www.nietoeditores.com.mxISSN-0300-9041 Volumen 72, Núm. 12, diciembre, 2004 593

Caracterización del espacio coriodecidual como un microambienterico en moléculas efectoras que inducen la rotura de las membranascorioamnióticas durante el trabajo de parto‡

Rodrigo Vega Sánchez,* Guadalupe Estrada Gutiérrez,* Arturo Cérbulo Vázquez,** Jorge BeltránMontoya,***,**** Felipe Vadillo Ortega*

Artículo original

Ginecol Obstet Mex 2004;72:593-601

RESUMEN

Objetivo: identificar un microambiente específico en contacto con las membranas fetales en el que se acumulan moléculas efectorasdirigidas a degradar los componentes de su matriz extracelular durante el trabajo de parto.Tipo de estudio: experimental, analítico, longitudinal y prospectivo.Material y métodos: se recolectaron muestras de sangre de los compartimientos materno, de cordón umbilical y coriodecidual y seaislaron las células mononucleares. Algunas células se marcaron con anticuerpos para determinar las subpoblaciones de leucocitos porcitometría de flujo; otras se cocultivaron durante 12 h con explantes de membranas corioamnióticas. Después del cocultivo en las célulasse identificó MMP-9 por inmunofluorescencia y en los sobrenadantes se determinó IL-1β y TNF-α por ELISA. Se hicieron tres experimen-tos independientes por duplicado y se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney.Resultados: aunque no se encontraron diferencias significativas en las subpoblaciones de leucocitos entre los tres compartimientos,la producción de MMP-9 por las células mononucleares fue mayor en las coriodeciduales, comparada con la de las células maternas ydel cordón umbilical. Del mismo modo, en los cocultivos con células coriodeciduales se encontró mayor cantidad de IL-1β y TNF-α queen los de los otros compartimientos.Conclusiones: en el trabajo de parto a término las subpoblaciones de células mononucleares del espacio coriodecidual no sondiferentes fenotípicamente de las maternas o del cordón umbilical, pero sí lo son en cuanto a producción de MMP-9, lo que sugiere queel entorno de las membranas corioamnióticas favorece la síntesis de esta enzima y promueve la degradación del tejido conectivo.Palabras clave: rotura de membranas fetales, coriodecidual, microambiente, MMP-9, IL-1β, TNF-α.

ABSTRACT

Objective: To identify a specific microenvironment in direct contact with fetal membranes where effector molecules acumulate, aimingto degrade the components of its extracellular matrix during labor.Type of study: experimental, analytic, longitudinal and prospective.Materials y methods: blood samples were collected from maternal, fetal and choriodecidual compartments, and mononuclear cellswere isolated. Part of these cells was stained with antibodies to determine leukocyte subpopulations by flow cytometry. The other partwas cocultured for 12 h with amniochorion explants. After coculture, MMP-9 was identified on the mononuclear cells byimmunofluorescence. IL-1β and TNF-α were determined in the supernatants by ELISA. Three independent experiments were carried outwith duplicates and analyzed with Mann-Whitney’s U test.Results: Although there were no significant differences in the mononuclear cell subpopulations from the three compartments, MMP-9production was higher in choriodecidual cells than in those of the maternal and fetal compartments. Furthermore, IL-1β and TNF-α weresignificantly more abundant in cocultures with choriodecidual cells compared with the other two compartments.Conclusions: During labor, choriodecidual cell subpopulations are not phenotypically different from those of the maternal or fetalcompartments, but they are regarding MMP-9 production, which suggests that the environment surrounding chorioamniotic membranesenhances the synthesis of this enzyme, thus promoting degradation of connective tissue.Key words: rupture of fetal membranes, choriodecidual, microenvironment, MMP-9, IL-1β, TNF-α.

SOMMAIRE

Objectif : identifier une micro-ambiance spécifique en contact avec les membranes fœtales dans laquelle s’accumulent des moléculeseffectrices dirigées à dégrader les composants de sa matrice extracellulaire pendant le travail d’accouchement.Type d’étude : expérimentale, analytique, longitudinale et prospective.

