BIOLOGIA MOLECULAR Blga. Olga Libia Cjuno Huanca

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Facultad de Ciencias Biologicas

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Unidad Acadmica N 4: TECNICAS MOLECULARES Y SUS APLICACIONES

SECUENCIAMIENTO DE ADN

Sabemos.. La estructura de un determinado ADN est definida por la

ordenacin o "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de polinucletidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la informacin gentica del ADN.

La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado (GC; A=T), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas determina automticamente el orden de la otra, por ello se dice que las cadenas son complementarias.

.

SECUENCIAMIENTO DEL ADN

Secuenciar el ADN es analizar la composicin de un fragmento de ADN para saber qu genes tiene y qu producen esos genes.

Los primeros intentos de secuenciar el material gentico datan de mediados del siglo XX. Las primeras tcnicas eran lentas e ineficaces y se basaban en realizar la lectura de copias de ARN.

A finales de los aos 70 se desarrollaron los mtodos que permitieron de manera simple y rpida, determinar la secuencia nucleotdica de cualquier fragmento de ADN.

Estos primeros intentos de secuenciar cidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciacin de protenas: romper las molculas en pequeos fragmentos, determinar su composicin de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes.

Este mtodo resulta relativamente sencillo para protenas donde estas resultan de la combinacin de hasta 20 aminocidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los cidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinacin de nicamente cuatro nucletidos diferentes.

METODOS CLASICOS DE SECUENCIACION:

Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico) comparten etapas comunes. Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar

radiactiva o fluorescentemente. Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas

sencillas de ADN marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos: qumicos y enzimatcos

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert Originalmente descrito por A. Maxam y W. Gilbert en 1977. Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de

cadena sencilla marcadas radiactivamente con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforsis, en funcin de su tamao en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radiactivas obtenidas.

Rompe el ADN mediante 4 reacciones qumicas especficas

C only: Hydrazine in 1.5 M NaCl, piperidine

G only: DMS, piperidine

A + G: DMS, formic acid, piperidine

C+T: Hydrazine, piperidine

Mtodo enzimtico de Sanger Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson tambin en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi. Para este mtodo resulta esencial disponer de

un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Frederick Sanger (1918)

AdR6G (570 nm)

GdROX (620 nm) CdR110 (540 nm)

TdTAMRA (600 nm)

4 ddNTPs fluorescentes distintos

El mtodo de Sanger

SECUENCIACION DEL ADN METODO DE SANGER

1.- Preparacin de los 4 tubos

1. PREPARACION DE 4 TUBOS

2.- Polimerizacin y terminacin de la cadena (ddT)

2. POLIMERIZACION Y TERMINACION DE LA CADENA ddT

3.- Electroforesis y reconstruccin de la secuencia

3. ELECTROFORESIS Y RECONSTRUCCION DE LA SECUENCIA DE LA CADENA

El Premio Nobel de Qumica (1980)

METODOS AUTOMATICOS

SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la reaccin de secuencia. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la electroforsis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales

se aade el oligonucletido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un nico tubo.

Secuenciacin empleando terminadores fluorescentes Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs,

cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente distinta.

SECUENCIADORES AUTOMTICOS Secuenciadores automticos capilares: Existen instrumentos de

electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por un polmero que se inyecta de forma automtica en un capilar antes de cargar la muestra de secuenciacin; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no superiores a unos 450pb.

Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de

acrilamida/bisacrilamida: La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplar en el secuenciador automtico para proceder a la carga de la muestras.

