Biología Molecular aplicada a Inmunohematología

Patricia Peralta Moncada

Universidad de Chile

• Introducción.

• Utilidades de las técnicas moleculares en inmunohematología.

• Técnicas utilizadas.

• Revisión rápida de un trabajo de investigación.

• Conclusiones.

Temas a tratar

Introducción

• La hemaglutinación ha permitido el desarrollo y la práctica de la medicina transfusionaldurante el siglo XX.

• La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero de pacientes oreactivos comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología:• Determinación de grupo ABO, Rh.• Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy)• Detección de anticuerpos irregulares.• Pruebas de compatibilidad.

• Limitaciones:• Fenotipo de pacientes politransfundidos.• Fenotipo de pacientes con GR recubiertos de Ig.• Identificación de variantes.• Discrepancias.• Falta de reactivos para detección de algunos antígenos.• Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.

Introducción

• Las técnicas que involucran al ADN han llevado a entender las bases molecularesde muchos de los sistemas sanguíneos.

• Existen muchos eventos moleculares que llevan a la formación de antígenosdistintos, y por ende, fenotipos distintos.

• La mayoría son consecuencia de SNPs (single-nucleotide polymorphism).

Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación

Eventos moleculares que llevan a antígenos y fenotipos de los grupos sanguíneos

Conversión genética o eventos de recombinación (MNSs, Rh, Ch/Rg)

Duplicación de un exón (Gerbich)

Deleción de un gen, exón o nucleótidos (ABO, Rh, MNS, Kel, Duffy, Dombrock)

Inserción de nucleótido (s) (Rh, Colton)

Sustituciones de un solo nucleótido SNPs (La mayoría)

Utilidades

• Como complemento a la investigación serológica.

• Se recomienda la genotipificación en pacientes con múltiplestransfusiones como parte del proceso de identificación deanticuerpos.

• Particularmente útil en pacientes dependientes de transfusionesque han producido aloanticuerpos.

Pacientes con transfusiones múltiples

• No pueden ser fenotipificados de manera exacta la mayoría de lasveces.

• Mejoraría la posibilidad de encontrar unidades compatibles.

Pacientes con GR recubiertos de IgG (AHAI)

Utilidades

• Para posibles transfusiones de la unidad (búsqueda de unidades antígenonegativos).

• Para crear paneles de células para búsqueda de anticuerpos irregulares.

Donantes

• D débil y parcial

• Discrepancias ABO

Resolución de discrepancias

• Para prevención de EHRN (por incompatibilidad Rh).

• DNA fetal se puede obtener a partir de células amnióticas, muestras devellosidades coriónicas y de plasma materno.

Materno-fetal

• Amplificación de ADN por PCR

• PCR-alelo-especifico

• PCR-RFLP

• PCR-multiplex

• Secuenciación

• Real time PCR

• Microarray

Complementarias o independientes.

Técnicas moleculares para el análisis genético de grupos sanguíneos.

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction).

• 3 procesos que se repiten por cada ciclo:

1. Denaturación

2. Apareamiento

3. Extensión

• Basado en las características de los ácidos nucleicos:

1. Mimetiza el proceso de replicación del ADN.

2. Capacidad de separarse (denaturación) y volver a hibridarse (renaturación).

3. Complementariedad de bases (A=T; G=C).

• Equipo: Termociclador.

• Detección: Electroforesis en gel de agarosa con tinción (Bromuro de etidio, GelRed)

PCR convencional

PCR convencional

• Uso de partidores secuencia específica.

• Permite la identificación de secuencias específicas para identificar distintos alelos de un gen.

PCR Alelo Específico

Mixes de reacción pre-alicuotados basados en PCR - Sequence Specific

Primers (SSP).

Genotipificación rápida.

Complemento a tipificación serológica.

• RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphysm.

• Tratamiento del DNA amplificado por PCR o tratamiento del DNA aamplificar con enzimas de restricción para generar cortes en secuenciasespecíficas.

• Se obtiene un patrón de bandeo dependiendo de los cortes realizados porlas enzimas.

PCR-RFLP

Ejemplo: “How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?”

Fenotipo D Polimorfismo relacionado

D débil tipo 1 809T>G; ApaLI

D débil tipo 2 1154G>C; AluI

D débil tipo 3 8C>G; SacI

DAR-1 957G>A; BseYI

• Amplificación de la muestra de ADNutilizando varios sets de primers a lavez, en un mismo mix de reacción,que son específicos para diferentesregiones de la secuencias de ADN.

