BIOTECNOLOXÍA

Bioloxía 2º Bacharelato

Tema 17

Temario CIUGA Tema 17

A xenómica e a proteómica. Proxecto Xenoma Humano. Enxeñaría xenética e aplicacións. Organismos modificados xenéticamente. Repercusions sociais e valoración ética da manipulación xenética

Criterios de avaliación:Coñecer algunhas das ferramentas da enxeñaría xenética e as súas aplicacións.

Observacións:Como unha introdución á enxenería xenética, ademais da PCR, explicar un experimento sinxelo de clonación no que interveñan o ADN que ten que ser clonado, as encimas de restrición, un plásmido e bacterias. Organismos transxénicos: comentar brevemente que son, como se obteñen e cales son as súas principais vantaxes e desvantaxes.Indicar que a produción de moléculas recombinantes por enxeñería xenética resulta moi útil para a nosa especie (produción de hormonas como por exemplo a insulina ou a hormona do crecemento, ou a produción dalgunhas vacinas como ás da hepatite A e B).Explicar o concepto de xenómica e proteómica. Informar sobre os traballos desenrolados no Proxecto Xenoma Humano e as suas aplicacións, tanto na prevención das enfermidades como na terapia xénica.Non será materia do exame o apartado “Repercusions sociais e valoración ética da manipulación xenética”.

Xenómica é o estudo da estrutura e funcionamento do xenoma. Mentres que a xenética clásica busca relacionar os xenes cos fenotipos, a xenómica ten por obxectivo averiguar a función dos xenes segundo a súa secuencia de bases, da súa posición no xenoma e as interaccións con outros xenes. Caracterízase polo enfoque multidisciplinar que involucra a varias disciplinas e ciencias: bioloxía, bioquímica, xenética, viroloxía, agronomía, enxeñería, química, medicina ou veterinaria.

Proteómica é o estudo da estrutura e función das proteínas. Este termo foi proposto por Marc Wilkins en 1994. O proteoma é a dotación completa de proteínas producidas por un ser vivo. O proteoma varía co tempo polo que a análise do proteoma dun individuo permite caracterizar o seu estado fisiolóxico. Isto é especialmente importante en certas patoloxías porque a presenza de certas proteínas (biomarcadores) permiten facer un diagnóstico ou prognosticar a súa evolución.

Biotecnoloxía é un conxunto de técnicas que teñen como obxectivo alterar o xenoma dun ser vivo. O obxectivo principal da biotecnoloxía é lograr que determinadas células realicen tarefas específicas e útiles de xeito predicible e controlable para obter produtos (alimenticios, farmacéuticos, bioquímicos...) ou servizos (terapias, procesos industriais...) útiles e rendibles. Algunhas técnicas ancestrais non se consideran biotecnoloxía aínda que poderían entrar nesta definición, como a selección artificial de especies para a agricultura e a gandería as fermentacións para e elaboración de pan, viño e outros produtos alimenticios, o control biolóxico de pragas e a compostaxe. En sentido estricto considéranse biotecnoloxía exclusivamente as novas técnicas derivadas da investigación molecular e celular que apareceron na década dos 70.

A biotecnoloxía Tema 17

Algunhas técnicas importantes da biotecnoloxía son:

- Cultivos celulares.

- Anticorpos monoclonais.

- Enxeñería das proteínas: Modificación da súa estrutura para mellorar o seu funcionamento ou para a produción de proteínas totalmente novas.

- Bioinformática: Técnica baseada na utilización de proteínas nos aparellos electrónicos, particularmente sensores biolóxicos e “biochips” (microchips biolóxicos capaces de lóxica e memoria).

- Enxeñería xenética: Conxunto de técnicas para manipular o ADN, principalmente mediante a transferencia de xenes duns organismos a outros, incluso entre seres de especies distintas. Os procedementos máis importantes da enxeñería xenética son:

- Técnica do ADN recombinante. - Reacción en cadea da polimerasa ou PCR.

Tema 17A biotecnoloxía

Un cultivo celular é un conxunto de técnicas que permiten o mantemento in vitro de células e tecidos destinadas a diferentes fins, de tal xeito que manteñan intactas as súas propiedades fisiolóxicas, bioquímicas e xenéticas.

