Canales de Calcio

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON

ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA

“CORRIENTES DE CALCIO A TRAVÉS DEL CANAL MUTANTE LEANER EXPRESADO EN UN SISTEMA

HETERÓLOGO”

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA

PRESENTA

Consuelo María Hernández Valdivia

ASESORA Dra. Esperanza García Martínez

Colima, Col., noviembre del 2005

DE COLIMA

ES

TUDIA LU C HA T

RA

BA

JA

ÍNDICE Tablas y figuras………………………………………………………………. i

Abreviaciones…………………………… …………………………………….ii

1 Resumen……............................................................................................. 1

2 Summary….…………………………………………………………………….. 2

3 Introducción…………………………………………………………………… 3

3.1 Canales de calcio…………………………………………….…………. 5

3.2 Clasificación y estructura de los canales de calcio activados

por voltaje………………………………………………………………... 7

3.3 Subunidad auxiliar β……………………………………………………. 11

3.4 Subunidad auxiliar 2…………………………………………………. 13

3.5 Subunidad auxiliar γ …………………………………………………….

15

3.6 Inactivación de canales iónicos dependientes de voltaje…………... 16

3.7 Mecanismos de inactivación de los canales de calcio ……………... 18

3.7.1 Inactivación dependiente de voltaje…………………………... 18

3.7.2 Inactivación dependiente de calcio…………………………….19

4 Antecedentes inmediatos…………………………………………………… 21

4.1 Modulación de los canales de calcio por proteínas G……………… 22

4.2 Bases estructurales de la modulación por proteínas G……………. 23

4.3 Efecto modulador de la calmodulina sobre la inactivación de

los canales de calcio tipo P/Q…………………………………………. 24

4.4 Ratones con mutaciones en canales de calcio: modelos para

estudiar desórdenes neurológicos en humanos…………………….. 26

5 Justificación…………………………………………………………………… 29

6 Hipótesis………………………………………………………………………. 31

7 Objetivo general……………………………………………………………… 31

7.1 Objetivos particulares…………………………………………………... 31

8 Materiales y métodos………………………………………………………... 32

8.1 Vectores usados………………………………………………………… 32

8.2 Técnicas bacteriológicas………………………………………………. 33

8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli………………. 33

8.2.2 Preparación de las bacterias competentes…………………... 33

8.2.3 Transformación de las bacterias E. coli………………………. 34

8.3 Determinación de la concentración de DNA…………………………. 34

8.4 Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN)……………………… 35

8.5 Sistema de expresión heteróloga …………………………………….. 36

8.6 Cultivo de células HEK 293……………………………………………. 36

8.7 Transfección de las células HEK 293 mediada por agregados

inorgánicos (fosfato de calcio)……………………………………. 36

8.7.1 Transfección celular……………………………………………. 37

8.8 Análisis electrofisiológico………………………………………. ……... 38

8.9 Medios y soluciones……………………………………………. ……... 41

9 Resultados y discusiones…………………………………………………… 42

9.1 Efecto de la mutación tgla corto sobre la densidad de corriente….. 42

9.2 Caracterización de la dependencia al voltaje de la activación

del tgla corto cuando la corriente acarreadora es Ca+2 ……….......... 43

9.3 Efectos sobre la cinética de inactivación producida por

el tgla corto………………………………………………………. …….. 45

9.4 Efecto de la mutación tgla corto sobre el grado de inactivación

en función del potencial………………………………………………... 46

9.5 Efecto de la entrada previa de calcio sobre la inactivación de

la corriente en la mutación tgla corto………………………….. ……... 47

9.6 Efecto de la mutación tgla corto sobre la inactivación en estado

estable del canal de calcio tipo P/Q…………………………………... 49

9.7 Efecto de la facilitación en la corriente de calcio mediada por

un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve

duración………………………………………………………………... 51

10 Conclusiones…………………………………………………………………. 53

11 Perspectivas……………………………………………………………. …….. 58

11.1 Anexo (figuras datos preliminares)…………………………………… 60

12 Referencias bibliográficas…………………………………………………. 65

ii

ABREVIACIONES

ADN Ácido desoxirribonucleico

ATP Trifosfato de adenosina

BID Dominio de interacción beta

CAM Calmodulina

CAM4 Calmodulina mutante 4

Ca+2 Calcio

Cai Concentración de calcio intracelular

CBD Sitio de unión constitutiva a calmodulina

CDI Inactivación dependiente de calcio

cDNA DNA complementario

Cs+ Cesio

Cl- Cloro

DMEM Medio dubelcos modificado

EFH EF hand

EGTA Ácido tetraacético de etilen-glicol

E. coli Escherichia coli

GFP Proteína verde fluorescente

HEK293 Células embrionarias de riñón de humano

HEPES 2-4-(2-hidroximetil)-1-piperazinaetano ácido sulfónico

hrs Horas

IFM Motivo isoleicona-fenilalanina-metionina

IV Corriente-voltaje

K+ Potasio

L Litros

LB Medio de Luria Bertani

Li+ Litio

M Molar

min minutos

iii

mM Milimolar

Na+ Sodio

NMG N-metil-glucamina

ng Nanogramos

Rb+ Rubidio

RE Retículo endoplásmico

rpm Revoluciones por minuto

seg segundos

SBF Suero bovino fetal

tgla corto leaner corto

tgla largo leaner largo

TEA Tetraetilamonio

Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano

UV Ultravioleta

Alfa

Beta

Delta

l Microlitros

g Microgramos

M Micromolar

i

TABLAS Y FIGURAS

Tabla 1. Clasificación de los canales de calcio dependientes de voltaje……………………………………………………….…………… 8 Figura 1. Conformación estructural de los canales de calcio dependientes de voltaje………………………………………………………………. 10 Figura 2. Topografía transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A. 11 Figura 3. Densidad de corriente de los canales de calcio tipo P/Q en células HEK293………………………………………………………………….. 43 Figura 4. Protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV…………….. 44 Figura 5. Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto)…………………………………………………………………. 46 Figura 6. Grado de inactivación en función del potencial para los canales de calcio tipo P/Q (tgla corto y 1A)……………………………………. 47 Figura 7. Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de prueba posterior a esta…………………………….. 49 Figura 8. Inactivación en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto)………………………………………………………………. 50 Figura 9. Evaluación de la facilitación de la ICa por prepulso para el canal mutante tgla corto y el canal silvestre (1A)…………………………. 52 PERSPECTIVAS ANEXO Figura 1. Efecto de la CAM4 sobre la dependencia al voltaje de la activación……………………………………………………………….. 60 Figura 2. Efecto de la CAM4 sobre el curso temporal de la inactivación en función del potencial de membrana………………………………. 61 Figura 3. En el canal silvestre la sobreexpresión de CAM4 no afecta el grado de inactivación en función del potencial de membrana….. 62 Figura 4. En el tgla corto, el porcentaje de inactivación en función del potencial se modifica con la sobreexpresión de calmodulina mutante………..63 Figura 5. Inactivación por prepulso: Efectos de la entrada previa de calcio sobre la inactivación de la ICa en el canal mutante tgla corto……………… 64

1

1 RESUMEN

Los canales de calcio dependientes de voltaje, participan de manera relevante

en la regulación de diversos procesos que dependen de calcio en las células

excitables. La apertura del canal, genera señales eléctricas e incrementos

transitorios en la concentración intracelular de calcio, que contribuyen en el control

de diferentes procesos fisiológicos.

La familia de proteínas que conforman a los canales de calcio tiene una gran

variabilidad genética; para su ensamblaje y funcionamiento adecuados, se requiere

de la asociación de hasta 5 diferentes subunidades (Caterall, 1995). En los últimos

años se han descrito enfermedades, que tienen una estrecha asociación con

mutaciones en los genes que codifican para las subunidades que conforman a los

canales iónicos (Meisler y cols., 2001).

La importancia del presente trabajo de investigación, radicó en tratar de

encontrar las posibles alteraciones electrofisiológicas del canal de calcio tipo P/Q

como consecuencia de cambios en su estructura. Se utilizó la subunidad 1A del

canal de calcio tipo P/Q de humano, al cual se le introdujo la mutación denominada

como leaner corto, que produce una alteración importante en la región carboxilo del

canal, con la consecuente pérdida del sitio de unión constitutiva a calmodulina

(CBD), además de un sitio de unión al complejo β de proteínas G.

Para estudiar las propiedades electrofisiológicas del canal, el cDNA de la

proteína mutada se expresó en células HEK293 y se registraron las corrientes

totales. Los resultados sugieren que la activación dependiente de voltaje no se ve

alterada por la mutación. La cinética de inactivación es más lenta en el canal de

calcio mutado que en el canal silvestre. La inactivación en estado estable no se ve

alterada en el canal truncado. La inactivación dependiente de la entrada previa de

calcio difiere significativamente de la del canal silvestre. La isoforma corta incrementa

la magnitud de corriente cuando la proteína es precedida por prepulsos

despolarizantes. Lo anterior sugiere que las alteraciones fenotípicas observadas en

el animal mutante se ven claramente influenciadas por alteraciones en los

mecanismos que participan en la modulación del canal de calcio tipo P/Q.

2

2 SUMMARY

The voltage gated calcium channels have a relevant participation in the

regulation of diverse processes wich depends on calcium in the excitable cells. The

conformational changes that leads to the opening of these channels are produced by

the depolarization of the membrane. As consequence it generate an electrical signal

and a transitory increases in the intracelular calcium concentration, contributing to the

control of different physiological processes.

The family of proteins that form the calcium channels has a great genetic

variability, since its correct assembly and function needs of the association of 5

subunits that differ in their genetic origin (Caterall, 1995). The previous thing turns out

to be particularly important, since the last years there have been described some

diseases that have a narrow association with the present mutations in the genes that

codify for the subunits of the ionic channels (Meisler and cols., 2001).

To study electrophysiological properties of this channel, the cDNA of the

mutated protein was expressed in HEK293 cells and the total currents were register.

The results suggest that the activation dependent on voltage does not see to

be altered by the mutation. The kinetic of inactivation was slower in the mutated

calcium channel that in the wild channel. The inactivation in steady state does not

become altered in the truncated channel. The inactivation dependent on the previous

entry of calcium differs significantly with regard to the native P/Q calcium channel.

The short isoform increases in a significant way the magnitude of the current when

the protein was preceded for depolarizant prepulses. These results suggests that the

phenotypic alterations observed in the mutant animal meet clearly influenced by the

alterations in the mechanisms that participate in the modulation of the type P/Q

calcium channel.

3

3 INTRODUCCIÓN

En los sistemas biológicos, el Na+, K+, Cl- y Ca+2 son los principales iones

involucrados en la realización de procesos celulares fundamentales. Para atravesar

la membrana celular que es una bicapa hidrofóbica lipídica, estos iones deben ser

transportado a través de: a) poros hidrofílicos denominados canales iónicos, b)

proteínas transportadoras y c) bombas iónicas.

Gran parte de la energía producida por el metabolismo celular se gasta en el

bombeo de iones en contra de su gradiente electroquímico a través de la membrana

celular; este proceso requiere de la participación de bombas iónicas que a diferencia

de los canales iónicos actúan a través de un mecanismo de transporte activo es

decir, requieren de la energía liberada por la hidrólisis de ATP para generar el

movimiento de los iones. Estos gradientes contribuyen a la generación de señales

eléctricas en las que los canales iónicos tienen una participación importante. Las

señales eléctricas viajan en forma de potenciales de acción por ejemplo, desde una

neurona hasta un sitio determinado donde desencadena otro tipo de señal no

eléctrica como puede ser la liberación de algún neurotransmisor o el inicio de

reacciones químicas en cascadas de señalización intracelular.

Los canales iónicos tienen una función aparentemente simple: permitir de

manera pasiva el flujo de iones a través de la membrana celular, proceso que ha

resultado de una complejidad que va más allá de esta simple descripción. Así, los

canales iónicos son proteínas integrales de membrana que forman poros acuosos

que permiten el paso de iones a favor de su gradiente electroquímico. Algunos

canales son altamente selectivos a una especie iónica en particular y al mismo

tiempo mantienen conductividades altas a esa especie iónica. Así mismo, los canales

iónicos poseen mecanismos que permiten su regulación a través de la apertura y el

cierre del poro conductor. Gran parte de lo que se conoce a la fecha sobre los

canales iónicos, se dedujo de mediciones eléctricas gracias al hecho de que estos

permiten el flujo de iones a través de las membranas biológicas, con un movimiento

iónico a favor del gradiente electroquímico que existe entre ambos lados de la

membrana. La importancia de estas proteínas (que dan lugar a la formación de

canales iónicos) en una gran cantidad de fenómenos celulares, ha sido reconocida

4

en los últimos años, y se sabe que tienen una participación determinante en la

transducción de señales externas en señales internas que permiten a la célula

modular su actividad en función de su medio extracelular, lo que es válido tanto para

células excitables como para las células no excitables. Así, los canales iónicos tienen

participación en fenómenos tan diversos como son: la excitabilidad eléctrica y

química, la secreción, la contracción muscular, la fecundación, las reacciones

inmunes, la diferenciación celular, etc. (Bers, 1991; Artalejo y cols., 1994; Murphy y

cols., 1991). El flujo de iones a través de los canales iónicos ocurre a una velocidad

de más de 106 iones / segundo; característica que permite poder observar la

actividad de una sola molécula a una resolución temporal muy alta, algo único en

biofísica. Esto, junto con el avance en las técnicas de biología molecular que hoy nos

permiten el acceso al uso de la clonación y al empleo de sistemas de expresión

heteróloga de los cDNAs para los canales iónicos de interés, ha hecho posible la

disección a nivel molecular de los dominios estructurales de la proteína que tienen

una relevancia funcional; como son aquellos implicados en la formación del poro

acuoso, en su comportamiento cinético, o en la unión de drogas que modifican su

actividad. Lo anterior ha permitido la exploración y el análisis microscópico de la

relación existente entre la estructura y la función de los canales iónicos.

