Descobrindo genes de doenças humanas

Carolina MagalhãesDrielly Braite

Fernanda RodriguesFernanda Valiati

Mariana Brutschin

Profª Fabiana Seixas, Dra.

Histórico

1856 - Descoberta da Hereditariedade

Genética baseada no

melhoramento genético

Século XX

Histórico – Século XXGenética molecular Citogenética

Genética do desenvolviment

o

Genética do câncer

Genética comportamenta

l

Surgimento de novas técnicas de estudo genético

Histórico

Reconhecimento dos fatores genéticos na etiologia das doenças Genética clínica Área Promissora

2003 – Projeto Genoma Humano

Atualidades

• Imprintings Genômicos: As contribuições dos genomas materno e paterno podem variar e acarretar em doenças com fenótipos diferentes.

Diagnósticos de doenças

Tratar, prevenir ou curar doenças genéticas

Função e manifestação desses genes

Mecanismos de hereditariedade

Aconselhamento genético

Banco de dados

Por que estudar os genes?

Genômica• Ramo da genética que estuda a natureza física e o

funcionamento do material genético contido no conjunto de cromossomos de cada espécie

Genômica Estrutural• Determina a posição cromossômica e a sequência de

bases dos genes de diversas espécies, incluindo a humana.

• Contribui para a detecção de mutação nos genes humanos.

Genômica Funcional• Descreve as funções dos genes• Analisa como os genes estão sendo expressos ou

silenciados.

Aplicações da genômicaDesenvolvimento de testes para a detecção

de mutações gênicas

Exemplo:Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, que

determinam as variantes hereditárias dos cânceres de mama e ovário.

SUSCEPTIBILIDADE A DOENÇAS!

Saúde

MEDICINA

Doença

MEDICINA GENÔMICA PERSONALIZADA

Baseada em testes genéticos e análises moleculares que

permitem o conhecimento do mapa de predisposições genéticas

de cada indivíduo.

Genome-Wide Association Studies (GWAS)

Rápido escaneamento de marcadores em genomas de uma série de pessoas a fim de

encontrar variações genéticas associadas com uma doença em particular.

Bases para a Medicina Genômica Personalizada

GWAS

GWASLevantamento do genoma de cada

participanteBusca por variações

SNPs

Variações com maior frequência

em portadores

Variações “associadas” com a

doença

GWASVariações “associadas” podem

não causar diretamente a doença

É necessário o sequenciamento de DNA da região do genoma em particular, a fim de identificar a exata modificação genética

envolvida na doença. 

NHGRI GWA Catalogwww.genome.gov/GWAStudies

Published Genome-Wide Associations through 12/2010, 1212 published GWA at p<5x10-8 for 210 traits

Doenças Neurodegenerativas

Perda excessiva

dos neurônios

• Deterioração do tecido nervoso na substância

cinzenta do SNC

Neurônios são células do SN responsáveis pelo impulso elétrico

•Identificação quanto a causa – esporádica/incidência familiar.Diagnóstico

•Avaliação da estrutura dos componentes do DNA.

Diagnóstico Molecular

•Identificação das alterações dos genes ou marcadores biológicos suscetíveis a doença.

Investigação Molecular

•Contribuição para o estudo.•Alterações: Medula espinhal, músculos e nervos.

Patologia

Genes envolvidos com Doenças

Neurodegenerativas

Doença de Alzheimer

Doença neurodegenerativa

Progressiva

Irreversível

Afeta

prncipalment

e IDOSOS

Manifestações Clínicas:Perturbaçõe

s de memória

Declínio cognitivo

Distúrbios comportame

ntais

Perda de autonomia

IDADE

Fatores

ambientai

s

Eventos

genéticos

Grande problema de saúde pública!

• Afeta: cerca de 13% dos indivíduos com 65 anos ou mais 30 -50% dos indivíduos com 80 anos ou

mais

Neuropatologia:Placas amiloides, compostas por peptídeo

amiloide- β (Aβ) Emaranhados de neurofibrilas contendo

proteína Tau hiperfosforilada.

Genes associados à Doença de AlzheimerDA de início precoce DA de início tardio

APPPSEN1 ApoEPSEN2

5% do total dos casos de DA95% do total dos casos de

DA

APP (proteína precursora de amiloide)

Localização : 21q21.2

Identificação a partir da purificação dos depósitos de peptídeo amiloide da placa neural.

Apresenta 695 resíduos de AA, composto por 18 éxons.

APP

Peptídeo amilóde Aβ - 42

Peptídeo amilóde Aβ - 40

SECRETASES!