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‡ Este trabajo obtuvo el primer lugar de investigación básicaen el 55 Congreso Mexicano de Ginecología y Obstetricia.

* Dirección de investigación.** Unidad de citometría de flujo.*** Departamento de tococirugía y urgencias.

Instituto Nacional de Perinatología, SSa.**** Miembro federado.

Correspondencia: Dr. Felipe Vadillo Ortega. Instituto Nacional dePerinatología, Dirección de Investigación. Montes Urales 800, Lo-mas Virreyes, México, DF, CP 11000. Tel.: 5202-9381. Fax:55200034. E-mail: fvadillo@servidor.inper.edu.mx yfelipe.vadillo@uia.mx

La versión completa de este artículo también está disponible eninternet: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

Vega Sánchez R y col.

ABREVIATURAS

DMEM + HLA: medio de cultivo Eagle modificado porDulbecco, adicionado con hidrolizado de lactoal-búmina.

FITC: isotiocianato de fluoresceínaIL-1β: interleucina 1-βMCA: membranas corioamnióticasMMP-2: metaloproteasa de matriz extracelular-2MMP-9: metaloproteasa de matriz extracelular-9PC5: ficoeritrina-cianina 5.1PE: ficoeritrinaRPM: rotura prematura de membranasSFB: suero fetal bovinoTNF-α: factor de necrosis tumoral αEn México, el parto pretérmino es un suceso que se

manifiesta en alrededor del 10% de los embarazos. Casi40% de éstos se relacionan con la rotura prematura delas membranas corioamnióticas,1 enfermedadobstétrica que se distingue por la rotura de las membra-nas en ausencia de trabajo de parto.

En condiciones normales y patológicas, la rotura seorigina por la degradación de los distintos tipos decolágena que constituyen el componente principal dela matriz extracelular que da soporte a las membranascorioamnióticas.2

Dicha degradación la controla una familia deenzimas dependientes de cinc llamadas metalopro-teasas de matriz extracelular (MMPs) y sus inhibidores(TIMPs).3

A lo largo de la gestación las membranas corioam-nióticas sintetizan MMP-2 y MMP-9, pero durante eltrabajo de parto aumenta la síntesis y actividad de estaúltima y disminuye su inhibidor, lo que se asocia concambios ultraestructurales en el tejido conectivo y conuna baja en la cantidad de colágena de las membranascorioamnióticas, por lo que la MMP-9 se considera unmarcador molecular del trabajo de parto.4

Los procesos de señalización local que induce laexpresión de MMP-9 por las células de las membranascorioamnióticas bajo condiciones fisiológicas y quecondicionan su rotura no se conocen, aunque loshallazgos apuntan hacia la participación de citocinasproinflamatorias, como la IL-1β y el TNF-α, que demanera paracrina y autocrina pueden regular laproducción de esta enzima.5,6 A nivel local, el amnios,el corion, los trofoblastos y las células deciduales soncapaces de producir citocinas proinflamatorias y MMP-9 en condiciones basales.7,8,9

Debido a que la síntesis de estas moléculas no serealiza sólo en los casos en los que hay infección, sesugiere que su producción a este nivel depende deltrabajo de parto más que de la presencia de bacterias.Lo anterior postula que este suceso representa unproceso de carácter inflamatorio.10,11,12

