Presentacin de PowerPoint

BIOLOGIA MOLECULARINTEGRANTES:

Badillo Eguavil, HildalidiaCalle Luque Gemma.Cndor Caldern HermelindaChinchay Espinoza Rosa E.Intiquilla Medrano, SandibellJuregui Valdez , MariellaLavado Ordoez , PatriciaMerca Rojas , YanettMontoya Huamn, MariangelicaSucasaca Quispe, DianethUrco Chuquillanqui, Sandra

CLONACION Y SECUENCIAMIENTO DEL ADN DOCENTE: MINAYA GALARRETA, ANGELICA KARINA

CLONACION DEL ADN MOLECULAR

En los aos 80:se llevaron acabo trabajos con vacas y ovejas, camino que se sigue actualmente . Estos trabajos consistieron en ir creando nuevos individuos a partir de clulas cada vez mayores con el fin de demostrar que por muy desarrollada que este una clula todava contiene la informacin suficiente para engendrar un nuevo ser.El 27 de febrero de 1997 se publica el informe sobre la primera clonacin de un mamfero (la oveja Dolly) a partir del ncleo de una clula adulta de otro individuo. Consisti en modificar genticamente un animal con un gen humano para posteriormente clonarloEl primer experimento en cuanto a la clonacin humana lo realiz Shettles en 1979. En este experimento no se paso de un estado de desarrollo muy bajo Posteriormente el cientfico Richard Seed, pretenda clonar seres humanos. Y segn los medios de comunicacin lo sigue intentando actualmente.

RESEA HISTORICACLONACION:

clonar significa crear un nuevo ser o varios iguales por medio de una sola clula somtica de un ncleo de otro individuo .los cuales son iguales o casi iguales al original. Es decir al dueo de la clula somtica es aquel procedimiento que se realiza para tomar una muestra del material gentico (genes)de u8n organismo para crear o procrear un nuevo ser con las misma caractersticas mas no con los mismos comportamientos .un clon es llamado por la unin de un ovulo con el espermatozoide.CLON:Un clon es un copia gentica igual de otro individuo .el cual no significa que sea igual en la personalidad.

Enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin, conocidas tambin como endonucleasas, slo cortan el ADN si reconocen en su interior una secuencia especfica de nucletidos.

Tipos de enzimas de restriccinTipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin (metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente y predecible.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos

VECTORES DE ADNLos vectores de clonacin son molculas que llevan insertados fragmentos de material gentico que nosotros queremos introducir en el hospedador , molculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN

CARACTERISTICAS DE UN VECTOR

Ser capaz de replicarse dentro de una clula receptora.Un vehculo para clonacin necesita ser pequeo. Poseer marcadores para la seleccin de bacterias.Poseer una o varias secuencias de restriccinTIPOS DE VECTORESPLASMIDOSLos plsmidos son molculas de DNA de doble cadena extra cromosmicas de origen natural que tienen un origen de replicacin (ori+) y que se replican autnomamente en las clulabacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniera gentica, se han modificado o diseado muchos plsmidos de manera que contengan un nmero limitado de sitios de restriccin y genes de resistencia a antibiticos especficos.

caractersticas:Tamao pequeo (mejor manipulacin y aislamiento

Replicacin relajada (permite obtener el DNA clonado en grandes cantidades)

PLASMIDOSBACTERIOFAGOSSe utilizan virus y bacterifagos como vectores porque su rendimiento de infeccin es superior al que se obtiene en la transformacin con plsmidos aunque su manipulacin es ms compleja. Los vectores virales admiten y replican de manera estable insertos mayores que los plsmidos. La infeccin viral permite que cada clula hospedadora contenga muchas copias del gen exgeno y que ste se exprese abundantemente bajo el control de los promotores de los virus que son muy activos.