AdR6G (570 nm)

GdROX (620 nm) CdR110 (540 nm)

TdTAMRA (600 nm)

4 ddNTPs fluorescentes distintos

C R-110

A R6G

T TAMRA

G ROX

Cada ddNTP emite una fluorescencia de distinto color

template

Se puede hacer la reaccin en un solo tubo, no en 4

Los productos de la PCR terminan con un ddNTP fluorescente

Cada color representa a un nucletido terminal

Electroforesis y reconstruccin de la secuencia

Electroferograma

La electroforesis capilar es mucho ms rpida

La electroforesis capilar se hace a gran escala

Cada electroferograma secuencia entre 400 y 900 bases

Electroferograma

OTROS MTODOS DE SECUENCIACIN AUTOMTICA

Secuenciacin de ADN empleando microarrays

Los microarrays constituyen la ltima lnea de tcnicas basadas en la interaccin de cadenas complementarias de ADN. Este tipo de tcnicas introducen bsicamente dos nuevas innovaciones: el empleo de soportes slidos no porosos tales como cristal que facilitan la miniaturizacin y la deteccin basada en fluorescencia y el desarrollo de mtodos de sntesis in situ de oligonucletidos a altas densidades sobre el soporte slido.

Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como tambin se les denomina. Desde los microarrays "artesanales" realizados en el laboratorio a los ofrecidos por compaas de biotecnologa, el principio que rige su diseo es el mismo: la complementariedad de las cadenas aisladas de ADN: o propiedad de las citadas cadenas de hibridarse con otras cadenas aisladas de ADN que posean una estructura complementaria.

Bsicamente un microarray consiste en una matriz de "pocillos" microminiaturizados sobre un substrato de vidrio en donde se implantan, utilizando diversas tcnicas, cadenas simples de oligonucletidos. El poder adherir una cadena corta de oligo sobre una superficie plana es decisivo en el diseo de los microarrays.

En la fabricacin de microarrays se emplean tcnicas fotolitogrficas anlogas a las utilizadas en microelectrnica. Un sustrato de vidrio se trata qumicamente con determinados grupos reactivos para permitir la implantacin de los oligonucletidos sobre el mismo; a continuacin se deposita sobre el substrato una pelcula fotodegradable y mediante la utilizacin de una plantilla y un haz luminoso, se crea la estructuura de celdas del microarray.

Pirosecuenciacin Se trata de un mtodo simple y consistente, til para la secuenciacin de fragmentos de ADN de tamaos pequeos o medianos.

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DE ADN Deteccin de mutaciones Secuenciacin de ADNs

fsiles Diagnstico de enfermedades

genticas Identificacin de especies y

control de cruces entre animales

Proyecto genoma humano

Deteccin de mutaciones

Esta tcnica nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea as la secuenciacin de ADN como un mtodo de diagnstico: una vez que se ha caracterizado la relacin con una enfermedad de una determinada mutacin puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cncer, etc..) o de una pequea delecin (delecin de 3 bases en el gen CFTR en la fibrosis qustica), puede desarrollarse un mtodo de deteccin rutinario. La secuenciacin automtica puede emplearse como mtodo de screenig en la localizacin de nujevas mutacioines.

Secuenciacin de ADNs fsiles

El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especmenes de museo y descubrimientos arqueolgicos en los cuales la mayora de las molculas estn daadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciacin.

Diagnstico prenatal / Diagnstico pre-implantacin

Diagnstico de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro.

Una o dos clulas del pre-embrin se retiran en el estado de 8 a 16 clulas, previo a la implantacin. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes especficos y as estudiar la enfermedad gentica o el sexo (utilizando genes especficos del cromosoma Y).

Identificacin de especies y control de cruces entre animales

Las tcnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, aunque sean cercanas entre s, y bastante conservadas dentro de la misma especie. Los controles de relaciones parentales en animales tiene importancia forense para el control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jvenes de especies en peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y "disfrazados" por certificados veterinarios falsos. En estos caso, el estudio familiar es el nico medio de descubrir el origen ilegal de los individuos.

Proyecto Genoma Humano El Proyecto Genoma Humano fue un proyecto internacional cuyo objetivo final es obtener una descripcin completa del genoma humano a travs de la secuenciacin del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear. Desde su inicio, el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios mdicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen humano. Se pens que la informacin proporcionara una capacidad de diagnstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad y se esper gran aporte a un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, adems de nuevas estrategias para la terapia gnica.

SINTESIS QUIMICA DE ADN

Sntesis de oligonucletidos, es la sntesis qumica de fragmentos relativamente cortos de cido nucleico con una secuencia estructural qumica definida. La tcnica es extremadamente til en la prctica actual en

laboratorios, porque provee un acceso rpido y barato a oligonucletidos hechos a medida con una secuencia deseada.

