Biología Molecular en UCI

Dr. Fernando PérezDr. Stevens Salva

Simplificación tecnológica, automatización del los procesos

Abaratamiento de los costos Entrenamiento del recurso humano en el manejo de la tecnología e interpretación de los resultados

Manejo de problemas o dilemas éticos

Transición tecnológica

DiagnósticoMicrobiológico

Diagnóstico Hemato - oncológiaGenética

Diagnóstico Biología Molecular

DiagnósticoMicrobiológico

Unidad de diagnóstico

Hemato - oncológia

Unidad de Genética

Diagnóstico Biología Molecular

Fundamentos técnicos

Aplicaciones clínicas en UCI

Conclusiones y recomendaciones

Diagnostico microbiológico por Biología Molecular

Identificación de microorganismos

• Virus • Bacterias • Micobacterias• Hongos• Parásitos

Mediante técnicas Moleculares

Reacción de cadena polimerasa (PCR)

En abril de 1983 Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.

Permite la amplificación un fragmento especifico de ADN in vitro.

Diagnostico microbiológico por Biología Molecular

Desnaturalización

Polimerización Producto final

Hibridación

93-97 ºC 45-72ºC

72ºC

Reacción de cadena polimerasa (PCR)

Diagnostico microbiológico por Biología Molecular

Reacción de cadena polimerasa (PCR)Clásico

UV Translluminator

Identificación del ADN (electroforesis)

Extracción del ADN o ARN

Amplificación ADN (PCR)

Reacción de cadena polimerasa (PCR)Clásico

Identificación del ADN (electroforesis)

Reacción de cadena polimerasa (PCR)Tiempo Real

PCR tiempo real

Diagnostico microbiológico por Biología Molecular

Reacción de cadena polimerasa (PCR)

Diagnostico microbiológico por Biología Molecular

Reacción de cadena polimerasa (PCR)Tiempo Real

DETECCIÓN DEPATÓGENOS POR PCRA TIEMPO REALPCR a tiempo real: análisis de patógenos

Revolución en el diagnóstico molecular.Amplificación de una secuencia específica del ADN.

Uso de un tercer “primer” capaz de emitir fluorescencia.

Detección de la amplificación ciclo a ciclo.Técnica altamente sensible

PCR a tiempo real: análisis de patógenosReal Time PCR

Infeccion

Quemaduras, isquemia, pancreatitis

Sepsis

Bacteremia

Adapted from Crit Care Med 1992;20:864-874.

El tiempo y adecuado diagnostico es vital…la sepsis es una enfermedad progresiva

SRIS

Falla Multiples organos

Sepsis

Sepsis Severa

Shock Septico

6 - 17%

16 %

20 %

46 %

> 60 %

Temperatura > 38 < 36FC > 90 ppmFR > 20 o PCo2 < 32GB > 12000 < 4000

SRIS + Lugar infeccion o fuerte sospecha

SRIS + Disfuncion de organo, hipoperfusion o hipotension

SRIS + hipoperfusion e hipotension

Current Definitions According to the “2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference”. Levy et al. (2003) CritCare Med 31: 1250 –1256

Mortalidad

El tratamiento empirico inicial El tratamiento empirico inicial muchas veces es inadecuadomuchas veces es inadecuado

Tratamiento antibiotico inicial

Adecuado

Inadecuado

Ibrahim Harbarth Kolleft

Dias 1 2 3 4 5

50

60

70

80

90

% d

e p

aci

en

tes

reci

bin

ed

o

trata

mie

nto

ad

ecu

ad

o

Inadequate treatment from day 1 to day5 (prospective study); BouzaE. et al, CID 2004/39/1161

Los clinicos necesitan diagnostico rapido!

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4

Hemocultivo

Septi Fast Especies

Resistencia: mecA

Gram Especies ResistenciaCultivo

PCR

6H

SeptiFast. Roche DiagnosticResistencia: mecA

a. DNA libreb. Patogenos

muertosc. Patogenos

viablesd. Patogenos

fagocitados

a. Patogenos viables

b. Patogenos fagocitados

50%

1. Medir el ácido láctico

2. Obtener cultivos de sangre antes de iniciar los antibióticos

3. Administrar antibióticos de amplio espectro en las primeras 3 horas del ingreso a la emergencia o en 1 hora desde otro servicio

El objetivo es realizar todas las indicaciones el 100% de las veces en las primeras 6 horas de la

identificación de la sepsis

TENDRAN UN LUGAR LAS TECNICAS

DE PCR TR?