CICLOS BACTERIOFAGOS

CSMIDOS son vectores hbridos desarrollados por combinacin de plsmidos y del genoma del fago . Constan de una molcula de DNA de 5kb que lleva genes de resistencia a antibiticos, el origen de replicacin de un plsmido bacteriano, los extremos cos del DNA del fago y sitios nicos de restriccin para la insercin del DNA a clonar. Los csmidos recombinantes pueden empaquetarse in vitroen partculas de fago para infectar las clulas hospedadoras en las que el DNA se inyecta y circulariza como fago pero se replica como plsmido. La seleccin de bacterias se hace, por eso, por resistencia a antibiticos. Los fragmentos de DNA clonados pueden ser muy grandes, de hasta 47kb por lo que son adecuados para la construccin de genotecas eucariticas.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES

YACCromosoma artificial de levaduraLos YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telmeros en sus extremos, un origen de replicacin y un centrmero. Estos componentes estn unidos a genes marcadores de seleccin y a un grupo de enzimas de restriccin para insertar ADN exgeno.Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.BACCromosoma artificial bacterianoUn BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plsmido de fertilidad ( factor F ) de bacterias. Es el ms utilizado.El factor F es un plsmido que se replica independientemente y que transfiere informacin gentica durante la conjugacin bacteriana.Los BAC son circulares y muy estables, con lo que no se rompen. Tienen un tamao de 100 kb y pueden transportar insertos de entre 100 y 300 kb. Solo permiten una copia del cromosoma por clula.

TIPOS DE CLONACIN CLONACION MOLECULAR.CLONACION CELULAR.CLONACION TERAPEUTICA CLONACION DE ORGANISMO DE FORMA NATURALCLONACION DE ESPECIES EN PELIGRO DE EXTINCION.

CLONACIN MOLECULAR Es un proceso de aislamiento de un fragmento de ADN especfico y la transferencia de este fragmento en un vector plasmdico.

CLONACIN CELULARClonar una clula significa derivar una poblacin celular a partir de una sola clula. Ese es un importante procedimiento in Vitro cuando se desea la expansin de una sola clula con ciertas caractersticas. Una valiosa tcnica de cultivo de tejido utilizada para clonar distintos linajes de clulas incluye el uso de aros de clonacin (cilindros).

CLONACIN TERAPUTICA

La clonacin teraputica es llevada a cabo, no para producir otro organismo, sino para cosecharclulas madre embrinicas que debern ser utilizadas en tratamientos mdicos. Lasclulas madre embrinicasson aquellas que pueden encontrarse dentro de los embriones en desarrollo. Las mismas puede ser usadas para producir una gran cantidad de diferentes clulas, entre las que se incluyen: tejidos, msculos, y clulas orgnicas.CLONACIN DE ORGANISMOS DE FORMA NATURALConsiste en crear un nuevo organismo con la misma informacin gentica proveniente de una clula existente.es un mtodo asexual, donde la fertilizacin no ocurre.En trminos generales solo hay un progenitor involucrado.

CLONACION DE ESPECIES EN PELIGRO DE EXTINCIONConsiste en la congelacin de clulas de animales extintos o en peligros de extincin para poder obtener, mas tarde, la secuencia de ADN, con la finalidad de clonar la especie.Es todo un reto, pero se han obtenido algunos indicios de que sea posible, como el 2001 clonaron un gaur, que esta en peligro de extincin, pero muri a los dos das.

Tecnologa del ADN Recombinante El trmino DNA recombinante hace referencia a la creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de molculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso gentico de la recombinacin produce DNA recombinante, este trmino se reserva a las molculas de DNA producidas por la unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas.