Aplicacións: • Micropropagación in vitro de plantas.• Mellora xenética.• Preservación e intercambio de xermoplasma.• Biosíntese de metabolitos secundarios de interese económico.• Investigación sobre o cancro (células HeLa).• Produción de vacinas.• Mantemento e produción de tecidos para transplantes.• Diagnóstico prenatal.

Cultivos celulares Tema 17

1. Disgregación dun tecido 2. Suspensión de

células individuais3. Cultivo primario: proliferación celular 4. Cultivo secundario:

utilización para estudos

Son anticorpos absolutamente idénticos, producidos por un único clon de linfocitos B, polo tanto teñen todos a mesma especificidade de actuación.

Os primeiros anticorpos monoclonais foron producidos en 1975 por Georges Köhler, Cesar Milstein e Niels K. Jerne, mediante a técnica dos hibridomas.

A técnica do hibridoma consiste en fusionar in vitro linfocitos B dun rato sensibilizado contra un antíxeno con células tumorais dun tumor linfocitario. O resultado son células que posúen a capacidade de producir anticorpos específicos e que teñen a capacidade de reproducirse indefinidamente. A clonación destas células ou hibridomas conduce á formación dunha gran cantidade de células clónicas produtoras de anticorpos.

Aplicacións: • Diagnóstico por identificación de moléculas marcadoras (hormonas, marcadores de

tumores, marcadores de infeccións) nos fluídos corporais. • Detección e identificación de drogas e substancias tóxicas nos fluídos corporais.• Determinación dos grupos sanguíneos.• Transporte de fármacos ata as células diana (células danadas ou cancerosas).• Investigación básica.• Como axentes terapéuticos (antiinflamatorios en procesos autoinmunes, inhibidores da

agregación plaquetaria, inhibidores da proliferación de células tumorais.

Anticorpos monoclonais Tema 17

Anticorpos monoclonais Tema 17

Rato inmunizado contra o antíxeno X

Cultivo de linfocitos tumorais

Linfocitos B

Hibridoma

Selección e cultivo de linfocitos B produtores de anticorpos contra o

antíxeno X

Cultivo de hibridomas

YY

YY

YY

YY

YY

YY

YYYY YY

YY

Illamento de anticorpos monoclonais contra o

antíxeno X

A técnica principal da enxeñería xenética é a elaboración de ADN recombinante. O ADN recombinante é unha molécula de ADN artificial, construída a partir de secuencias de ADN procedentes de organismos diferentes, incluso de distintas especies.

Coa introdución dun ADN recombinante nun ser vivo, introdúcense novos xenes, altérase a súa configuración xenética e, como consecuencia, modifícanse algunhas características fenotípicas ou exprésanse outras novas. As proteínas sintetizadas a partir dos xenes introducidos denomínanse proteínas recombinantes.

As principais ferramentas moleculares utilizadas na elaboración de ADN recombinante son:

• Enzimas de restrición. Son enzimas que cortan o ADN especificamente en certas secuencias de nucleótidos (palindrómicas) que son quen de recoñecer. As bacterias utilizan estos enzimas (endonucleasas) para loitar contra os virus, realizando cortes en toda molécula allea de ADN que encontren. Con frecuencia o corte non se realiza á mesma altura das dúas cadeas de ADN de modo que queda un fragmento monocatenario terminal. Así se forman extremos de dous tipos: romos e cohesivos.

• Vectores. É un fragmento de ADN que permite a transferencia de xenes dun organismo a outro. Os vectores máis frecuentes en enxeñería xenética son os plásmidos bacterianos, os plásmidos do virus fago λ, e os virus bacteriófagos.

• ADN ligasa. É un enzima que une fragmentos de ADN.

ADN recombinante Tema 17

ADN recombinante Tema 17

1. Selección e illamento dos xenes

que se queren transferir

2. Introdución destes xenes nun

vector

3. Introducción do vector na

célula de destino

O corte faise con enzimas de

restricción

A unión faise con enzimas ligasas

ADN recombinante

Plásmido bacteriano

4. Multiplicación de células

portadores de ADN

recombinante

Célula bacteriana

Células produtoras da proteína codificada no

ADN recombinante

Etapas dun proceso de clonación dun xene: 1. Illamento e obtención dun xene, que se corta mediante

endonucleasas de restrición2. Selección do vector de clonación: plásmidos, cromosomas artificiais

ou xenomas de algúns virus (fago λ, fago M13).3. Formación do ADN recombinante mediante un enzima ADN ligasa.4. Inclusión do ADN recombinante nunha célula hospedadora

mediante transformación natural ou mediante transdución 5. Comprobación da expresión do xene clonado mediante marcadores

ou mediante sondas radioactivas.6. Selección de células hospedadoras que levan o xene clonado.

