clase de biologia molecular

Herramientas de Biología Molecular Herramientas de Biología Molecular para el diagnóstico de para el diagnóstico de

EnfermedadesEnfermedades

Prof. José Antonio Nastasi Catanese

DESNATURALIZACION.- La ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble cadena de un ácido nucleico, dando origen a dos cadenas simples, complementarias entre sí, pero separadas. Usualmente la ruptura de la doble cadena se basa en el uso de calor, elevación de pH, modificaciones de la fuerza iónica del medio o una combinación de esos factores.

RENATURALIZACION.- El proceso inverso a la desnaturalización.

HERRAMIENTAS Y TERMINOS DE GENETICA MOLECULAR


Hibridación.- La unión entre dos moléculas simples “single stranded” a traves de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (A-T;C-G) para formar una molécula doble “doble stranded”. La unión puede ser entre ADN-ADN; ADN-ARN; ARN-ARN. La estabillidad de la doble molécula formada dependerá de la perfección de la complementaridad entre las bases de las dos cadenas. La rapidez y precisión de la formación de la doble cadena dependerá de la concentración de las cadenas simples y de las condiciones del medio (pH; Fuerza iónica, etc.)

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION.- Enzimas de origen bacteriano, que reconocen secuencias específicas en el ADN, usualmente “secuencias palindrómicas” y lo cortan a ese nivel. Pueden dar origen o no a “extremos pegajosos”. Por ejemplo, EcoRI es una enzima aislada a partir de Escherichia coli que reconoce la secuencia 5’-GAATTC-3’ y corta ambas “hebras” del ADN entre los nucleótidos G y A.


Enzimas de Restricción

Enzima deRestricción

Fuente Secuencia dereconocimiento

BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5’-G GATC C-3’3’-C CTAG G-5’

EcoRI Escherichia coli RY 13 G AATT CC TTAA C

HaeIII Haemophilus aegytius GG CCCC GG

HindIII Haemophilus influenzae Rd A AGCT TT TCGA A

NotI Nocardia otitidis-cavarium GC GGCC GCCG CCGG CG

Sau3A Staphylococcus aureus 3A GATC CTAG^

SstII Streptomyces stanford CC GC GGGG CG CC

EcorRI

1

2

3

45

6

---G A A T T C---

---C T T A A G---

A A T T C------G G------C T T A A

EcorRI

1

2

3

45

6

1

2

3

4

5

6

EcorRI

1

2

3

45

6

1

2

3

4

5

6

GAATACCT TATG

5+6

12

3

4

5

65+6

12

3

4

5

6

12

3

4

5

6

12

3

4

5

65+6

?

VECTOR.- Una molécula de ADN que se puede replicar de forma autónoma en un huesped (bacteria o levadura), del cual puede ser posteriormente aislada en forma pura. En su molécula se puede insertar otras moléculas de ADN de origen distinto al del vector y replicar asi abundantemente dicha molécula “extraña”. Los vectores pueden ser: Plásmidos, Fagos, Cósmidos, YACS, etc.

HUESPED.- El organismo que se usa para mantener y propagar una molécula de ADN recombinante. Usualmente una bacteria (Escherichia coli) o una levadura (Sacaromyces cerevisiae).


Vectores

Vector Huesped Tipo de Clonación

Tamaño del inserto

Plasmidos Bacteria, Levadura

ADN Genómico, ADNc

Usualmente < 5 – 10 Kb

Bacteriagos lambdas

Bacteria ADN Genómico, ADNc

Hasta 20 Kb.

Cosmidos Bacteria ADN Genómico Hasta 50 Kb.

Cromosomas artificiales de bacterias

Bacterias ADN Genómico 100 a 300 kb

cromosomas artificiales de levaduras

Levadura ADN Genómico 100 a 1000 Kb.

CLONE.- Una molécula de ADN recombinante, usualmente un vector, que contiene un gene u otra secuencia de interés.

CLONAR.- Generar un clone.

BIBLIOTECA GENOMICA.- Una colección de clones que contienen gran parte o todo el genoma de una célula, tejido o cromosoma original. Ejemplo. Una biblioteca de “DNAg humana” , Una biblioteca de ” genoma humano”.


Crecimiento selectivo

VectorADN ligasa

ADN Humano o porción de ADN a Clonar (inserto)

Aislamiento en grandes cantidades

Inserción en Huésped

Clonación Molecular

SONDA.- Una molécula de ADN o ARN, natural o sintética de secuencia conocida o no, “marcada” con sustancias radioactivas, fluorescentes o enzimáticas, usada para detectar su secuencia complementaria por hibridización molecular.


Detección de Mutaciones

PrimerSitio de una mutación

Oligonucleótido tipo salvaje

Oligonucleótido mutante

Sano Het Mut

TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

SOUTHERN BLOT.- Técnica para transferir ADN desde un gel de Agarosa o poliacrilamida a una membrana, usualmente de Nylon, a fin de poder utilizar dicho ADN en procesos de desnaturalización, hibridización y renaturalización que serían imposibles de realizar en los geles.

