Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa

[Práctica 3: Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa] Introducción a la Biotecnología

1

RREESSUUMMEENN

El presente reporte está elaborado en miras a focalizar y entender la aplicación del método

experimental en lo que refiere a la verificación de mediciones haciendo uso del modelo de

Michaelis-Menten para una reacción química a través del estudio de la catálisis enzimática para la

enzima “glucosa-oxidasa” al preparar soluciones con diferentes concentraciones de glucosa (50,

100, 500, 1000, 2000, 3000 y 4000 ppm), donde en los frascos del espectrofotómetro a 10μL de

solución de glucosa se le añadían 10 ml de reactivo enzimático(Glucosa Oxidasa) para todas las

soluciones de las diferentes concentraciones preparadas, luego en un frasco aparte se preparó el

blanco para la realización de la curva de calibración, el cual se preparó usando 10 ml de reactivo

enzimático con 100μL de agua destilada, para cada solución de las diferentes concentraciones se

dio un tiempo de reacción de 45 minutos a 25ºC y se tomaba la lectura de la absorbancia cada 5

min. hasta llegar a 30 min. y luego hasta 45 min. Luego, con los datos de absorbancia obtenidos

para las diferentes concentraciones se elaboró la curva de calibración y el cálculo de las

concentraciones de quinoneimina producidas existentes en cada tiempo “t” junto con el cálculo de

la velocidad de aparición de ésta y la velocidad de desaparición de la glucosa, para después

establecer para cada concentración los parámetros de Michaelis-Menten que se muestran en los

cálculos mostrados en éste reporte.

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN TTEEÓÓRRIICCAA

La cinética enzimática estudia la velocidad de

las reacciones catalizadas por enzimas. Estos

estudios proporcionan información directa

acerca del mecanismo de la reacción

catalítica y de la especifidad de la enzima.1

La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima. La velocidad puede determinarse bien midiendo

1 PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME

http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedic

ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf

la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se hace el estudio de la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el parte del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento.2

2Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb,

Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH


2

Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

En otras palabras:

[S]= concentración del sustrato

[P]= concentración del producto

[v0]= velocidad inicial

+ = aparición de producto

- = desaparición de sustrato

Se ha tomado el supuesto que la enzima usada en la práctica (Glucosa-Oxidasa) se comporta según el modelo de cinética de Michaelis-Menten de donde se deduce la siguiente ecuación:

La ecuación es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de sustrato único.

La constante de Michaelis Km se define como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax.

3

PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111;

Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.

3 Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor;

Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México;

Editorial El Manual Moderno; p.77-93.

http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedic

ados/Quimica%20clinica/12503%20glucosa.pdf

Una forma práctica de linealizar los datos es haciendo uso de la gráfica de Lineweaver-Burk, que es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten, el resultado de este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.4

Fig. 1:

La recta obtenida de la linealización es la pendiente que representa a: Km/Vmax, el intercepto es equivalente a 1/Vmax de la

reacción enzimática.

El reactivo enzimático del que se hará uso

contiene dos enzimas: Glucosa-Oxidasa

(GOD), la cual se hidroliza a ácido glucónico

4 Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor;

Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER; México;

Editorial El Manual Moderno; p.93-98.

Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb,

Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION WITH

PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111;

Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.


3

y Peroxidasa (POD), que comprueba la

presencia de peróxido de hidrógeno. De

donde luego ocurren las siguientes

reacciones:

La segunda reacción antes mostrada ocurre

tan rápido que podemos suponer que la

velocidad de aparición de la quinoneimina es

igual a la velocidad de consumo de glucosa y

es igual a la velocidad de aparición de

peróxido de hidrógeno, la velocidad de

aparición de la quinoneimina la mediremos

en el espectrofotómetro de UV visible y de

aquí partiremos para hacer el cálculo de las

demás variables.5

5http://www.uco.es/organiza/departamentos/b

ioquimica-biol-

mol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRÍA.pdf

Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor;

Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE HARPER;

México; Editorial El Manual Moderno; p.99-110.


