BIOSENSORES PARA LA DETERMINACIÓN RÁPIDA Y...

CURSO: CONTAMINANTES EMERGENTES EN EL SIGLO XXI

BIOSENSORESPARALADETERMINACIÓNRÁPIDAYPORTABLEDEMICOTOXINAS

29– Septiembre- 2016

MICOTOXINAS: CONTAMINANTES EMERGENTES

Las micotoxinas son un grupo muy amplio y variado de moléculas tóxicas,producidas como metabolitos secundarios por hongos filamentosos, y que puedencontaminar a un grupo muy amplio de alimentos.

Castillo, J.R., Vidal-JC , et al., Electrochemical Affinity Biosensors for Detectionof Mycotoxins: A Review, Biosens. Bioelectr. 49 (2013) 146-158

Aflatoxins (Aspergillus)

(Aspergillus & Penicillium)

Zearalenone(Fusarium)Fumonisina B1 (Fusarium)

Deoxinivalenol (Fusarium)

Ocratoxina A

Tricotecenos

MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS

ELISAs

INMUNOSENSORES

Electroquímicos(VOLT,AMP,EIS)

Fluorescencia(FP,IAC-FLD,F.O.)

APTASENSORES

FlujoLateral(LFDs) SPR

Microfluídica(Lab-on-a-chip)

BIOSENSORESYMÉTODOSRÁPIDOS

Anticuerpos Aptámeros

• Extracción (aislamientomicotoxina)• Tratamientosencillodelamuestra• Evitarinterferenciasdematriz• Selectividaddelligando• Sensibilidad(<ppb´s)• Determinaciónrápida• Bajo coste (instrumentaciónsencilla)• Portabilidad(in-situ)• Determinaciónmúltiple• Kits comerciales• Sistemasdealerta(screening)

QCM

ELISAsELISAs

LODs ≈ 0.1-1 ng mL-1

• Kits ELISAs comerciales

Lector ELISABio-Rad - 680

enzyme linked immuno-sorbent assays

• Portabilidad(in-situ)• Micotoxinas másimportantes• Tiemposmedida:～ 0,5-4h.• Sensibilidadysencillez• Screening /Cuantitativos.

EnsayocompetitivoAmplificaciónenzimática

mpELISAs

mpELISAs

mpEIA

(TMB)Rd

(TMB)Ox

Muestra (extracto micotoxina)

MIC

MIC

OTAFB1DON

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Rapiddtm.ofrecent COCusewith mpEIA inserum,salivaandurine fluids,J.Pharm.Biomed.Anal.125(2016)54-61

GEAS:GrupodeEspectroscopía AnalíticaySensores(UZ)

KITS INMUNOSENSORES ELECTROQUÍMICOS Y ESPECTROFOTOMÉTRICOS

BIOSENSORES

Biosensores para micotoxinas

Muestra

Biorreconocimiento Transducción

electronics

Anticuerpos

Aptámeros

• Óptica (FM)• Electroquímica• QCM• SPR

Señal Analítica = f(c)

Afinidad

Catalíticos

Enzimas (inhibición)

BIOSENSORES: TRANSDUCCIÓN ELECTROQUÍMICA

A. B.+

FB1 mAb-FB1FB1-HRP MBs-PrG

HQ+H2O2

pBQ

HQ2 e-+

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Meth.7(2015)3742-3749

Fumonisina B1

• LOD:0,58±0,05ng mL-1 FB1• EC50:4,34±0,15ng mL-1 FB1• Range:0,70-54ng mL-1 FB1

• 7-13%RSD

TRANSDUCCIÓN MULTI-ELECTROQUÍMICA

• Multi-potenciostato• Multi-micotoxinas• Nanoestructuración

• Arrays serigrafiados (8X)

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Amulti-electrochemical competitive immunosensor forsensitive COCdtm.inbiological samples,Electroanal.28(2016)685-694

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,An electrochemical immunosensor for OTAdetermination inwines based on amAb andparamagnetic microbeads,Anal.Bioanal.Chem.403(2012)1585-1593

SPCEsscreen-printed carbon electrodes

NANOESTRUCTURACIÓN

Lananoestructuración mejoralaspropiedadesdelbiosensor (inmunosensor)

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Improved electrochemical immunosensor for OTAwith abiotinilated mAb captureprobe andAuNPs nanotructuring,Anal.Meth.3(2011)977-984

• mAb-OTA-bi• OTA-BSA-AuNPs• OTA:0,15– 10ng mL-1

• LOD:0,10ng mL-1 OTA• %RSD:10%

• pAb-OTA• OTA-BSA-AuNPs• OTA:0,9– 9ng mL-1• LOD(sinAuNPs):0,86 ng mL-1 OTA• LOD(AuNPs):0,20 ng mL-1 OTA• %RSD:10,6%y8,0%• Recuperaciones:105%