5

3.1 CANALES DE CALCIO

La concentración libre de calcio (Ca+2) en el citosol de cualquier célula es

extremadamente baja (10-7M), mientras que la concentración en el medio

extracelular y en el retículo endoplásmico (RE) es considerablemente mayor

(10-3M). Esta diferencia genera un fuerte gradiente de concentración que tiende a

permitir el paso de Ca+2 al citosol a través de ambas membranas. Cuando se activan

las vías que permiten la entrada de calcio al citoplasma, se produce un marcado

incremento de la concentración local de Ca+2 intracelular en un rango aproximado de

0.3-1M (Berridge, 2000).

El flujo de Ca+2 a través de la membrana plasmática está regulado por una

gran familia de canales, los cuales se abren o cierran en respuesta a un estímulo

determinado, el cual puede provenir de la interacción entre la proteína que conforma

el canal y nucleótidos cíclicos, de la unión de neurotransmisores con receptores del

canal o bien de cambios en el potencial eléctrico a través de la membrana.

A los canales de calcio que se activan por el potencial eléctrico, se les ha

denominado como canales de calcio activados por voltaje, los que forman una gran

familia de proteínas de membrana multiméricas que controlan de manera selectiva el

flujo de iones de Ca+2 en respuesta a cambios en el potencial de la membrana.

El Ca+2 es un ión que juega un papel muy importante en los procesos

intracelulares de las células excitables incluyendo a las neuronas. Durante el

desarrollo neuronal, la entrada de este ión a través de los canales de calcio

dependientes de voltaje tiene una participación importante en diversas funciones

como por ejemplo, en el control de la liberación de neurotransmisores, la muerte

neuronal, el crecimiento de las neuritas, en la formación y eliminación de sinápsis, en

la diferenciación fenotípica, además, actúa como segundo mensajero en la expresión

de genes (Desmadryl y cols., 1998; Zwingman y cols., 2001). El Ca+2 es un

mensajero intracelular por excelencia, que requiere de un control fino en sus niveles

citoplasmáticos para mediar los distintos procesos en que se ve involucrado. Esto

significa que la concentración de Ca+2 debe mantenerse en un rango estrecho del

orden nanomolar (Saris, 2005), ya que este catión puede llegar a ser tóxico para la

6

célula si sus niveles no son controlados de manera precisa. Así, aunado a los

canales de calcio existen otros mecanismos involucrados en la regulación del calcio

intracelular tales como las bombas e intercambiadores que remueven el Ca+2 del

citoplasma una vez que ha cumplido su papel como señalizador, logrando mantener

de esta forma las concentraciones basales del mismo.

7

3.2 CLASIFICACIÓN Y ESTRUCTURA DE LOS CANALES DE CALCIO ACTIVADOS POR VOLTAJE

De acuerdo a sus propiedades electrofisiológicas y farmacológicas, los

canales de calcio dependientes de voltaje han sido clasificados en cinco tipos

denominados como T, L, N, P/Q y R (ver nueva nomenclatura en Tabla 1). Las

corrientes iónicas acarreadas por los canales antes mencionados se caracterizan por

tener distintos umbrales de activación, por lo que se les distingue básicamente en

dos grupos: los canales de bajo umbral de activación (tipo T), aquellos que se activan

con pulsos de despolarización cercanos al potencial de reposo, y los canales de alto

umbral de activación (tipo L, N y P/Q), los cuales para su activación requieren de

estímulos despolarizantes muy por encima de su potencial de membrana. Estos

canales son complejos hetero-oligoméricos los cuales se activan tras la

despolarización de la membrana celular. La expresión y funcionamiento adecuados

de los canales de Ca+2 requieren del ensamblaje de la subunidad 1 (que es la

encargada de formar el poro de selectividad iónica), y de las subunidades accesorias

, 2 y que están implicadas en la regulación del canal (Klugbauer y cols., 1999).

El primer canal de calcio activado por voltaje fue purificado y clonado de

túbulos transversos de músculo esquelético (Curtis y Catterall 1986; Tanabe y cols.,

1987). Desde entonces, se han identificado siete genes que codifican para la

subunidad alfa que conforma el poro de los canales de alto umbral de activación

(Hofmann y cols. 1999) y tres genes para los canales de bajo umbral (Lee y cols.,

1999). Si bien inicialmente las subunidades identificadas se nombraban según el

tejido de procedencia, recientemente se ha adoptado una nueva nomenclatura en

base a las características que comparten (ver la Tabla 1).

8

Tabla 1.- Clasificación de los canales de calcio dependientes de voltaje: conductancia unitaria, agonistas, bloqueadores, características cinéticas de la corriente, nomenclatura, distribución celular (Modificada de Catterall, 2000)

La subunidad 1 tiene un peso molecular de 190-250 kDa y es la estructura

fundamental de los canales de calcio activados por voltaje. Está conformada por

cuatro dominios transmembrana homólogos (I-IV) cada uno de ellos conformado por

6 alfa hélices transmembrana (S1-S6) circundantes a un poro central (Tanabe y cols.,

1987) (figura 1 A). Los extremos amino y carboxilo de la subunidad 1 se encuentran

localizados intracelularmente. Los segmentos S4 de cada uno de los dominios

poseen elementos estructurales específicos que incluyen residuos de aminoácidos

cargados positivamente (lisina y arginina), los que también han sido reportados en

los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje. Dichos aminoácidos forman el

sensor de voltaje, el cual sufre un cambio conformacional en respuesta a una señal

despolarizante (figura 1 A), del tal modo que este cambio puede acoplarse a la

apertura del poro del canal. Por analogía con algunos canales de K+, se ha sugerido

que la boca externa del poro esta dada por la invaginación que ocurre en el “asa” del

poro, entre los segmentos 5 y 6 transmembrana (figura 1 A). Además, el “asa” del

poro posee residuos de glutamato (o aspartato en algunos canales de bajo umbral de

activación), los cuales dan lugar al filtro de selectividad del canal. Se cree que los

residuos de glutamato se coordinan con el Ca+2 durante su paso a través del poro

9

(Ellinor y cols., 1995) y por otro, lado proveen el mecanismo que permite el bloqueo

del canal por metales pesados tales como el Cd+2 y el Co+2, los cuales se asocian

fuertemente con los sitios de unión para Ca+2 dentro del poro.

La subunidad 1 en su región intracelular tiene secuencias altamente

conservadas que le permiten la interacción con proteínas. Así, entre los dominios I y

II se encuentra un sitio de unión específica a la subunidad denominado dominio de

interacción alfa (AID) (figura 1 B). Un segmento entre el “asa” I y II de los canales tipo

no L une el complejo de proteínas G (De Waard y cols., 1997; Zamponi y Snutch,

1998). En tanto, la región carboxilo posee sitios que median la inactivación de

canales tanto L como no L a través del complejo Ca+2/Calmodulina (Lee y cols.,

1999; Zühlke y cols., 1999).

10

Figura 1. En el apartado A se muestra la conformación estructural de la subunidad 1 de los canales de calcio dependientes de voltaje. Mientras que en apartado B, se representa la composición multimérica de los canales de calcio dependientes de voltaje resultado de la asociación de las distintas subunidades que los conforman; además se señalan algunos de sus determinantes moleculares (ver texto para detalle).

11

3.3 SUBUNIDAD AUXILIAR β Debido a que la subunidad ß no forma parte de la proteína que conforma el poro del

canal, se le ha denominado como subunidad accesoria o auxiliar. La primer

subunidad de este tipo con un peso molecular de 58 kDa se clonó del músculo

esquelético (Tanabe y cols., 1987). No posee segmentos transmembrana (figura 1

B). La estructura de su dominio se asemeja grandemente al dominio SH3 que une

regiones ricas en prolinas, lo que refuerza la idea de que la subunidad ß también

sirve como sitio de anclaje de la subunidad α1 a otras proteínas (Miller, 1992; Zong,

1994). A la fecha, se han identificado 4 genes no alélicos para esta subunidad

(Castellano y Pérez-Reyes, 1993), además de diversas variantes derivadas de

procesamiento alternativo. Estas proteínas y sus formas alternas se expresan de

manera específica en diferentes tejidos. La nomenclatura (con su distribución mas

prevalente entre paréntesis) es ß1A (músculo esquelético), ß1B (cerebro), ß2 (corazón,

pulmón, cerebro), ß3 (cerebro, músculo liso) y ß4 (cerebro, particularmente en cerebelo).

Como se mencionó anteriormente, las subunidades ß se unen a la subunidad α1

mediante una secuencia específica del "asa” intracelular entre los dominios I y II de

esta última, al que se le ha denominado como AID (Pragnell y cols., 1994) (figura 1

B). Mientras que el dominio correspondiente en la subunidad ß se ha determinado

como el dominio de interacción ß (BID) (figura 1 B). En el ratón letárgico, existe una

mutación en la subunidad ß4 antes del BID, lo que da como resultado una forma

truncada de RNA mensajero, con la consecuente pérdida funcional de la proteína.

Esta alteración estructural es la responsable de los daños neurológicos expresados

en este mutante, que incluyen la ausencia de epilepsia y presencia de ataxia

(Burgess y cols., 1997). Las subunidades ß juegan distintos roles, principalmente son

importantes para la expresión membranal de las subunidades α1 (Brice y cols.,

1997). En algunos casos, las subunidades ß pueden sufrir una especie de

"reorganización” con el fin de compensar la sobre expresión o la ausencia de una de

las otras subunidades. Esto se observa con la subunidad ß4, donde la forma

truncada de la proteína causa el daño neurológico observado en el ratón letárgico.

Sin embargo, la perdida del gen que codifica para la subunidad ß1 en ratones “knock

out” conduce a la muerte en el nacimiento (Gregg y cols., 1993). De manera

12

secundaria, las subunidades β ejercen diversos efectos sobre las propiedades

biofísicas de las subunidades α1, que son específicos para cada una de las

diferentes subunidades ß.

13

3.4 SUBUNIDAD AUXILIAR α2-δ

La familia de subunidades 2consiste de tres genes. La primer subunidad

identificada fue extraída del músculo esquelético de conejo y se le denominó 21

(Ellis y cols., 1988). Existen otras cinco subunidades 2-1 generadas por expresión

alternativa (Angelotti y Hofmann, 1996) pero su importancia funcional aún no ha sido

establecida. Dos nuevos miembros de esta familia de subunidades se identificaron

posteriormente en seres humanos y en ratones a las que se les llamó 2y

2respectivamente � (Klugbauer y cols., 1999); estas nuevas subunidades

mantienen una homología del 56 y 30% con la subunidad 2-1, respectivamente.

Una mutación en la subunidad α2-δ2 es la responsable del daño neurológico

manifestado como ataxia en un ratón con mutación espontánea denominado “ducky”

(Barclay y cols., 2001).

Las 3 subunidades 2 tienen perfiles hidrofóbicos similares y contienen

varios sitios potenciales de N-glicosilación. La subunidad 2-1 está conformada por

2 proteínas, la 2 altamente glicosilada localizada extracelularmente y una pequeña

proteína que permite el anclaje de la 2 a la membrana celular (Brickley y cols.,

1995; Wiser y cols., 1996). Las dos proteínas auxiliares α2 y δ son producto del

mismo gen y se originan por un corte proteolítico post-traduccional (De Jongh y cols.,

1990) (figura 1 B). Las subunidades 2 y se asocian mediante puentes disulfuro

que se forman entre los numerosos residuos de cisteínas que se localizan en ambas

proteínas (figura 1B). Si bien, la subunidad 2 posee 2 dominios hidrofóbicos, se

piensa que esta subunidad se encuentra localizada extracelularmente y se une a la

subunidad transmembrana δ mediante puentes disulfuro (Brickley y cols., 1995).

Los efectos de la subunidad 2-1 sobre las propiedades biofísicas de las

subunidades 1 dependen del sistema de expresión y de las subunidades utilizadas.

Aunque invariablemente estas incrementan la densidad de corriente a través de los

canales de calcio al aumentar la cantidad de canales funcionales en la superficie

celular. Además, se ha reportado que altera de manera alostérica la activación e

inactivación de diversas subunidades 1 (Singer y cols., 1991; Bangalore y cols.;

1996, Felix y cols., 1997; Klugbauer y cols., 1999). Se sabe también que la

14

subunidad 2-1 incrementa la unión de dihidropiridinas a los canales de calcio tipo L

y de -conotoxina a los tipo N (Félix y cols., 1997; Brust y cols., 1993). Por otro lado,

se ha visto que la coexpresión de las subunidad 2-1 con la 2a muestra que estas

dos subunidades auxiliares tienen un efecto cooperativo sobre la expresión de los

canales Cav1.2 a nivel membranal, lo que se traduce en un incremento de la

densidad de corriente (Yamaguchi y cols., 2000).

