Laboratorio de Bioquímica

Resumen

Se realizó el análisis de la dependencia de la velocidad de reacción en función de la cantidad

enzimática (composición), de la temperatura y del pH. Así mismo se analizó la especificidad de la

acción enzimática, empleando la presencia de ureasa en la harina de soya y contrastar su acción

en la tiourea y la acetamida.

Los resultados obtenidos demostraron que la velocidad enzimática se ve influenciada por la

cantidad de enzima presente en solución. La gráfica que se produce como consecuencia de la

aparición de eritrodextrinas del almidón genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite

pensar que a medida que la concentración de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para

transformar el sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración).

Estos últimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores

biológicos de una reacción.

Así mismo se demostró que la temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimática.

Si la temperatura aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la

desnaturalización de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la

acción enzimática sobre el sustrato. Siendo 38°C la temperatura optima para la acción enzimática

de la ptialina.

De igual forma se pudo observar que la reacción enzimática también se ve influenciada por el

cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo, el cual para la ptialina está alrededor de

6.7-6.8 cerca del pH neutro. Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima

ptialina así como muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH

neutro. Este resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.

Finalmente se pudo comprobar la especificidad enzimática de la ureasa sobre la urea, en la

descomposición de la urea en amoniaco y dióxido de carbono.

1Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Introducción

Los enzimas son macromoléculas, específicamente proteínas, que tienen la propiedad de catalizar

las reacciones bioquímicas. Pero las condiciones en las cuales se realice dicha catálisis afectarán la

eficiencia de la reacción por lo tanto estas se deben de controlar en todo momento.

Por ejemplo son muy importantes los factores como la concentración del enzima, la temperatura

y el pH. Por ejemplo si la temperatura es muy elevada, el enzima se desnaturaliza y queda inactiva;

si la temperatura es muy baja, el enzima no se desnaturaliza, pero igual queda inactiva. Mientras

que valores de pH extremos pueden desnaturalizar a los enzimas.

Los enzimas, también se caracterizan por tener un alto grados de especificidad, es decir sólo

actúan para un solo tipo de sustrato. Esto puede deberse a la relación estereoquímica entre el

sustrato y el enzima, así como también al tipo de grupos funcionales que del sustrato. Por ejemplo

la ureasa contenida en la harina de soya sólo actúa sobre la urea descomponiéndola en amoniaco

y dióxido de carbono. Pero este enzima no actúa sobre la tiourea o acetamida a pesar de tener una

estructura muy parecida.

2Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Marco teórico

Cinética enzimática

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las

enzimas. El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo

catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede

ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.

Las enzimas son proteínas (macromoléculas) con la capacidad de manipular otras moléculas,

denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo

reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados

mecanismo enzimático. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar

diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos polipéptidos.

En otros casos, se produce la unión simultánea de dos sustratos, como en el caso de la ADN

polimerasa, que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato

2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, también suelen

presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Esta etapa

limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o

del sustrato.

Fundamentos

La reacción catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma

cantidad de producto que una reacción no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de

catálisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reacción entre sustrato y producto.

Sin embargo, al contrario que las reacciones químicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a

mayor cantidad de sustrato, mayor número de centros catalíticos estarán ocupados, lo que

incrementará la eficiencia de la reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén

ocupados. En ese momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se

añada más sustrato, no aumentará más la eficiencia.

3Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Las dos propiedades cinéticas más importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en

saturarse con un sustrato en particular y la máxima velocidad de reacción que pueda alcanzar. El

conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una

enzima en el ambiente celular y predecir cómo responderá frente a un cambio de esas

condiciones.

