Búsqueda de sustancias Búsqueda de sustancias biológicamente activas: biológicamente activas:

Consideraciones acerca de Consideraciones acerca de estrategias de estrategias de

“screening” y evaluación.“screening” y evaluación.

Dr. Armando Rojas RubioEscuela de Medicina, Universidad Católica del Maule

Principales modos de acción Principales modos de acción entre xenobióticos y sistemas entre xenobióticos y sistemas

biológicos.biológicos.

Bases de un programa de Bases de un programa de búsqueda de sustancias búsqueda de sustancias

biológicamente activasbiológicamente activas..

Química

BioquímicaBiología MolecularBiología Celular

Farmacología

FisiologíaFisiopatología

Farmacología reversa

Optimizarestructura

Evaluar eficacia

seguridad

Screenin

g

Fuente de diversidadquímica

Moléculas dianas

GenómicaProteómica

Bioinformática

FisiologíaFisiopatología

Quimiotecas (*)Química

combinatoria

ScreeningConvencionalAlto flujo, etc

SAR ADMEFarmacología Toxicología preclínica

Fármaco

(*) NIH 10-01-07, Anuncio la creación de la Librería de Pequeñas Moléculas para ser utilizadas en la Red de Librerías Moleculares para Centros de Screening.

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

Proceso de descubrimientoProceso de descubrimiento

Serendipidad Etnomedicina Screening convencional o de alto flujo

No es necesario conocer la estructura del blanco. Diseño racional de fármacos

Si es necesario conocer la estructura del blanco

Etapas en la estrategia de Etapas en la estrategia de búsquedabúsqueda

Descubrimiento: Ideas Candidatos

Desarrollo: Candidatos Fármacos

Sistema de screening o tamizaje de actividades biológicas Sistema que permite la identificación de compuestos que presenten actividad sobre un blanco o función especifica,

potenciando que se conviertan en candidatos a una evaluación que permita el desarrollo hacia aplicaciones

clínicas.

Niveles del ScreeningNiveles del Screening

Nivel MolecularNivel Molecular Unión a receptores, actividad Unión a receptores, actividad

enzimática, etc,.enzimática, etc,. Nivel Celular/TisularNivel Celular/Tisular

Función celular / tisular.Función celular / tisular. Nivel Órganos/SistemasNivel Órganos/Sistemas

Visión integradoraVisión integradora

In vitro

In vivo

La búsqueda de La búsqueda de candidatoscandidatos

Identificación y validación del blanco

Tamizaje (primario y secundario)

Identificación de un líder potencial

Partida con estudios SARs

Generación de presuntos candidatos

Definición del farmacoforo

Optimización del candidato

Síntesis Química

Química Medicinal

La búsqueda de candidatosLa búsqueda de candidatos

Aspectos esenciales que tienen que ser considerados en cualquier estrategia de

screening Necesidad en MedicinaNecesidad en Medicina

Evento de amenaza a la vidaEvento de amenaza a la vida Evento autolimitadoEvento autolimitado

Disponibilidad de opción terapéuticaDisponibilidad de opción terapéutica Nivel de satisfacciónNivel de satisfacción

Ventajas sobre competidoresVentajas sobre competidores Mejor selectividad/potenciaMejor selectividad/potencia Enfoque novedosoEnfoque novedoso

Oportunidad comercialOportunidad comercial Mercado potencial (número de pacientes)Mercado potencial (número de pacientes) Duración del tratamientoDuración del tratamiento Aplicación en condición aguda o crónicaAplicación en condición aguda o crónica

Sistemas de tamizajeSistemas de tamizaje Screening primarioScreening primario: :

Diseño simple Diseño simple Blanco terapéutico definido (*)Blanco terapéutico definido (*) Alta sensibilidad y especificidad Alta sensibilidad y especificidad Usualmente una dosis.Usualmente una dosis. Recomendable ensayos en formato homogéneo y miniaturización.Recomendable ensayos en formato homogéneo y miniaturización.

Screening secundarioScreening secundario Confirmar la especificad sobre el blanco a un mayor nivel de Confirmar la especificad sobre el blanco a un mayor nivel de

complejidad (Mayor costo) complejidad (Mayor costo) Usualmente ensayos heterogéneosUsualmente ensayos heterogéneos Permitir evaluación de efecto umbral y relación dosis respuesta (mínimo Permitir evaluación de efecto umbral y relación dosis respuesta (mínimo

3 dosis).3 dosis).