Aqu tenemos un gen que interesa insertar en un plsmido Una enzima de restriccin a cortado el gen y el plsmido, quedando unos bordes cohesivos y pegajososLa unin del ADN que contiene el gen que desea clonar con el vector de clonacin se realiza por la ADN ligasas, unen ambas partes de ADN , el resultado es ADN recombinante ya que contiene fragmentos de ADN distintos

Placas de agar con colonias de bacterias transformadasSe presiona con un papel de nitrocelulosa sobre la placa de agar Papel de nitrocelulosa El tratamiento con lcali rompe las clulas y expone el ADN desnaturalizada de agar ADN unido al papel Sonda de ADN marcada radiactivamente Incubacin del papel con la sonda radioactiva Sonda hibridada con las colonias de inters Exposicin del papel a la pelcula de rayos x Tcnica de Lisis AlcalinaPurificacin de ADN

As se el ADN recin extrado en alcohol

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

SECUENCIAMIENTO DE ADN

Definicin:Es una tcnica en la que se hace un anlisis ms detallado de la estructura del ADN y consiste en un conjunto de tcnicas y mtodos bioqumicos que nos permiten averiguar la secuencia de los nucletidos (A, C, G, T) en el ADN.

Antecedentes:A finales de la dcada de 1970 se desarrollaron dos mtodos que permitan la secuenciacin de una molcula de ADN de una manera sencilla y rpida. Al principio, la idea consista en imitar los clsicos mtodos de secuenciacin de protenas, donde las molculas eran fragmentadas y analizada su composicin en funcin de sus caractersticas fisicoqumicas, deduciendo as su secuencia a partir de fragmentos solapantes.

Historia de los mtodos de secuenciacin de ADNHistricamente hay dos mtodos de secuenciacin del ADN:

Degradacin qumica:

El mtodo de degradacin qumica fue propuesta por Maxxam y Gilbert, fue publicado en febrero de 1977 Historia de los mtodos de secuenciacin de ADNEn 1977 Frederick Sanger (galardonado con el Nobel de Qumica en 1980, con Walter Gilbert y Paul Berg) desarrolla y publica las tcnicas de secuenciacin del ADN, mediante el que pasara a conocerse como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi.En 1986 este mtodo es mejorado por el bilogo molecular estadounidense Leroy Hood con la automatizacin de las etapas de secuenciacin del ADN y el anlisis computarizado de los geles obtenidos, incorporando ordenadores y laser en este procesoSECUENCIAMIENTO DE ADN

METODOS DE SECUENCIACION DE ADNHistricamente hay dos mtodos de secuenciacin del ADNMtodo de Maxam & Gilbert o mtodo de degradacin qumica.Secuenciacin por terminador fluorescenteSecuenciacin alelo-especfica por bisulfitoMtodo de SangerHoy en da es el ms usado en los laboratorios

MTODO DE MAXAM & GILBERTEl protocolo de secuenciacin de Maxam-Gilbert utiliza reacciones qumicas en la escisin en las bases especficas para generar, a partir de copias pre-marcadas de la cadena de ADN para ser secuenciados.

Los fragmentos posteriormente se separan por tamao medianteelectroforesis en gel o auto radiografa.

El mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Se marca en los extremos 5 o 3' de una o ambas hebras con 32P Despus la muestra de ADN se divide y genera rupturas de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar el ADN son las siguientes:

Fred Sanger, investigador de la universidad de Cambridge (Inglaterra) fue uno de los pioneros en la secuenciacin de protenas, l ideo en el ao de 1977 el mtodo de secuenciacin de ADN llamado "interrupcin de la cadena" o mtodo didesoxi.MTODO DE SANGER(1918-2013)El mtodo de Sanger se basa en la sntesis de una nueva cadena de DNA que fuera el complemento de una plantilla de una sola cadena, de manera que la identidad de la ltima letra estuviera determinada. Adems Sanger incluyo un nucletido didesoxi modificado.FUNDAMENTO

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Debe estar en estado de hlice sencillaDNA de cadena simple DNA de cadena doble que se ha desnaturalizado Clonacin en bacterifago M13 Tratamiento con calor o lcali.EL ADN MOLDE O SEGMENTO DE ADN QUE SE DESEA SECUENCIAR

Fago M13 M13 es un fago filamentoso que en su forma replicativa contiene DNA de cadena doble .Es continuamente excretado de las clulas bacterianas durante el proceso de infeccin en forma de virus que contiene DNA de cadena sencilla.Para obtener DNA monocatenario del fragmento que se va a secuenciar , simplemente hay que clonarlo en M13, infectar clulas husped adecuadas y purificar el DNA de los fagos excretados al medio de crecimiento .