Matériel et méthodes : on a récolté des échantillons de sang des compartiments maternel, de cordon ombilical et chorio-décidual eton a isolé les cellules mononucléaires. Quelques cellules ont été marquées avec des anticorps pour déterminer les sous-populations deleucocytes par cytométrie de flux ; d’autres ont été cocultivées pour 12 h avec des explants de membranes chorio-amniotiques. Aprèsla coculture, dans les cellules on a identifié MMP-9 par immunofluorescence et dans les surnageants on a déterminé IL-1β et TNF-α parELISA. On a réalisé trois expériences indépendantes par duplicata et on les a analysées avec le test U de Mann-Whitney.Résultats : même si l’on n’a pas trouvé des différences significatives dans les sous-populations de leucocytes entre les trois compartiments,la production de MMP-9 par les cellules mononucléaires a été majeure dans les chorio-déciduaux, comparée avec celle des cellulesmaternelles et du cordon ombilical. De la même façon, dans les cocultures avec des cellules chorio-déciduaux on a trouvé une quantitémajeure de IL-1β et TNF-α que dans celles des autres compartiments.Conclusions : dans le travail d’accouchement à terme, les sous-populations de cellules mononucléaires de l’espace chorio-décidual nesont phénotypiquement pas différentes des maternelles ou du cordon ombilical, mais elles le sont quant à la production de MMP-9, ce quisuggère que l’entourage des membranes chorio-amniotiques favorise la synthèse de cette enzyme et promue la dégradation du tissuconnectif.Mots-clé : rupture de membranes fœtales, chorio-décidual, micro-ambiance, MMP-9, IL-1β, TNF-α.

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En los estudios en que se identifica de manera másfina la fuente de citocinas y metaloproteasas en lasmembranas fetales y otros tejidos gestacionales se hapodido demostrar que la mayor parte proviene delinfiltrado leucocitario y no de las células locales, comoantes se creía.13,14 Los neutrófilos, macrófagos y linfocitosT, atraídos quizá por un aumento en la expresión demoléculas de adhesión, invaden la placenta, elmiometrio, el cuello uterino y las membranas fetales, loque coincide con incremento en la cantidad IL-1β, TNF-α y MMP-9 en esos tejidos.15,16,17

De esta manera, la caracterización fenotípica de losleucocitos que llegan al microambiente coriodecidual,sus perfiles de secreción de citocinas proinflamatorias,el MMP-9 durante el trabajo de parto y la roturaprematura de membranas resultan indispensables.

OBJETIVO

Identificar y determinar los atributos de la existenciade un microambiente específico en contacto con lasmembranas fetales en el que se acumulan componentesefectores celulares dirigidos a degradar loscomponentes de la matriz extracelular durante el trabajode parto.

TIPO DE ESTUDIO

Experimental, analítico, longitudinal y prospectivo.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestras biológicasLas muestras utilizadas en este estudio se obtuvieronen la unidad tocoquirúrgica del Instituto Nacional dePerinatología inmediatamente después del alumbra-miento, de mujeres con embarazo a término (37 a 40semanas de gestación) sin datos clínicos ni microbio-lógicos de infección y sin enfermedades. Las muestrasse transportaron al laboratorio en condiciones deesterilidad para ser procesadas durante la primera horadespués de su obtención.

Aislamiento de leucocitosLas muestras de sangre se obtuvieron de mujeres entrabajo de parto. Se extrajeron 10 mL de sangre

coriodecidual por drenado de los cotiledones de laplacenta, con lo que se tuvo una muestra representativade los leucocitos que estaban circulando localmente invivo. Además, se obtuvieron 10 mL de sangre periféricamaterna y 10 mL de sangre del cordón umbilical porpunción venosa. La sangre total se procesó con elreactivo Lymphoprep™ (Axis-Shield, Noruega), quesepara las células mononucleares mediante ungradiente de densidad.

Algunas de las células se procesaron de inmediatopara la citometría de flujo y otras se pusieron en cocultivocon explantes de membranas corioamnióticas.

Membranas corioamnióticasLas membranas se obtuvieron de mujeres sin trabajode parto. Se procesaron siguiendo la metodología yadescrita.5 Las membranas se cortaron cerca del sitio deunión a la placenta y se transportaron en medio deEagle modificado por Dulbecco con 1% de antibiótico-antimicótico. En el laboratorio se lavaron con soluciónsalina fisiológica en condiciones de esterilidad y sehicieron explantes de 1 cm de diámetro cuidando queno se separaran el amnios y el corion. Los explantes semantuvieron en cultivo durante 24 horas en medio deEagle modificado por Dulbecco, con 10% de suero fetalbovino, 1% de piruvato de sodio y 1% de antibiótico-antimicótico. Después de ese tiempo se sustituyó elmedio de cultivo por otro adicionado con 0.2% dehidrolizado de lactoalbúmina (DMEM + HLA) y sedejaron en las mismas condiciones de cultivo por otras24 horas antes de iniciar el cocultivo con las célulasmononucleares.