Mientras que las enzimas sintetizan ADN y ARN en una direccin de 5' a 3', la sntesis qumica de oligonucletidos se lleva a cabo en el sentido opuesto, en la direccin 3' a 5'.

Actualmente, el proceso est implementado como una sntesis en fase slida usando el mtodo de la fosforo-amidita y bloques de construccin de fosforo-amidita derivados de 2 deoxinuclesidos (dA, dC, dG y T), ribonuclesidos (A, C, Gy U), o nuclesidos qumicamente modificados, como los ANB.

Actualmente existen mquinas programables para sintetizar rpidamente secuencias determinadas de ms de 100 nucletidos. Se usan a menudo para generar sondas moleculares en la bsqueda y caracterizacin de determinados segmentos de ADN, y sobre todo para producir los cebadores usados en la reaccin en cadena de la polimerasa.

SNTESIS DE OLIGONUCLETIDOS

OBTENCIN QUMICA

CARACTERSTICAS:

CCLICA

SNTESIS EN FASE SLIDA

GRANDES DIFERENCIAS CON LA SNTESIS DE LA CLULA:

NECESIDAD DE PROTECTORES

SE REALIZA EN UNA DISOLUCIN

FORMACIN : 3 5

SE REALIZA EN MAQUINAS AUTOMATIZADAS

NUCLEOTIDOS CON DISTINTA FORMA

FRAGMENTOS CIDO NUCLEICO ESTRUCTURA DETERMINADA

OLIGONUCLETIDO SE FORMA A PARTIR DE UN

RECEPTOR

LOS OLIGONUCLETIDOS

SECUENCIA CORTA DE NUCLETIDOS

UNA BASE NITROGENADA

SUBNIDADES FORMADAS UNA AZUCAR

UNA MOLECULA DE CIDO FOSFRICO

HISTORIA:

COMIENZO : SINTETIZADORES DE PEPTIDOS

VEGA BIOTECHNOLOGIES

PRIMERA PUBLICACIN : Michelson y Todd (1955)

LEY BAYH-DOLE (1980)

PRIMER INTENTO HACER OLIGONUCLETIDOS

QUIMICAMENTE SU QUMICA

APLICACIONES

ACTUAN COMO CEBADORES

SILENCIADORES DE GENES

OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO

OLIGONUCLEOTIDOS FLUORESCENTES

PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

TERAPIA GNICA

SECUENCIACIN DEL ADN

CONSTRUCCION DE SONDAS DE ADN

Una sonda es un fragmento de ADN (o raramente ARN) de pequeo tamao (normalmente entre 100 y 1000 bases) usado en biologa molecular como herramienta para detectar la presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual.

En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN1c ARN) mediante un mecanismo de hibridacin que forma una estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana.

Esta unin se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formndose pares de bases complementarias.

MARCAJE: Para visualizar las molculas diana se utiliza una sonda

marcada, bien radiactivamente, bien mediante marcaje inmunolgico.

Para el uso de ADN de doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une a la diana; y los lugares de unin se detectan porque los mtodos de marcaje dejan una seal detectable mediante fotografa.

En los mtodos ms avanzados se utilizan marcajes mediante fluorescencia que emiten seales detectadas mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.

La sonda de ADN es una tcnica que permite cortar, repegar, multiplicar y seleccionar fragmentos de ADN.

Radiactividad Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que tengan alguno de sus tomos con un istopo radiactivo, normalmente , pero tambin es frecuente el uso de tritio. Inmunolgico Aunque el marcaje radiactivo es muy sensible, conlleva el peligro asociado a la utilizacin de radiactividad. Para evitar este peligro se desarrollaron otros mtodos de marcaje basados en anticuerpos. Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula (digoxigenina), a la solucin se le aaden anticuerpos especficos que se unen a esa molcula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o fluorescente (Como el CDP-Star) que deja impronta fotogrfica.