15

3.5 SUBUNIDAD AUXILIAR γ

La primera secuencia que se dedujo a partir del músculo esquelético indica

que la subunidad γ1 es una proteína de 25 kDa con cuatro dominios transmembrana

característicos (Jay y cols., 1990) (figura 1B). La función de esta subunidad en los

canales de calcio del músculo esquelético aún no se determina completamente;

aunque se sabe que en estos modula el pico de corriente además de las cinéticas de

activación e inactivación de la subunidad alfa 1 (Singer y cols., 1991; Eberst y cols.,

1997). Posteriormente se encontró que ratones que manifiestan ausencia de

epilepsia (fenotipo stargazer) poseen un gen homologo en los que se genera la

inserción de un transposón y da lugar a la subunidad denominada como γ2 (Letts y

cols., 1998). Este nuevo miembro de la familia de subunidades γ se clonó de tejido

cerebral y si bien, puede producirse cierta cantidad de RNA mensajero funcional, la

inserción del transposón causa considerables aberraciones fenotípicas. Además de

la subunidad γ2, recientemente han sido identificadas otras 3 subunidades (γ3- γ5) en

ratones (Klugbauer y cols., 2000). Las subunidades γ3 y γ4 solamente han sido

encontradas en cerebro, mientras que la γ5 es expresada en riñón, músculo

esquelético, hígado y pulmón (Klugbauer y cols., 2000). La homología de la

subunidad γ1 con el resto de las subunidades es muy baja, compartiendo solo el 25%

de identidad con la γ2.

Finalmente, es importante resaltar que en su conjunto las subunidades

accesorias , 2 y modulan las cinéticas de activación e inactivación, la densidad

de expresión, la dependencia del voltaje y las propiedades farmacológicas de la

subunidad 1 del canal de calcio (Hofmann y cols., 1999).

16

3.6 INACTIVACIÓN DE CANALES IÓNICOS DEPENDIENTES DE VOLTAJE

Desde el punto de vista funcional, la inactivación es un proceso común y

crítico en muchos tipos de canales iónicos dependientes de voltaje. Un ejemplo claro

es el canal de sodio dependiente de voltaje, donde la inactivación rápida determina la

duración del potencial de acción y el período refractario en tejidos excitables;

mientras que la remoción de la inactivación del canal rompe el gradiente iónico

conduciendo a la perdida de la excitabilidad.

A la fecha, se sabe poco sobre el proceso de inactivación de los canales de

Ca+2 dependientes de voltaje (Stotz y Zamponi, 2001). Sin embargo, el proceso de

inactivación de los canales de Na+ y K+ cuyas estructuras moleculares se asemejan a

la de los canales de calcio dependientes de voltaje, se encuentra mejor descrito. Así,

el proceso de inactivación de los canales de Na+ y K+ puede servir como punto de

partida para tratar de correlacionar de manera indirecta el o los mecanismos de

inactivación presentes en los canales de Ca+2

Tanto los canales de Na+ como los de K+, presentan dos procesos diferentes

de inactivación denominados como inactivación rápida e inactivación lenta, que son

mediados por diferentes componentes de la subunidad del canal. Estos

mecanismos son procesos independientes, ya que la remoción de la inactivación

rápida, no elimina la inactivación lenta; por ejemplo, la inactivación rápida se elimina

mediante el tratamiento enzimático intracelular (Rojas y Amstrong, 1971) y por

mutaciones en el “asa” citoplasmático que une al tercer y cuarto dominios de la

proteína que conforma el canal (Stühmer y cols., 1989; Patton y cols., 1992; West y

cols., 1992); sin embargo, estos tratamientos no ejercen ningún efecto sobre la

inactivación lenta.

El mecanismo para el proceso de inactivación rápida en los canales de

potasio, se describió en el canal de potasio tipo shaker, de acuerdo a un modelo de

bola y cadena (Hoshi y cols, 1990). En este modelo, un segmento de

aproximadamente 20 aminoácidos situado en la región amino terminal de cada

dominio, es potencialmente capaz de ocluir físicamente el poro del canal en su región

citoplasmática.

17

La inactivación rápida de los canales de Na+ se asocia a un mecanismo

cualitativamente similar; sin embargo, en estos canales la estructura de inactivación

no está asociada a la región amino terminal, sino al “linker” III y IV donde se ha

demostrado que existe una región hidrofóbica de 3 aminoácidos (isoleucina [I],

fenilalanina [F] y metionina [M]) denominada como motivo IFM. Es decir; la oclusión

física del poro en los canales de Na+ durante la inactivación, está mediada por la

unión del motivo IFM a un sitio de acoplamiento localizado en la subunidad del

canal. En este sentido, el linker III y IV funciona como una especie de tapadera que

cuando se acopla a la región del poro es capaz de impedir el flujo de corriente (West

y cols., 1992).

La inactivación lenta es un proceso que parece estar asociado a la obstrucción

de la boca externa del poro del canal. Esto es, que el poro es capaz de controlar la

selectividad del filtro por si mismo, contribuyendo de alguna manera en la cinética

característica de la inactivación lenta. Sin embargo, los mecanismos moleculares que

controlan este tipo de inactivación distan mucho de estar claramente descifrados.

Para los canales de potasio, se sugiere que durante esta inactivación, el poro

sufre un estrechamiento debido a un rearreglo estructural. El tetraetilamonio (TEA) es

capaz de reducir dramáticamente la inactivación lenta cuando se aplica

extracelularmente, como si ésta no pudiese ocurrir mientras el TEA se mantiene

unido a la boca externa del poro. Por otro lado, los iones extracelulares juegan un

papel importante. Así, la presencia de iones permeables como el K+ y el Rb+,

reducen de manera importante la inactivación lenta, como si su presencia en el filtro

de selectividad previniera de alguna forma el estrechamiento del poro. De manera

notable, en ausencia de estos iones en el medio extracelular, el canal de potasio en

el estado de inactivación lenta es permeable al sodio. Lo que ha llevado a sugerir

que el reacomodo de la parte más externa del filtro de selectividad, conduce a un

estrechamiento y no a un colapso del poro durante la inactivación (Jerng, 1999).

Por otro lado, en los canales de Na+, la inactivación lenta parece ocurrir de

manera similar. Además, la presencia de iones como el Na+, Li+, K+, Rb+ y Cs+, son

capaces de modificar la cinética de la inactivación lenta en los canales de Na+

(Townsend y Horn, 1999).

18

3.7 MECANISMOS DE INACTIVACIÓN EN LOS CANALES DE CALCIO.

Contrariamente a los canales de Na+ y K+, se sabe poco de las estructuras

moleculares que intervienen en los procesos de inactivación de los canales de calcio.

A través de la evolución, los canales de calcio han desarrollado varios mecanismos

de inactivación para controlar el flujo de Ca+2 al interior celular. A la fecha, se han

descrito tres tipos de inactivación: inactivación rápida dependiente de voltaje (Zhang

y cols., 1994), inactivación dependiente de Ca+2 (Peterson y cols., 1999) e

inactivación lenta dependiente de voltaje (Sokolov y cols., 2000).

En sistemas de expresión heteróloga, las subunidades 1 de los canales de

Ca+2 no requieren de subunidades auxiliares para presentar una inactivación

dependiente de voltaje, lo que sugiere que la inactivación es un proceso intrínseco de

la subunidad 1 (Nargeot, 1992).

3.7.1 INACTIVACIÓN DEPENDIENTE DE VOLTAJE

El primer trabajo dirigido a la identificación de los elementos estructurales de

la subunidad 1 que participan en este proceso de inactivación dependiente de

voltaje fue reportado por el grupo de Tsien en 1994. Usando canales de calcio

quiméricos que combinaban características estructurales de distintas subunidades,

mostraron que las diferencias en las cinéticas de inactivación observadas, se debían

exclusivamente a la región S6 del dominio I tansmembranal. Sin embargo,

posteriormente se demostró que algunas mutaciones puntuales en distintas

secuencias de la subunidad 1, tales como la región carboxilo, el “linker” entre el

dominio I-II, el “linker” entre el dominio III y IV además de los segmentos S6

transmembrana, pueden afectar dramáticamente la cinética de inactivación. Lo

anterior, llevó al empleo de otras estructuras quiméricas utilizando canales

filogenéticamente más distantes con comportamientos cinéticos diferentes,

lográndose encontrar que los cuatro dominios transmembrana contribuyen a la

dependencia del voltaje de la inactivación.

19

3.7.2 INACTIVACIÓN DEPENDIENTE DE CALCIO

Las primeras evidencias de la existencia de un mecanismo de inactivación

dependiente de calcio (CDI), surgieron de un estudio realizado por Brehm y Eckert en

1978 al encontrar que la cinética de inactivación en canales de Ca+2 (de

Paramecium) era mucho más rápida en presencia de Ca+2 que la observada cuando

perfundían soluciones con Ba+2. Adicionalmente, también encontraron que diversos

amortiguadores de calcio tenían como efecto una reducción en la inactivación del

canal.

Los canales de calcio dependientes de voltaje representan una de las vías

más importantes de influjo de Ca+2 y la CDI representa un mecanismo muy

importante de retroalimentación negativa que permite al Ca+2 autorestringir su

entrada al interior celular.

Se han propuesto distintos mecanismos para explicar la CDI como son: los

procesos de desfosforilación, así como la participación de proteínas de unión a Ca+2.

Si se toma en cuenta que la CDI es un proceso rápido, entonces resulta lógico

pensar que la defosforilación y la producción de segundos mensajeros no constituyen

el mecanismo primario que inicia la inactivación mediada por calcio. De tal modo que,

los esfuerzos para tratar de descifrar este mecanismo, se han centrado en el papel

que juegan las proteínas que unen calcio y que tienen la capacidad de unirse al

canal. Así, en 1995 se encontró que los canales tipo L poseen determinantes

estructurales importantes para la CDI en la región proximal del extremo carboxilo, a

la cual se le denominó como región de inactivación por Ca+2 (CI). La región CI

contiene un motivo de unión a Ca+2 denominado con EF hand (EFH), el cual fue

propuesto como el sensor de Ca+2 para la CDI (De León y cols, 1995). Sin embargo,

estudios posteriores donde se eliminaron de manera selectiva regiones del extremo

carboxilo del canal tipo L permitieron identificar dos grupos de aminoácidos

necesarios para la CDI. (Zühlke y cols.,1998). Una de estas regiones es el motivo de

unión a calmodulina denominado como IQ, lo que dejaba abierta la posibilidad de

que la calmodulina pudiese estar participando en el mecanismo de inactivación por

20

calcio. Así, en los últimos años y gracias al empleo de sistemas de expresión

heteróloga, diversos grupos han demostrado que la calmodulina actúa como el

sensor de Ca+2 en la CDI (Lee y cols., 1999; Peterson y cols., 1999; Zühlke y cols.,

1999).

21

4 ANTECEDENTES INMEDIATOS

Durante muchos años las enfermedades neurológicas hereditarias fueron

reconocidas como errores congénitos asociadas al metabolismo. Sin embargo, en los

últimos años gracias al avance técnico y científico se ha reconocido la presencia de

mutaciones en diversas proteínas como son: receptores membranales, proteínas

presentes en el citoesqueleto y recientemente en proteínas de transporte,

particularmente en los canales iónicos que dan origen a la manifestación de diversas

enfermedades (Lehmann-Horn y Jurkat-Rott, 1999).

Como se mencionó al principio del presente trabajo, los canales de Ca+2

activados por voltaje proveen un vínculo de suma importancia entre las señales

eléctricas en la membrana plasmática y una diversidad de procesos intracelulares

que requieren del ión Ca+2 como segundo mensajero (como la liberación de

neurotransmisores), o bien aquellos procesos cuya modulación requiere de vías de

señalización intracelular dependientes de Ca+2 (como la expresión génica).

Recientemente se han identificado mutaciones en el gen que codifica para la síntesis

de la subunidad 1a del canal de calcio tipo P/Q, que tienen una íntima relación con

algunas alteraciones neurológicas hereditarias en seres humanos, como son : la

ataxia cerebelar tipo 6, la migraña hemipléjica familiar y la ataxia episódica tipo 2

(Zhuchenko, 1997; Ophoff, 1998).

El flujo iónico a través de los canales de calcio activados por voltaje da la pauta

inicial para el desencadenamiento de múltiples y diversos mecanismos de

señalización intracelular, por lo que la regulación del curso temporal y la distribución

subcelular de dicho flujo iónico como respuesta a una despolarización tiene una

influencia directa sobre aspectos importantes de la fisiología neuronal.

La subunidad 1a constituye a los canales de calcio tipo P/Q de alto umbral de

activación, y se localiza principalmente en las prolongaciones dendríticas y en el

soma de las células de Purkinje, así como en las terminales sinápticas de las células

granulares (Westenbroek y cols., 1995). La distribución subcelular, así como las

consecuencias funcionales de su interacción con proteínas de la membrana

presináptica, indican que estos canales desempeñan una función importante en la

regulación de la eficiencia sináptica de estos tipos celulares (Sutton y cols., 1999).

22

4.1 MODULACIÓN DE LOS CANALES DE CALCIO POR PROTEÍNAS G

Algunos estudios utilizando la técnica de “patch clamp” en la configuración de

célula completa (Hamill y cols., 1981), han demostrado que la activación de

receptores acoplados a la vía de transducción de señales mediada por proteínas G,

ejerce un efecto inhibitorio sobre los canales de calcio tipo N y P/Q (Colecraft, 2001).