Blancos en el tamizaje primarioBlancos en el tamizaje primario

All drugs that are presently on the All drugs that are presently on the market are estimated to target less market are estimated to target less than 500 biomolecules, ranging from than 500 biomolecules, ranging from nucleic acids to enzymes, G-protein-nucleic acids to enzymes, G-protein-coupled receptors (GPCRs) and ion coupled receptors (GPCRs) and ion channelschannels11 ( (

Metodologías mas usadas Metodologías mas usadas en el screening primarioen el screening primario

Ensayos basados en salidas de tipo:Ensayos basados en salidas de tipo: Radioactividad Colorimetría Turbidimetría Fluorescencia Quimioluminiscencia Bioluminiscenceia

Los sistemas de tamizaje Los sistemas de tamizaje primario/secundarioprimario/secundario

Bioquímico Celular

Caracterización sist. enzimático

Caracterización del blanco

Titulación (Km; Kd; etc) Respuesta activación/inhibición

Concentraciones Densidad celular

Potencia (IC50/EC50)

Logística del sistema de screeningLogística del sistema de screening

Bioquímico Celular

Protocolo detallado

Disponibilidad

(lotes múltiples ?)

Banco de células

Efecto de pases Estabilidad en el tiempo

Estabilidad de la señal

Seguridad

COSTOS

Variabilidad y reproducibilidad en la Variabilidad y reproducibilidad en la ventana de señal del ensayoventana de señal del ensayo

Bioquímico Bioquímico CelularCelular

Tolerancia solvente (DMSO *)Tolerancia solvente (DMSO *)

Ventana de respuesta del ensayo (máxima, media, Ventana de respuesta del ensayo (máxima, media, mínima)mínima)

Curvas de IC50/EC50 de tres días consecutivos de Curvas de IC50/EC50 de tres días consecutivos de inhibidores/activadoresinhibidores/activadores

La mayoría de las líneas celulares no son afectadas por < 0.1% DMSO La mayoría de los ensayos enzimáticos in vitro son tolerantes a 1–5% DMSO

Niveles de dosis a evaluar en Niveles de dosis a evaluar en screening primario y secundarioscreening primario y secundario

Garantizar la identificación de compuestos de baja potencia.

Evaluar varios compuestos simultáneamente en cantidades equimolares

Dianas superficie celular

Dianas intracelulares

British Journal of Pharmacology (2007) 152, 53–61

Optimización de un líder. Estudios tipo Optimización de un líder. Estudios tipo SARs y Q SARsSARs y Q SARs

Las actividades biológicas de un compuesto estan definidas por la estructura y propiedades químicas del compuesto

Los estudios SARs QSARs se utilizan para evaluar como diferentes modificaciones o descriptores moleculares (hidrofobicidad, topología y conectividad molecular, distribución de cargas, polaridad , puentes de H, etc) condicionan una actividad biológica determinada.

Definir la estructura del farmacoforo y predecir actividad biológica.

El riesgo que hay que minimizarEl riesgo que hay que minimizar

Un elevado porcentaje de las moléculas que inician Un elevado porcentaje de las moléculas que inician como candidatos fracasan al llegar a la fase clínica como candidatos fracasan al llegar a la fase clínica debido, entre otras cosas, a problemas debido, entre otras cosas, a problemas farmacocinéticos. farmacocinéticos.

Necesidad de poder predecir el comportamiento farmacocinético en humanos en etapas cada vez más tempranas.

Predicción de ADMET. El uso de Predicción de ADMET. El uso de recursos informáticosrecursos informáticos

Absorción

Distribución

Metabolismo

Eliminación

Toxicidad

Disponibilidad de herramientas informáticas (Noraymet, ADMETOX, etc) que ayudan a realizar estas predicciones sobre la base de entradas de ensayos in vitro e in vivo.

•Solubilidad•Permeabilidad•Unión a proteínas plasmáticasUnión a proteínas plasmáticas•Movimiento a través de transportadoresMovimiento a través de transportadores•Metabolismo por enzimas hepáticas (P450)Metabolismo por enzimas hepáticas (P450)•Distribución tisularDistribución tisular•CitotoxicidadCitotoxicidad

Principales razones para la falla de Principales razones para la falla de un candidato.un candidato.