TECNICAS DE HIBRIDACION

La hibridacin es la construccin artificial de cidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de un proceso de unin de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molcula de cido nucleico de doble cadena.

Es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado de relacin gentica entre dos cidos nucleicos. Tambin permite la deteccin de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas).

La calidad en la unin de las cadenas de cidos nucleicos en un proceso de hibridacin viene determinada por unos moduladores que imponen una mayor o menor exigencia de perfeccin o astringencia.

En condiciones normales, la complementariedad (GC; A=T), El par de bases GC tiene tres uniones hidrgeno, mientras que el par AT tiene solamente dos. Como consecuencia, se necesita ms energa para romper el par GC que el par AT.

El hecho de que una cadena de ADN sea complementaria a la otra permite una reproduccin exacta del material gentico; as, cada cadena puede servir como molde (template) para la sntesis de otra.

Cualquier hibridacin en la que la complementariedad sea inferior al 70% se considerar como no-homloga y, por tanto, ocurre en condiciones de baja astringencia (temperatura baja y/o concentracin alta de sales).

CONDICIONES DE LA HIBRIDACION

Temperatura:

La temperatura elevada rompe los puentes de hidrgeno y separa las hebras del ADN (desnaturalizacin). Esto ocurre alrededor de los 90 (temperatura de fusin). Cuando una solucin de DNA que ha sido calentada se enfra lentamente se produce la rehibridacin dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociacin ocurre slo si las secuencias de bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridacin permite la formacin de complejos bicatenarios no naturales de DNA:DNA y ADN:ARN.

pH y productos qumicos: El pH alto (pH>11) rompe los puentes de hidrgeno, por lo

que se produce desnaturalizacin. Esto tambin pueden producirlo agentes qumicos como la

urea y la formamida e incluso el agua destilada, que impide la neutralizacin de los grupos fosfato de la molcula por sales de sodio y magnesio; al ser los grupos fosfato de marcado carcter negativo, su repulsin causa la separacin fsica de las hebras y, por tanto, su desnaturalizacin.

La concentracin baja de sales en una solucin donde se produce una hibridacin impone una condicin de alta astringencia, permitiendo slo uniones de gran complementariedad.

TECNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACION Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra.

1- los tipos bloting: Southern y northern blot

Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la deteccin de ADN. EL MTODO TIPO SOUTHERN O SOUTHERN BLOT: para la deteccin de genes especficos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los

fragmentos son separados por tamaos mediante una electroforesis en un gel.

Se realiza tincin con bromuro de etidio para comprobar la calidad de la electroforesis y del ADN.

Luego los fragmentos de ADN de doble cadena son parcialmente hidrolizados con un cido dbil y desnaturalizados con NaOH para permitir la transferencia.

Posteriormente, el ADN es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN presentes en el gel.

A continuacin el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida).

La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo.

NORTHERN BLOT: El northern blot fue desarrollado en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford.

Es esencialmente idntica al mtodo de Southern blot, salvo que las molculas de cido nucleico de la muestra, en este caso de ARN (total, mensajero, vrico, etc.), se separan por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (en presencia de formaldehdo, que forma parte de la composicin del gel).

Esto es debido a que, a pesar de ser una molcula de una sola cadena, se forman complejas estructuras secundarias que dificultan la migracin.

Al igual que en el Southern blot, el ARN se transfiere a la membrana de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada.

Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S).

Tanto la tcnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en da al haber sido sustituidas por tcnicas derivadas de la PCR.

2. CGH (hibridacin genmica comparada): La hibridacin genmica comparada es una tcnica

citogentica para detectar regiones cromosmicas que estn amplificadas o delecionadas en una muestra, especialmente en tumores.

En la CGH, dos muestras de DNA genmico (una tumoral y una normal) se marcan con diferentes fluorocromos y se hibridan simultneamente sobre una extensin de cromosomas metafsicos.

La relacin de intensidad entre las dos seales fluorescentes proporciona una medida de la relacin entre el nmero de copias de las dos muestras de DNA genmico.