Lo anterior se refleja en una reducción en la amplitud de la corriente al pico,

acompañada por una disminución en las constantes de activación e inactivación de

estos canales. Por otro lado, se ha observado que esta inhibición tiene un efecto

marcado a voltajes hiperpolarizantes, lo que implica que el grado de inhibición

depende en gran medida del potencial de membrana. Esta inhibición se manifiesta

como un desplazamiento hacia la derecha en la curva de inactivación del canal, lo

que indica que en presencia de proteínas G, los canales ven reducida su

probabilidad de apertura ante determinado potencial de la membrana. Así, esta

dependencia al voltaje da como consecuencia una desestabilización de la proteína G

cuando la conformación del canal se encuentra en estados despolarizados, de tal

forma que el efecto inhibidor producido por la proteína G desaparece mediante la

aplicación de pulsos despolarizantes de gran amplitud (prepulsos antes del pulso de

prueba) a lo que se le ha dado el término de facilitación. El efecto producido por la

facilitación ya sea como algunos autores lo han sugerido, por un cambio

conformacional que no implica la desunión total de la proteína G del canal (Kasai,

1989), o bien, por una disociación física completa que expone al canal a una

reasociación con la proteína G (Hille, 1994) genera la posibilidad de estudiar cual es

el efecto modulador por proteínas G en los canales de calcio (Zamponi y Snutch,

1998).

Estudios previos han mostrado que la activación de receptores acoplados a la

vía de transducción mediada por proteínas G inhibe los canales de calcio tipo N y

P/Q en neuronas centrales (Currie, 1997). La interacción del heterodímero G con la

región citoplásmica entre el dominio I y II del canal de calcio cambia el modo de

activación, generando una población de canales “refractarios”. En consecuencia, la

corriente macroscópica disminuye, la constante de tiempo de activación de las

23

corrientes aumenta, y ocurre un cambio positivo en la dependencia al voltaje de la

activación (Bean, 1989; Mintz y Bean, 1993). Los canales refractarios pueden

cambiar de nuevo al modo “disponible” de activación si se aplican pulsos

despolarizantes de gran amplitud, a lo cual se ha denominado facilitación. AsÍ, la

magnitud y la cinética de la facilitación producida por despolarizaciones sostenidas, o

por pulsos relativamente breves a potenciales muy positivos (+100 a +150 mV) se

considera un criterio para explorar la modulación de la corriente de calcio por

proteínas G (Zamponi y Snutch, 1998).

4.2 BASES ESTRUCTURALES DE LA MODULACIÓN POR PROTEÍNAS G

Las primeras evidencias encaminadas a mostrar cuales son los determinantes

estructurales para la modulación por proteínas G surgieron del empleo de canales

quiméricos (Cav2.2 y Cav2.1) (Zhang y cols., 1996). A partir de este trabajo diversos

estudios han sugerido la participación de varios determinantes estructurales para la

interacción de proteínas G con el canal de calcio, que implican la participación de la

región carboxilo terminal; una región de 38 aminoácidos a la que se une el complejo

G (Qin y cols., 1997), y otra de 19 aminoácidos, cercana al segmento

transmembranal S6 del dominio IV, a la que se une la subunidad G (Furukawa y

cols., 1998). Resulta interesante resaltar que uno de los dos sitios de unión a

proteínas G en el lazo citoplasmático entre los dominios I y II se superpone con el

sitio de interacción de la subunidad ß con el canal, lo que es consistente con la

evidencia de que las subunidades ß regulan la acción por proteínas G en canales de

calcio (Bouring y cols., 1996, Fitzgerald y cols., 1995; Dolphin y cols., 2003 y Doering

y cols., 2004).

24

4.3 EFECTO MODULADOR DE LA CALMODULINA SOBRE LA INACTIVACIÓN DE LOS CANALES DE CALCIO TIPO P/Q

La calmodulina (CAM) es una proteína ubicua moduladora del calcio

intracelular que desempeña un papel fundamental en la regulación de una gran

variedad de procesos biológicos. También posee una función importante en la

diferenciación neuronal; participa en la regulación de numerosas proteínas, entre las

que se incluyen algunas protein- quinasas, tales como la quinasa CaM de tipo II,

algunas formas de adenilato ciclasa, la fosfodiesterasa de adenosina monofosfato

cíclico y fosfolipasas de membrana, tales como la fosfolipasa C (que hidroliza a

fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PIP2]) y fosfolipasa A2. La CAM es una pequeña

proteína (15 kD) de aproximadamente 148 aminoácidos que se encuentra en el

citosol de la mayoría de las células eucariotas. En concentraciones basales, el calcio

tiene una baja afinidad por la CAM pero a medida que la concentración de calcio

aumenta, se ocupan los cuatro sitios de unión que posee para este ión y se activa la

CAM. La variación en las afinidades de las proteínas por CAM permite que, al

aumentar la concentración de calcio, dichas proteínas se afecten de forma diferente.

Los mecanismos que subyacen a la inactivación dependiente de calcio en los

canales de calcio tipo L son los mejor documentados a la fecha (Neely y cols., 1994;

Imredy y cols., 1994; Catterall y cols., 2000), no así para los canales de calcio tipo

P/Q. Sin embargo, recientemente utilizando técnicas de doble híbrido en levadura y

de inmunoprecipitación, se ha identificado un nuevo sitio de unión a CAM que se

encuentra localizado en la región carboxilo terminal de la subunidad 1 del canal

Cav2.1 (Lee y cols., 1999). Este dominio de unión a calmodulina (CBD) está

localizado en la porción carboxilo terminal de la subunidad 1 2.1 que es homóloga a

la secuencia del dominio IQ de los canales Cav1.2 (Kraus y cols., 1998). Este

dominio está involucrado en la inactivación de la corriente de calcio, pero también

forma parte del mecanismo de facilitación a largo plazo (Lee y cols, 1999).

Aparentemente, la calmodulina se puede unir a esta región del canal cuando la

concentración de calcio intracelular es baja; y por otro lado, en respuesta a la

25

estimulación con trenes de pulsos, lo cual genera la acumulación de calcio en el

citoplasma; esta proteína regula el curso temporal de la recuperación de la

inactivación. Este mecanismo de regulación por calmodulina parece determinar la

disponibilidad de canales funcionales en función de la concentración de calcio y de la

frecuencia con la que se despolariza la membrana (Lee y cols, 1999).

26

4.4 RATONES CON MUTACIONES EN CANALES DE CALCIO: MODELOS PARA ESTUDIAR DESÓRDENES NEUROLÓGICOS EN HUMANOS

A principios de los años sesenta, Sidman y Green (1965) sugirieron que

algunas enfermedades de tipo neurológico podrían explicarse por la existencia de

posibles mutaciones en los canales iónicos. Años después, en 1996, el grupo de

Fletcher identificó en los ratones tottering y leaner la primera mutación en canales de

calcio. Recientemente, varios estudios a nivel de genética molecular han evidenciado

que diferentes enfermedades en humanos están claramente asociadas a mutaciones

en diversos canales iónicos. A esta disfuncionalidad en los canales iónicos se le ha

denominado con el término de canalopatías, asociadas en su mayoría a cambios en

el flujo de iones de Na+, K+ y Ca+2 en diversos tipos de células. En seres humanos,

las canalopatías conducen a diversas enfermedades tales como la ataxia, la migraña,

algunas epilepsias y otros desórdenes neuromusculares.

Se han identificado algunos ratones que muestran mutaciones espontáneas

llamados: tottering y leaner (Fletcher y cols., 1996; Doyle y cols., 1997), rolling

nagoya (Mori y cols., 2000), stargarzer (Letts y cols., 1998), lethargic (McEnery y

cols., 1998), rocker (Zwingman y cols., 2001), y ducky (Barclay y cols., 2001). Los

primeros tres tipos de ratones mutantes poseen variantes alélicas, presentando

mutaciones en el cromosoma 8, en el locus asociado al gen Cacnal1a que codifica

para la subunidad 1 del canal de calcio tipo P/Q (ver figura 2)

27

Figura 2.- Topografía transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A. Donde: tg=tottering, tgla= leaner, rkr= rocker, rol= rolling nagoya; P=prolina, L=leucina, R=arginina, G=glicina, T=Treonina, K=lisina (Adaptado de Fletcher y cols., 1996).

Además de los ratones con mutaciones espontáneas, se han generado varios

ratones transgénicos mediante “knocking out” o mediante la sobre-expresión de

subunidades específicas de canales de calcio (Muth y cols., 2001). Los fenotipos

causados por las mutaciones en la subunidad 1A de los canales de calcio,

muestran diversos grados de severidad quizá como consecuencia del sitio en que se

presente la mutación.

Algunos estudios han asociado a la mutación en la subunidad 1A del canal

de calcio tipo P/Q con tres alteraciones neurológicas en humanos: la migraña

hemipléjica familiar, la ataxia episodica tipo 2 y la ataxia espinocerebelar tipo 6

(Ophoff y cols., 1998). Así, tanto la ataxia espinocerebelar tipo 6 como el ratón leaner

ven interrumpida la secuencia intracelular de la región caboxilo terminal (Fletcher y

cols., 1996; Zhuchenko y cols., 1997); lo que da como resultado una severa

degeneración cerebelar (Herrup, 1982; Heckroth 1994; Herrup 1997).

Por otro lado, las mutaciones asociadas a la migraña hemipléjica familiar, la

ataxia episódica tipo 2 y la mutación leaner alteran la región donde se localiza la

región del poro del canal (Fletcher y cols., 1996; Ophoff y cols., 1996) lo que se

28

refleja en daño neurológico sin sufrir grandes cambios en la morfología cerebelar

(Heckroth, 1994).

A continuación se enlistan algunas evidencias de paralelismo genotípico y

fenotípico de las patologías ligadas a canales de calcio tipo P/Q entre ratones y seres

humanos (Hess, 1996).

1) La secuencia de aminoácidos de la subunidad 1A del canal de calcio sensible a

voltaje de ratón presenta un 94% de identidad con la proteína correspondiente en

seres humanos.

2) El nivel de expresión del RNAm de la subunidad 1A en cerebelo es elevada, lo

cual coincide con el patrón de degeneración neuronal asociado con la

manifestación fenotípica de ataxia.

3) La localización cromosómica de la mutación tottering y leaner es una región

sinténica con el segmento del cromosoma humano 19p13, en el cual se han

localizado las mutaciones correspondientes a la migraña hemipléjica familiar y la

ataxia episódica tipo 2.

4) La ataxia y la atrofia cerebelar progresiva en los ratones mutantes son

comparables a los síntomas descritos en individuos con migraña hemipléjica

familiar, ataxia episódica tipo 2 y ataxia cerebelar tipo 6.

Las similitudes genotípicas y fenotípicas entre las enfermedades neurológicas

y los ratones mutantes, sugieren que los canales de calcio originados por las

mutaciones leaner y tottering son un excelente modelo para tratar de elucidar la

relación existente entre los cambios estructurales y la función del canal.

29

5 JUSTIFICACIÓN

Durante la última década, diversas mutaciones en los genes que codifican

para distintos canales iónicos han sido asociadas a enfermedades neurológicas

hereditarias en seres humanos. De manera simultánea, también se han descrito

mutaciones en los genes que codifican para proteínas similares pero en roedores, lo

que los coloca como modelos ideales para tratar de establecer la relación entre la

mutación y el fenotipo observado. Así, diversas alteraciones genéticas que ocurren

de manera espontánea en ratones que presentan epilepsia de ausencia y ataxia

cerebelar, se asocian a mutaciones en canales de calcio. Los ratones; tottering,

rocker, rolling Nagoya y leaner presentan mutaciones en la subunidad 1 del canal

de calcio tipo P/Q, que en neuronas cerebelares tiene un alto nivel de expresión; de

tal modo que las posibles alteraciones en las propiedades biofísicas del canal

mutado, pueden ser un factor importante de correlación con el daño neuronal

observado en el animal mutante (Mori, 2000). Lo anterior resulta de suma

importancia, ya que en seres humanos algunas alteraciones neurológicas de tipo

hereditario como son la migraña hemipléjica familiar, la ataxia episódica tipo 2 y la

ataxia espinocerebelar tipo 6 están también asociadas a mutaciones en el gen que

codifica para el canal tipo P/Q (Fletcher y cols, 1996; Ophoff y cols, 1998).

Para establecer de manera fidedigna cómo las mutaciones afectan la actividad

del canal y desencadenan la enfermedad, es necesario estudiar su efecto en un

contexto fisiológico. Sin embargo, el estudio biofísico de las mutaciones in vitro,

permiten detallar los mecanismos básicos que se ven alterados en la función del

canal en un intento por tratar de comprender cómo estas alteraciones podrían

conducir a la enfermedad.

Así, mediante este trabajo se pretende analizar los efectos funcionales

producidos por la mutación leaner en el canal de calcio tipo P/Q, utilizando un

sistema de expresión heteróloga.

Como consecuencia de la mutación leaner, se producen dos isoformas de

RNA mensajero diferentes con alteraciones en la secuencia del extremo carboxilo:

una forma larga (tgla largo) que incluye el segundo intrón (una secuencia

normalmente no transcrita) y una forma corta (tgla corto) que pierde la secuencia del

30

segundo exón (Fletcher y cols., 1996). Si bien, la mutación afecta la región carboxilo

del canal de calcio tipo P/Q donde se encuentran las secuencias que tienen que ver

con la modulación del mismo, el interés del presente trabajo de tesis se centró en la

isoforma corta ya que es la que pierde el dominio CBD dejando intacto el motivo IQ.

Así, la mutación leaner nos sirvió como modelo para tratar de establecer cuál es la

posible contribución a nivel molecular del dominio IQ en la actividad eléctrica del

canal. Para esto, usamos el cDNA de la subunidad 1A de humano a la que

mediante mutagénesis dirigida se le introdujo la mutación leaner y que fue

generosamente proporcionado por el Dr. Terry Snutch (University of British

Columbia).

Como se mencionó con anterioridad, la subunidad 1A del canal P/Q tiene en

su extremo carboxilo dominios de interacción con proteínas reguladoras del canal.