4

MMÉÉTTOODDOOSS

Materiales utilizados:

Espectrofotómetro de UV visible.

Celda para espectrofotómetro.

Frascos volumétricos de 500ml.

Pipeta graduada de 1 mL.

Pipeta graduada de 10mL.

Perilla de succión.

Reactivos:

Reactivo enzimático (Glucosa Oxidasa y Glucosa Peroxidasa).

Solución de Glucosa.

Agua destilada.

Procedimiento:

Aviso previo a la realización de la práctica:

Se tuvo presente la pureza del reactivo de

trabajo, éste debía encontrarse sin nada que

lo contamine, ya que los oxidantes dan color

al mismo permitiendo el acrecentamiento de

blancos, los reductores disminuyen la

respuesta de color y los detergentes, metales

pesados y cianuros son inhibidores de

enzimas. Evitando todo contacto con la piel y

membranas mucosas.

Preparación de la curva de calibración:

1. Se prepararon soluciones de glucosa anhidra con las concentraciones a continuación: 50, 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 ppm.

2. En los frascos de uso para el espectrofotómetro, se añadió a 100μL de solución de glucosa, 10ml de reactivo enzimático. Esto se llevó

a cabo para todas las concentraciones que se prepararon en el paso no. 1.

3. En otro frasco de uso en el espectrofotómetro, se preparó una solución de 10 ml de reactivo enzimático con 100μL de agua destilada; éste fue usado para tomar el blanco de la curva de calibración.

4. Se dejó que la reacción transcurriera en un tiempo de 45 min. a T=25ºC, donde se tomaba lectura de la absorbancia para cada concentración en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 500nm.

5. Luego transcurridos los 45 min. y haber hecho la toma de datos, se llenó la primera tabla de datos de absorbancia proporcionada.

Obtención de datos para la elaboración de

la curva de cinética química:

1. Nuevamente se prepararon las soluciones “glucosa + reactivo enzimático” y el “blanco” como fue detallado en el procedimiento de elaboración de la curva de calibración. De las soluciones de glucosa-reactivo enzimático se tuvieron que preparar desde la concentración de 50ppm hasta 3000ppm, exceptuando la última de 4000ppm.

2. Para cada concentración preparada, se iba tomando el dato de absorbancia en lapsos de tiempo de 5 min. por lectura hasta llegar a 30 min. y luego una última lectura de absorbancia en 45 min. para luego llenar la segunda tabla de datos de absorbancia dada.


5

CCÁÁLLCCUULLOOSS YY RREESSUULLTTAADDOOSS

Para medir la disminución de la

concentración de la glucosa tomaremos

como base la reacción secundaria de

producción de quinoneimina, que es un

compuesto coloreado de rojo, del cual

podemos medir su concentración en la

solución usando un espectrofotómetro de

absorción de UV visible.

La glucosa es oxidada por la enzima glucosa

oxidasa (GOD) para formar un compuesto

orgánico y peróxido de hidrógeno, luego el

peróxido junto con un tinte incoloro y fenol,

por la acción de la enzima peroxidasa (POD),

son transformados a quinoneimina y agua

(ver sistema de reacciones 1).

Glucosa + 𝑂2 + 𝐻2O 𝐺𝑂𝐷 𝐶6𝐻12𝑂7 + 𝐻2𝑂2

2 H2O2 + Tinte Incoloro + Fenol 𝑃𝑂𝐷 Quinoneimina + 4 𝐻2𝑂

La segunda reacción es casi inmediata por lo

que la velocidad de producción de

quinoneimina está determinada por la

formación de peróxido de la primera

reacción. Por esta razón se puede asumirse

que la velocidad de formación del complejo

coloreado es igual a la velocidad de

formación del peróxido de hidrógeno y esta a

su vez es igual a la velocidad de

desaparecimiento de glucosa (sustrato de la

GOD).

Ahora bien los datos obtenidos son:

Concentración Inicial de Glucosa en

ppm

Absorbancia de la Quinoneimina

0 0 50 0,3676

100 0,396 500 0,5894

2000 1,0434 3000 1,2546 4000 1,5173

Tabla 1: Datos para la curva de calibración.