En el procedimiento original se utilizaba el fragmento de klenow de la ADN polimerasa I de E. coli.

UNA ENZIMA QUE REPLIQUE EL ADNPosee una baja velocidad de polimerizacin Posee una baja procesividad (nucletidos que polimeriza antes de disociarse del ADN molde )

Hoy en da su utilizacin ha sido desplazada por otras polimerasas que han superado dichos inconvenientes UN CEBADOR O "PRIMER"

suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementarias a la del fragmento de ADN que se desee secuenciar Procede de una region muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce .

LOS CUATRO NUCLETIDOS TRIFOSFATO (DATP, DCTP, DGTP Y DTTP)Son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'.

NUCLETIDOS DIDESOXI

Existen algunas variaciones tcnicas del mtodo de secuenciacin de terminacin de la cadena.En un mtodo, los fragmentos de ADN son marcados con nucletidos marcados con fsforo radiactivo. Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente.

Separacin de los Fragmentos (Sanger)Todos los mtodos actuales de secuenciacin requieren que la separacin de los fragmentos de DNA detecten diferencias en longitud de una base.Esto se logra por una electroforesis ya sea en geles de poliacrilamida o en capilares con polmeros lquidos.

Separacin de los Fragmentos (Sanger)

Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. 5' AAATCAATTCTGTGAACGATAATCCAGTCATTGATGTTGCCAGAGACAAAGCT 3'ADN-C :ADN-M 3' TTTAGTTAAGACACTTGCTATTAGGTCAGTAACTACAACGCTCTCTGTTTCGA 5'

Secuenciacin por terminador fluorescente

La secuenciacin se puede llevar a cabo en una sola reaccin. stos terminan la cadena dando fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por electroforesis capilar Se marcan los cuatro Didesoxinucletidos con colorantes fluorescente no interfiere en la reaccin de la polimerasaddTtp ddGtpddCtpddAtp

ddNTP terminal

Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito

Utilizada para el mapeo de metilacin en los sitios CPG. FUNCION:Desamina las citosinas del ADN convirtindolas en uracilo Incapaz de actuar en las citosinas q se encuentren metiladas La amplificacin de la regin que queremos mapear x PCR y se secuencia de forma normal Metilacin del ADN fue la primera marca Epigentica descubierta y sigue siendo el ms estudiada.

Aplica mtodos de secuenciacin de rutina de bisulfito tratados con ADN genmico para determinar el estado de metilacin de los Dinucletidos CpG.

Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito- limitacionesCONVERSION INCOMPLETAInterpretacin incorrecta : Las Citosinas no metiladas no convertidas en uracilo como citosinas metiladas, dando lugar a falsos positivos para la metilacin. DEGRADACION DEL ADN Largos tiempos de incubacinT elevadaAltas [] de NaHSo3 pequeas roturas al azar a lo largo de la cadena de ADN y dar errores durante la amplificacin por PCR

DESULFONACION INCOMPLETA DE LOS RESIDUOS DE PIRIMIDINAUna inadecuada alcalinizacin de la solucin donde afecta negativamente las polimerasas de ADN , las cuales sern incapaces de replicar la cadena molde.

LIMITACIONES

Estrategias y aplicaciones de la secuenciacin de cidos nucleicos

El proyecto del genoma humano El Proyecto Genoma Humano (PGH) Fue un proyecto de investigacin cientfica que tuvo el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases que componen el ADN Se realizo por el Departamento de Energa y los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos, bajo la direccin del doctor Francis Collins, quien lideraba el grupo de investigacin pblico , conformado por mltiples cientficos de diferentes pases, con un plazo de realizacin de 15 aos.