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,OTAnanostructured electrochemical immunosensorsbased on pAb andAuNPs coupled tothe antigen,Anal.Meth.2(2010)335-341

MÉTODOS RÁPIDOS: FLUORESCENCIA DE POLARIZACIÓN

FPIA • Fasehomogénea (rapidez)• Noesprecisoseparación(lavado)• Velocidadderotación• Instrumentosportables(1sóla micotoxina,1𝛌em)• Tiempodevidafluorescencia:tdesdeexc.aemis.(～4ms.)• Alineamientodipolosconlaluzpolarizada,tiempoemis.• 1ªaplicaciónFPIA(myctx):2001(FB1enmaíz)• tincubación:2-10min.(fasehomogénea)

3min.(extract.)+2min.(FPIA)

ensayocompetitivo

MYCTX LODs ó EC50

Aflatoxinas EC50: 28 ng mL-1

DON LOD: 100 𝜇g kg-1; EC50 ～ 20 ng mL-1

FB1 LOD: 500 𝜇g kg-1

OTA LODs ～ 0,5 - 10 ng mL-1

ZEA LODs ～ 70 - 130 𝜇g kg-1

T-2 + HT-2 LODs ～ 8 𝜇g kg-1

Másinformación:

Maragos,C.etal.,Fluorescence polarizationimmunoassays for rapid,accurate andsensitive determination ofmycotoxins,WorldMyc.J.7(2014)479-489

MÉTODOS RÁPIDOS: Inmunosensores de fibra óptica

Ondaevanescente(interfase)(𝞰 ext.menor)

• Altaespecifidad• Portabilidad(miniaturización)• Medidasentiemporeal• Faltadesensibilidad• Influencia𝞰 disolventes

Másinformación:

Maragos,C.etal.,Fiber-optic immunosensor for mycotoxins,NaturalToxins 7(1999)371-376Leung,A.etal.,Areview offiber-optic biosensors,Sens.Act.B125(2007)688-703

Ejemplo:FB1:EC50=25 𝜇gg-1 (LOD=3,2𝜇gg-1)

AFB1:<2ng mL-1

EC50=5𝜇gg-1 (LOD=0,4𝜇gg-1)

IAC

MÉTODOS RÁPIDOS: IACs (FM)

Columnas de inmunoafinidad(IACs)

OchratestDONTestFumonitest

LODs ≈ 0.01-5 ng/mL(Fluorescencia intrínseca de la micotoxina)

• Limpieza/preconcentración enHPLC-FLD(MS)• Determinaciónposterior(FM,VOLT,Biosensores)• Mejoradelaselectividadysensibilidad.

• MenoresLODs.• Evitamoselefectodelamatriz enlatécnicainstrumental.

Másinformación:

Zheng,M.Z.etal.,Areview ofrapid methods for theanalysis ofmycotoxins,Mycopathologia 161(2006)261-273

MÉTODOS RÁPIDOS: MISPE - FLD

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Lett.45(2012)51-62

• OTA:3-18ng mL-1 OTA• LOD:1,2ng mL-1OTA• Recovery:93±9%(cereal)• Dynamic binding capacity:118±9ng OTA/45mgMIP

MIPs

INMUNOSENSORES: MICROBALANZA DE CUARZO

• Viscoelasticidad• FIA•Noetiquetado

Modelización:Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Bioanal.Chem.394(2009)575-582

QCM

OTA:10-128ng mL-1LOD:8ng mL-1

EcuaciónSauerbray

DISPOSITIVOS DE FLUJO LATERAL (LFDs)

• Tirasreactivas(NC,f.vidrio)• Cut-off level (+ó -)• Myctx:1epítopo• Ensayocompetitivo• Sencillez,rapidez,estabilidad• Usoin-situ.Comerciales.• Semi-cuantitativos(screening)• Multiple testlines• 5-10min.

LFDs

Sample pad Membrane pad

DispositivosInmunocromatográficos

PROPIEDADES ANALÍTICAS: LFDs

LFDs

Fuente:Nimal,J.etal.,Mycotoxin detection – Recent trends atgloballevel,J.ofIntegrative Agriculture 14(2015)2243-2264

Fuente:Song,S.etal.,MultiplexLFDfor mycotoxin determination,Anal.Chem.66(2014)4995

DON+ZEA+AFB1

INMUNOSENSORES SPR

• Inmunosensores para(múltiples)micotoxinas

• Serequieremuypocovolumen(～𝜇L)

• Reutilizaciónsensorchip

• Cinéticamicotoxina-anticuerpo

• Noserequiereetiquetado(inmunosensor)

• MiniaturizacióndelainstrumentaciónSPR(in-situ).

• Myctx (PM<700Da<<10kDa):sandwich,indirect.competitive.