[G] (ppm)

Datos de Absorbancia

5 min 10

min 15

min 20

min 25

min 30

min 50 0,3620 0,3656 0,3667 0,3670 0,3671 0,3673

100 0,3849 0,3926 0,3939 0,3942 0,3954 0,3954 500 0,5384 0,5811 0,5889 0,5909 0,5917 0,5964

1000 0,9689 1,1076 1,1402 1,1467 1,1480 1,1481 2000 0,9497 1,0298 1,0454 1,0479 1,0482 1,0470 3000 1,0934 1,2275 1,2559 1,2626 1,2646 1,2625

Tabla 2: Datos de absorbancia en el tiempo a diferentes

concentraciones iniciales de glucosa [G].

Podemos calcular la curva de calibración en

términos de la concentración de la

quinoneimina [Q]. Sabemos por

estequiometria que por cada mol que se

produce de quinoneimina, se necesitan 2

moles de peróxido y por tanto 2 moles de

glucosa para formarlo, entonces:

𝑄 =1

2[𝐺]

𝑄 = 1

2

Xo ppm de Glucosa

1000mgg

× 180g de Glucosa

mol

= Xo ppm

360000

mol

Lt (Ec.1)


6

Con esto podemos formar una nueva tabla:

Concentración de la Glucosa

(en ppm)

Concentración Quinoneimina

(mol/Lt) Absorbancia

0 0 0

50 0,000138889 0,3676

100 0,000277778 0,396

500 0,001388889 0,5894

2000 0,005555556 1,0434

3000 0,008333333 1,2546

4000 0,011111111 1,5173

Tabla 3: Datos para la gráfica de la curva de calibración.

Graficando y obteniendo la curva de regresión más ajustada tenemos:

Gráfico 1: Curva de Calibración con la curva de mejor

ajuste.

Ahora tenemos una ecuación para encontrar [Q] a partir de la absorbancia con muy buena aproximación:

𝑄 = −0,002𝑎𝑏𝑠4 + 0,0049𝑎𝑏𝑠3 +0,0045𝑎𝑏𝑠2 − 0,0016𝑎𝑏𝑠 − 9 × 10−06

(Ec. 2)

Entonces con los datos de la tabla 2

obtenemos para cada concentración inicial

de glucosa:

Para Xo de 50 ppm de glucosa:

Concentración Inicial de 50 ppm de Glucosa

Tiempo (min)

Absorbancia de Q

Concentración de Q (mol/Lt)

0 0 -0,000009

5 0,362 0,000189295

10 0,3656 0,000200524

15 0,3667 0,000203995

20 0,367 0,000204945

25 0,3671 0,000205262

30 0,3673 0,000205896

Tabla 4: Variación de la concentración de quinoneimina [Q] en el tiempo para una concentración inicial

de 50 ppm de glucosa [G].

Gráfico 2:

Concentración de Q en el tiempo con la curva de mejor ajuste.

De donde obtenemos la curva de mejor ajuste siguiente:

𝑄 = 2 × 10−10𝑡5 − 2 × 10−8𝑡4 + 7 ×10−7𝑡3 − 1 × 10−5𝑡2 + 8 × 10−5𝑡 − 9 × 10−6

(Ec. 3)

[Q] = -0.0026abs4 + 0.0049abs3 + 0.0045abs2 -0.0016abs - 9E-06

R² = 0.9997

-0.002

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0 0.5 1 1.5 2

Q (m

ol/

Lt)

Absorbancia

Curva de Calibración de Absorbancia vrs

Concentración Molar de Q

[Q] = 2E-10t5 - 2E-08t4 + 7E-07t3 - 1E-05t2 + 8E-05t- 9E-06

R² = 0.9992

-0.00005

0

0.00005

0.0001

0.00015

0.0002

0.00025

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (m

ol/

Lt)

Tiempo (min)

Variación de Q vrs tG inicial = 50 ppm


7

Luego para Xo de 100 ppm de glucosa:


Tiempo (min)

Absorbancia de Q


0 0 -0,000009

5 0,3849 0,00026417

10 0,3926 0,000291192

15 0,3939 0,000295846

20 0,3942 0,000296924

25 0,3954 0,000301249

30 0,3954 0,000301249



Gráfico 3: Concentración de Q en el tiempo con la curva de

mejor ajuste.