ADN recombinante Tema 17

Principais proteínas recombinantes comercializadas pola industria farmacéutica Usos

Insulina humana Tratamento da diabetesHormona do crecemento humana Tratamento do ananismo hipofisario

Interferón humano Tratamento da esclerose múltipleADN polimerase I Tratamento da fibrose quística

Vacinas baseadas en proteínas recombinantes Vacina da hepatite B

Quimosina Elaboración de queixos duros

Hormona de crecemento bovina Estimulación do crecemento e da produción leiteira nas vacas

Lipolasa® Elaboración de deterxentes

Corte con enzimas de restricción deixando os

extremos cohesivos

Xene que se vai transferir

Plásmido

Unión con ADN ligasa e inserción do xene no

plásmido

ADN recombinante Tema 17

...G C A C T T A A G A C T T A G C... G T T C G A A C C G T C

...C G T G A A T T C A A G C T T G G C A G C T G A A T C G...

...C G T G C T G A A T C G... A A T T C A A G C T T G G C A G

...G C A C T T A A G T T C G A A C C G T C G A C T T A G C...

Secuencias de recoñecemento (palindrómicas)

Sitio de rotura pola acción dunha endonucleasa de restrición

Sitio de rotura pola acción dunha endonucleasa de restrición

Extremos cohesivos

Extremos romos

... A G C T G ...T C G A C T T A A

C T G T A G C A.. G A C A T C G T...

G T T C G A A C C G T CA A T T C A A G C T T G G C A G

... A G C T G ...T C G A C T T A A

C T G T A G C A.. G A C A T C G T... G T T C G A A C C G T C

A A T T C A A G C T T G G C A G

Unión do fragmento de ADN pola acción de ligasas

ADN recombinante

PCR (polymerase chain reaction)

Técnica desenvolvida por Kary Mullis en 1985 para producir moitas copias dun fragmento de ADN, incluso si se dispón dunha cantidade mínima de mostra. A PCR ten unha gran sensibilidade e unha enorme capacidade de amplificación. É un procedemento totalmente automatizado que repite procesos de síntese de ADN de forma exponencial: vinte ciclos de síntese poden dar máis dun millón de copias.

Ademáis da investigación biolóxica, a técnica da PCR ten moitas aplicacións en arqueoloxía, paleontoloxía, criminalística, probas xudiciais e forenses, etc.

Proceso:

1. Desnaturalización do ADN mostra mediante a aplicación de alta temperatura para separar as dúas cadeas da dobre hélice. Cada cadea servirá de molde para sintetizar a súa complementaria.

2. Unión dun cebador (oligonucleótido).3. Síntese de novo ADN. Esta reacción é catalizada por un encima ADN-

polimerasa procedente de bacterias termófilas, que é funcional a temperatura elevada (ata 95ºC).

4. Unha vez amplificado o número de copias mediante esta técnica, o fragmento de ADN pódese unir a calquera vector, e introducilo nunha célula hospedadora para que se exprese.

Tema 14

PCR (polymerase chain reaction)

3´5´

5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´

5´

3´5´

3´

3´

5´

5´

3´

5´

3´5´

3´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´

3´

3´

5´

5´ 3´ 5´

3´

5´

5´

3´

3´ 5´

3´

5´

5´

2º Ciclo

3º Ciclo

Desnaturalización térmica

Unión do cebador

Síntese de ADN

1ª replicación

Xene de interese

1º Ciclo

Tema 14

Ciclos - copias1 - 22 - 43 - 84 - 165 - 326 - 647 - 1288 - 2569 - 512

10 - 102411 - 204812 - 409613 - 819214 - 1638415 - 3276816 - 6553617 - 13107218 - 26214419 - 52428820 - 1048576

A clonación é o proceso de xeración de células idénticas co mesmo material xenético. Ten lugar de forma natural na formación de células somáticas nos tecidos dos organismos pluricelulares mediante mitose. O proceso de clonación artificial é unha das aplicacións biotecnolóxicas máis útiles. Existen varios tipos de clonación:

- Clonación acelular: xenes ou moléculas de ADR ou ARN. Utilízase para aumentar o número de certas moléculas no curso dunha investigación.

