores competitivos. Sin embargo, la forma de actuar de ambos inhibidores es diferente. Mientras que la inhibición de la PPO por parte del 4HR se debe a que este se asocia con la enzima formando un






complejo inactivo que detiene la reacción de pardeamiento en los pasos iniciales (Lambrecht 1995), por lo que actúa como un inhibidor competitivo de fijación lenta (Jiménez y col., 1998). El efecto inhibitorio de la b-CD sobre la actividad de la PPO ha sido atribuido a que forma complejos de inclusión con el sustrato, y en consecuencia disminuye la concentración de sustrato libre que puede ser oxidado por la enzima (Fayad y col., 1997; Mar Sojo y col., 1999; Nuñez-Delicado y col., 2003).

Teniendo en cuenta que la b-CD forma complejos de inclusión con el AC, con una constante de equilibrio del orden de 465 M-1, para la máxima concentración de AC estudiada (10 mM), la concentración de AC libre (que no se encuentra complejado y sobre el que puede actuar la PPO) es de 6.3 mM. A partir de la figura 6, podemos suponer que, a una concentración libre de AC 6.3 mM, la PPO control (en ausencia de CD) presentaría una actividad de aproximadamente 0.0018 Uabss-1, mientras que en presencia de b-CD la PPO muestra una actividad menor, cercana a 0.0014 Uabss-1. Por lo tanto, estos datos sugieren que el efecto inhibitorio de la b-CD sobre la PPO no es exclusivamente debido a la complejación del sustrato, sino que pudiese existir otro mecanismo implicado, tal como se ha sugerido en la inhibición de la tirosina fenol liasa por derivados de CD (Koralewska y col., 2004). Se requieren estudios posteriores para investigar dicha posibilidad.

Por último, la combinación de b-CD y 4HR produjo una inhibición de la PPO mayor que la inducida por ambos inhibidores por separado. Este efecto es mas claro a concentraciones elevadas de sustrato, ya que a partir de los 5 mM de AC, únicamente es significativa la inhibición de la PPO inducida por la mezcla de inhibidores. Este efecto es contrario al descrito por Mar Sojo y col. (1999) en PPO de plátano, donde la mezcla de derivados de b-CD e inhibidores tuvo un efecto menor que los inhibidores en ausencia de ciclodextrina. Sin embargo, en aquel estudio se sugirió que el sustrato utilizado (dopamina) no formaba complejos de

inclusión con la b-CD, mientras que los inhibidores (ácido cinámico y 4-yodofenol) sí los formaban y estos complejos perdían parte de su efecto inhibitorio.

El efecto sinérgico entre la b-CD y el 4HR observado en el presente trabajo, concuerda con el observado en la inhibición del pardeamiento de jugo de manzana tratado con 4HR en combinación con antioxidantes (Monsalve-González y col., 1995). La combinación de b-CD con antioxidantes también ha mostrado un efecto sinérgico sobre la inhibición del pardeamiento de jugo de manzana (Sapers and Douglas, 1987)

Para conocer el tipo de inhibición producida por 4HR y b-CD, se determinaron los parámetros K´M y Vmax mediante dos métodos: una representación de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk (figura 7), así como un ajuste no lineal (figura 6).

En la figura 7 se observa que ambos inhibidores presentaron un comportamiento similar, sin embargo, la comparación de los parámetros mostrados en la tabla 1 indica que mientras que el 4HR presentó un tipo de inhibición competitiva, concordando con estudios previos (Jiménez y col., 1998). La b-CD, por su parte, muestra un comportamiento que podría considerarse mixto. Koralewska y col. (2004) también han sugerido un tipo de inhibición mixta producida por derivados de b-CD en la enzima tirosina fenol liasa.

A partir de los valores de K´M calculados en presencia de inhibidores, se determinaron las constantes de inhibición (ecuación 3), las cuales se presentan en la tabla 1. Esta constante representa la constante de disociación del complejo enzima-inhibidor, por lo tanto, mientras menor sea el valor de esta constante, mayor será el efecto inhibitorio.

Así, se puede observar que el 4HR es alrededor de 10 veces más eficaz como inhibidor de la PPO que la b-CD. Una conclusión similar se puede obtener del análisis de la figura 6 en la cual una concentración 10 veces mayor de b-CD presenta un efecto equivalente al de una baja concentración de 4HR (0.5 mM).