• Para la detección por electroforesis,se debe tener en cuenta el diseño delos partidores para obtenerproductos de diferentes tamaños.

High-throughput multiplex PCR genotyping for 35 red blood cellantigens in blood donors

PCR-multiplex

• Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto).

• Se distinguen entre sí por el método de detección:

• Fluorocromo no específico:

• SYBR Green (se une a cualquier molécula de ADN).

• Fluorocromo específico (sonda):

• Sondas TaqMan

• Sondas Molecular Beacons

• Sondas Scorpion

• Se cuantifica la fluorescencia emitida

Real Time PCR

Real Time PCR

CT: Ciclo Umbral (Thresholdcycle): Nº de ciclo donde la señal cruza el umbral de detección

• Técnica mediante la cual se logra conocer la secuencia nucleotídica de la porción de ADN a analizar.

• La gran mayoría está basado en el método de Sanger y Rapley.

Secuenciación

¿Cuándo secuenciar?

Serología Genotipificación Secuenciación

• Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN adheridas de forma ordenada a una superficie sólida.

• Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente.

• Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su complementario.

• Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o quimioluminiscencia.

• Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada chip con bases de datos para generar los genotipos.

Microarrays

Microarrays

• En una misma prueba genera sobre 3000 resultados.

• Se basa en la detección de SNPs.

• El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se captura y se marcacon fluorescencia por elongación en sondas alelo específicas inmovilizadas enmicropartículas sintéticas. La fluorescencia de cada perla se analiza en el ArrayImaging System (AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS)calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un genotipo y predecirun fenotipo para cada polimorfismo.

Microarrays

How do we identify RHD variants using a practical

molecular approach?Revista Transfusion, volumen 54, Abril de 2014.

Importancia:

• Prevenir la aloinmunización en receptores.

Receptor D parcial

Tipificado Rh+ (Sueros

clasificadores)

Transfusión con Rh+

Formación de anti-D

Donante D débil

Tipificado Rh-(Sueros

clasificadores)

Transfundido a receptor Rh-

Formación de anti-D

How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach? Revista Transfusion, volumen

54, Abril de 2014.

How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach?

• 360 muestras con expresión atípica del antígeno D (Reactividad menor de 3+ en la tipificación D).

• PCR multiplex basado en Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons (Maaskant-van Wijk y cols.)

• Seis sets de primers específicos para la amplificación de los exones 3, 4, 5, 6, 7 y 9 del gen RHD. Adaptación: 5 sets que amplifican los exons 3, 4, 5, 7 y 9

• Localizados en las regiones donde se pueden encontrar SNPs causantes de muchos D variantes.

• Basado en los resultados, combinados con la asociación a los alelos RHCE y lasfrecuencias de las variantes, se decide el protocolo a utilizar.

Estrategia: Método fácil y racional para la identificación de las variantes D más comunes usando un camino más corto y menos caro en comparación a otros métodos moleculares comerciales.

Algoritmo basado en la genética molecular de RHD, polimorfismos de D, frecuencias de las D variantes en diferentes poblaciones y asociación con los alelos RHCE. (Búsqueda en bases de datos ISBT y Rhesus

Site)

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?

1. PCR multiplex

2. PCR-RFLP

3. Secuenciación

de DNA

How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach?

• PCR multiplex + 1 PCR-RFLP 84 muestras (23% ).

• PCR multiplex + 2 PCR-RFLP 135 muestras (37%).

• PCR multiplex + 3 o más PCR-RFLP + secuenciación de un exón 121 muestras (33%).

How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach?

Ventajas:• PCR multiplex + PCR-RFLP toman aproximadamente 2 horas (corto tiempo).• Más barato que microarrays o secuenciar los 10 exones.• Identificación de variantes no cubiertas en microarrays (11,6% de las muestras

estudiadas).• Útil para resolver discrepancias RhD y distinguir entre D débil o parcial.• Puede ser adaptado a otras poblaciones.

Conclusiones

• La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación.

• Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos.

• Tipificación de pacientes con transfusiones recientes.

• Identificación de riesgo de EHRN.

• Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión.

• Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a expresar en el GR.

• La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación para disminuir costos, manteniendo la calidad.

Bibliografía

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Biología Molecular aplicada a Inmunohematología

Patricia Peralta Moncada

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