Una de las más importantes es la calmodulina, una proteína reguladora que participa

en una gran variedad de eventos fisiológicos dependientes de calcio. Es una proteína

de 148 aminoácidos, capaz de unir 4 moléculas de calcio de manera específica, es

estructuralmente estable y flexible aún bajo los cambios conformacionales inducidos

por el calcio y modula la actividad de una gran cantidad de proteínas incluyendo

proteínas cinasas, fosfodiesterasas, bombas de calcio, etc. Tanto la secuencia IQ

como el dominio CBD en el canal tipo P/Q son capaces de interaccionar con

calmodulina. Así, considerando que la isoforma corta pierde el dominio CBD, resultó

de suma importancia tratar de establecer el papel modulador del dominio IQ mediado

por calmodulina sobre la actividad del canal.

31

6 HIPÓTESIS

La reducción funcional observada en los canales de calcio tipo P/Q en el

modelo de epilepsia conocido como leaner podría deberse a cambios en los

mecanismos de regulación de la proteína que constituye el canal como resultado de

la alteración en el dominio de interacción con proteínas moduladoras.

7 OBJETIVO GENERAL

Analizar las propiedades electrofisiológicas de las mutaciones en el canal de

Ca+2 tipo P/Q utilizando como modelo la mutación conocida como leaner corto, en un

sistema de expresión heteróloga.

7.1 OBJETIVOS PARTICULARES

1.- Estudiar la dependencia al voltaje de la corriente acarreada por Ca+2 a

través del canal mutante tgla corto.

2.- Analizar el efecto de la corriente de Ca+2 evocada durante un prepulso

sobre la inactivación del canal de calcio mutante.

3.- Evaluar la dependencia de voltaje de la inactivación en estado estable

en el tgla corto.

4.- Comparar el grado de facilitación asociado a la estimulación con prepulsos

positivos usando Ca+2 como acarreador de corriente.

32

8 MATERIALES Y MÉTODOS

Las técnicas y métodos empleados son descritos en esta sección. Todos los

reactivos utilizados tenían la calidad requerida para biología molecular. Algunas

composiciones de soluciones específicas se describen en la metodología general,

mientras que las soluciones amortiguadoras generales (buffer) se muestran en la

sección de medios y soluciones.

8.1 VECTORES USADOS

Los constructos originales de cDNA usados a lo largo de este trabajo (1,

1tgla, 2 y β2A, fueron generosamente proporcionados por el Dr. T. Snutch

(University of British Columbia). Las diferentes secuencias de cDNA utilizadas se

encontraban insertadas en los siguientes vectores para su amplificación y expresión

en el sistema de expresión heteróloga.

pcDNA: es un vector de expresión eucariótica que puede ser cultivado en bacterias

E.Coli. Tiene un promotor de citomegalovirus para generar un alto nivel de

transcripción de la secuencia insertada, una señal de poli-adenilación, un sitio de

clonación múltiple, un gen de resistencia a ampicilina y una secuencia de terminación

de la transcripción

pTracer: es un vector de expresión en células de mamíferos que contiene la

secuencia de la Proteína Verde Fluorescente (GFP), posee una secuencia de poli-

adenilación, un gen de resistencia a zeocina y una secuencia de terminación de la

transcripción.

33

8.2 TÉCNICAS BACTERIOLÓGICAS

8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli

Las bacterias utilizadas para la amplificación y la purificación de los DNA

plasmídicos utilizados durante este trabajo fueron E. coli de la cepa DH5-. El cultivo

de estas bacterias se realizó en medio de Luria-Bertani (medio LB). Las bacterias se

crecieron en matraces de vidrio a 37°C en agitación constante a 225 rpm. El

antibiótico de selección adicionado al medio LB dependió del cDNA a obtener, siendo

ampicilina (50g/ml) para las subunidades 1 (o 1tgla), 2 y β2A y zeocina (25

g/ml) para la proteína verde fluorescente (GFP). Las cajas con agar sólido se

prepararon usando medio LB adicionado con agar (15g/L). El medio se esterilizó

mediante calor húmedo a una temperatura de 121°C y una presión de 15 libras por

pulgada cuadrada durante 20 minutos, posteriormente se adicionó el antibiótico

requerido que fue previamente esterilizado mediante un filtro de 0.22m. Una vez

obtenidas las colonias, las cajas con agar sólido se mantuvieron a 4°C para su

almacenamiento por períodos cortos (no mayor a 2 semanas).

8.2.2 Preparación de las bacterias competentes

Para la preparación de las células competentes se utilizaron las siguientes

soluciones: CaCl2 (50 mM) y CaCl2/Glicerol al 20 % (50 mM).

El procedimiento seguido fue el siguiente:

1.- Se inocularon 50 ml de medio LB con una sola colonia de bacterias E. coli de la

cepa DH5- y se incubó toda la noche en agitación constate a 225 rpm y 37°C.

2.- Posteriormente se inocularon 200 ml de medio LB con 2 ml del cultivo anterior.

3.- Se tomaron 100 ml del medio anterior y se monitoreo el crecimiento bacteriano

hasta que alcanzó una densidad óptica de 0.4 a una absorbancia de 600 nm.

4.- Una vez alcanzada la absorbancia indicada se transfirió el medio a tubos estériles

y se mantuvieron en hielo durante 25 min.

5.- Posteriormente el medio se centrifugó a 3000 rpm por 5 min (4°C) y se removió el

sobrenadante.

34

6.- Se resuspendió el “pellet” mediante agitación suave con los 100 ml de medio

restantes del paso 2 y 50 ml de la solución de CaCl2 50 mM.

7.- Se incubó en hielo por 1 hora

8.- Posteriormente se centrifugó a 2500 rpm por 5 min (4°C) y se removió el

sobrenadante.

9.- El “pellet” obtenido se resuspendió en 20 ml de la solución de CaCl2/Glicerol 20%.

10. Finalmente se hicieron alícuotas de 0.5 ml en crioviales estériles, que se

congelaron inmediatamente en una mezcla de hielo seco/etanol y así las bacterias

competentes se almacenaron a -70°C.

8.2.3 Transformación de las bacterias E. coli.

Los diferentes plásmidos de DNA empleados en el presente trabajo se

introdujeron en las bacterias competentes E. coli mediante una reacción de shock

térmico a través del siguiente procedimiento.

1.- Se adicionaron 10 a 15 ng del DNA requerido a 200l de bacterias competentes.

2.- Se incubaron en hielo por espacio de 30 min.

3.- Posteriormente se realizó un shock térmico a 42°C por 40 seg.

4.- Se adicionaron 3 ml de medio LB y se incubó a 37°C por 60 min.

5.- Luego se centrifugó a 14000 rpm por 1 min a temperatura ambiente.

6.- Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el “pellet” en el líquido remanente.

7.- Las bacterias se sembraron en las cajas con agar sólido conteniendo el antibiótico

de selección correspondiente y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Se

eligieron colonias completamente aisladas para su cultivo y posteriormente el DNA

se aisló mediante el procedimiento de Maxi-prep de QIAGEN.

8.3 Determinación de la concentración de DNA

La concentración de los cDNA obtenidos se midieron mediante la técnica de

espectrofotometría. Se utilizó la relación de absorbancia 260/280 para determinar la

pureza de los cDNA, tomando un valor por arriba de 1.65, como indicador de que la

muestra se encontraba pura.

35

8.4 Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN)

Para obtener una producción a gran escala (20g) de los distintos DNA

plasmídicos, se usó un sistema de purificación de plásmidos Maxi-prep (Qiagen)

siguiendo las instrucciones del fabricante:

1.- Una colonia de bacterias conteniendo el inserto requerido se cultivó en 3 ml de

medio LB en presencia del antibiótico de selección requerido.

2.- 100ml de medio LB más el antibiótico de selección se inocularon con el medio

anterior y se incubaron a 37°C durante toda la noche.

3.- Posteriormente se centrifugó a 6000 rpm por 10 min, 4°C y el paquete de células

se resuspendió en 10 ml del buffer P1 frío.

4.- Luego se adicionaron 10 ml del buffer de lisis P2 y se incubó por 5 min a

temperatura ambiente.

5.- La solución se neutralizó con 10 ml del buffer P3 y se incubó en hielo durante 20

min.

6.- El componente lisado se centrifugó a 12000 rpm por 30 min y 4°C.

7.- El sobrenadante se decantó en una columna de intercambio iónico, que

previamente había sido equilibrada con el buffer QBT (NaCl 750mM, MOPS 50mM,

pH 7.0, isopropanol 15%, Triton X-1000.15%)

8.- La columna se lavó posteriormente 2 veces con 30 ml del buffer QC (NaCl 1M,

MOPS 50mM, pH 7.0, isopropanol 15%).

9.- El DNA se eluyó con 15 ml del buffer QF (NaCl 1.25M, Tris-Cl 50mM, pH 8.5,

isopropanol 15%).

10.- El DNA se precipitó con 10.5 ml de isopropanol y se centrifugó a 12000 rpm por

20 min y 4°C.

11.- El paquete de DNA se lavó con etanol al 70% , se dejó secar por espacio de 15

min y se resuspendió en agua desionizada estéril para determinar su concentración y

su posterior uso.

36

8.5 Sistema de expresión heteróloga

Debido a que la mutación leaner genera dos isoformas diferentes por edición

alternativa en los canales de calcio tipo P/Q, se requirió de un sistema de expresión

que permitió evaluar de manera diferencial las propiedades electrofisiológicas de la

isoforma corta (tgla) con respecto al canal de calcio tipo P/Q silvestre. Razón por la

que se decidió utilizar a la línea celular HEK-293 como sistema de expresión

heterólogo, ya que esta no expresa canales de calcio tipo P/Q endógenos.

8.6 Cultivo de células HEK-293

Se logró el mantenimiento en el laboratorio de la línea celular HEK-293

(obtenida de riñón de humano en estado embrionario), como sistema de expresión

heteróloga. Las células se mantuvieron en un medio de Eagle modificado por

Dulbecco (DMEM), enriquecido con suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor al

10% y con antibiótico penicilina-estreptomicina (50 U/ml), bajo una atmósfera de CO2

al 5% y a una temperatura de 37°C. Para asegurar su continuidad se realizaron

resiembras periódicas al alcanzar un 70-80% de confluencia celular con una solución

de tripsina 0.05%/EDTA 0.2% . El pasaje celular para preparar alícuotas de la

suspensión celular, se llevó a cabo de manera similar excepto que las células se

transfirieron a una mezcla de SBF + DMSO al 10% y se mantuvo así un lote de

células congeladas a -70°C.

8.7 Transfección de las células HEK-293 mediada por agregados inorgánicos (fosfato de calcio) 12 horas previas a la transfección, las células se resembraron en cajas de

Petri de 35 mm a una confluencia aproximada del 20%. Se utilizó el método de

fosfato de calcio (Okayama y Chen, 1990) para transfectar de manera transitoria las

células con el cDNA que codifica para cada una de las subunidades que conforman

el canal de calcio 1 (o 1 tgla), 2, β2A con 2 g de cada una para obtener una

relación molar de 1:1:1. Como marcador para la identificación visual, las células se

cotransfectaron con el vector pTracer que contiene la secuencia de la Proteína Verde

37

Fluorescente (1 g) que emite luz verde al ser excitada en el rango de luz UV (

Cheng y cols., 1996) y para la reacción general se empleó el plásmido Bluescript

como acarreador de DNA (c.b.p 20g).

El procedimiento general para realizar el proceso de transfección fue el

siguiente:

Preparación de la mezcla cDNA-fosfato de calcio:

1.- Se utilizaron en total 20 g de cDNA para transfectar 3x106 células, los cuales se

disolvieron en 220 l del buffer TE.

2.- Se adicionaron 250 l del buffer 2x HBS y se agitó suavemente.

3.- Posteriormente se agregaron 30 l de CaCl2 2 M gota a gota y lentamente.

4.- La solución con el cDNA se incubó a temperatura ambiente por 30 min.

8.7.1 Transfección celular:

1.-La monocapa de células se lavó una vez con el buffer PBS, para posteriormente

agregar medio DMEM sin suero e incubar por espacio de 30 min antes de la

transfección.

2.- Después de los 30 min de incubación se agregó la mezcla de cDNA-fosfato de

calcio gota a gota distribuyéndola de manera uniforme en toda el área de la caja de

Petri que contenía la monocapa celular.

3.- Se incubó a 37°C/CO2 5% durante toda la noche.

4.- Tras la incubación el medio se intercambió por medio completo (DMEM/SBF/Pen-

Estrepto)

5.-Después de 24 horas de haber sido realizada la transfección, las células se

resembraron en cubreobjetos de vidrio tratados previamente con polilisina (50g/ml),

donde se realizaron los registros electrofisiológicos.

38

8.8 Análisis electrofisiológico Los cDNA de las subunidades que codifican para el canal de calcio tipo P/Q

subclonados en los vectores pcDNA se transfectaron de manera transitoria en las

células HEK-293, en una relación 1:1:1 usando el método de fosfato de calcio. Los

cubreobjetos con las células transfectadas se montaron en una cámara de registro

sobre un microscopio invertido equipado con una lámpara de fluorescencia. Las

células se mantuvieron bajo un flujo de perfusión constante (1.5 ml/min) lo que

permitió el recambio de la solución externa (Tris 140 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 1 mM,

Glucosa 10 mM a pH 7.4). Los registros se realizaron 24-72 horas después de

haberse realizado la transfección, identificando como células positivas a la

incorporación del cDNA exógeno aquellas que emitieron fluorescencia bajo luz UV.