APP é uma proteína trans-membranaSua degradação anormal produz fragmentos peptídeos Aβ42 que se agregam e formam a

placa neural

MutaçõesMais de 32 mutações missense (não

silenciosa)Sítios de clivagem das secretasesDomínio trans-membrana nos éxons 16

e 17

V717I •maior produção do peptídeo Aβ• produção na

forma Aβ42

PSEN1 (Presensilina 1)Localização : 14q24.3

Apresenta 12 éxons e codifica para uma proteína com 467 aminoácidos.

São responsáveis pela clivagem da APP a partir da γ-secretase.

Mutações• Mais de 176 mutações na PSEN1 - maioria

missense.

Aβ42 / Aβ40

Defeitos em PSEN1 : formas mais graves de DApenetrância completa

início logo aos 30 anos de idade

L166P • Adolescência• Elevada

produção de Aβ42

PSEN2 (Presensilina 2)

Localização : 1q42.13

Possui 12 éxons que codificam para um peptídeo de 448 aminoácidos.

Mutações

• Apenas 14 mutações foram relatadas

I141NPerda do éxon 5

• Aumento  da  proporção  de 

Aβ42  sobre Aβ40

ApoE (Apolipoproteína E)Localização : 19q13.2 Composto por 4 éxons que codificam uma

proteína de 299 aminoácidos.

No éxon 4 há a presença de três

isoformas proteicasε2 (CIS/CIS); ε3

(CIS/ARG); ε4 (ARG/ARG)

Risco de desenvolver DA até os 85 anos:4/ 4 55%3/ 4 27%3/ 3 9%

ApoE 4 principal fator de risco para desenvolvimento da doença, representado em excesso nos indivíduos com DA.

A herança de um ou dois desses alelos eleva até 5x a probabilidade de desenvolvimento da

doença!

Descobertas recentes:

GWAS - genome-wide association study

Procura por SNPs

Genoma de indivíduos

portadores da doença

Genoma de indivíduos normais

Consórcio genético da doença de Alzheimer (ADGC) reuniu banco de dados de 9 coortes a partir dos 29

Institutos Nacionais do Envelhecimento (NIA)

Nesse estudo foram identificados os genes MS4A4A, CD2AP, EPHA1, CD33 que são fatores de risco para a DA e comprovada a associação de genes

anteriormente descobertos.

Até o momento foram confirmados então 10 genes envolvidos com a DA

de início tardio (ApoE, CR1, CLU, PICALM, BIN1, EPHA1, MS4A, CD33,

CD2AP e ABCA7)

Diagnóstico Molecular

GENOTIPAGEM de ApoE

Um dos potenciais terapêuticos para o tratamento da DA seria a diminuição da produção ou o aumento da degradação do

peptídeo beta-amiloide.

Monócitos foram modificados geneticamente para expressar a enzima neprilisina (NEP) que é capaz de degradar esse peptídeo

beta-amiloide.

Terapia Gênica

Doença de HuntingtonDoença neurodegenerativa

hereditáriaAutossômica dominante com

penetrânciaCompleta5 a 10 casos por 100.000 habitantes

Entre 35 e 50 anos

Movimentos involuntários e

anormais

Distúrbios psiquiátricos

Deterioração progressiva das funções cognitivas

Demênciadepressão

transtorno obsessivo-compulsivo

ansiedade

Manifestações Clínicas

Raciocínio Lento

Dificuldade de concentração, organização,

decisão

Perda de Memória

Corpo estriado Problemas com o movimento

Córtex Problemas emocionais, cognitivos e psiquiátricos

Genes AssociadosMutação região 4p16.3

Gene IT15, extremidade 5’repetições de trinucleotídeo

Glutamina

Mutação instável – pai afetadoNúmero de Poliglutaminas Idade de

manifestaçãoFenômeno de antecipação raro – 60-70

repetições

Antecipação genética

http://portaldoprofessor.mec.gov.br/storage/recursos/10111/antecipacao_genetica.

swf

Gene IT151983 – análise de ligação, sonda G8

Primeiro gene responsável por doença

localizado em humanosCodifica huntingtina

HuntingtinaPresente em vários tecidos do corpo Cérebro

Cérebro: quase exclusiva do citoplasma neuronal axônios, dendritos e corpo celular

