Aislamiento de bacterias y hongos del suelo

Blgo-Mblgo. Juan Damian Icanaqué Ordinolajdio6@hotmail.com

Laboratorio de Biotecnología y Bioprocesos avanzados (UNT), Trujillo, La Libertad.

Homo sapiens Tetraodon nigroviridis

Bacterias de ambientes naturales

MÉTODOS DE AISLAMIENTO

• El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos.

• El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).

• Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo).

• Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables.

• Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes

• naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski

• que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos

• presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.

Métodos de muestreo y colección de Hongos

Los hongos ubicuos, son organismos heterotroficos que ocupan rápidamente cada imaginable nicho.

Antes de iniciar el aislamiento de hongos es importante definir algunos objetivos (producto de interés) y para comprender la estructura de el ecosistema que esta siendo muestreado. Esto determinará el tipo de ambiente a muestrear.

La muestras deberían ser colectadas usando guantes estériles, pinzas, escalpelos, o cucharas, llevadas en envases tapa rosca o botellas (almacenarlo toda la noche a 5º C).

Cuando se colecta muestras de suelo, todos los horizontes de un suelo en particular, pequeñas hojas o ditritus, rhizosfera, arena, grava y roca deben ser incluidos.

Tipos de hongos

Métodos

Cualquier parte de la planta puede ser util para el aislamiento de hongos ( hoja, tallo, raíz, flores). La forma, tamaño, y estado fisiológico (viva, muerta, saludable, enferma) de las partes de la planta, condiciones de superficie (rugoso, pubescente, glandular), y la posición o exposición de la muestra tanto sobre la planta indiviual y su exposición con el ecosistema, como un todo (p. e. Exterior e interios de la arboleda), que pardialmente determinará las epecies de hongos aislados.

La muestras de agua pueden ser colectadas a partir de esturarios, cloacas, lagos, ambientes marinos, arroyos, etc. Al menos 50 mL de agua deberían ser colectados, usando botellas estériles.

Los hongos son ubícuos

Ambiente Natural

Medio de aislamiento para hongos menores

Sales, antibióticos (clorotetraciclina en aguas de desecho), cebos (p .e. semillas)

Medio rosa de bengala. Agar PCNB, agar agua de caño. Agua envasada.

Aguas: fresca, marina, desecho.

Sales, quitina, pectina, celulosa o mat. veg. estériles (p.e. discos de zanah), inhibidores.

Agar infusión hierba, Agar extracto de sabia de hojas, agar agua de caño.

Material vegetal: fresco o dañado, materia vegetal, detritos.

Sales, tetraciclina, estreptomicina. antifúngicos, etc.

Agar Infusión suelo. medio rosa de bengala, agar infusión hierba, agar PCNB, agar agua de caño.

Suelos: arena, limo, arcilla, roca, humus, etc.

AditivosMedio sugeridoTipo de muestra

Parámetros ecológicos y medios

Newhousae y Hunter, demostratron que cambiando unos constituyentes de un medio pueden favorecer el aislamiento de algunos hongos sobre otros. De otro lado, no existe un medio todo propósito para el aislamiento de hongos.

Parámetros físicos ( pH, salinidad, fuentes de nutrientes, Tº) del ecosistema que esta siendo muestreado, tanto como el tipo de hongo (lignocelulósico, halofílico, etc.) aislado, deben ser considerdos en el desarrollo de agares de aislamiento.

Usando medios con bajas proporciones de C/N rinde más colonias discretas contables, resultando en aislamientos e identificaciones más efectivas. Medios de inhibición y selectivos pueden ser usados simult

Tº de incubación: 5 – 15º C (Psicrófilos); 20 – 35º C (Mesófilos); y 45 – 50º C (Termófilos).

La luz y tensión de CO2 pueden ser necesario para la fructificación.

Graficos de especies

Aspergillus sp. Botritis sp Rhizopus sp

Penicillium sp Saccharomyces cerevisiae Hifas

Enriquecimiento selectivo

Diseñado para lograr aislamientos de unas especies sobre otras, p. e. Aislar especies de Fusarium de otras, basado en los requerimientos nutricionales. Otro ejemplo, aislamiento de org. Celulolíticos.

Incorporación de substratos estériles (infusiones extracto de suelo, vegetal, etc) a partir del ambiente muestreado dentro del medio de aislamiento es una simple pero efectiva vía para enriquecimiento de hongos, así aislamiento de Nº y tipo de levaduras a partir de hojas de uvas, en medios con algunos azúcares encontrado en la savia de la parra. p. e. Jugo de uva/ext. de lev. y Jugo de uva/ext. de higado.