𝑄 = −4 × 10−9𝑡4 + 3 × 10−7𝑡3 − 8 ×10−6𝑡2 + 9 × 10−5𝑡 − 7 × 10−6

(Ec. 4)



Tiempo (min)

Absorbancia de Q


0 0 -0,000009

5 0,5384 0,00098026

10 0,5811 0,001245819

15 0,5889 0,001297405

20 0,5909 0,001310784

25 0,5917 0,001316153

30 0,5964 0,001347896



Gráfico 4:



𝑄 = −1 × 10−8𝑡4 + 8 × 10−7𝑡3 − 2 ×10−5𝑡2 + 3 × 10−4𝑡 − 5 × 10−6

(Ec. 5)

[Q] = -4E-09t4 + 3E-07t3 - 8E-06t2 + 9E-05t - 7E-06R² = 0.994

-5E-05

-1E-19

5E-05

1E-04

0.00015

0.0002

0.00025

0.0003

0.00035

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (

mo

l/Lt

)

Tiempo (min)


[Q] = -1E-08t4 + 8E-07t3 - 2E-05t2 + 0.0003t - 5E-06R² = 0.9991

-0.0002

0

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.001

0.0012

0.0014

0.0016

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (m

ol/

Lt)

Tiempo (min)



8



Tiempo (min)

Absorbancia de Q


0 0 -0,000009

5 0,9689 0,004830775

10 1,1076 0,0064844

15 1,1402 0,00688594

20 1,1467 0,006966297

25 1,148 0,006982377

30 1,1481 0,006983614



Gráfico 5:



𝑄 = −4 × 10−8𝑡4 + 4 × 10−6𝑡3 − 1 ×10−4𝑡2 + 1,4 × 10−3𝑡 + 3 × 10−7

(Ec. 6)



Tiempo (min)

Absorbancia de Q


0 0 -0,000009

5 0,9497 0,004612282

10 1,0298 0,005542709

15 1,0454 0,005729074

20 1,0479 0,005759072

25 1,0482 0,005762674

30 1,047 0,005748269



Gráfico 6:



𝑄 = −6 × 10−8𝑡4 + 5 × 10−6𝑡3 − 1 ×10−4𝑡2 + 1,4 × 10−3𝑡 + 2 × 10−5

(Ec. 7)

[Q] = -4E-08t4 + 4E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 3E-07R² = 0.9998

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (m

ol/

Lt)

Tiempo (min)

Variación de Q vrs t

G inicial = 1000 ppm

[Q] = -6E-08t4 + 5E-06t3 - 0.0001t2 + 0.0014t + 2E-05R² = 0.9977

-0.001

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (m

ol/

Lt)

Tiempo (min)



9



Tiempo (min)

Absorbancia de Q


0 0 -0,000009

5 1,0934 0,006310506

10 1,2275 0,007967348

15 1,2559 0,008317459

20 1,2626 0,008399711

25 1,2646 0,008424232

30 1,2625 0,008398484



Gráfico 7:



𝑄 = −7 × 10−8𝑡4 + 6 × 10−6𝑡3 − 2 ×10−4𝑡2 + 1,9 × 10−3𝑡 + 2 × 10−5

(Ec. 8)

Para conocer la velocidad de reacción inicial

debemos derivar la expresión obtenida de la

regresión de curva de mejor ajuste y

evaluarla en el tiempo 0, así:

Derivando la Ec. 3: 𝑑 𝑄

𝑑𝑡= 1 × 10−9𝑡4 − 8 × 10−8𝑡3 + 2,1 ×

10−6𝑡2 − 2 × 10−5𝑡 + 8 × 10−5

(Ec. 9)