Tinción para antígenos de superficiePara la caracterización fenotípica de las células seutilizaron 10 µL de los siguientes anticuerposmonoclonales, marcados con diferentes fluorocromos(Immunotech, Francia), con el fin de encontrar lasdistintas subpoblaciones de leucocitos: CD3-PC5 paralinfocitos T, CD4-FITC para linfocitos T cooperadores,CD8-PE para linfocitos T citotóxicos, CD14-PE paramonocitos, CD56-PE para células NK y CD19-PC5 paralinfocitos B.

Las muestras se analizaron por citometría de flujoen un equipo Epics Altra de Coulter y el análisis de losdatos se hizo con el programa informático Expo.

Espacio coriodecidual como un microambiente rico en moléculas efectoras

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Cocultivo de leucocitos coriodeciduales con membra-nas corioamnióticasEn un pozo de placa de cultivo celular se colocó unexplante de membrana corioamniótica en 1 mL demedio de Eagle modificado por Dulbecco adicionadocon hidrolizado de lactoalbúmina y se puso encimaun inserto (Transwell®, Corning Inc., EUA) conmembrana transparente de policarbonato de 12 mm dediámetro y poros de 0.4 µm. En el interior del inserto sepusieron las células mononucleares en 1 mL de medioDMEM más HLA. Este sistema evita el contacto físicode las células y las membranas y permite lacomunicación por mediadores solubles.

El cocultivo se dejó en incubación durante 10 horas,a 37°C, con 5% de CO2. En ese tiempo se agregóbrefeldina A (Sigma, EUA), a una concentración finalde 10 µg/mL para impedir que las proteínassintetizadas por los leucocitos se liberaran al medio decultivo y así poder comprobar la producción de MMP-9. El cultivo se dejó en esas condiciones durante 2 horasmás para completar las 12 horas de cocultivo. Al cabode ese tiempo se colectaron las células mononucleares,que se procesaron para inmunofluorescencia de MMP-9, y los sobrenadantes de dentro y fuera del Transwell,que se juntaron y almacenaron a -20°C para despuéshacer las determinaciones de IL-1β y TNF-α por ELISA.

Inmunofluorescencia de MMP-9Se homogenizó el contenido de la parte interna delTranswell y se tomaron 10 µL de la suspensión decélulas para hacer un extendido sobre un portaobjetos.Después de secar al aire, las células se fijaron cincominutos con una mezcla v:v de metanol-acetona fríapara luego hacer un lavado con PBS-Tritón X-100 al0.2% para permeabilizarlas. Sin dejar que se secaranpor completo se adicionó un anticuerpo monoclonalanti MMP-9 (Oncogene, EUA) diluido, 1:500, y seincubaron durante 30 minutos, a 37°C en una cámarahúmeda. Después de repetir el paso del lavado seadicionó un anticuerpo secundario conjugado conFITC (Zymed Laboratories) diluido, 1:1000, y seincubaron en oscuridad durante el mismo lapso bajolas mismas condiciones. Por último, las preparacionesse lavaron con PBS, se tiñeron con azul de Evans, paracontrastar las células, y se montaron con bálsamo deCanadá para observarlas al microscopio confocal.