Levaduras osmóticamente sensibles fueron aislados por incorporación de partes de vegetales estériles en agar agua. El aislamiento de hongos alcalófilos con elevada tolerancia a las sales de mar, se lograron con la incorporación de varios niveles de sales de mar en el medio y ajustando el pH en alcalinidad.

Inhibición de bacteriasPor incorporaciópn de antibióticos como cloramfenicol, kanamicina, penicilina, estreptomicina, y tetraciclina en los medios, los cuales inhibiran el desarrollo de las colonias de bacterias. Otros métodos de eliminación de bacterias es el secado de las placas con medio (3 a 4 días) antes de su uso. El pH bajo es muy efectivo en el aislamiento de hongos. El agregado de rosa de bengala (1:30,000) inhibe el desarrollo bacteriano.

Inhibición de hongos

El agregado de agentes antifúngicos puede inhibir el desrrollo de hongos ideseables. Antibióticos antifúngicos: nistatina, pimaricina, cicloheximida). Otros agentes inhibitorios, p. e. El CO2, sales de propionato de calcio, Oxgall, y cristal violeta. Fungicidas comerciales: Botran (2,6- dicloro – 4 – nitroanilina), Benlate, Pentaclorofenol, Nitrobenceno y Captan. No todos los hongos son inhibidos por estos agentes.

Colonias

Penicillium sp Paecilomyces sp

Fusarium spEscopulariopsis

Colonia de moho

Obs. microscopica

Paecilomyces lilacinus Penicillium sp

Métodos de aislamiento de hongos a partir del suelo

Método del Implante

Método de la dilución en placa

Por medio de una espátula o pico, poner una pequeña partícula de suelo cerca de la orilla de agar. Presione suavemente en línea la muestra e introduzca en el agar e incube.

Haga tubos diluciones en serie conteniendo 9 mL de agua destilada estéril u otro diluyente. Ponga 1 g de suelo en un tubo de dilución y agite por 15 min. Corra las diluciones y siembre las tres últimas diluciones a razón de 0.1 mL/placa con medio de cultivo, luego extienda con varilla de vidrio aplanada (la diluc. debe resultar entre 40 – 60 colonias /placa)

Estrategias para recuperar y purificar productos

• La recuperación y purificación de productos de una fermentación es esencial para un proceso comercial. La dificultad de los procesos de recuperación y purificación depende de la naturaleza del producto.

Los productos que resultan de los proceso biotecnológicos pueden ser muy variados. La variedad estará dada por:

a. La naturaleza química del mismo: sustancias simples (alcoholes, ácidos orgánicos); proteínas, sustancias con actividad terapéutica (antibióticos, hormonas) etc.

b. El volumen de producción y la concentración del producto en el caldo de fermentación: los llamados “commodities” (etanol, ácido cítrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./año y en altas concentraciones en la fermentación. Mientras que los agentes terapéuticos de última generación (hormonas, factores de coagulación, etc.) se producen sólo algunos kg/año y su concentración en la producción es baja. Esto determina la escala de producción.

c. Los requerimientos de pureza del producto final. Las moléculas a ser utilizadas en salud humana requerirán una pureza final muy diferente a las enzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar ó de un acidulante para alimentos.

Separación de productos insolubles.

• “DNA Pasajero” = “DNA Extraño o Foráneo” = “Inserto”.• Puede ser un único fragmento o una población mixta de

piezas diferentes de DNA.• Puede ser un sdDNA, un ssDNA, RNA.• Puede ser un DNA natural, extraido de una fuente

biológica cualquiera, o bien de una molécula sintética, obtenida artificialmente, tam,bién puede ser un cDNA sintetizado a partir de RNAm.

• Es el principal responsable del éxito del experimento.• Transporta distintos tipos de marcadores fenotípicos.• Es el elemento donde se pone en práctica toda la faceta

de diseño que supone un experimento de este tipo Los vectores son por ello construcciones complejas, moléculas quiméricas formadas a partir de la unión de regiones de muy diferentes procedencias, naturales o sintéticas, y colocados en un orden y un sentido específicaos.

EL DNA PASAJERO

Esquema de un experimentode Clonaje de DNA Recombinante

• Muchos casos Específico para un determinado tipo de célula; en otros el véctor es activo a distintos tipos celulares no muy diferentes (Rango de Hospedador Amplio) Así existe vectores para el clonaje en:

• Diferentes especies bacterianas.

• Diferentes especies de Levaduras.

• Gran número de plantas.

• En distintos tipos de células o en embriones animales.

• Vectores Mixtos En más de un tipo de célula ( por ej.: en bacterias y en células animales) = “Vectores Lanzadera”.

TIPOS DEL DNA VECTOR

CLASIFICACIÓN EN FUNCIÓN DE LA FUENTE PRINCIPAL(de la que deriva la señalque controla la replicación).