86


1/ [AC]

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

1/

V

o

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000Control4-HR / 0.5 mMb-CD / 5.0 mMMezcla (4-HR + b-CD)

1/ [AC]

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

1/

V

o

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000Control4-HR / 0.5 mMb-CD / 5.0 mMMezcla (4-HR + b-CD)

Figura 7. Gráfica de Lineweaver-Burk de la inhibición de la actividad de la PPO de manzana por 4HR, -CD y mezcla de ambos inhibidores.

Tabla 1. Parámetros cinéticos de la PPO de manzana Red Delicious.

1V 2.9 2.8 2.2 2.5max1K´ 3.39 9.86 4.20 8.35M2V 3.0 2.8 2.9 2.1max2K´ 3.68 10.84 6.62 6.4M

K 0.26 8.38 3.42i

Control 4HR MJ* b-CD

-1 3 1Vmax: U /10 ; K´M: mM; Ki: mM; valores obtenidos por ajuste abss2no lineal a la ecuación 1; valores obtenidos por ajuste lineal a la

ecuación 2; *resultados preliminares.

Finalmente, considerando que existen diversos trabajos en los cuales se ha utilizado con éxito al MJ para mantener la calidad de frutos tropicales (González-Aguilar y col., 2003), se estudió el efecto de este compuesto natural sobre la actividad PPO de un extracto de manzana. En la figura 8 se muestran resultados preliminares (representan solo 2 repeticiones) que indican que el MJ (2 mM) presenta un efecto inhibitorio ligeramente menor que el de la ciclodextrina (5 mM). No se estudió el efecto de una mayor concentración de MJ, debido a que esta es su máxima solubilidad en disolución acuosa. La figura 8b, así como los datos de la tabla 1 sugieren que el MJ se comporta como un

inhibidor mixto, al presentar una Vmax reducida con respecto al control y un mayor K´M. Así mismo, el valor de Ki indica que el MJ tiene una afinidad por la enzima menor que el 4HR y la b-CD y por ello una menor actividad inhibitoria. Estos resultados también parecen indicar que no existe un efecto sinérgico entre la b-CD y el MJ como inhibidores de la PPO. Esto puede ser debido a que la b-CD forma complejos de inclusión con el MJ, con una constante de equilibrio similar a la del AC (datos no publicados), con lo que en el sistema se plantea un equilibrio competitivo entre ambos huéspedes (AC y MJ), que da como resultado una mayor concentración de AC libre.

[AC] / mM0 2 4 6 8 10

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

Vo

/U

ab

sS

-1

control

MJ / 0.5 mM b-CD / 5.0 mMMezcla (MJ + b-CD)

[AC] / mM0 2 4 6 8 10

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

Vo

/U

ab

sS

-1V

o/

Ua

bsS

-1

control


control


1/ [AC]0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1/

V

o

control


1/ [AC]0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1/

V

o

Figura 8. Efecto de la concentración de sustrato sobre la

actividad de PPO en ausencia y presencia de MJ, b-CD y mezcla de ambos a) representación de Michaelis-Menten y b) representación de Lineweaver.






Conclusiones.

Los resultados mostrados en el presente trabajo sugieren que los tres compuestos estudiados (4HR, MJ y b-CD) inhiben en diferente grado la actividad de la PPO de manzana. Así mismo, el uso de la b-CD en combinación con 4HR, a las concentraciones estudiadas, presentó un efecto sinérgico sobre la inhibición enzimática, lo cual podría tener importancia en la industria de alimentos como herramienta para la conservación de manzana fresca cortada. A pesar de que se ha descrito el uso de MJ en la conservación de diversas frutas y vegetales, no se conocen estudios con manzana, con lo cual, los resultados aquí presentados sugieren que su uso podría ser apropiado. Es importante resaltar que el MJ, además de sus múltiples efectos sobre el tejido vegetal, posee un efecto directo como inhibidor parcial de la polifenol oxidasa.

Agradecimientos.

Los autores agradecen al Fondo Sectorial SAGARPA-CONACYT (proyecto SAGARPA-2002-C01-0787), a la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (proyectos internos) y a CYTED (Proyecto XI. 22) por el financiamiento brindado.