TECNICA CGH Y CGH-Array

3. Microarrays de ADN Es el tipo de microarray al que suele referirse cuando

se habla de forma general y sirven para analizar el nivel de expresin de miles (o todos) los genes de una muestra.

Los hay de dos tipos principales: Aquellos que utilizan como sondas fragmentos de

cDNA y los que usan fragmentos ms pequeos de ADN (oligonucletidos).

A estas sondas, colocadas sobre el soporte, se les lanzar el ARN de la muestra que ha sido previamente transformado en cDNA, de tal manera que aquellos genes muy expresados (con gran cantidad de ARN en la muestra original) darn una mayor seal al unirse (hibridacin) a su sonda correspondiente, lo cual se detecta por medio de fluorescencia con un lector de luminosidad .

El resultado del experimento es una fotografa del estado de expresin del ARN de los genes de la muestra (tumoral o normal). Se trata por tanto de un mtodo de screening masivo para detectar aquellos genes que se sobre- o infraexpresan en una muestra.

Utilidad en Patologa Molecular: Deteccin de mecanismos o vas estimulados o

reprimidos en el metabolismo celular (neoplasias o no neoplasias

Deteccin de marcadores tumorales tiles para el diagnstico y clasificacin de las neoplasia

Deteccin de marcadores tumorales tiles para el pronstico y prediccin de respuesta teraputica de las neoplasia.

Deteccin de dianas teraputicas.

4. Hibridacin in situ. Es una tcnica de hibridacin que se realiza directamente sobre

tejido, clulas o cromosomas localizados sobre un soporte slido, habitualmente un portaobjetos. La visualizacin puede realizarse por medios isotpicos , enzimticos o con fluorescencia , siendo evaluada en un microscopio. Su gran virtud es que permite identificar las clulas donde se produce la hibridacin que detecta la alteracin genmica o transcripcional.

La visualizacin de resultados puede realizarse por marcaje con fluorescencia de la sonda (FISH) o cromognico (CISH, SISH). Este ltimo tiene la ventaja de poder realizarse en microscopio de campo claro y poder almacenarse casi indefinidamente las preparaciones.

Los usos ms frecuentes en Patologa molecular son la deteccin de amplificaciones (Ej. Her2 en cncer de mama c-myc en linfoma de Burkitt), traslocaciones ( linfoma folicular, linfoma del manto, sarcomas) y presencia de virus (Epstein-Barr, HPV)

Representacin Esquemtica del anlisis de expresin mediante microarrays de cDNA. Tras la extraccin de ARN, este se transforma en cDNA y se co-hibrida sobre el microarray con sondas de ADN. Los diferentes colores tras la hibridacin indican el nivel de expresin (rojo: sobreexpresin.

USO DE SONDAS DE ADN PARA EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

Las pruebas de hibridacin a menudo disminuyen el tiempo necesario para identificar organismos fastidiosos. Adems, permiten que los laboratorios puedan aumentar el nmero de patgenos que pueden ser identificados. En el estudio de costos, debe considerarse que aunque los exmenes que usan sondas son ms caros que los mtodos tradicionales, el hecho de tener un resultado en un mnimo de tiempo puede significar un ahorro para el paciente y el hospital.

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una muestra clnica (expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la identificacin de un cultivo que por otros mtodos tarda varios das (Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etctera).

Adems, las sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la respuesta del husped a un agente infecciosos en particular y tambin para determinar la extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de varios rganos.

CONSTRUCCION DE LIBRERIAS GENOMICAS

GENOTECAS: o librerias genmicas es til para cuando se quiere caracterizar una secuencia genmica determinada, establecer el mapa fsico de un genoma o secuenciar, total o parcialmente, un genoma.

La genoteca de ADN genmico es un conjunto de vectores recombinantes que contienen un fragmento de genoma de la especie estudiada. La construccin de una genoteca de ADN genmico consta de las siguientes etapas:

- Aislamiento de ADN genmico de la especie en inters.

- Digestin del ADN con una enzima de restriccin que permita obtener fragmentos de un tamao compatible con el vector.

- Clonacin de los fragmentos en un vector.

- Integracin de los vectores recombinantes en un microorganismo para su multiplicacin.