• Derivados de plásmidos, bacterianos o de levaduras.• Derivados de Bacteriófagos o de virus eucariotes.• Vectores de origen mixto (Fagómidos) Derivados de más

de un tipo de fuente (con más de un origen de replicación).• Vectores Integrativos DNA Recombinante se integra a

cromosoma de célula receptora.

CLASIFICACIÓN EN FUNCIÓN DE SU CAPACIDAD DE ACTUAR SOBRE EL PASAJERO QUE TRANSPORTA.

• Vectores de Clonaje: ƒ mantener establemente el recombinante.

• Vectores de Expresión Aporta señales necesarias para la transcripción y/o la traducción de la secuencia del inserto.

TIPOS DEL DNA VECTOR

• Contener un origen de replicación (región ori) Fundamental para definir el rango de hospedador de un vector. Ej.: Vectores con un origen de replicación activo en E. coli no replicacrán en células de levadura ni en células de animales; los vectores lanzadera presentan más un origen de replicación y, por ello, son activos en mas de un tipo de célula.

• El número de copias del recombinanteen la célula no sea muy alto, es muy conveniente que el vector disponga de regiones que faciliten un buen reparto entre células hijas.

• Presentar uno o, mejor, varios sitios de restricción (Polylinkers) Facilitar la ligación con el inserto.

• Contenga Marcadores Fenotípicos de Selección (que permita anular el crecimiento de células que no lo contiene. Ej.: Resistencia a antibióticos).

• Tamaño adecuado Rendimiento de sistema de transferencia de DNA es inversamente proporcional al tamaño de la molécula. El tamaño también favorece se disponga de un espacio mayor para el pasajero.

CONDICIONES DE UN VECTOR

Algunas Enzimas de Restricción

• Molécula que resulta de la unión del DNA Vector + DNA Pasajero, mediante la acción de DNA-Ligasa

EL DNA RECOMBINANTE

LA CÉLULA HOSPEDADORA

• Recibe el DNA recombinante Ej.: E. coli Organismo mejor conocido de la biosfera, motivo por el cual es el más empleado Sin embargo esta bacterias tiene sus limitaciones: Trabajos con insertos eucariotas pueden demandar en ocasiones sistemas celulares también eucariotas.

DNA LIGASA

DNA LIGASA

FERMENTACIÓN ACETICA

HistoriaLa producción de ácido acético ha sido conocida hace 10,000 años (tanto como la producción de vino). Los Romanos y los Griegos utilizaban vinagre diluido como bebida refrescante y producían vinagre dejando el contendor de vino abierto. Se producían en vasijas planas abiertas, hasta que en el s XIX, se modernizaron los procesos, se creo el proceso GENERADOR DE GOTEO (utilizado hasta ahora). Los procesos sumergidos se desarrollaron desde 1949, ambos procesos se utilizan en todo el mundo.

La producción de vinagre (10% de acético), en 1980, ascendió a 356 x 106 L en la CEE, 469 x 106 L en EU y 1600 x 106 L en todo el mundo (excluyendo a China y URSS).

Las bacterias del ác. Acético se usan para procesos comerciales: Los Gluconobacter y los Acetobacter. El primer grupo oxida el etanol hasta ác. Acético y el segundo grupo (los super oxidantes) capaces de oxidar etanol, primero hasta ác. Acético y luego hasta CO2 y agua.

Biosíntesis

Es una oxidación incompleta, se produce 1 mol de ác. Acético por mol de etanol. A partir de 1 L de etanol (12%), se produce 1 L de ác. Acético (12,4%). SE requiere suficiente oxígeno. A una concentración de 5% de ác. Acético y etanol, mueren el 34% de las bacterias, después de una interrupción de aireación de 2 minutos.

Fermentador por goteo. Biorreactor de madera de 60 m3, esta lleno de virutas de haya. El material se rocía en la superficie y gotea a través de las virutas que contienen bacterias hasta el fondo del recipiente. Del alcohol que se añade, el 88 – 90% se convierte en ác. Acético. Tº en la superficie es de 29ºC y en la parte inferior es de 35ºC. El tiempo neceario para producer vinagre (12%) es de unos tres días.

Fermentador sumergido.

Construidos de acero inoxidable y están agitados desde el fondo. El aparato de aireación consiste en un rotor de succión que introduce el aire desde la parte superior del fermentador a través de una tubería. Normalmente deben ser instalados intercambiadores de calor para el control de la Tº y eliminadores de espuma. El vinagre casero (13%) se produce en forma discontinua, con aireación y agitación constante, 7 – 10 g de ácido acético/100 mL y 5% de etanol, cuando la concentración de eanol cae a 0,05 – 3% (35 h), se saca el 50% de la solución y se reemplaza con una nueva mezcla que contiene 0 – 2 g de ác. Acético/100 mL y 10 – 15% de etanol.