ELISA para IL-1βββββ y TNF-αααααLa determinación de estas citocinas se hizo conensayos de ELISA tipo emparedado creados en nuestrolaboratorio, se siguió la misma metodología para ambospero se utilizaron los anticuerpos respectivos para cadacitocina. En placas de 96 pozos se puso un anticuerpomonoclonal anti IL-1β o TNF-α y se incubó toda la nochea 37°C. Se lavaron las placas de 3 a 5 veces con PBS-Tween al 0.05%. Se bloquearon durante dos horas atemperatura ambiente con una solución de PBS con5% de sacarosa, 1% de albúmina sérica bovina y 0.05%de azida de sodio. Se volvieron a lavar y se pusieronpor un lado los estándares de proteína recombinante(0.001 - 0.5 ng/mL en el caso de IL-1β y 0.156 - 7.5 ng/mL de TNF-α) y por otro 100 µL de los sobrenadantesde los cocultivos homogeneizados. Se incubaron todala noche a 4°C. Se lavaron las placas y se puso unanticuerpo policlonal biotinilado que se incubó atemperatura ambiente durante dos horas. Después delavarse se incubaron con un conjugado de estrepta-vidina-fosfatasa alcalina durante 90 minutos, a 37°C.Se lavaron y finalmente se les agregó una solución dep-nitrofenilfosfato que se dejó durante 30 minutos, a37°C. La absorbancia se analizó con un lector de ELISAa 410 nm.

Análisis estadísticoPara el análisis estadístico de los datos se obtuvieronlas medias y desviaciones estándar y se buscaron lasdiferencias usando la prueba U de Mann-Whitney.

RESULTADOS

En el cuadro 1 se muestran los resultados de lacitometría de flujo realizada a las células mononu-cleares inmediatamente después de su obtención.

Los porcentajes de todas las subpoblaciones seencontraron dentro de los rangos de normalidad, deacuerdo con los valores de referencia para célulasmononucleares por citometría de flujo.18

La población de linfocitos T (CD3+) fue la másabundante en todas las muestras. Aunque losporcentajes de células CD4+ y CD8+ estuvieron dentrodel rango normal, la relación CD4/CD8, que por loregular es de dos células CD4+ por cada CD8+, sólo seobservó en la sangre periférica con trabajo de parto. En

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los demás casos hubo mayor cantidad de linfocitos Tcitotóxicos (CD8+) de lo esperado.

En los resultados de la citometría no se encontrarondiferencias estadísticamente significativas (p < 0.05)al comparar los porcentajes de las subpoblacionescelulares de los distintos compartimientos.

Sin embargo, la inmunofluorescencia para MMP-9(figura 1) reveló que la producción de esta enzima esmucho más abundante en las células provenientes delespacio coriodecidual, comparada con las muestras delcordón umbilical, donde hubo menor producción, ysobre todo con las células de la sangre materna, dondela existencia de esta enzima es prácticamente nula.

En los cocultivos, los controles demostraron que parala IL-1β (figura 2) las células mononucleares producenmayor cantidad de esta citocina que el explante demembrana corioamniótica y que dicha producción esmayor en el caso del ambiente coriodecidual, encomparación con el materno y el del cordón umbilical.

Para el TNF-α (figura 3) el explante de membranademostró que la capacidad de síntesis de esta citocinaes muy superior a la de las células mononucleares decualquiera de los tres compartimientos.

Sin embargo, en los sobrenadantes de los cocultivosse encontró que cuando las células se pusieron encontacto con la membrana hubo incremento en lasíntesis de ambas citocinas; éste fue mayor en loscocultivos con células coriodeciduales que en los quetenían células maternas o del cordón umbilical.

DISCUSIÓN

Los hallazgos más recientes en la bibliografíainternacional apuntan a que el trabajo de parto es unproceso de tipo inflamatorio que incluye la llegada de

un infiltrado leucocitario al entorno del espaciocoriodecidual y la consecuente secreción de citocinasy otras moléculas efectoras propias de una respuestade este tipo.

La MMP-9 es una enzima que degrada colágena dela matriz extracelular de las membranas y cuyaexpresión y actividad aumenta de forma selectiva conel trabajo de parto. Al analizar los perfiles deproducción de esta enzima pudo observarse que elespacio coriodecidual es el ambiente específico en elque se favorece dicha producción. El hecho de que sólose observe MMP-9 en las células del espacio coriode-cidual y, en menor medida, en las del cordón umbilical,pero no en las del ambiente materno, podría sugerirque las señales de la degradación de las membranascorioamnióticas efectuadas por esta enzima derivandel feto.