Microbiological diagnosis of sepsis: comparison between real-time

polymerase chain reaction and blood culture techniques

Simona Barnini, Carlotta Dodi and Mario CampaDipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche,

Infectivologia ed Epidemiologia, Unità Operativa di Microbiologia, Università di Pisa, Pisa, Italy

Critical Care 2007, 11(Suppl 4):P41doi:10.1186/cc6020

Numero de organismos detectados

Nu

mero

de m

uest

ras

10

20

30

27 30 147 muestras51 pacientes con sepsis

30 hemocultivos positivos 27 positivos por PCR

En el 76 % de los casos mismo resultado. Prueba multiplex fue mas rapida que el cultivo el 97% de los casos

Critical Care 2007, 11(Suppl 4):P41doi:10.1186/cc6020

Reaccion en cadena de la Polimera por Multiplex para la deteccion de bacteremia y fungemia.

Louie, Richard F. PhD; Tang, Zuping MD; Albertson, Timothy E. MD, PhD; Cohen, Stuart MD; Tran, Nam K. BS; Kost, Gerald J. MD, PhD

Crit Care Med. 2008 May;36(5):1487-92.

• 200 pacientes con SRIS de emergencia y UCI

45

37

Deteccion patogenos

25 50 Resistencia Mec A( 3/4 casos verificados x HC)

100%

50%

25%

75%

Reaccion en cadena de la Polimera por Multiplex para la deteccion de bacteremia y fungemia

Louie, Richard F. PhD; Tang, Zuping MD; Albertson, Timothy E. MD, PhD; Cohen, Stuart MD; Tran, Nam K. BS; Kost, Gerald J. MD, PhD

Crit Care Med. 2008 May;36(5):1487-92.Polimicrobiana 9

“PCR es una técnica coadyuvante a los

métodos tradicionalesde cultivo, en facilitarla detección temprana

de microorganismos

en sepsis.”

Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia

J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410.

Marie von Lilienfeld-Toal,1,2†* Lutz E. Lehmann,3† Ansgar D. Raadts,3 Corinna Hahn-Ast,1 Katjana S. Orlopp,1 Günter Marklein,4 Ingvill Purr,4 Gordon Cook,2 Andreas Hoeft,3 Axel Glasmacher,1 and Frank Stüber5

Results of blood cultures and PCR during antimicrobial therapy

PathogenN (%) of positive

Results By No. of FNEs (no. initially positive)

Blood culture PCRNone 113 (97) 565 (84)Staphylococcus aureus 0 32 (4.8) 19 (6)

Staphylococcus species (CoNS)

2(1.8) 13 (1.9) 9 (2)

Enterococcus faecium 0 14 (2.0) 6 (1)

Enterococcus faecalis 0 3 (0.4) 1 (1)

Escherichia coli 0 6 (0.9) 4 (3)Pseudomonas aeruginosa 0 14 (2.0) 3 (1)

Stenotrophomonas maltophilia

1(0.9) 4 (0.6) 3 (2)

Candida krusei 0 1 (0.1) 1 (0)Candida albicans 0 8 (1.2) 2 (0)Aspergillus fumigatus 0 9 (1.3) 5 (1)

Total positive (%) 3% 15%

Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia

J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410.

Marie von Lilienfeld-Toal,1,2†* Lutz E. Lehmann,3† Ansgar D. Raadts,3 Corinna Hahn-Ast,1 Katjana S. Orlopp,1 Günter Marklein,4 Ingvill Purr,4 Gordon Cook,2 Andreas Hoeft,3 Axel Glasmacher,1 and Frank Stüber5

Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay

L. Louie,1* J. Goodfellow,1 P. Mathieu,2 A. Glatt,2,3 M. Louie,1,4† and A. E. Simor1,4

Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre,1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada,4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica,2 New

York Medical College, Valhalla, New York3

Organism type No. of strains

Expected PCR resultsa (16S/mecA/

nuc)

Direct PCR results, 16S/mecA/nuc (no.

of isolates)CoNS,b methicillin resistant

107 +/+/− +/+/− (100); −/+/− (7)

CoNS, methicillin susceptible

73 +/−/− +/−/− (71); −/−/− (2)

MSSA 36 +/−/+ +/−/+ (34); −/−/+ (2)

Total 223

J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790.

Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay

L. Louie,1* J. Goodfellow,1 P. Mathieu,2 A. Glatt,2,3 M. Louie,1,4† and A. E. Simor1,4

Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre,1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada,4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica,2 New

York Medical College, Valhalla, New York3

J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790.

A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis

Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer

Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5

A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis

Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer

Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5

A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis

Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer

Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5

A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis

Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer

Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5

Indicaciones razonables para requerir estudios de PCR tiempo

real (Septi Fast)

1. Pacientes tratados previamente con antibioticos

2. Aislamiento de germenes de crecimento lento, aislamiento complejo.

3. Pacientes con shock septico o sepsis severa4. Sospecha de germenes resistentes (MRSA- Enterococo-Vanc)

Detección Temprana

Activación del Código

Reanimación Inicial

Traslado a UCI

www.grupogenolab.com