Este proyecto del genoma humano inicio el ao 1990 y finaliz en el 2001, cuatro aos antes de la fecha prevista(2005) .Gracias a los avances en el campo de la genmica, as como los avances en la tecnologa computacional.(la mayor parte de la secuencia se obtuvo con tecnologa ABI PRISM 3700) .

El genoma humano es la secuencia de ADN y Est dividido en fragmentos que conforman los 23 pares de cromosomas (22 pares de autosomas y 1 par de cromosomas sexuales).

El genoma humano est compuesto por aproximadamente entre 22500 y 25000 genes distintos. Cada uno de estos genes contiene codificada la informacin necesaria para la sntesis de una o varias protenas. se logro secuenciar un total aproximado de 3000 millones de pares de bases de ADN (3200 Mb) .ESTRATEGIAS PARA LA SECUENCIACIN DE FRAGMENTOS GRANDES DE ADNShotgun Sequencing

Hay dos estrategias generales para secuenciar fragmentos grandes de ADN. chromosome walking

chromosome walkingEl chromosome walking es un mtodo de clonacin posicional utilizado para aislar y clonar un gen en particular con una biblioteca de genes . A partir de experimentos de mapeo gentico se sabe que un gen particular es un gen previamente clonado, y es posible mediante el aislamiento de clones genmicos repetidamente adyacentes de la biblioteca. El proceso se conoce como paseo cromosmico y se utiliza para moverse a lo largo de un cromosoma de una ubicacin conocida y para clonar los clones genmicos superpuestos que representan progresivamente partes de un cromosoma particular Un pequeo segmento de ADN a partir de un extremo del clon genmico se usa como una sonda para aislar clones que contienen esta secuencia y las secuencias adyacentes que codifican la siguiente porcin del genoma. La secuencia final de la segunda clon se utiliza para aislar un tercer clon y as sucesivamente hasta que se aisl una serie de clones superpuestos. Es necesario el uso de sondas de ADN cuyas secuencias son de una sola copia, de lo contrario si la sonda utilizada es una secuencia repetida.

Consiste en lo siguiente: La fragmentacin parcial del ADN para su insercin en un vector de clonacin.La obtencin de un banco de clonas de fragmentos que contienen segmentos que se traslapan.La secuenciacin de una clona y la identificacin de una segunda que posea la continuacin del segmento que se est secuenciando. Este proceso se repite hasta que se completa la secuencia de la molcula original de ADN.Esta estrategia se utiliz originalmente en el proyecto de secuenciacin del genoma humano.

http://gxs.home.texas.net/work_samples/flash_samples/R1450AW.htmlShotgun SequencingLa segunda estrategia general para la secuenciacin de fragmentos grandes de ADN, se llama secuenciacin tipo shotgun(secuenciacin automtica ). La gran diferencia entre esta estrategia y la anterior es que en el shotgun se hace a partir de fragmentos que han sido cortados al azar. Despus, se utiliza un programa de cmputo para encontrar las regiones que se traslapan entre las secuencias individuales. De esta manera se va ensamblando la secuencia del fragmento original. Las secuencias ms largas se subdividen en fragmentos ms pequeos que pueden ser secuenciados por separado, y posteriormente se re-ensamblados para dar la secuencia global.

Genes clonados Mltiples genes son cortes en diferentes tamaos al azar .

Fragmentos de secuenciacin desordenados Montaje automtico por la computadora Resultado por superposicin Superposicin del segmento para construir la secuencia del genoma humano 73Shotgun Sequencing

Shotgun SequencingLa Ventaja :es rpidarequiere la sntesis de pocos iniciadorestiene una eficiencia comprobada.

La Desventaja esta estrategia requiere la redundancia de las secuencias para asegurar la obtencin de una muestra completa del ADN original.se requiere mucha tecnologa computacional para ensamblar la secuencia original quedan gaps (regiones del fragmento original que no se secuenciaron).

SECUENCIA DE ALTO RENDIMIENTO CON TECNOLOGAS