La velocidad de la reacción va aumentando a medida que aumenta la concentración de sustrato hasta que la enzima se satura. (Imagen. Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)

Ensayos enzimáticos

Un ensayo enzimático es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se

puede medir la velocidad de una reacción enzimática. Como las enzimas no se consumen en la

reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios experimentados bien en

la concentración de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentración de producto (que va

aumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas. La espectrofotometría

permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la

concentración de estos) y la radiometría implica incorporación o liberación de radiactividad para

medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los

más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el

contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son

ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten

detectar niveles muy bajos de actividad enzimática. También se puede utilizar la espectrometría

de masas para detectar la incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es

convertido en producto.

4Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres dirigidos a través de un microscopio para

observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reacción. Estas

medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en

el mecanismo de catálisis o bien unir moléculas fluorescentes en lugares específicos de la enzima,

que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catálisis. Estos estudios están dando una

nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales, en oposición a los estudios

de cinética enzimática tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una

población de millones de moléculas de enzima.

En la figura de la derecha se

puede observar la típica

evolución de una curva obtenida

en un ensayo enzimático.

Inicialmente, la enzima

transforma el sustrato en

producto siguiendo un

comportamiento lineal.

A medida que avanza la reacción,

se va agotando la cantidad de

sustrato y va disminuyendo la

cantidad de producto que se

genera por unidad de tiempo

(disminuye la velocidad de la

reacción), lo que se manifiesta

en forma de curva asintótica en

la gráfica. Dependiendo de las

condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos

hasta horas. Los ensayos enzimáticos suelen estar estandarizados para que el período inicial dure

en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas más fácilmente. Sin embargo, los modernos

equipos de mezcla rápida de líquidos permiten llevar a cabo medidas cinéticas de períodos

iniciales cuya duración puede llegar a ser inferior a un segundo.

5Practica N° 8 Cinética enzimática

Curva de saturación de una reacción enzimática. La pendiente representa, en el período inicial, la velocidad de la reacción. La ecuación de Michaelis-Menten describe cómo va variando la pendiente con la concentración de sustrato o de enzima. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)

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La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la

zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la

reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones

enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Esta aproximación es muy útil como

alternativa a las cinéticas rápidas, cuando el período inicial es demasiado rápido para ser medido

con precisión.

Factores físico-químicos que pueden modificar la actividad enzimática

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad

por este factor. Los rangos de temperaturas óptimos pueden llegar a variar sustancialmente de

unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima verá

incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalización de la misma,

que dará lugar a una reducción progresiva de dicha actividad.

pH: el rango de pH óptimo también es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio

se aleja del óptimo de la enzima, esta verá modificada su carga eléctrica al aceptar o donar

protones, lo que modificará la estructura de los aminoácidos y por tanto la actividad enzimática.

Concentración salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentración de

sales del medio es crucial para una óptima actividad enzimática. Una elevada concentración o una

ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimática, ya que las enzimas precisan

de una adecuada concentración de iones para mantener su carga y su estructura.

α-Amilasa (Nombre alternativos: 1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa)

Las α-amylasas son metaloenzimas de calcio, completamente afuncionales en ausencia de calcio.

Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en

maltotriosa y maltosa desde la amilosa o maltosa, glucosa y dextrina desde la amilopectina. Dado

que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la β-amylasa. En los animales

es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6.7 y 7.0.

En fisiología humana tanto la procedente de la saliva como la pancreática son α-Amylasas. Puede

encontrarse en algunas plantas, hongos y bacterias.

6Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Cinética de Michaelis-Menten

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra

un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad

inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como

[S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la

[S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura

de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso,

independientemente de la [S].

Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k1, k-1 y k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)

El modelo de cinética micheliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de

la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el

sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimático para

una reacción unimolecular puede ser bastante complejo, existe una etapa

enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética

única cuya constante es k2.

(Ecuación 1)

k2 también llamado kcat o número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones

enzimáticas catalizadas por segundo.

7Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la

forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a

expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la

velocidad de reacción depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S].

Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas

condiciones, la velocidad de la reacción (v ≈ k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeños cambios

en la [S]. En este caso, la concentración total de enzima ([E] tot) es aproximadamente igual a la

concentración del complejo ES:

La ecuación de Michaelis-

Menten[7] describe como la

velocidad de la reacción

depende del equilibrio entre la

[S] y la constante k2. Leonor

Michaelis y Maud Menten

demostraron que si k2 es mucho

menor que k1 (aproximación del

equilibrio) se puede deducir la

siguiente ecuación:

(Ecuación

2)

Esta famosa ecuación es la base

de la mayoría de las cinéticas

enzimáticas de sustrato único.

Representación de la ecuación de Michaelis-Menten

8Practica N° 8 Cinética enzimática

Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)

Laboratorio de Bioquímica

La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas

concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la

concentración de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar

regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de

la Km y la Vmax en las gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran

sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como

resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial

de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia α, se puede simular el

comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas.

La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de

mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación

de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo

de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la

recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de

abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar

valores negativos para 1/[S]; el

mínimo valor posible es 1/[S] = 0,

que correspondería a una

concentración infinita de sustrato,

donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto

de corte entre la recta y el eje x es

una extrapolación de datos

experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las gráficas de Lineweaver-Burke

distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a

9Practica N° 8 Cinética enzimática

La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)

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estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la Km.[9] Un modelo lineal mucho más exacto es el

diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones científicas actuales, todo este tipo de

linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por métodos más fiables basados en

análisis de regresión no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalización de los

mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e

incrementando la fiabilidad del análisis.

Especificidad

Las enzimas suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan como del sustrato

involucrado en la reacción. La forma, la carga y las características hidrofílicas/hidrofóbicas de las

enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas también pueden

mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad.

Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisión en su actividad son

aquellas involucradas en la replicación y expresión del genoma. Estas enzimas tienen eficientes

sistemas de comprobación y corrección de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que

cataliza una reacción de replicación en un primer paso, para comprobar posteriormente si el

producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado

una media de tasa de error increiblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de

reacciones en determinadas polimerasas de mamíferos. Este tipo de mecanismos de

comprobación también han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa

y en los ribosomas.

Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que

pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia

especificidad de sustrato podría ser clave en la evolución y diseño de nuevas rutas biosintéticas.

Ureasa

La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima que cataliza la hidrólisis de urea a dióxido de carbono y

amoniaco. La reacción ocurre de la siguiente manera:

(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

10Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

En 1926, James Batcheller Sumner demostró que la ureasa es una proteína. Es producida por

bacteria, hongos y varias plantas superiores.

Características

Peso molecular: 480 kDa o 545 kDa para la ureasa de frijol.

Metal en el sitio activo: Niquel(II).

pH óptimo : 7.4

Temperatura óptima: 60ºC

Especificidad enzimática: urea e hidroxiurea

Inhibidor enzimático: metales pesados

Diagnóstico

Los organismos que producen ureasa tienden a ser patógenos del tracto gastrointestinal o

urinario, siendo que la ureasa les permite neutralizar el ácido presente en estos medios acídicos.

Los patógenos ureasa positivos, incluyen:

Helicobacter pylori

Bacterias entéricas incluyendo Proteus, Klebsiella y Serratia

Nocardia, una bacteria filamentosa

Ureaplasma urealyticum, relacionada con mycoplasma

Cryptococcus, un hongo oportunista

11Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Procedimiento Experimental

Materiales de laboratorio : Rejilla, 10 tubos de ensayo, cocinilla, vasos de 100 y 500mL,

probeta, termómetro,

Reactivos : solución de almidón al 1%, solución de yodo en yoduro de potasio (Lugol),

buffer fosfato –citrato 0,1M con pH 5,6;6,4;7,2;8,0.

Material biológico : solución de saliva diluida.

Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima

1. Primero se diluye la saliva en 20, 40,80 y 160 veces su volumen.

2. Se toma 4 tubos de ensayo y se coloca en cada uno de ellos 1mL de cada una de las soluciones preparadas.

3. A cada uno de los 4 tubos se agrega 1mL de solución de almidón y se coloca en un baño de 38°C y se controla el tiempo inicial de la reacción.

12Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

4. Después de unos 2 minutos toman 2 gotas del líquido de cada muestra y le agregan a ellas 1 gota de solución de Lugol. Se registra el tiempo en que la reacción ha terminado pues primero se presenta una coloración azul, luego rojo-violeta y por ultimo roja.

Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura

1. Se coloco en un tubo de ensayo 5 gotas de saliva. Luego se hirvió por 2 minutos en un baño de agua y se paso a enfriar.

2. En otros dos tubos se coloca 5 gotas de saliva también pero sin hervir.3. A todos los tubos se les agrego 10 gotas de solución de almidón.4. Al primer y segundo tubo se les coloco en un baño de 38°C y al tercer tubo en agua con

hielo por 3 minutos.5. Por ultimo se añadió a cada tubo 1 gota de solución de Lugol y se comparo las

coloraciones.

13Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio

1. En 5 tubos se miden 10 gotas de solución buffer de fosfato-citrato con los diferentes pH mencionados.

2. Luego a cada uno de los tubos se le agr3go 5 gotas de saliva diluida 10 veces su volumen y 10 gotas de solución de almidón y todo se coloca en un baño de agua a 38°C.

3. Luego de 2 a 3 minutos se toma 1 gota de cada tubo y se le realiza el ensayo de Lugol en donde anotaremos el tiempo de aparición de la coloración roja.

14Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Demostración de la especificidad absoluta de la ureasa

(Laboratorio N°9)

1. En un tubo de ensayo se coloca 1mL de urea ya preparada, en un segundo tubo se coloca tiourea y en el tercero acetamida.

2. A cada tubo se le agrego aproximadamente 100mg de harina de soya y 2 gotas de fenolftaleína, mezclamos cuidadosamente y dejamos reposar a temperatura ambiente.

3. Por ultimo se observa la aparición de color rosado claro y detectamos la presencia de amoniaco por el olor característico.

15Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Reacciones Químicas

El método está basado en el estudio de la velocidad de hidrólisis del almidón revelado con

Lugol, en dependencia de la cantidad añadida del alfa-amilasa de la saliva. Así mismo se

cumplen las reacciones al influir la temperatura y el pH.

La amilasa del almidón forma con el yodo un complejo de color azul, el glucógeno – pardo

rojizo o amarillento.

La primera reacción que se describe a continuación es el fraccionamiento del almidón en

maltosa y dextrina por la enzima amilasa, esto ocurre en la boca.

Demostración de la especificidad absoluta de la ureasa

El método se basó en la determinación del amoníaco que se forma por la acción de la ureasa de

la harina de soya sobre la urea:

(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3

El desprendimiento de amoniaco se detectó por el olor y por el cambio de color de la

fenolftaleína y del papel de tornasol rojo.

16Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Cálculos Experimentales

Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima

T(s) 1/T(s) [amilasa diluida]8 0.13 20

10 0.10 4014 0.07 8020 0.05 160

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzíma

[concentracion] de amilasa

1/T(s)

Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática de la temperatura

Enzima Sustrato Coloración con Lugol Temperatura (°C)Amilasa Almidón Transparente 38Amilasa Almidón Transparente 38Amilasa Almidón Azul 8

Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio

pH 1/T (min)5.6 0.0706.4 0.1706.8 0.3307.2 0.2008.0 0.125

17Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

5 6 7 8 90

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Dependencia de la velocidad de la reacción enzimática del pH del medio

pH del buffer fosfato-citrato

1/T(min)

18Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Discusión de resultados

Dependencia de la velocidad de reacción de la cantidad de enzima

Los resultados obtenidos demuestran que la velocidad enzimática se ve influenciada por la

cantidad de enzima presente en solución.