Possíveis funções na célula:Migração vesicular e de exocitose de substâncias

neurotransmissores e enzimas

Mecanismos anti-apoptóticos

Huntingtina Normal

Huntingtina DH

35 resíduos CAG

+38 resíduos CAG

Citoplasma Neuronal

Núcleo Neuronal

X

Alteração da função normal

Interações

Celulares

Proteína Mutante

Cito-toxicidad

e

Doença de Huntington

Hunting-tina Sp1 TAFII1

30

Hunting-tina

Sp1 TAFII130

Expressão genes para

transmissão neuronal

Genes não são expressos

Degradação e

mudanças na função neuronal

Huntingtina NormalSequestra elementos

repressores de transcrição

BDNF é transcrito normalmente

* Outros genes neuronais são

transcritos normalmente

Huntingtina DHCapacidade de

reter elementos repressores é

diminuídaBDNF e outros

genes neuronais não são transcritos

Redução dos genes neuronais

Huntingtina + Proteínas do citoesqueleto

Permite circulação de vesículas nos microtúbulos

Huntingtina DH + Proteínas do citoesqueletoInterações mais fortes

Reduz o transporte de vesículas nos microtúbulos

Fortes interações com HAP-1 Morte Celular

Disfunção e morte neuronal precoce

Perda do suporte neurotrófico da

BDNF do neurônio cortical para o

estriado

Disfunção Mitocondrial

Agregados da proteína:

citoplasma e núcleo

Reciclagem Vesicular alterada

Aumento da autofagia

Transporte Axonal

Prejudicado

Desregulação transcricional

DH

Tratamento

Abordagens do Artigo

Repressão da Huntingtina mutante

através de RNAi

Atrasar ou Impedir início dos sintomas

em DH

RNAi induzido por RNAs hairpin curto (shRNAs) a fim de reduzir a expressão de htt mutante e melhorar as anormalidades  associadas a DH

em um modelo de camundongo transgênico da doença.

RNAi direcionado contra o gene que codifica

HuntingtinaReduz RNAm

Reduz expressão da proteína em culturas de células e em células do

cérebro do rato

Melhora nas anormalidades

comportamentais e neuropatológicas

Terapias com RNAi possui potencial para o tratamento de DH

Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)Doença de Lou Gehrig ou Doença de Charcot

Cãibras e tremores musculares

Atrofia dos membros superiores e inferiores

Perda de força muscular

Manifestações clínicas

Eletroneuromiografia (EMG)

Espirometria

Ressonância Magnética

Coleta do líquido cefalorraquidiano

Diagnóstico

Genes envolvidos com a ELA

Principais genes estudados

SOD1

FUS/TLS

TARDBP

13 regiões do genoma

denominadas

ALS

Apenas 10% da doença

tem caráter genético

Região ALS1: SOD1Função: Enzima Superóxido Disumutase - enzima antioxidante - conversão de íons superóxido em peróxido de hidrogênio

Mutação: gera proteína com função altamente tóxica – incapacidade de dimerizar Cu e Zn

Localização: braço longo do cromossomo 2

Região ALS6: FUS/TLSFunção: regulação de como os RNAs mensageiros são criados, modificados e transportados para produzir as proteínas

Mutação: proteína encontrada aglomerada fora do núcleo – efeito tóxico

Localização: cromosssomo 16

Região ALS10: TARDBPFunção: produz proteína TDP43 relacionada a regulação da expressão gênica

Mutação: aglomerados da proteína tóxicos ou ligada a grupos for a do núcleo – apoptose dos neurônios

Localização: braço curto do cromossomo 1

Terapia GênicaEstudos realizados com camundongos

transgênicos que expressam o gene SOD1 contendo a mutação G93A.

Utilizou-se RNAi para impedir a tradução dos mRNA não ocorrendo a produção da proteína de conformação errada.

Essa técninca utilizou como vetor os Lentivírus e obersevou-se como resultado um retardo do início dos sintomas da ELA.

Outros genes envolvidos…

Doença de Parkinson

2ª doença neurodegenerativa mais comum

Afeta principalmente idosos> 50 anos de idadePrevalência aos 65 anos

Doença de Parkinson

Crônica Progressiva Perda de neurônios dopaminérgicos da substância cinzenta do SNC.

dopamina SINTOMAS MOTORES

DISTÚRBIO DO SISTEMA MOTOR

Diagnóstico

Tratamento

Característica morfológicaCorpos de Lewy

Tratamento por controle dos sintomas

Manifestações ClínicasApós perda de 60% dos neurônios e diminuição de

80% da produção de dopaminaTremor

Rigidez dos membros e do tronco;

Bradicinesia ou lentidão dos movimentos;

Instabilidade postural

Diminuição do equilíbrio e da coordenação.