Se han descrito procesos continuos con rendimientos del 98% a 40ºC.

Con el proceso sumergido la velocidad de producción por m3 es 10 veces mas alta que la fermentación en superficie y aproximadamente 5% mas alta que el fermentador por goteo.

MICROORGANISMOS EFICACES “EM”

EM

Dr. Teruo Higa, Profesor de Horticultura, la Universidad del Ryukyus, Okinawa, Japón ha dirigido el trabajo pionero, adelantando el concepto de "Microorganismos Eficaces" (EM). Él ha desarrollado inóculos microbianos que se han demostrado mejorar la calidad de los suelos, crecimiento rendimiento de las cosechas y ha ganado la atención mundial.

Nosotros vemos la tecnología de EM como una potencialmente valiosa herramienta que puede ayudar al granjero a desarrollar sistemas de cultivo que son económicamente, medioambientalmente, y socialmente sustentables.

Dr. James F. Parr

Effective Microorgsanims (EM)

Rhodopseudomonas sp, Lactobacillus sp, S. cerevisiae, Azotobacter chroococcum Pseudomonas fluorescenses, P. cepacia, P. Putida, Providencia stuartii, Actinomuyces, Mohos, Levaduras,

los EM, como inoculos microbiano, para cambiar el equilibrio microbiológico del suelo de manera que puedan mejorar la calidad del suelo, reforzar la producción y protección de las cosechas y protecciones, conservar los recursos naturales, y finalmente también crear una agricultura más sustentable y ambiental

EM contiene especies seleccionadas de microorganismos que incluyen poblaciones predominantes de bacterias ácidas lácticas y levaduras y números más pequeños de las bacterias fotosisnteticas, actinomicetos y otros tipos de organismos. Todos éstos son entre si mutuamente compatibles y pueden coexistir en el cultivo líquido

Éstos incluyen hongos del genero Penicillium, Trichoderma, y Aspergillus, y actinomycetes del género Streptomyces. Los antibióticos que ellos producen pueden tener efectos biostaticos y biocidas en patógenos de la planta que están en el suelo, incluso Fusarium

Tales microorganismos incluyen bacterias fotosintéticas que realizan la fotosíntesis anaerobicamente incompleta, cierto Phycomycetes (hongos que se parecen las algas), y algas verdes y algas azul verdes que funcionan aerobicamente

Las funciones de los Microorganismos Beneficiosos

La fijación de nitrógeno atmosférico.

La descomposición de desechos y residuos orgánicos.

La supresión de patógenos contenidos en el suelo.

Reciclando e incrementado la disponibilidad de nutrientes para la planta.

La degradación de tóxicos incluso los pesticidas.

La producción de antibióticos y otros compuestos bioactivos.

La producción de moléculas orgánicas simples para la captación de la planta.

Complexación de metales pesados para limitar la captación de la planta.

Solubilización de fuentes nutrientes insolubles.

La producción de polisacáridos para mejorar la agregación de la tierra.

Las funciones de los Microorganismos Dañinos

La inducción de enfermedades de la planta

El estímulo de patógenos contenidos en el suelo

La inmovilización de nutrientes de la planta

La inhibición de germinación de la semilla

La inhibición de crecimiento de la planta y desarrollo

La producción de substancias fitotoxicas

Enzimas inmovilizadas

Reciclabes.

Robustas.

Bajos costos de operación.

Fácil recuperación.

Bajos costos down.

Bajos costos up.

Bajos costos Main.

Nuevas propiedades.

Hubo microporos de 10 micrometros con agregados de microcolonias unidas a la biomasa filamentosa y macroporos de 20 a 200 micrometros en la matriz de la biomasa.

El área microporosa fue del 30% en la base y del 90 % en la superficie

Una biopelícula de 640 micrometros de EM

Okabe, Kuroda y Watanabe 1998

Biodegradación de tetracloruro de carbono en u n biorreactor de biopelícula fija y su estudio cinético

Jin & Englande 1998

Biorreactor de flujo continuo de biopelícula fija con potencial redox controlado incialmente

La columna fue sembrada con un cultivo mixto de microroganismos indigenas de Pseudomonas cepacia y y providencia stuartii.

El biorreactor mostro un 98 y 99.9% de degradación del TCC de una concentración incial de 200 ug/L con una retención de 1 a 4 días respectivamente. Los modelos bifásicos y de Eckenfelder proveyeron excelentes correlaciones y fueron fáciles de aplicar.