Los vectores de tipo fago, son muy usado para la clonacin de secuencias genmicas particulares, mientras que los cosmidos y los YAC y BAC se utilizan en caracterizacin de genomas enteros.

La genoteca obtenida por este proceso contiene millones de clones recombinantes.

Dado que el ADN genmico es esencialmente igual en todas las clulas de un organismo, se puede usar cualquier tejido para obtener ADN a clonar. En las plantas por ej. Un ADN genmico construido a partir de ADN de races sera, en principio identica a otra construida de hojas.

Una genoteca de ADNcomplementario, es representativa de la poblacin de ARNm, presentes en un tejido concreto en un momento determinado del desarrollo. A diferencia de la genoteca de ADN genmico, una genoteca de ADNc es especfica de tejdo. Una genoteca ADNc podra considerarse como una fotografa instantnea de las poblaciones de ARNm, presentes en un rgano.

CONSTRUCCION DE UNA GENOTECA DE ADNcomplementario

La construccin de una genoteca ADNc se realiza en distintas etapas: 1. Extraccin de ARN a partir del rgano de inters y, en algunos

casos, purificacin de los ARNm poliadenilados (x cromatografa de afinidad, en columna de poliT).

2. Copiado de los ARNm en ADNc por accin de la transcriptasa inversa.

3. Eliminacin especfica del ARNm del hbrido ADN/ARN con sosa o por accin de ARNasa H.

4. Sntesis de la segunda cadena de ADNc con una ADN polimerasa. 5. Ligacin de oligonucletidos(adaptadores) para crear dianas de

restriccin. 6. Ligacin en un vector de clonacin (plsmido o fago). 7. Integracin de los vectores recombinantes en bacterias.

Los vectores de clonacin utilizados para las genotecas de ADNc, son los plsmidos o los fagos. Las etapas de la sntesis de la segunda cadena de ADNc y ligacin de adptadores se realizan, cada vez ms por PCR. La sntesis de la primera cadena de ADNc se realizan generalmente a partir de un cebador de poliT, que se fija en el extremo poliA del ARNm. Tambin se puede empezar la reaccin a partir de mezcla de hexanucletidos de secuencia aleatoria que acta como cebadores que se fijan al azar sobre el ARNm.

TECNICAS DE AMPLIFICACION Las tcnicas de hibridacin pueden tener una baja sensibilidad

debido a que en algunos casos existe una sola copia de la secuencia en blanco. Por esta razn las tcnicas de amplificacin, que pueden producir millones de copias de un determinado segmento de ADN o ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas reas del diagnstico clnico.

Existen varias tcnicas de amplificacin las cuales varan ligeramente en su mtodo de amplificacin. Unas de las tcnicas de amplificacin ms usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el propio laboratorio como comercialmente, es la reaccin de la polimerasa en cadena o PCR.

Otra tcnica que ha sido evaluada para el diagnstico es la reaccin de la ligasa en cadena o LCR, en la cual pequeos segmentos amplificados son posteriormente ligados.

Ambas tcnicas se encuentran disponibles comercialmente y pueden ser adquiridas en varios formatos de automatizacin.

Otras tcnicas de amplificacin, la mayora sin nombre traducido al espaol, son:

Strand displacement amplificatin (SDA), isothermal RNA self sustaining sequence replication. reaction, nucleic acid sequence-based amplification (TMA) y la amplificacin por QB replicasa.

A continuacin slo se analizarn los fundamentos de las tcnicas de PCR en el diagnstico de enfermedades infecciosas, que el anlisis de las otras escapa al objetivo de esta revisin.

PCR. REACCION EN CADENA DE LAS POLIMERASAS

Tcnica que revolucion en los aos 80.

Permite tener mucha cantidad de un fragmento de ADN de inters: esta tcnica de PCR, reaccin en cadena de la polimerasa Es una tcnica muy rpida, que por otra parte puede funcionar partiendo de trazas de ADN.

Por ello se utiliza mucho en el rea forense y de identificacin humana, as como en gentica de poblaciones, en casos en los que se tiene muy poquito ADN.