Después para obtener la velocidad de desaparición de la glucosa hacemos la relación de la estequiometria:

−2 ×𝑑 𝑄

𝑑𝑡=

𝑑[𝐺]

𝑑𝑡

Entonces podemos obtener la siguiente tabla

evaluando para cada tiempo t:


Tiempo (min)

Velocidad de Q (M/ min)

Velocidad de G -1 x (M/min)

0 0,000080 0,000160

5 0,000223 0,000446

10 0,000420 0,000840

15 0,000633 0,001266

20 0,000840 0,001680

25 0,001033 0,002066

30 0,001220 0,002440

Tabla 10: Velocidad de reacción de aparición de la

quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa [G] en el tiempo para una concentración inicial


Ahora si graficamos los datos obtenemos:

Gráfico 8: Velocidad de reacción en función de la glucosa

versus el tiempo en minutos.

[Q] = -7E-08t4 + 6E-06t3 - 0.0002t2 + 0.0019t + 2E-05

R² = 0.9991

-0.002

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0 5 10 15 20 25 30 35

Q (m

ol/

Lt)

Tiempo (min)


0.0E+00

5.0E-04

1.0E-03

1.5E-03

2.0E-03

2.5E-03

3.0E-03

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)

Velocidad de Reacción d[G]/dt vrs t[G] inicial = 50 ppm


10

Luego, haciendo lo mismo para las demás

concentraciones iniciales:

Derivando la Ec. 4: 𝑑 𝑄

𝑑𝑡= −1,6 × 10−8𝑡3 + 9 × 10−7𝑡2 − 1,6 ×

10−5𝑡 + 9 × 10−5

(Ec. 10)


Tiempo (min)



0 0,000090 0,000180

5 0,000031 0,000061

10 0,000004 0,000008

15 -0,000002 -0,000003

20 0,000002 0,000004

25 0,000002 0,000005

30 -0,000012 -0,000024




Gráfico 8:

Velocidad de reacción en función de la glucosa versus el tiempo en minutos.

Derivando la Ec. 5:

𝑑 𝑄

𝑑𝑡= −4 × 10−8𝑡3 + 2,4 × 10−6𝑡2 − 4 ×

10−5𝑡 + 3 × 10−4

(Ec. 11)


Tiempo (min)



0 0,000300 0,000600

5 0,000155 0,000310

10 0,000100 0,000200

15 0,000105 0,000210

20 0,000140 0,000280

25 0,000175 0,000350

30 0,000180 0,000360




Gráfico 9:


-5.0E-05

0.0E+00

5.0E-05

1.0E-04

1.5E-04

2.0E-04

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)


0.0E+00

1.0E-04

2.0E-04

3.0E-04

4.0E-04

5.0E-04

6.0E-04

7.0E-04

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)



11

Derivando la Ec. 6:

𝑑 𝑄

𝑑𝑡= −1,6 × 10−7𝑡3 + 1,2 × 10−5𝑡2 − 2 ×

10−4𝑡 + 1,4 × 10−3 (Ec. 12)


Tiempo (min)



0 0,001400 0,002800

5 0,000680 0,001360

10 0,000440 0,000880

15 0,000560 0,001120

20 0,000920 0,001840

25 0,001400 0,002800

30 0,001880 0,003760


quinoneimina [Q] y de conversión de la glucosa

[G] en el tiempo para una concentración inicial


Gráfico 10:


Derivando la Ec. 7:

𝑑 𝑄

𝑑𝑡= −2,4 × 10−7𝑡3 + 1,5 × 10−5𝑡2 − 2 ×

10−4𝑡 + 1,4 × 10−3 (Ec. 13)


Tiempo (min)



0 0,001400 0,002800

5 0,000745 0,001490

10 0,000660 0,001320

15 0,000965 0,001930

20 0,001480 0,002960

25 0,002025 0,004050

30 0,002420 0,004840





Gráfico 11:


0.0E+005.0E-041.0E-031.5E-032.0E-032.5E-033.0E-033.5E-034.0E-03

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)