El registro de las corrientes en la configuración de célula completa se realizó

mediante el empleo del método de fijación de voltaje (Hamill y cols., 1981). Las

señales generadas por las corrientes se amplificaron mediante un amplificador

Axopatch 200B (Axon instruments, USA) y se adquirieron a través de un convertidor

analógico digital de 16 bits (Axon instruments, USA) para su posterior análisis. Los

electrodos de registro se fabricaron con capilares de borosilicato (Sutter BF150-86-10

0.86, 1.5 diámetros interno y externo respectivamente). La resistencia final de los

electrodos fue de 2.4M con la solución interna (NMG 120mM, MgCl2 1mM, HEPES

60mM, EGTA 0.5mM, ATP-Mg 2mM a pH 7.2).

Las propiedades electrofisiológicas de las corrientes producidas por los

canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto), se estudiaron a través de los siguientes

protocolos experimentales: 1) La relación corriente voltaje (curva IV), se evaluó

mediante la aplicación de pulsos de voltaje de 800 ms a partir de un potencial de

mantenimiento de -100 mV, incrementando su amplitud cada 5 mV y evaluando un

rango de voltaje entre -50 y +45 mV. 2) La inactivación dependiente de la magnitud

de la corriente durante un prepulso (inactivación por prepulso), se estudió a través de

la aplicación de prepulsos de prueba breves (30 ms) a partir de un potencial de

mantenimiento de -100 mV; después de un intervalo de 20 ms, se aplicó un pulso de

prueba con duración de 200 ms a un potencial de 0 mV. De esta forma se midió la

fracción de corriente que puede evocarse por un segundo pulso, tomando en cuenta

39

que durante el prepulso la inactivación es mínima. 3) Para analizar la inactivación en

estado estable, se aplicaron prepulsos de voltaje de larga duración (15 s) a partir de

un potencial de mantenimiento de -120 mV, incrementando su amplitud cada 10 mV

y explorando un rango de voltaje entre -120 y +70 mV; de esta manera se evaluó la

magnitud de la corriente que evocó un pulso de prueba con duración de 200 ms a

+10 mV, el cual fue aplicado inmediatamente después del prepulso condicionante.

Maniobra experimental que permitió medir la disponibilidad de canales funcionales en

función del voltaje que produjo inactivación. Finalmente, 4) la evaluación de la

facilitación por prepulsos positivos se realizó mediante un protocolo que consistió en

la aplicación alternada de pulsos de prueba con duración de 100 ms a +5mV,

precedidos o no por un prepulso con duración de 50 ms a +150 mV. Esto permitió

medir la magnitud de la corriente evocada por el pulso de prueba generado en

ausencia de prepulso lo que se comparó con el valor de la corriente evocada por el

pulso de prueba precedido por prepulsos positivos.

El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo con el programa de

computadora origin 6.0 (Microcal, USA). La significancia estadística de los

promedios de corriente se evaluó mediante la prueba de t-Student, considerando

como significativo una p5%.

La relación corriente-voltaje se analizó haciendo un ajuste con la ecuación de

Boltzmann (I = {Gmax (Vm-Er) } {1/1 + exp[(Vm-Vh)/k]}), obteniendo de esta manera

los parámetros de dependencia de voltaje de la activación del canal de calcio tipo

P/Q.

Donde:

I es la corriente normalizada

Vm es el potencial del pulso de prueba

Er es el valor extrapolado del potencial de inversión de la corriente.

Gmax es el valor máximo de la conductancia

Vh es el potencial al cual se alcanza el 50% de activación.

k es el factor de Boltzmann (RT/zF) en mV.

Mientras que el porcentaje de inactivación durante un pulso de prueba se

expresó como la relación entre la corriente al final del pulso de prueba denominada

40

como “Ipedestal” y la corriente máxima de denominada como “Ipeak”, los dos valores

se midieron en las corrientes que fueron evocadas por pulsos de voltaje en un rango

entre -50 y +45 mV y se expresaron como el cociente r= I pedestal/Ipeak.

Por otro lado, para la inactivación en estado estable, una vez normalizada la

corriente esta se graficó en función del potencial del prepulso condicionante y se

ajustó a una relación de Boltzmann (I = { 1/[1 + exp(V – Vh)/k]}).

Donde:

I es la corriente durante el pulso de prueba

V es el valor del potencial aplicado durante el prepulso

Vh es el potencial de membrana al cual el 50% de los canales están

disponibles

k es el factor de Boltzmann.

Además, para el análisis de la inactivación dependiente de la corriente durante

el prepulso, la corriente evocada durante cada pulso de prueba se normalizó y se

graficó en función del potencial aplicado durante el prepulso correspondiente; se

comparó el rango de voltaje donde se observó la máxima inactivación con el valor

correspondiente para la corriente máxima en la relación corriente voltaje (curva IV).

Finalmente, la facilitación por prepulso se calculó como el cociente de la

corriente evocada después de un prepulso fuertemente despolarizante a +150mV

(I+PP) con respecto a la corriente evocada en ausencia del prepulso (I-PP). Se

graficaron los valores obtenidos en forma de histograma (I+PP/I-PP).

41

8.9 MEDIOS Y SOLUCIONES

Las soluciones utilizadas fueron esterilizadas mediante calor húmedo a

121°C/15 PSI/20 min, a menos que se especifique otro método de esterilización.

Medio LB: Tryptona 10%, Extracto de levadura 5%, NaCl 5%, Glucosa 1%. El medio

se adicionó con antibiótico cuando el protocolo lo requirió.

PBS 1X: NaCl 0.17M, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8mM, KH2PO4 1.7 mM a pH 7.4.

TE 1X: (EDTA 0.1 Mm, Tris-HCl 1 mM pH8.0).

HBS 2X: NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1.5 mM, Dextrosa 12 mM, HEPES 50

mM pH 7.5.

CaCl2 2 M: Se disolvieron 14.7 g de CaCl2 en 100 ml de H20 desionizada.

P2: NaOH 200mM, Dodesil sulfato de sodio SDS 1% (peso/volumen)

P3: Acetato de potasio 3.1 M (pH 5.5)

42

9 RESULTADOS Y DISCUSIONES El presente trabajo se centró en la caracterización funcional del canal de calcio

tipo P/Q de humano (1A) al que se le introdujo una mutación en el extremo

carboxilo denominada como leaner corto (tgla corto), mutación que produce la

perdida del dominio de unión constitutiva a calmodulina (CBD), para evaluar sus

propiedades electrofisiológicas y compararlas con las del canal silvestre.

9.1 Efecto de la mutación tgla corto sobre la densidad de corriente

La figura 3 muestra que la expresión de la mutación tgla corto en células

HEK293 no afecta de manera significativa (p>0.05) la densidad de corriente (pA/pF)

con respecto a la densidad de corriente generada por la transfección del canal

silvestre en el mismo tipo celular. Sin embargo, mientras que para el canal silvestre

se requirieron en promedio 30 horas después de la transfección para alcanzar la

densidad de corriente observada, para el canal mutante en promedio fue necesario

mantener las células en incubación por espacio de 55 horas después de realizada la

transfección. Lo anterior sugiere que al menos en el sistema de expresión

heteróloga y bajo las condiciones de transfección empleadas, aún cuando el canal

mutante tgla corto afecta el curso temporal de la expresión de la corriente, una vez

que el canal se encuentra en un estado activo la densidad de corriente tiene una

magnitud similar a la observada para el canal silvestre.

43

0

4

8

1 2

1 6

2 0

2 4

2 8

tg la-c o rto +2 A + 2 1 A +2 A + 2

n = (6 )5 5 h rs p o s t-tra n s fe cc ió n


pA

/pF

0

4

8

1 2

1 6

2 0

2 4

2 8

tg la-c o rto +2 A + 2 1 A +2 A + 2



pA

/pF

Figura 3.- Densidad de corriente (DC) expresada en pA/pF cuando se expresaron los canales de calcio tipo P/Q en células HEK293. Canal silvestre (1A humano) coexpresado con las subunidades auxiliares β2A y 2, con una DC promedio de 16 pA/pF (n=4) ( ). Canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2, con una DC promedio de 12 pA/pF (n=6) ( ). 9.2 Caracterización de la curva corriente-voltaje del tgla corto cuando la corriente es acarreada por Ca+2

En la figura 4B se pueden apreciar los trazos representativos de las corrientes

obtenidas a través del canal silvestre y la mutación tgla corto, cuando el ión

acarreador es calcio (ICa); donde a simple vista se observa que hay diferencias

importantes en cuanto a la cinética de inactivación en ambos canales, los trazos en

las corrientes obtenidas sugieren que la cinética de inactivación de las corrientes

obtenidas para el tgla corto (coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2)

es mas lenta que la observada en los trazos de corrientes obtenidos para el canal

silvestre coexpresado con las mismas subunidades accesorias. La curva IV (figura

4A) se obtuvo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la misma

figura. Así, los resultados arrojaron que la dependencia al voltaje de la activación no

se ve afectada de manera significativa (p>0.05) en el tgla corto respecto al canal

44

silvestre. El ajuste a la curva hecho con la ecuación de Boltzmann, mostró que

mientras el potencial al cual se alcanzó el 50% de la activación (Vh) para el tgla corto

resultó ser de -13.710.68 mV para el canal silvestre fue de -14.490.67 mV. Así, los

resultados permiten sugerir que los cambios generados en la región carboxilo del

canal de calcio tipo P/Q, como consecuencia de la mutación tgla corto no muestra

incidencia sobre los mecanismos de activación dependientes de voltaje que

participan en este tipo te canal. De tal forma que los resultados en cuanto a la

dependencia de activación obtenidos durante el presente trabajo, concuerdan con los

datos reportados por Lorenzon y cols. (1998) para neuronas de Purkinje del ratón

mutante leaner.

tgla Corto

50 pA

100 ms

1A humano

-100mV-50+45

800 ms 100 ms

50 pA

-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Co

rrie

nte

Nor

ma

liza

da

Vm 1A humano n=5tgla corto n=6

1A humano

tgla Corto

50 pA

100 ms

1A humano

-100mV-50+45

800 ms-100mV

-50+45

800 ms 100 ms

50 pA

-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Co

rrie

nte

Nor

ma

liza

da

Vm 1A humano n=5tgla corto n=6

1A humano

Figura 4.- Inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A se aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuación de Boltzmann (ver materiales y métodos) para el canal silvestre coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 ( ) y para el canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 ( ) . En el panel B se observan trazos representativos de las corrientes obtenidas a través de los canales silvestre (trazo superior) y tgla corto (trazo inferior).

B A

45

9.3 Efectos sobre la cinética de inactivación producidas por el tgla corto

Las cinéticas de inactivación de las corrientes acarreadas por calcio a través

del canal de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) también fueron estudiadas y los

resultados obtenidos se muestran en la figura 5.

El curso temporal de la inactivación de la ICa a través del canal de calcio 1A

(figura 5A) requirió de un ajuste biexponencial (fast, slow), mientras que la ICa a través

del canal de calcio tgla corto ( figura 5B) se ajustó a una sola exponencial (slow).

Estos resultados sugieren que las alteraciones generadas por la mutación tgla corto

en el canal de calcio tipo P/Q producen: 1.- La perdida de la fast observada en el

canal silvestre que se encuentra en el orden de los 30 ms y 2.- una reducción

significativa (p<0.05) en la constante de inactivación lenta (slow en el orden de

500ms) comparada con la que se obtuvo para el canal silvestre (slow en el orden de

los 300 ms). Estos resultados, son por demás interesante debido a que la mutación

afecta una región estructural (dominio CBD) que ha sido asociado por algunos

autores como parte importante del proceso de regulación de la inactivación

dependiente de ICa del canal de calcio tipo P/Q (DeMaría y cols., 2001).

46

1A humano + 2A + 2n = 5

-10 0 10 20 30

tgla corto + 2A + 2n=4

300

400

500

600

700

800

len

ta(m

s)

1A humano + 2A + 2n = 5

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35

10

30

50

70

90

110

130

150

170

190

ráp

ida(

ms)

Potencial de membrama (mV) Potencial de membrama (mV)

1A humano + 2A + 2n = 5

-10 0 10 20 30


300

400

500

600

700

800

len

ta(m

s)

1A humano + 2A + 2n = 5

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35

10

30

50

70

90

110

130

150

170

190

ráp

ida(

ms)


1A humano + 2A + 2n = 5

-10 0 10 20 30


300

400

500

600

700

800

len

ta(m

s)

1A humano + 2A + 2n = 5

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35

10

30

50

70

90

110

130

150

170

190

ráp

ida(

ms)


Figura 5.- Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con incrementos de 5 mV y con una duración del pulso de prueba igual a 800 ms. El canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 tuvo un ajuste monoexponencial (panel B ), dando lugar a una solo constante de inactivación lenta (lenta) (n=4). El canal silvestre (1A) coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 a diferencia del canal mutante tuvo un ajuste biexponencial generando dos constantes de inactivación: una rápida (rápida) (Panel A ) y otra constante lenta (lenta) (Panel B ) (n=5).