Muestra de ADNDigestión con una Enzima de restricciónColocar muestras en cada pozo de un gel de agarosa

-

+

1 2 3 4 Migración

Alto peso molecular

Bajo peso molecular

1 2 3 4

Revelar

Hibridar en el ADN inmobilizado

Denaturar por calor

Sonda de ADN

Adicionar la sonda radiactiva

Transferir el ADN a la membrana.

Lavar el Exceso de sonda y colocar placa de rayos X

Procedimientos de Blotting

Método delBlot

Materialanalizado

fraccionamiento Detección

Southern ADN Electroforesis Hibridizaciónde AcidosNucleicos

Northern ARN Electroforesis Hibridizaciónde AcidosNucleicos

Western oInmunoblot

Proteínas Electroforesis Inmunológico

TECNICAS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA.- Técnica que permite la amplificación de un determinado segmento de ADN. El segmento especificado es copiado repetidas veces y a partir de una sola molécula original pueden obtenerse millones de copias al final de la reacción.

ADN Molde

1er Paso: Desnaturalización. 2do. Paso: Alineación.

+Taq. PolimerasaDNTPsPrimers

3er. Paso: Extensión.

PCR

PCR

Al cabo de 1 cicloAl cabo de 1 ciclo

PCR

230=1.073.741.824

TERMINOS Y HERRAMIENTAS DE GENETICA MOLECULAR

SECUENCIACION DE ADN.- Técnicas que permiten determinar la secuencia nucleotídica de una molécula de ADN. Desarrolladas independientemente por Walter Gilbert y Fred Sanger , quienes compartieron el premio Nobel en 1980 por su descubrimiento.

Secuenciación del ADN

T A G T C G C A G T T A T G GA T C A G C G T C A A T A C C

A T C A G C G T C A A T A C C

Las hebras se separan

1G

2A+G

3T+C

4C

Un agente químico destruye una o dos bases de el total de cuatro

bases nitrogenadas

Más grande

Más pequeño

G AG TC C

Secuencia

ATCAGCGTCAATACC

MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT

Secuenciación del ADN

A T C A G C G T C A A T A C C

Se colocan en el termociclador, luego se separan con una electroforesis de

ácidos nucleicos.

Más grande

Más pequeño

G A T C

Secuencia

TAGTCGCAGTT

MÉTODO DE SANGER

A T G G

1ddGTP

ADN Polimerasa4 dNTP(dTTP, dCTP, dATP, dGTP

2ddATP

3ddTTP

4ddCTP


Electroforesis de ácidos nucleicos.- Migración de moléculas de ácidos nucleicos en un campo eléctrico y en un medio (Agarosa o poliacrilamida) que los separa de acuerdo a su tamaño (Peso molecular)

APLICACIONES DE LA HERRAMIENTAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

MAPEO DE GENES DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GENÉTICAS MICROBIANAS

SUSCEPTIBILIDADES A ENFEREMEDADES PROYECTO GENOMA HUMANO (HUGO) IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS TERAPIA GÉNICA CLONACIÓN

MOLECULAR INDIVIDUAL

ANIMALES TRANSGENICOS.


TAGCCAGTAACGTTAGCAGTCCTGGAGTACGTATCGGTCACTGCAATCG

ATCGGTCACTGCAATC T

TAGCCAGTAACGTTAGAAGTCCTGGAGTACGTATCGGTCACTGCAATCT

TAGCCAGTAACGTTAGATCAGGACCTCATGCAATCGGTCACTGCAATC

G

TAGCCAGTAACGTTAGATCAGGACCTCATGCAX X

Primer tipo salvaje

Primer mutante

Normal Heterocigoto Mutante

1 2 3

Primer

Sitio de Restricción creado por una mutación



PrimerSitio de una mutación

Oligonucleótido tipo salvaje

Oligonucleótido mutante

Sano Het Mut

Aplicaciones: Medicina Forense

15

18

20

23

Madre Padre Hijo

Exclusión

15

18

20

Madre Padre Hijo

Inclusión

Aplicaciones: Medicina Forense

13

16

21

23

Víctima Semen Sangre Piel Victimario

Inclusión

13

16

21

23

Víctima Semen Sangre Piel Victimario

Exclusión28

Proyecto Genoma

Organismo Tamaño Secuenciado % finalizado

Microbios 4.2 4.2 100

E. Coli 4.6 4.6 100

Levadura 13 13 100

Nematodo 100 71 71

Drosofila 130 8 6

Raton 3000 6 0.2

Humano 3000 60 2

Genomas Secuenciados para Septiembre de 1997.

Aplicaciones: Diagnóstico de microorganismos.

Tomado de cualquier tejido corporal

Primers Específicos para el agente

Amplifica millones de veces el ADN o ARN viral, siendo, posteriormente detectado muy fácil y rápidamente. Incluso simultáneamente se puede detectar el serotipo o cualquier variante del virus.

27 de febrero SE CLONO AL PRIMER MAMÍFERODOLLY

CLONACIÓN

Los cinco primeros cerdos clonados

CLONACIÓN

Lily, Daffodil, Crocus, Forsyhtia y Rose son las cuatro vacas clonadas en

Estados Unidos, cuyas células se ven más jóvenes

que lo normal.

CLONACIÓN

Animales y vegetales transgénicos.

Susceptibilidad genética

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