Se observó que los leucocitos mononucleares de lasangre del entorno coriodecidual no son distintosfenotípicamente de los que se encuentran en lacirculación materna o fetal, esto en cuanto a lasproporciones de las subpoblaciones medidas porcitometría de flujo.

Sin embargo, el análisis de dos citocinas proinflama-torias, como la IL-1β y el TNF-α, demostró que elprincipal aporte del TNF-α está a cargo de lamembrana, mientras que el de la IL-1β depende, enmayor medida, de las células mononucleares.

El hecho de que las cantidades de citocinas en elsistema de cocultivo no sean iguales a la suma de loproducido por las células y por el explante de maneraaislada sugiere que el contacto de las distintaspoblaciones celulares ejerce un efecto modulador en lasíntesis de moléculas efectoras. Además, al restar losvalores de los controles de las células y del explante a

Cuadro 1. Porcentajes de células mononucleares en sangre periférica materna, de cordón umbilical y coriodecidual

Materna Cordón Coriodecidual

Linfocitos T 43.23 ± 18.44 36.80 ± 15.42 39.27 ± 20.20Linfocitos T CD4 49.23 ± 12.79 40.63 ± 23.84 31.67 ± 10.35Linfocitos T CD8 23.50 ± 4.17 23.63 ± 3.67 26.30 ± 11.46Relación CD4/CD8 2.09 1.7 1.2Monocitos 24.30 ± 11.76 11.27 ± 12.03 10.27 ± 3.25Células NK 10.75 ± 1.06 10.30 ± 7.91 14.1 ± 2.40Linfocitos B 5.67 ± 0.92 9.73 ± 3.76 3.60 ± 3.41

Valores expresados como promedio ± desviación estándar.

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Figura 2. IL-1β secretada al medio en los distintos cocultivos de células mononucleares con membranas corioamnióticas. Los datosrepresentan el promedio.

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Explante Materna Cordón Coriodecidual

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Figura 1. Inmunofluorescencia para MMP-9. La MMP-9 se muestra teñida en color verde. A) Compartimiento materno. B) Compartimientofetal. C) Compartimiento coriodecidual.

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los datos del cocultivo se observó que en el caso delambiente materno las cantidades de IL-1β y TNF-αsecretadas al medio no difieren de los valores basales.No así en el caso del espacio coriodecidual y del cordónumbilical donde el incremento fue evidente.

Todo lo anterior sugiere que el entorno de contactocon las membranas corioamnióticas es un microam-biente específico en el que se entabla un diálogomolecular entre las células de dicho tejido y las quearriban al espacio coriodecidual, lo que da lugar a laacumulación de grandes cantidades de estas citocinas,que inducen la síntesis de MMP-9 y promueven ladegradación del tejido conectivo de las membranasfetales cuando el embarazo llega a término.

Ante estas pruebas es indispensable que los estudiosfuturos se orienten a caracterizar el aporte de citocinasproinflamatorias al microambiente coriodecidual porparte de las subpoblaciones leucocitarias específicas,así como la producción diferencial de MMP-9 paraidentificar su papel en la rotura de las membranascorioamnióticas.

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Explante Materna Cordón Coriodecidual

Células solas Cocultivo

Figura 3. TNF-α secretado al medio en los distintos cocultivos de células mononucleares con membranas corioamnióticas. Los datosrepresentan el promedio.

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El opio y sus derivados, el laudano en enemas, la morfina en inyecciones subcutáneas a la dosis de uncentigramo por centímetro cúbico hacen desaparecer la contracción y al mismo tiempo el dolor. Heobtenido resultados muy manifiestos de detención del parto, en casos de amenazas de parto prematuro,por la asociación de la morfina y atropina: un miligramo de sulfato neutro de atropina y dos centigramosde morfina, en inyección subcutánea, renovada diariamente.

Reproducido de: Fabre. Manual de obstetricia. Barcelona: Salvat Editores,1941;p:124.