Bibliografía

Alvarez-Parrilla, E., de la Rosa, L. A., Torres-Rivas, F., Rodrigo-García, J. and González-Aguilar, G. A. 2005. Complexation of apple antioxidants: chlorogenic acid, quercetin and rutin by b-cyclodextrin (b-CD). J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem. En prensa.

Fayad, N., Marchal, L., Billaud, C. and Nicolas, J. 1997. Comparison of b-cyclodextrin effect on polyphenol oxidation catalyzed by purified polyphenol oxidase from different sources. J. Agric. Food Chem. 45(7): 2442-2446.

Fukuda, T., Maeda, Y. and Kitano, H. 1999. Stereoselective inclusion of DOPA derivatives by a self-assembled monolayer of thiolated cyclodextrin on a gold electrode. Langmuir 15(5): 1887-1890.

González-Aguilar, G. A., Buta, J. C. and Wang, C. Y. 2003. Methyl jasmonate and modified atmosphere packaging (MAP) reduce decay and maintain postharvest quality of papaya "Sunrise". Postharvest Biol. Technol. 28: 361-370.

Janovitz-Klapp, A. H., Richard, F. C., Goupy, P. M. and Nicolas, J. J. 1990. Kinetic studies on apple polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 38(7): 1437-1441.

Jiménez, M., Escribano-Cebrián, J. and García-Carmona, F. 1998. Oxidation of the flavonol fisetin by polyphenol oxidase. Biochim. Biophys. Acta 1425: 534-542.

Koralewska, A., Augustyniak, W., Temeriusz, A. and Kanska, M. 2004. Effects of cyclodextrin derivatives on the catalytic activity of tyrosine phenol-lyase. J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem. 49: 193-197.

Lambrecht, H. S. 1995. Sulfite substitutes for the prevention of enzymatic browning in foods. Enzimatic browning and its prevention. C. Y. Lee and J. R. Whitaker. USA, American Chemical Society: 313-324.

Mar Sojo, M., Nuñez-Delicado, E., García-Carmona, F. and Sánchez-Ferrer, A. 1999. Cyclodextrins as activator an inhibitor of latent banana pulp polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 47(2): 518-523.

Meijide, F., Pérez, J., Ramos Cabrer, P., Seijas, J. A., Ulloa, H., Fraga, F. and Vázquez Tato, J. 2001. Thermodynamic interactions of model allelopathic compounds (polyphenols) with a- and b-cyclodextrin. Biolog. J. Armenia 53(special issue): 207-217.

Monsalve-González, A., Barbosa-Canovas, G. V., McEvily, A. J. and Iyengar, R. 1995. Inhibition of enzymatic browning in apple products by 4-hexylresorcinol. Food Technology: 110-118.

Nuñez-Delicado, E., Mar Sojo, M., García-Carmona, F. and Sánchez-Ferrer, A. 2003. Partial purification of latent persimmon fruit polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. 51(7): 2058-2063.

Richard-Forget, F., Amiot, M. J., Goupy, P. M. and Nicolas, J. 1995. Evolution of chlorogenic acid o-quinones in model solutions.

88


Enzimatic browning and its prevention. C. Y. Lee and J. R. Whitaker. USA, American Chemical Society: 144-158.

Rodrigues, E., Vaz, S., Gil, V. M. S. S., Caldeira, M. M. and Moreira da Silva, A. M. G. 2002. Inclusion of polyphenol oxidase substrates in b-cyclodextrin: a 1H-NMR study. J. Inclusion Phenom. Macrocyclic Chem. 44: 395-397.

Sapers, G. M. and Douglas, F. W. 1987. Measurement of enzymatic browning at cut surfaces and juice of raw apple and pear fruits. J. Food Sci. 52(5): 1258-1262.

Soliva-Fortuny, R. C., Grigelmo-Miguel, N., Odriozola-Serrano, I., Gorinstein, S. and N Martín-Belloso, O. 2001. Browning evaluation of ready-to-eat apples as affected by modified atmosphere packaging. J. Agric. Food Chem. 49(8): 3685-3690.

Szejtli, J. 1988. Cyclodextrin Technology. Dordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers.

Szejtli, J. 1998. Introduction and general overview of cyclodextrin chemistry. Chem. Rev. 98(5): 1743-1754.




Beta Ciclodextrina Utilizada Para Conservar Manzana Fresca

Documents

Transcript of Beta Ciclodextrina Utilizada Para Conservar Manzana Fresca