Ineficacia.

Toxicidad.

Fallas en la biodisponibilidad.

Candidato selectivo, potente y optimizado Candidato selectivo, potente y optimizado y ADMET apropiada.y ADMET apropiada.

Estudios preclínicosEstudios preclínicos

Estudios preclínicos: Por que Estudios preclínicos: Por que son necesarios?son necesarios?

Demostrar su efectividad farmacológica en modelos animales

Demostrar que el candidato puede ser evaluado de forma segura en humanos.

Parte indispensable de los requerimientos de las agencias regulatorias.

Evaluación de actividad farmacológica Evaluación de actividad farmacológica en animales: en animales: La utilidad de los modelos La utilidad de los modelos

animales de enfermedadanimales de enfermedad..

A este nivel entran solamente candidatos con reconocida actividad en screening primario y secundario y favorable evaluación de ADME.

MUY ALTO COSTO

Modelos animales de enfermedad.

Modelos farmacológicos clásicos vs

modelos de animales transgénicos, knock out, knock down.

Estudios preclínicos de Estudios preclínicos de Toxicología.Toxicología.

• Necesarios para seguridad de dosis.Necesarios para seguridad de dosis.

• Realizados conforme a protocolos estándares, Realizados conforme a protocolos estándares, aprobados por las agencias reguladoras.aprobados por las agencias reguladoras.

• Realizados de acuerdo a las GLP correspondientesRealizados de acuerdo a las GLP correspondientes..

Genotoxicidad• Objetivo

• Determinar el potencial mutagénico y su posible riesgo a humanos

• Ensayos in vitro:• Mutaciones puntuales. (actividad mutagénica)

• Ensayo de Ames • Linfoma ratón (TK gen)

• Ensayos in vivo:• Aberraciones cromosómicas in vivo (actividad clastogénica)

• Análisis citogenético de medula ósea ratón.• Ensayo de micronúcleos.

Toxicidad aguda ( Dosis única)• Objetivo:

• Determinar la LD50, • Máxima Dosis Tolerada (MTD) • Nivel de NO Observación de Efectos (NOEL)

• Requerimientos de especies:• Rata, ratón.

• Parámetros: • Mortalidad, Necropsias, cambio de peso,

observaciones clínicas.

Toxicidad Sub aguda.• Objetivo:

• Determinar toxicidad después de dosis repetidas.

• Especies mas usadas:

• Rata y ratón.

• Parámetros: • Mortalidad, Hallazgos clínicos, química orina,

histología, cambio de peso.

Toxicidad Subcrónica/crónica.• Objetivo:

• Toxicidad en esquema de cronicidad.• Especies mas usadas:

• Rata y ratón.• Parámetros:

• Mortalidad, patología, histología, cambios conductuales, observaciones clínicas, cambio de peso.

Carcinogenicidad.• Objetivo:

• Evaluar el potencial tumorigénico en animales y el riesgo a humanos.

• Especies mas usadas

• Rata o ratón.

• Parámetros: • Desarrollo de tumor, lesiones pre-neoplásicas,

anatomía patológica.

En promedio, 1 de 10 000 compuestos tiene éxito En promedio, 1 de 10 000 compuestos tiene éxito en un sistema de búsqueda y posterior evaluación. en un sistema de búsqueda y posterior evaluación. Puede tomar entre 6 y 8 años.Puede tomar entre 6 y 8 años. Altísimo costo: Centenares de millones USD.Altísimo costo: Centenares de millones USD.

Descubrimiento y desarrollo de fármacos. Un largo y tortuoso camino

¿Como afrontar el reto?

Papel de las Universidades en un Papel de las Universidades en un programa de screeningprograma de screening

Aprovechar todas las potencialidades de cooperación y sinergia transversal propias de la vida universitaria

Lograr la identificación de un candidato potente y específico. Realizar la correspondiente acciones en protección de la propiedad intelectual. Estrategia de alianza para la etapa de desarrollo con la industria

.

Alan S.Verkman J. Physiol Cell Physiol 286: c465-c474, 2004

Muchas gracias