La gráfica que se produce como consecuencia de la aparición de eritrodextrinas del almidón

genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que la concentración

de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el sustrato en producto es

mucho menor (al graficar 1/t vs concentración).

Estos últimos resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores

biológicos de una reacción.

Por otro lado se pudo corroborar cualitativamente la presencia de eritrodextrinas del almidón,

como consecuencia de la acción enzimática de la ptialina sobre el sustrato (almidón).

Cabe destacar por ultimo, que se pudo observar que la reacción enzimática siguió una cinética de

Michaelis por tener un comportamiento lineal al ser graficada la velocidad versus la concentración.

Así mismo destacar que la reacción enzimática de la amilasa sobre el almidón es de naturaleza

específica.

Dependencia de la velocidad de reacción enzimática de la temperatura

Los resultados del experimento demuestran que la temperatura tiene un efecto importante en la

velocidad enzimática.

Si la temperatura aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la

desnaturalización de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los productos de la

acción enzimática sobre el sustrato.

19Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidón. Así mismo se produce este resultado a

38°C, que es una temperatura ideal de acción de la enzima. Finalmente la acción enzimática no se

produce a 7°C debido a que no es la temperatura de acción de la ptialina.

Estos resultados pues indican, que la acción enzimática es específica no solamente a la estructura

del sustrato sino también a una temperatura adecuada, para que se puedan generar los enlaces de

naturaleza covalente y se pueda producir el fenómeno termodinámico y por ultimo la

transformación de los reactantes en productos.

Dependencia de la velocidad de reacción enzimática del pH del medio

Los resultados demuestran que la reacción enzimática también se ve influenciada por el cambio

del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo, el cual para la ptialina está alrededor de 6.7-6.8

cerca del pH neutro.

Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina así como muchas

enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH neutro. Este resultado

puede ser ubicado en la punta de la campana.

El pH funciona de esta manera como un tercer factor además de la temperatura y la composición

del sistema.

20Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Conclusiones

El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo

catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo

puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de

moléculas.

La velocidad enzimática se ve influenciada por la cantidad de enzima presente en solución.

La gráfica que se produce como consecuencia de la aparición de eritrodextrinas del

almidón genera una recta de pendiente positiva, lo cual permite pensar que a medida que

la concentración de la enzima es mayor el tiempo que se necesita para transformar el

sustrato en producto es mucho menor (al graficar 1/t vs concentración).

Los resultados son consistentes por el hecho que las enzimas son catalizadores biológicos

de una reacción.

La temperatura tiene un efecto importante en la velocidad enzimática. Si la temperatura

aumenta considerablemente la reacción puede no producirse debido a la

desnaturalización de la enzima. Si la temperatura es alta y propicia se obtienen los

productos de la acción enzimática sobre el sustrato.

Como es el caso de la ptialina actuando sobre el almidón. Así mismo se produce este

resultado a 38°C, que es una temperatura ideal de acción de la enzima. Finalmente la

acción enzimática no se produce a 7°C debido a que no es la temperatura de acción de la

ptialina.

Los resultados demuestran que la reacción enzimática también se ve influenciada por el

cambio del pH del medio hasta alcanzar un pH óptimo, el cual para la ptialina está

alrededor de 6.7-6.8 cerca del pH neutro.

21Practica N° 8 Cinética enzimática

Laboratorio de Bioquímica

Estos resultados son consistentes pues en el ser humano la enzima ptialina así como

muchas enzimas ubicadas en los tejidos sensitivos por lo general actúan en pH neutro. Este

resultado puede ser ubicado en la punta de la campana.

Bibliografía

1.- BIOQUÍMICA, Legninger, Edit. Omega. Segunda edición. 1981. Madrid.

2.- BIOQUÍMICA PRÁCTICA, Plummer. Edit. McGraw-Hill.

3.- GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA, García Alayo, Fred, FQIQIA, UNMSM, Perú, 2011.

22Practica N° 8 Cinética enzimática