9.4 Efecto de la mutación tgla corto sobre el grado de inactivación en función del potencial

En la figura 6 se muestra el grado de inactivación en función del potencial,

medido como el cociente de la corriente al pico respecto a la corriente al final del

pulso (ver inserto de la figura 6) cuando el rango de voltaje analizado fue entre 0 y

+40 mV. La mutación tgla corto mostró un grado de inactivación menor que el

observado para el canal silvestre. Para el tgla corto se observó el grado máximo de

inactivación a un potencial de +20 mV, siendo este cercano al 30% (figura 6B),

mientras que para el canal silvestre se observó también el máximo grado de

inactivación al mismo voltaje pero con un porcentaje de inactivación cercano al 80%

(figura 6A). Estos resultados sugieren que la mutación tgla corto tiene un efecto

importante sobre el mecanismo de inactivación bajo estas condiciones, ya que el

A B

47

grado de inactivación fue significativamente diferente (p<0.05) con respecto a los

resultados obtenidos para el canal silvestre. Aspecto que también soporta la idea de

que la alteración producida en el extremo carboxilo del canal de calcio tipo P/Q,

como resultado del ensamblaje alternativo de la mutación leaner que da lugar a la

isoforma corta, afecta los mecanismos que permiten al canal pasar a un estado

inactivo.

r = Iped / Ipeak

-10 0 10 20 30 40 50 60

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

r=Ip

ed/Ip

eak

Pulso (mV)

1A+2A+2 (n=4)

-10 0 10 20 30 40 50 60

0.6

0.8

1.0

Pulso (mV)

r=Ip

ed/Ip

eak

tgla

corto+2A+2 (n=6)

-10 0 10 20 30 40 50 60

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

r=Ip

ed/Ip

eak

Pulso (mV)

1A+2A+2 (n=4)

-10 0 10 20 30 40 50 60

0.6

0.8

1.0

Pulso (mV)

r=Ip

ed/Ip

eak

-10 0 10 20 30 40 50 60

0.6

0.8

1.0

Pulso (mV)

r=Ip

ed/Ip

eak

tgla

corto+2A+2 (n=6)

Figura 6.- El grado de inactivación en función del potencial para los canales de calcio tipo

P/Q (tgla corto y 1A) se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak (ver inserto) de la corriente evocada por pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos de 5 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv. En el panel A ( ) se aprecia que el grado de inactivación máximo para el canal silvestre (1A) coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 es mucho mayor (cercano al 80%), mientras que en el panel B ( ) se aprecia que el canal mutante tgla corto coexpresado con las mismas subunidades β2A y 2 mostró una reducción considerable en el grado de inactivación máxima en función del potencial (cercano al 30%). 9.5 Efectos en la entrada previa de calcio sobre la inactivación de la corriente en la mutación tgla corto

En la figura 7 se muestran los resultados al evaluar el efecto de la entrada

previa de calcio sobre la inactivación de la corriente acarreada por este ión a través

del canal mutante tgla corto y su comparación con el canal silvestre (el protocolo de

pulsos seguido se muestra en el inserto de la figura). En la figura 7A se pueden

A B

48

observar trazos representativos del efecto producido por la entrada previa de calcio

tanto para el tgla corto como para el canal silvestre. En los trazos de corriente del

pulso de prueba se marcan los voltajes que corresponden al prepulso condicionante.

De tal modo que puede apreciarse que al valor del prepulso (0 mV) donde se

produce la mayor entrada previa de calcio, existe una reducción en la corriente

evocada por el pulso de prueba, respecto a la corriente obtenida por el pulso de

prueba cuando el prepulso condicionante (-40 mV) no genera una entrada previa de

calcio significativa; lo anterior, se visualizó tanto para el tgla corto (figura 7A inferior)

como para el canal silvestre (figura 7A superior). Por otro lado, en la figura 7B se

muestran los resultados obtenidos tras graficar la corriente normalizada que se

generó durante el pulso de prueba en función del potencial durante el prepulso

condicionante. Así, para el canal silvestre (figura 7B superior) se pudo observar que

existe una correlación directa en la reducción de corriente en función de la entrada

previa de calcio, lo que generó una forma de U invertida de la curva corriente voltaje

(figura 4A). De tal modo que a un valor del potencial durante el prepulso

condicionante igual a 0 mV, se obtuvo el grado máximo en la reducción de la

corriente evocada durante el pulso de prueba, lo que se correlaciona con el rango de

voltaje (aproximadamente 0 mV) en el que para la curva IV se observa el pico

máximo de corriente (ver figura 4). Sin embargo, para la mutación tgla corto se obtuvo

una variación significativa con respecto a lo observado en el canal silvestre. Los

resultados obtenidos para el tgla corto sugieren que para un rango de voltaje entre -

50 y +25 mV existe una población de canales inactivados a los que la entrada previa

de calcio parece no afectarles y no es sino hasta que se genera una acumulación de

calcio intracelular, que el canal mutante muestra inactivación (potenciales mas

positivos que 25 mV) (7B inferior).

49

-40mV

0mV

50ms

100pA

1A + 2A

-40mV

0mV

50pA50ms

tgla Corto

Cor

rient

e no

rma

lizad

a

V prepulso-100mV

-40

+10030 ms

20ms

200ms0mV

-40 -20 0 20 40 60

-1.00

-0.95

-0.90

-0.85

-0.80

-0.75

-0.70

-0.65

-0.60

Co

rrie

nte

nor

mal

izad

a

V prepulso

1A + 2A+2

-50 0 50 100 150

-1.0

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

tgla corto+2A+2

-40mV

0mV

50ms

100pA

1A + 2A

-40mV

0mV

50pA50ms

tgla Corto

Cor

rient

e no

rma

lizad

a

V prepulso-100mV

-40

+10030 ms

20ms

200ms0mV

-40 -20 0 20 40 60

-1.00

-0.95

-0.90

-0.85

-0.80

-0.75

-0.70

-0.65

-0.60

Co

rrie

nte

nor

mal

izad

a

V prepulso

1A + 2A+2

-50 0 50 100 150

-1.0

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

tgla corto+2A+2

Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de

prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura). En el panel A se puede observar que tanto para el canal silvestre (superior) como para el canal mutante tgla corto (inferior) existe una reducción en la corriente acarreada por calcio (trazos rojos) cuando hay una entrada previa de calcio en comparación con la corriente evocada por el pulso de prueba sin entrada previa de calcio (trazos negros). En el panel B se muestra la corriente normalizada generada por el pulso de prueba en función del voltaje correspondiente durante el prepulso condicionante. Para el canal silvestre ( ) se observó que la fracción máxima de inactivación corresponde al rango de voltaje en que se obtuvo el pico máximo de corriente durante la curva IV (ver figura 4). Sin embargo, el canal mutante tgla corto ( ) presenta un valor sostenido en el grado de inactivación en un rango de voltaje de -50 a +25 mV, disminuyendo el grado de inactivación en la ICa a voltajes del prepulso mas positivos.

9.6 Efecto de la mutación tgla corto sobre la inactivación en estado estable del canal de calcio tipo P/Q

La inactivación en estado estable del canal de calcio tipo P/Q se evaluó a

través de un protocolo de doble pulso (ver inserto figura 8). A partir de las curvas de

inactivación en estado estable tanto para el canal mutante como el silvestre (1A), se

hizo el análisis de los resultados obtenidos ajustando a una ecuación de Boltzmann

(ver materiales y métodos), y este indicó que no existe una diferencia significativa

(p0.05) en el potencial al cual se alcanza el 50% de inactivación del canal, siendo

Vh=-33.610.71 para el canal silvestre y Vh=-33.130.5 para la mutación tgla corto;

50

además, el factor de Boltzmann (k) resultó ser similar para ambos canales (tgla corto

=5.050.5 y 1A =6.50.6). Los resultados permiten sugerir que los cambios

generados por la mutación tgla corto en el extremo carboxilo no parecen alterar la

dependencia al voltaje durante el proceso de inactivación del canal cuando se utiliza

calcio como ión acarreador.

-100 -50 0 50

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1A (n=8)

Vh = -33.61 0.71

K = 6.5 0.6

tgla corto (n=7)Vh = -33.13 0.54K = 5.05 0.5

Cor

rien

te n

orm

aliz

ad

a

Potencial prepulso (mV)

-100 -50 0 50

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1A (n=8)

Vh = -33.61 0.71

K = 6.5 0.6

tgla corto (n=7)Vh = -33.13 0.54K = 5.05 0.5

Cor

rien

te n

orm

aliz

ad

a

Potencial prepulso (mV)+70mV

200ms

10 mv

+70mV

200ms

10 mv

Figura 8.- Para determinar la inactivación en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q

(1A y tgla corto), se llevó a cabo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la figura. Las curvas de inactivación en estado estable para el canal silvestre (1A) ( ) y el canal mutante tgla corto ( ) se obtuvieron graficando la corriente (normalizada) que se evocó durante el pulso de prueba en función del valor de potencial aplicado durante el prepulso condicionante, ajustando a una relación de Boltzmann (ver materiales y métodos). La gráfica muestra que no existe una diferencia significativa (p0.05) en la inactivación en estado estable del canal mutante (Vh=-33.130.5) comparada con el canal silvestre siendo (Vh=-33.610.71).

51

9.7 Efecto de la facilitación en la corriente de calcio mediada por un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve duración.

En la figura 9A se puede observar un trazo representativo del efecto de la

facilitación en la corriente a través del canal mutante tgla corto cuando se utilizó calcio

como ión acarreador de la corriente (el protocolo de pulsos que se empleó se

muestra en el inserto de la figura 9). Así, en la figura 9A se puede apreciar que la

magnitud de la corriente evocada por un pulso de prueba fue diferente dependiendo

de la presencia o ausencia de un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve

duración (150mV/50ms). De tal forma que la magnitud de la corriente evocada por el

pulso de prueba fue significativamente mayor (p0.05) cuando fue precedido por un

prepulso despolarizante (+PP), en comparación con la magnitud de corriente

evocada por el pulso de prueba que no fue precedido por un prepulso despolarizante.

La facilitación por prepulso ha sido reportada como un mecanismo que ocurre

mediante la disociación del complejo β de la proteína G del sitio de unión

correspondiente en los canales de calcio dependientes de voltaje y que la

recuperación de la facilitación está mediada por la religación del complejo a su sitio

de unión en el canal (Zamponi, 1998). Sin embargo, de suma importancia resulta

hacer notar que los cambios producidos por la mutación tgla corto además de

conducir a la perdida del sitio de unión constitutiva a calmodulina, también elimina el

sitio de unión al complejo β de proteínas G. Así, estos resultados están en

concordancia con los datos reportados por el grupo de Amy Lee (2000) en el sentido

de que la inactivación de canales de calcio tipo P/Q puede recuperarse mediante la

aplicación de trenes de pulsos previos que permiten la acumulación de calcio

intracelular, proceso que se encuentra asociado al complejo Ca+2/Calmodulina es

decir, que es un evento independiente del papel que juega el sitio de unión a

proteínas G situado en el extremo carboxilo del canal.

52

- PP

+ PP

20 ms

100 pA

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

tgla

corto1A

(n=9)

(n=8)

I +P

P/

I -PP

100ms50ms

5mV150mV

-100mV

- PP

+ PP

20 ms

100 pA

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

tgla

corto1A

(n=9)

(n=8)

I +P

P/

I -PP

100ms50ms

5mV150mV

-100mV

Figura 9.- La evaluación de la facilitación de la ICa por prepulso para el canal mutante tgla

corto y el canal silvestre (1A) se llevó a cabo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la figura. El grado de facilitación medido como el cociente de la corriente obtenida después de un prepulso a -150 mV con respecto a la evocada en ausencia de prepulso (I+pp/I-pp), resultó ser significativamente mayor (p<0.05) para el canal mutante tgla corto (rayado color rojo) en comparación al resultado obtenido para el canal silvestre (rayado color negro).

53

10 CONCLUSIONES

La subunidad 1A da lugar a la formación del canal de calcio tipo P/Q, que

tiene un alto nivel de expresión en células granulares y en células de Purkinje

(Westenbroek y cols., 1995). Por lo que dada su distribución celular así como las

interacciones fisiológicas con proteínas de la membrana presináptica, señalan que

los canales de calcio tipo P/Q tienen un papel relevante en los mecanismos

reguladores de los procesos sinápticos; es decir, influyen de manera directa en la

liberación de neurotransmisores (Sutton y cols., 1999).

La mutación leaner en el canal de calcio tipo P/Q genera una isoforma

denominada como tgla corto, provocando cambios estructurales en la región carboxilo

del canal que conducen a la perdida de sitios que permiten la interacción con

proteínas reguladores como: el dominio de unión a calmodulina (Lee y cols, 1998) y

el dominio de interacción con proteínas G (Furuwaka y cols, 1999). Dicha mutación

se encuentra estrechamente asociada a algunas alteraciones neurológicas en

humanos, como la migraña hemipléjica familiar y la ataxia espino cerebelar tipo 2

(Zhüchenko y cols., 1997).

Así, para llevar a cabo este trabajo consideramos que dada la gran

importancia que tienen los canales de calcio en la regulación de procesos fisiológicos

implicados en la regulación neuronal, resulta indispensable tratar de establecer la

interrelación causa-efecto entre la mutación tgla corto y las alteraciones neurológicas

observadas. Si bien, lo ideal es estudiar la alteración en un contexto lo más cercano

a lo fisiológico posible, también es cierto que la relación que existe entre la mutación

y el fenotipo clínico observado involucra procesos de señalización por calcio

sumamente complejos. De tal forma que es necesario estudiar las propiedades

electrofisiológicas y la modulación del canal mutante bajo condiciones estrictamente

controladas, por lo que el uso de un sistema de expresión heterológa como modelo in

vitro es el punto de partida inicial que contribuirá de manera determinante en la

comprensión de la posible participación de la mutación en la alteración de la

excitabilidad neuronal, así como en la secreción de neurotransmisores relacionadas

a procesos neurodegenerativos.