- Clonación de células illadas, ou formando tecidos. Pode utilizarse en terapias xénicas.- Clonación de organismos completos. Pode utilizarse para a mellora xenética de especies comerciais.

Tema 17Aplicacións da biotecnoloxía: clonación

Da ovella 1 extráese unha

célula somática

Da ovella 2 extráese un

óvulo

Fusión do núcleo da célula somática co óvulo enucleado

A ovella que nace do desenvolvemento

deste óvulo é un clon da ovella 1

Hibridación dos ácidos nucleicos: Mediante fragmentos coñecidos de ADN ou ARN (Sondas) podemos localizar as secuencias complementarias nun ADN ou ARN calquera, xa que se aparearán cas súas correspondentes secuencias complementarias.

Librerías de ADN ou xenotecas: conxunto de xenes, obtidos por fragmentación do ADN cromosómico dun organismo, illados e identificados, que son introducidos individualmente en bacterias, para que poidan estar dispoñibles para os investigadores dun xeito rápido.

Aplicacións en investigación: Mutaxénese: cambios artificiais na secuencia dun xene.Sobreexpresión de proteínas.Transcrición “in vitro”.Elaboración de secuencias de ADN.

Aplicacións biotecnolóxicas:Estudos evolutivos.Estudos históricos e arqueolóxicos.Estudos forenses (identificación mediante ADN).Obtención de proteínas de mamíferos.Obtención de vacinas.Terapia xénica.Diagnose clínica.Obtención de organismos transxénicos (agricultura e gandería).Obtención de organismos clónicos.

Tema 17Outras aplicacións da biotecnoloxía

Proxecto de secuenciación completa do xenoma humano. Comezou en 1990 e completouse en 2003. Foi realizado por varios gupos de traballo de varios países integrados no Consorcio Público Internacional Proxecto Xenoma Humano e coordinados por Francis Collins. A empresa Celera Genomics realizou un traballo paralelo e non exento de polémica.

Os 17 donantes do ADN, homes e mulleres de distintas partes do mundo, permanecen no máis estricto anonimato.

Principais conclusións do proxecto:- O xenoma humano consta duns 20500 xenes.- O 99,99% do xenoma é común a todas as persoas, as diferencias

entre indivíduos son mínimas. Pero existe un número enorme de variacións nuns poucos xenes denominados polimorfismos nucleótidos, entre 1,4 e 2,1 millóns de variacións en cada un.

- Só unha pequena fracción do ADN forma os xenes, que están constituídos por exons e intrón e, deles, só os exóns codifican proteínas. O resto é ADN lixo e está formado por secuencias repetitivas e non repetitivas.

- Descoñécese a función do 98% do ADN.- Estímase que no ser humano existen entre 500.000 e 1 millón de

proteínas diferentes o que significa que un xene pode intervir na codificación de varias proteínas.

Proxecto xenoma humano Tema 17

55%21%

22%2%

ExónsIntrónsSecuencias non repetitivasSecuencias repetitivas

Repercusions sociais da manipulación xenética

Os avances científicos son extraordinarios. As aplicacións son inmensas en medicina, agricultura, gandería, ciencia forense, etc

Valoración ética da manipulación xenética

Desde o principio a ten producido unha fonda controversia social debido a:- Carencias na lexislación.- Riscos de seguridade (contaminación por transxénicos, bioterrorismo).- Incertidume por descoñecemento das verdadeiras posibilidades.- Reparos éticos a certas prácticas.- Problemas económicos (patentes de organismos vivos).

Declaración Universal sobre o Xenoma Humano e os Dereitos Humanos (UNESCO 1998)

- Promove as prácticas desexables.- Limita ou prohibe as prácticas máis polémicas.

Impacto da tecnoloxía do ADN Tema 17