7/25/2019 Canal de Potasio

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"El canal de potasio KcsA: modelo para el estudio de la oligomerizacin y elplegamiento de protenas de membrana".

M Lourdes Renart, Francisco N. Barrera, M Luisa Molina, Jos A. Encinar, AsiaFernndez, Jos A. Poveda, Jos M. Gonzlez-Ros.

Instituto de Biologa Molecular y Celular, Universidad Miguel Hernndez. Elche(Alicante).

El canal de potasio KcsA de Steptomyces lividanses considerado un sistema modelo

para el estudio de canales inicos, ya que puede ser expresado y purificado con relativa

facilidad y su estructura atmica ha sido resuelta mediante difraccin de rayos X. KcsA esun homotetrmero, con subunidades de 160 aminocidos formadas por dos hlices

transmembrana y dominios citoplasmticos en los extremos amino y carboxilo terminal. Su

estructura secundaria es preponderantemente alfa helicoidal y es resistente a condicionesdesnaturalizantes tales como urea 8M, cloruro de guanidinio 6M o SDS 2%.

Trabajando con KcsA en su forma solubilizada ( en -D-dodecilmaltsido, DDM)

hemos observado que los tetrmeros de KcsA son capaces de autoasociarse, en un procesodependiente de concentracin. Adems, cuando la protena es reconstituida en asolectina o

solubilizada en micelas mixtas de DDM y DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-fosfoetanolamina)y DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3[fosfo-rac-(1-glicerol)], se da un incremento en el estado

de oligomerizacin, formndose clusters de tamao heterogneo. La formacin de este

tipo de estructuras explicara la diversidad funcional de este canal observado mediantetcnica de pinzamiento de membrana (patch-clamp).

Analizando la estabilidad proteica del canal solubilizado en DDM frente

concentraciones crecientes de 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), observamos que manifiesta tres

transiciones sucesivas. La primera transicin ocurre a porcentajes bajos de TFE, menores a15%, es poco cooperativa y constituye la prdida de las estructuras de peso molecular

superior al tetrmero. La segunda de las transiciones es cooperativa y dependiente de la

concentracin de protena, ocurre a concentraciones medias de TFE (alrededor de 25% v/v),en donde KcsA incrementa la exposicin de sus triptfanos al disolvente y pierde

parcialmente su estructura secundaria caracterstica. Conjuntamente con estos cambios en

la estructura secundaria y terciaria, ocurre la disociacin del tetrmero en sus monmerosconstituyentes. Bajo estas condiciones de TFE podemos lograr un alto porcentaje de

replegamiento de la protena por simple dilucin con tampn y detergente. El canal as

replegado mantiene su funcin caracterstica cuando posteriormente a la dilucin es

reconstituido y sometido a medidas funcionales por patch-clamp. Por otro lado, latransicin entre tetrmero plegado y monmero desplegado fue completamente reversible

(100% rendimiento) cuando se utiliz KcsA en micelas mixtas de DDM y DOPE (1,2-

dioleoil-sn-glicero-fosfoetanolamina) y DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3[fosfo-rac-(1-glicerol)]) en una relacin molar 7:3. No fue posible obtener la forma nativa de KcsA

partiendo de concentraciones elevadas de TFE, correspondientes a la segunda transicin,

donde la protena se desnaturaliza de manera irreversible.De esta manera comprobamos que puede replegarse de manera eficiente una

protena de membrana preponderantemente helicoidal como es KcsA y que ciertos factores

como la presencia de lpidos en la mezcla de reaccin favorece la aparicin de estructurasrelevantes para la funcionalidad de este canal.