54

La elevación intracelular de Ca+2 mediada por la apertura del canal de calcio

tipo P/Q, es capaz de inhibir la entrada de Ca+2. Este proceso denominado como

inactivación mediada por calcio, representa un mecanismo importante de

retroalimentación que contribuye a la aceleración en la inactivación del canal.

En la región carboxilo de la subunidad 1A se localiza una secuencia de

aminoácidos llamada dominio IQ, que tiene la peculiaridad de ser capaz de

interaccionar con calmodulina, una proteína sensible a calcio. Así, el complejo

Ca+2/calmodulina interactúa con el dominio IQ a través de un mecanismo sensible a

los niveles de calcio promoviendo la inactivación del canal (Lee y cols., 1999). Sin

embargo, dicho mecanismo dista mucho de ser completamente conocido.

En el presente trabajo, se utilizó el canal de calcio tipo P/Q de humano (1A

humano) al que mediante técnicas de mutagénesis dirigida se le introdujo la

mutación leaner (tgla corto) y el cual fue comparado con la proteína silvestre. Las

proteínas que conforman el poro se coexpresaron con las subunidades accesorias

β2A y 2 en las células HEK 293. Dichas coexpresiones permitieron realizar el

análisis electrofisiológico de los canales mencionados, en un intento por tratar de

comprender las posibles alteraciones en los mecanismos de inactivación por calcio

generadas por los cambios promovidos en la región carboxilo del canal por la

mutación tgla corto; para ello, se utilizó la técnica de patch clamp en su configuración

de célula completa.

La coexpresión de las subunidades 1 de tgla corto+β2A+2 no mostró

cambios significativos en la dependencia al voltaje de la activación cuando el ión

acarreador es calcio respecto al canal silvestre coexpresado bajo las mismas

condiciones experimentales. Estos resultados coinciden con los datos reportados

por los grupos de Lorenzon (1998) y Dove (1998) en experimento realizados en

células de Purkinje del ratón mutante leaner.

La densidad de corriente expresada en pA/pF no mostró valores

significativamente diferentes, a diferencia de los datos reportados por Lorenzon y

cols. (1998) que manifiestan existe una reducción significativa en la densidad de

corrientes en neuronas de Purkinje del ratón leaner. Sin embargo, se debe destacar

en principio, que los modelos experimentales son completamente diferentes,

55

mientras en este trabajo se empleó un sistema de expresión heterológa que permitió

controlar el estudio de una sola isoforma mutada (tgla corto), ellos utilizaron células

nativas del animal mutante donde se desconoce cual es la contribución y el efecto

funcional de las dos isoformas generadas por la mutación leaner. Estos resultados

sugieren que los cambios generados en el extremo carboxilo en el tgla corto no

interfieren en la densidad de corriente expresada a través del canal de calcio tipo P/Q

mutado.

El análisis estadístico de los registros obtenidos para la inactivación en estado

estable tanto para el canal mutante (tgla corto) como para el canal silvestre no mostró

una diferencia significativa. Resultados que también se encuentran en concordancia

con lo reportado en células nativas del ratón mutante leaner (Lorenzon y cols.,

1998).

Por otro lado, los registros obtenidos bajo la configuración de célula completa

sugieren que la mutación tgla corto promueve la pérdida de un componente de

inactivación rápido, observado en el canal silvestre. El canal mutante tgla corto

mostró solo una cinética de inactivación lenta, que incluso fue significativamente

diferente de la constante de inactivación homóloga obtenida para el canal silvestre.

Resultados que sugieren la posible participación de un mecanismo de inactivación

mediado por el complejo Ca+2/Calmodulina a través del sitio de unión constitutiva a

calmodulina (CBD), que ha sido asociada a la inactivación por calcio en canales de

calcio dependientes de voltaje (Zülkhe y cols., 1999 y Lee y cols., 1999).

Además de la pérdida de un componente de inactivación lenta, los resultados

generados de este trabajo indican que la mutación tgla corto disminuye de manera

significativa el grado de inactivación del canal en función del potencial de membrana

respecto al canal silvestre, lo que de alguna manera soporta la idea de que los

cambios generados por la perdida del dominio CBD como consecuencia de la

mutación tienen una participación importante en los cambios observados en los

mecanismo de inactivación del canal.

Otro de los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigación,

resultado de graficar los datos generados durante el protocolo de inactivación por

prepulsos evocaron una forma de U invertida, que se asocia a la existencia de un

56

mecanismo de inactivación dependiente del nivel de entrada previo de calcio. Sin

embargo, la mutación tgla corto perdió esta forma característica, sugiriendo que en un

rango de -50 a +25 mV existe una población de canales en estado inactivo (meseta

en la figura 7 panel B inferior) y por otro lado, se observa que no es hasta que se

produce una acumulación de calcio en el lado citoplasmático que el canal muestra

regulación por la entrada previa de calcio.

La facilitación por prepulsos es un fenómeno en el cual un prepulso

fuertemente despolarizante seguido de un pulso de prueba a un potencial dado

induce un cambio conformacional en los canales de calcio dependientes de voltaje, lo

que permite un incremento en su probabilidad de apertura. Este fenómeno ha sido

asociado a la disociación de proteínas G de su sitio de unión en la región carboxilo

del canal (Aparna, 2005). Sin embargo, la mutación tgla corto genera la perdida del

sitio de interacción con proteínas G además del dominio CBD. De manera

sorprendente los resultados obtenidos durante este trabajo señalan que la mutación

tgla corto muestra un incremento significativo en la fracción de corriente mediada por

calcio en comparación a la facilitación observada en el canal silvestre. Lo anterior

sugiere que probablemente el mecanismo que promueve este incremento en la

magnitud de corriente evocada por un pulso de prueba precedido por un prepulso

despolarizante, recae en la secuencia de aminoácidos que codifica para el dominio

IQ y que es regulado por el complejo Ca+2/Calmodulina.

Así, los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigación

muestran que la mutación tgla corto:

a) modifica la cinética de inactivación dependiente de calcio.

b) altera la fracción de canales que inactiva en función del potencial de membrana.

c) la acumulación de calcio intracelular promueve cambios conformacionales en la

región carboxilo de la proteína, lo que da como resultado alteraciones en los

mecanismos de retroalimentación que intervienen en la inactivación del canal.

d) el dominio isoleucina glutamina parece estar involucrado en un fenómeno de

facilitación de la corriente de calcio que normalmente es asociado a la interacción

con proteínas G.

57

De tal modo que estas observaciones, soportan la hipótesis de que la

reducción funcional observada en el canal de calcio tipo P/Q del modelo leaner se

debe a cambios en los mecanismos de regulación de la proteína que constituye el

canal, como resultado de la alteración en el dominio de interacción con proteínas

moduladoras.

58

11 PERSPECTIVAS

Los resultados obtenidos de este trabajo, muestran que la alteración en el

extremo carboxilo de la proteína 1 perfila un largo camino para tratar de entender

cuales son los mecanismos que participan en la modulación del canal tipo P/Q, que

comparativamente al resto de los canales de calcio dependientes de voltaje se

encuentran en menor grado dilucidados; siendo la mutación leaner un modelo idóneo

para este fin.

La mutación leaner da lugar a la formación de dos isoformas distintas: una

corta que pierde el dominio CBD y otra larga que incluye una secuencia normalmente

no transcrita (Fletcher, 1996). El proyecto se centró básicamente en la evaluación de

las consecuencias primarias de la mutación tgla corto en base a que experimentos

previos de nuestro laboratorio mostraron que la mutación tgla largo tiene un

comportamiento similar al del canal silvestre (datos no mostrados). Sin embargo,

resulta imprescindible llevar a cabo una reevaluación a nivel electrofisiológico de las

consecuencias primarias de la mutación tgla largo y posteriormente diseñar

experimentos que permitan manipular la presencia de proteínas reguladoras como

son la calmodulina y proteínas G, con el fin de tratar de explicar de manera certera

cual es la participación que tienen en la regulación del canal.

En particular los resultados obtenidos, muestran que el dominio IQ parece

tener influencia en el proceso de facilitación por prepulsos; aspecto que resulta por

demás interesante, debido a que la recuperación de la inactivación puede ser un

proceso determinante para la entrada de calcio al citoplasma celular y la liberación

de neurotransmisores en las sinapsis (Forsythe y cols., 1998). Por lo que a futuro

resultaría de gran importancia, evaluar el papel que juega la calmodulina y

variaciones de esta que inhiben su unión a calcio (calmodulinas mutantes), lo que

contribuiría muy probablemente al esclarecimiento de los mecanismos que permiten

al complejo Ca+2/Calmodulina participar de manera diferencial en dos proceso tan

importantes como son la inactivación y la facilitación del canal de calcio tipo P/Q

(DeMaría y cols., 2001).

En forma anexa se presentan algunas figuras de resultados preliminares

utilizando calmodulina mutante 1,2,3,4 (CAM4), una proteína que pierde la

59

capacidad de unión a Ca+2 en sus 4 dominios. Estos datos no son concluyentes, la

idea a futuro es llevar a cabo los mismo protocolos que en el trabajo de tesis,

aumentar el número de muestras y complementar los resultados bajo condiciones de

sobreexpresión con calmodulina silvestre.

60

11.1 ANEXO

(FIGURAS DE DATOS PRELIMINARES)

Efecto de la CAM4 sobre la dependencia al voltaje de la activacion

50 pA

100 ms

1A humano + CAM4

100 pA100 ms

tgla Corto + CAM4

-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Co

rrie

nte

No

rma

liza

da

Vm 1A + CAM4 n=10tg

lacorto + CAM4 n=2

Efecto de la CAM4 sobre la dependencia al voltaje de la activacion

50 pA

100 ms

1A humano + CAM4

100 pA100 ms

tgla Corto + CAM4

-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Co

rrie

nte

No

rma

liza

da

Vm 1A + CAM4 n=10tg

lacorto + CAM4 n=2

-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0-60 -40 -20 0 20 40 60

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

Co

rrie

nte

No

rma

liza

da

Vm 1A + CAM4 n=10tg

lacorto + CAM4 n=2

-100mV-50+45

800 ms-100mV

-50+45

800 ms

Figura 1.- EI inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A se aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuación de Boltzmann (ver materiales y métodos) para el canal silvestre coexpresado con la proteína mutante CAM4 además de las subunidades accesorias β2A y 2 ( ) y para el canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 y la proteína mutante CAM4 ( ) . En el panel B se observan trazos representativos de las corrientes obtenidas a través de los canales silvestre (trazo superior) y tgla corto (trazo inferior) bajo las mismas condiciones experimentales.

A B

61

Efecto de la CAM 4 sobre el curso temporal de la inactivaciónen función del potencial de membrana

-10 0 10 20 30100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000 1A + CAM4 n=8

tglacorto + CAM4 n=2

(m

s)

Potencial de membrana (mV)

Figura 2.- Constantes de inactivación de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con incrementos de 5 mV y con una duración del pulso de prueba igual a 800 ms. Tanto el canal mutante tgla corto (n=2) ( ) como el canal silvestre (n=8) ( ) coexpresado con las subunidades accesorias β2A y 2 y la CAM4 tuvieron un ajuste monoexponencial, dando lugar a una sola constante de inactivación () .

62

En el canal silvestre la sobreexpresión de CAM4 no afectael grado de inactivación en función del potencial de membrana

0 10 20 30 400.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

r=Ip

ed/Ip

eak


1A n=41A + CAM4 n=4

Figura 3.- El grado de inactivación en función del potencial para el canal de calcio tipo P/Q silvestre (1A) con ( ) y sin ( ) la sobreexpresión de CAM4 se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de la corriente evocada por pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos de 5 mV partiendo de un potencial de mantenimiento igual a -100mV. En la figura se aprecia que la sobreexpresión de calmodulina mutante no afecta de manera significativa (p<0.05) el grado de inactivación del canal silvestre.

63

En el tgla corto, el porcentaje de inactivación en función del potencial se modifica con la sobreexpresión de calmodulina mutante

0 10 20 30 400.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

r=Ip

ed/Ip

eak


tgla Corto n=3tgla Corto + Cam4 n=4

Figura 6.- El grado de inactivación en función del potencial para el canal de calcio tipo P/Q mutante denominado como tgla corto se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de la corriente evocada por pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 mV con incrementos de 5 mV a partir de un potencial de mantenimiento de -100mV. La figura muestra que la coexpresión del mutante tgla corto con CAM4 ( ) disminuye de manera significativa (p<0.05) el grado de inactivación en función del potencial con respecto al canal silvestre ( ) expresado bajo las mismas condiciones.

64

Co

rrie

nte

no

rma

lizad

a

V prepulso

-50 0 50 100 150

-1.0

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

tgla corto+2A+2

-60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120-1.05

-1.00

-0.95

-0.90

-0.85

-0.80

-0.75

-0.70

-0.65

-0.60

Co

rrie

nte

nor

ma

lizad

a

V prepulso

tglacorto + CAM4

INACTIVACIÓN POR PREPULSO: Efectos de la entrada previa de calcio sobre la inactivación de la ICa en el canal mutante tgla corto

-100mV-40

+10030 ms

20ms

200ms0mV

Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura. La figura muestra la corriente normalizada generada por el pulso de prueba en función del voltaje correspondiente al prepulso condicionante. Los resultados sugieren que la coexpresión del canal mutante tgla corto con la CAM4 ( ) no presenta un cambio significativamente diferente (p>0.05) en la inactivación por prepulso comparada con la expresión del tgla corto sin CAM4 ( ). Ambos canales presentan un valor sostenido en el grado de inactivación en un rango de voltaje de -50 a +25 mV, disminuyendo el grado de inactivación en la ICa a voltajes del prepulso más positivos.

65

12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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