Esta tcnica aprovecha las caractersticas de la replicacin del ADN, es decir que a partir de un pequeo cebador la polimerasa puede proseguir unacadena.

El requisito como se ve en la figura es poder disear dos cebadores adecuados.

Por la posicin de estos cebadores, al cabo de una serie de rondas de replicacin, (hablamos de una reaccin en cadena), tenemos grandes cantidades de un solo trozo, el tramo que va desde uno de los cebadores al otro.

Esta tcnica, en la que el ADN tiene que ser desnaturalizado por calor para inciar cada nuevo ciclo se torn muy fcil cuando hizo uso de una polimerasa que resiste el calor (aislada de una bacteria de aguas termales). Esta tcnica se utiliza ya rutinariamente

Desoxinucleosidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores (o primers), oligonucleotidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN.

Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2).

Iones monovalentes, como el potasio.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70C (la ms comn es la Taq polimerasa).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

81

Elementos necesarios para la PCR

82

TERMOCICLADOR

30 ciclos repetitivos conformados

cada uno de tres pasos.

Consisten en un bloque que

puede ser programado para

calentarse y enfriarse

rpidamente en determinados

tiempos

83

(Lodish y cols., 2006) 84

Desnaturalizacin Alineamiento/Unin del cebador Extensin/Elongacin de la cadena Elongacin Final

85

ETAPAS DE LA PCR

1. Desnaturalizacin.

Mediante un calentamiento a 94C, el

ADN de doble cadena logra que sus

cadenas se separen o desnaturalicen

Actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C (vida media a 92.5C = 2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.), por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin.

Se rompen puentes

de hidrogeno.

Las bases

nitrogenadas quedan

expuestas

Sntesis de novo.

86

ETAPAS

Desnaturalizacin

Alineamiento/Unin del cebador

Extensin/Elongacin de la cadena

Elongacin Final

Se aaden los

nucletidos en el

hidroxilo 3 terminal

del iniciador ya

apareado al sitio

blanco de la

amplificacin.

Mientras que un

cebador es

complementario al

extremo 5 de la regin

del ADN molde a

amplificar, el otro es al

extremo 3de la misma

pero en la cadena

opuesta

87

2. Alineamiento

Inicio de la reaccin de la PCR. Los cebadores complementarios que

flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrgeno. De

esta manera la polimerasa puede comenzar a extenderlos para copiar

ambas hebras molde.

ETAPAS

Desnaturalizacin

Alineamiento/Unin del cebador

Extensin/Elongacin de la cadena

Elongacin Final

Enzima Taq polimerasa

Temperatura entre 40 y 72 C

Union del cebador

ETAPAS

Desnaturalizacin

Alineamiento/Unin del cebador

Extensin/Elongacin de la cadena

Elongacin Final

Desoxiribonucleosidos

monofosfatos

1 min. Para alargar 1000 nucletidos

Progreso de la reaccin de la PCR. A la

temperatura ptima de la ADN

Polimerasa Taq (72C), la enzima agrega

los dNTPs a partir del 5 prima hacia el

extremo 3 prima 89

3. Extension y elongacin de la cadena

Es comn que al finalizar todos

los ciclos se realice un ltimo alargamiento por 5 min.

a 72C, para asegurarse que todos los productos de

amplificacin estn completamente terminados

y tengan, por ende, exactamente la misma longitud

ETAPAS

Desnaturalizacin

Alineamiento/Unin del cebador

Extensin/Elongacin de la cadena

Elongacin Final

90

4. Elongacin Final.

PCR Melting

94 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

5 3

3 5 DNA de

cadena doble

PCR Melting

94 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

3 5

5 3

Calor

DNA de

cadena simple

PCR Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

3 5

5 3 5

5

Melting

94 oC

Hibridacin

de primers

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30 ciclos

3 5

5 3

Calor

Calor

5

5

5

Fragmentos de

tamao definido

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3 5

5 3 5

5 5

5

5

5

5

5

5

5

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

96

VARIANTES DEL PCR

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

97

El molde utilizado es RNA pero el producto final es ADN Generacin de cDNA Enzima retrotranscriptasa reversa

98

Es muy conveniente para conocer la fisiologa

de las clulas y saber cmo cambia la expresin

de genes (su traduccin a proteinas) a lo largo

de un procesos infeccioso.