0.0E+00

1.0E-03

2.0E-03

3.0E-03

4.0E-03

5.0E-03

6.0E-03

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)



12

Derivando la Ec. 8:

𝑑 𝑄

𝑑𝑡= −2,8 × 10−7𝑡3 + 1,8 × 10−5𝑡2 − 4 ×

10−4𝑡 + 1,9 × 10−3 (Ec. 14)


Tiempo (min)



0 0,001900 0,003800

5 0,000315 0,000630

10 -0,000580 -0,001160

15 -0,000995 -0,001990

20 -0,001140 -0,002280

25 -0,001225 -0,002450

30 -0,001460 -0,002920





Gráfico 12:


Ahora que tenemos las velocidades iniciales

a diferentes concentraciones graficamos el

inverso de las velocidades iniciales de

reacción (1/Vo) vrs la concentración inicial de

sustrato, que en este caso es la glucosa

(1/[G]), para poder obtener los parámetros

del modelo de reacción de Michaelis-

Menten.

[Go] mol/Lt

- Vo M/min

1 / [G] - 1 / Vo

0,000277778 0,000160 3600 6250

0,000555556 0,000180 1800 5555,556

0,002777778 0,000600 360 1666,667

0,005555556 0,002800 180 357,1429

0,011111111 0,002800 90 357,1429

0,016666667 0,003800 60 263,1579

Tabla 16: Inversos de la concentración inicial de glucosa

[Go] y de la velocidad inicial en función de la

glucosa (Vo).

Gráfico 13:

Gráfico de los inversos de velocidad vrs. los inversos de la concentración inicial para obtener

los parámetros de la Michaelis-Menten.

La gráfica parece apegarse a la linealidad de groso modo debido a su varianza de 0,8827. Por tanto podemos suponer que el modelo elegido no dista de la realidad.

-4.0E-03

-2.0E-03

0.0E+00

2.0E-03

4.0E-03

6.0E-03

0 10 20 30 40

r d

e [G

]-1

x (

M/m

in)

Tiempo (min)


y = 1.8196x + 561.4R² = 0.8827

-1,000

0

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

-1000 0 1000 2000 3000 4000

-1/

Vo

1/[G]

1/Vo vrs 1/[G] de la Glucosa-oxidasa


13

Con el intercepto en y (x=0) de la curva de ajuste podemos obtener el valor de la velocidad máxima de reacción:

1

𝑉𝑚= 561,4 => 𝑉𝑚 = 0,00178

𝑀

𝑚𝑖𝑛

Luego con el intercepto en x (y=0) podemos

adquirir el valor de la constante de reacción

de Michaelis-Menten:

−1

𝐾𝑚= −

−561,4

1,8196 => 𝐾𝑚 = 0,00324

Quedando totalmente definido el modelo

para la reacción Michaelis-Menten.

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA

3,4,5 - Murray, Robert; Granner, Daryl; Rodwell, Victor; Mayes, Peter; 1997; BIOQUÍMICA DE

HARPER; México; Editorial El Manual Moderno; p.77-110.

2,4 - Mier, Geraldine; Rhodes, V.J.; Maharg, Leta; Webb, Nancy, S; et al.: BEEF TENDERIZATION

WITH PROTELYITIC ENZYMES; E.E.U.U.; Food Tech; p.16,111; Dairy Sci. Abstracts; p.23,197.

1 - PRODUCTION AND APPLICATION OF ENZYME PREPARATIONS IN FOOD MANUFACTURE;

(Symposium, London,1959); Monograph No.11; Industrial Chemical Society; London.

Páginas de Internet consultadas:

5 - http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-

mol/pdfs/08III%20ESPECTROFOTOMETRÍA.pdf

Consultada el día Jueves 27 de Mayo de 2010 a las 22:49 horas

1,3 - http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos%20dedicados/Quimica%20clinica/

12503%20glucosa.pdf

Consultada el día Sábado 29 de Mayo de 2010 a las 23:56 horas

Cinética Enzimática de la Glucosa-Oxidasa

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