ResonanciadePlasmón superficial(Inmunosensores)

SensorChipMásInformación:Ying,L.etal.,Review:Recent developments andapplicationsofSPRbiosensors for the detection ofmycotoxins infoodstuffs,Food Chem.133(2012)1548-1554

Micotoxinas LODs(ngg-1)

AFB1+ZEA+FB1+DON 0,2/0,01/50/0,5

OTA 0,01

T-2,HT-2 25

• Monocadenas oligonucleótidos(ssDNA,RNA)• MétodoSELEX(～1995):Selectividad• Mayorestabilidadvs.anticuerpos• Síntesismáseconómica• Sensiblesaenzimasnucleasas• OTA,FB1,AFB1(aptámeros).

APTÁMEROS: APTASENSORES PARA MICOTOXINAS

-C-G--A-T-

LFDs

Señal

ELIMAs

Aptámeros:

Másinformación:

Yang,X.etal., Review:Application ofAptamer Identification Technology inRapidAnalysis ofMycotoxins,Chin.J.Anal.Chem 41(2013)297-306.

Sampleloading

APTASENSORES

Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Biosens.Bioelectr.26(2011)3254-3259

• OTA:0,7-8,8ng mL-1• LOD:0,07±0,01ng mL-1• RSD:8%

OTAvs.OTB

BIOCHIP ARRAYS

Másinformación:

Oswald,S.etal.,Automated regenerable microarray-basedimmunoassay for rapid parallel quantification ofmycotoxins incereals,Anal.Bioanal.Chem.405(2013)6405-6415.

• Inmunoensayo múltiple(indirecto)• Spottingover adefined surface.• Chip:di-amino-PEGsobresuperficievidrio

• Quimiluminiscencia.• Aflatoxinas (B1,B2,G1,G2),OTA,DON,FB1• Extracciónmúltiple(MeOH:Agua,80:20,V:V)• a-IgG-HRP(luminol,H2O2).• Tiempototal:19min.

• Re-utilizaciónbiochip:50veces.

Array biosensor optical assays

Avidin (silanized)coated glass slide(PDMStemplate)biosensor array.Eachpattern:21x1x2.5mm. (LxWxH)

Micotoxina LODs(µgkg-1) Linearrange(µgkg-1)

OTA 1,1 1,7–15,4

AFB1 0,9 2,6–11,6

FB1 159 168-2216

DON 40,5 76-1173

MICROFLUÍDICA: LAB-ON-A-CHIP

• 𝜇TAS(1980´s)• Lab-on-a-chip• Preparaciónmuestra,filtración,reacción,detección.

• Canalesmicrofluídicos:10-200𝜇m• Consumomenordereactivos• Tiempos(incubación,medida)menores.

Másinformación:

Fang,K.,Application ofmicrofluidic “lab-on-a-chip”for the detectionofmycotoxins infoods,Trends inFood Sci.Tech.46(2015)252-263

Unchipmicrofluídico típico

DeterminacióndeZEA

PDMS


Gracias por su atención


29deSeptiembrede2016



29deSeptiembrede2016

InformaciónadicionalparaelCurso

ELISAs COMERCIALES

ExisteungrannúmerodekitsELISAScomercialesparatodotipodemicotoxinas

INFORMACIÓN ADICIONAL

ELISAs

ELISAS: ALGUNOS OTROS EJEMPLOSINFORMACIÓN ADICIONAL

ELISAs

BIOSENSORES PARA MICOTOXINAS

Fuente:Anal.Chim Acta902(2015)12-33


Algunostiposdebiosensoresparaladeterminacióndemicotoxinas

MÉTODOS RÁPIDOS: IACs

Fuente:Turner,N.W.etal.,Review – Analytical methods for determination ofmycotoxins:An update (2009-2014),Anal.Chim.Acta901(2015)12-33

EjemplosdelusodeColumnasdeInmunoafinidad


Fuente:Anal.Chim.Acta901(2015)12-33

PROPIEDADES ANALÍTICAS: APTASENSORES

OTA/FB1/AFB1Aptámerosseleccionados:

INFORMACIÓN ADICIONALAptasensores paramicotoxinas

BIOSENSORES DE FUSARIUM

Fuente:Lin,X.etal.,Review - Advances inBiosensors,Chemosensors andAssaysfor the Determination ofFusariumMycotoxins,Toxins 8(2016)161-181

Másinformación:Xu,L.etal.,Review:Mycotoxin determination infoods using advanced sensorsbased on antibodies or aptamers,Toxins 8(2016)239-255

Biosensores paramicotoxinas Fusarium


PROPIEDADES ANALÍTICAS

Fuente:Anal.Chim.Acta901(2015)12-33

Polímerosmodeladosmolecularmente(MIPs)

Biosensores deinhibiciónenzimática


Fuente:Mycopathologia 161(2006)211

PROPIEDADES ANALÍTICAS (II)INFORMACIÓN ADICIONAL

MICROFLUÍDICA: LAB-ON-A-CHIPFuente:Food Sci.Tech.46(2015)252-263


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