CausasAção de neurotoxinas

ambientais

Produção de radicais livres

Anormalidades mitocondriais

Envelhecimento cerebral

Predisposição genética

IDIOPÁTICA

Susceptibilidade genéticaForma esporádica

95% dos casos

Etiologia multifatorial

Fatores genéticos + ambientais

Forma familiar

5% a 10% dos casos

Histórico familiar

Fatores genéticos

Autossômica

dominante

Autossômica

recessiva

Genes envolvidos Alfa-

sinucleína (SNCA)

Parkin UCH-L1

PINK-1 DJ-1 LRRK2

GBA ATP13A2

Alfa-sinucleína

(SNCA)

UCH-L1Parkin

SNCAPARK 1 – SNCA4q21.3Herança: autossômica dominante Codifica para a alfa-sinucleína

Proteína pré-sináptica140 a.aPrincipal componente dos corpos de Lewy

SNCAMutações: A53T e A30P

Impedem degradação protéica pela alfa-sinucleína

Ligação de protofibrilas em vesículas sinápticas

Excesso de dopamina no citosol

MUTAÇÕES

Agregados protéicos

intracelulare

s (Corpos de

Lewy)

Células

dopaminérgicas prejudicad

asA presença de alfa-sinucleína, ubiquitina e subunidades proteassômicas nos corpos de Lewy

sugerem o envolvimento da alfa-sinucleína na etiologia da disfunção do complexo ubiquitina-

proteassoma na DP, o qual é essencial para a

degradação de proteínas danificadas.

SNCA

ParkinPARK 2 – Parkin

6q25.2-27

Mutações são comuns

50% dos casos de DP

Herança: autossômica recessiva

Mutações

95 já identificadas

• 40 rearranjos de éxons• 28 deleções• 14 multiplicações

• 43 SNPs• 12 inserções e deleções

Mutações mais frequentes:

• deleção do éxon 2, 3 e 4• mutações nos éxons 2 (255/256delA) • mutação pontual no éxon 7 (924C>T)

ParkinCodifica para a parkina (ubiquinona)

Envolvimento na via ubiquitina-proteassoma

Presente nos corpos de Lewy

Domínio RING

UBIQUITINA –LIGASE E3

MUTAÇÕES

UCH-L1PARK 5 – UCH-L1

4p14

Herança: autossômica dominante

Codifica para a enzima hidrolase L1 ubiquitina carboxiterminal

UCH-L1Enzima deubiquitinizante

Novos processos de ubiquitinação de proteínas danificadas

MUTAÇÕES

Outros genes envolvidosLocus Localização

cromossômicaGene Padrão de herança

PARK 1 4q21.3 Alfa-sinucleína AD

PARK 2 6q25.2-27 Parkin AR

PARK 3 2p13 - AD

PARK 4 4p15 - AD

PARK 5 4p14 UCH-L1 AD

PARK 6 1p35-p36 PINK-1 AR

PARK 7 1p36 DJ-1 AR

PARK 8 12p11.2-q13.1 LRRK2 AD

PARK 9 1p36 ATP13A2 AR

PARK 10 1p32 -

PARK 11 2q36-q37 - AD

5 novos genes

5 novos genes

Meta-análise de sequências variantes de cinco estudos GWAS da doença de Parkinson dos EUA e Europa

• investigar as associações de loci previamente identificados e identificar novos loci de risco para a doença• avaliar as consequências biológicas de variantes de risco identificadas, como SNPs• Examinar a associação de alelos variantes, tanto com a expressão gênica quanto com a metilação do DNA.

Objetivos:

Diagnóstico molecular

É recomendada a realização de testes genéticos para a identificação de mutações no gene parkin em pacientes

nos quais a doença tiver início antes dos 30 anos de idade.

Terapia gênica

BibliografiaTobin A.J; Signer, E.R. Huntington’s disease: the challenge for

cell biologists. Trends Cell Biol. 2000 Dec;10(12):531-6.Li SH, Li XJ. Huntingtin-protein interactions and the

pathogenesis of Huntington’s disease. Trends Genet. 2004 Mar;20(3):146-54.

 Nasir, J; Goldberg ,Y.P; Hayden M.R. Huntington disease: new insights into the relationship between CAG expansion and disease. Hum Mol Genet. 1996;5 Spec No:1431-5.

Lynn M. ; Genetics of Alzheimer Disease; J Geriatr Psychiatry Neurol. 2010 December ; 23(4): 213–227. doi:10.1177/0891988710383571.

Bird, T. ; Genetic Aspects of Alzheimer Disease; Genet Med. 2008 April ; 10(4): 231– 239. doi:10.1097/GIM.0b013e31816b64dc.

Obrigado!