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

99

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

Permite realizar una amplificacin de las regiones flanqueantes de un fragmento de ADN que solo se conoce su secuencia interna

secuencia conocida

secuencias desconocidas

+ER

ER

digerir DNA

ligar extremos

PCR

30 ciclos de PCR

100

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

Pequeas cantidades de DNA Se quieren evitar las amplificaciones inespecficas que a veces se observan con la PCR tradicional, dado que en cada etapa se realizan un numero menor de ciclos. Se usan iniciadores cuya secuencia est hacia dentro del producto de la secuencia original (anidados) Se genera un producto ms pequeo que el de la reaccin primaria

PCR anidado nested PCR

CYP2D6 CYP2D7 CYP2D8

101

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relacin entre 50/1 y 100/1. Se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego slo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, producindose a partir de entonces de forma lineal. El producto de PCR contiene 10 a 20 veces ms de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciacin directa con la tcnica de Sanger

102

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR ARBITRARIA

Realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. Consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma.

PC

R M

ULTIP

LE

103

RETRO PCR

PCR INVERSA

PCR INTERNA

PCR

ASIMETRICA

PCR IN SITU

PCR MULTIPLE

PCR

ARBITRARIA

PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de DNA.

Tcnica especfica, sino tambin muy sensible, pues en principio para practicarla bastara una sola molcula, por ejemplo, del genoma humano ~6 picogramos.

Puede usar como substrato para la reaccin al ADN, sin tener que purificarlo de su fuente natural, y es comn emplear productos biolgicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullicin de la muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN, dejndolo listo para la reaccin.

104

VENTAJAS

Se puede prescindir del uso de radioistopos, los cuales eran indispensables antes de su invencion (Rodrguez I, 2004)

Proporciona muchas alternativas ms rpidas y menos costosas para muchas aplicaciones de la clonacin, en particular para los organismos en los que se conoce la secuencia completa del genoma .

Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso de clulas.

Con est tcnica se puede seleccionar una secuencia especifica de nucletidos para replicarse en forma selectiva y rpida en grandes cantidades a partir de cualquier muestra que las contenga (Alberts y cols., 2006).

Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse qumicamente, la PCR solo puede utilizarse solo para clonar ADN con secuencias de comienzo y de terminacin conocidas.

DESVENTAJAS

Pre-diagnstico de enfermedades

Diagnostico de enfermedades

Amplificacin de regiones hipervariables

Investigaciones forenses

Aplicaciones en estudios evolutivos

APLICACIONES

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

INVESTIGACIONES FORENSES

Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos.

El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano.

A pesar del innegable poder de las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico clnico, es errneo pensar que van a reemplazar a los exmenes convencionales para deteccin de agentes patgenos.

Sin embargo, la capacidad de estas tcnicas para proporcionar un diagnstico definitivo en corto tiempo tendr sin duda, un efecto en el manejo del paciente y nos ayudarn a entender mejor la patognesis de la infeccin.

Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las tcnicas de diagnstico molecular tendrn un mayor impacto en algunos patgenos.

Es as que exmenes rpidos para la identificacin de Micobacterias y la deteccin de resistencia a las drogas de primera lnea, dar la base para que se tomen ms oportunamente las decisiones clnicas adecuadas.

Tambin, la identificacin rpida de virus Herpes simplex en el LCR de un paciente con encefaliitis dar la oportunidad de comenzar oportunamente la terapia adecuada, eliminando otros procedimientos ms invasivos.

A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones ms precisas, los laboratorios clnicos podrn incorporar estos exmenes en el funcionamiento de rutina y los clnicos podrn familiarizarse an ms con la interpretacin y con las ventajas que proporcionan las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico clnico.

APLICACIONES COMERCIALES DE LA INGENIERIA GENETICA

Produccin de vacunas

Produccin de hormonas

Terapia gnica