Central Lechera Asturiana, estudio de producto Naturcol

EVALUACIÓN DE PRODUCTOS DE NUEVA FORMULACIÓN CON ESTEROLES INCORPORADOS, APLICABLES A CONTROLAR TRASTORNOS METABÓLICOS ASOCIADOS CON FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULAR

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EVALUACIÓN DE PRODUCTOS DE NUEVA FORMULACION CON ESTEROLES INCORPORADOS, APLICABLES A CONTROLAR TRASTORNOS METABOLICOS

ASOCIADOS CON FACTORES DE RIESGO CARDIOVASCULAR

Informe Final Junio de 2004

Facultad de Ciencias Experimentales y de la Salud Universidad San Pablo-CEU DEPARTAMENTOS PARTICIPANTES Departamento de Fisiología, Morfología y Ciencias de la Alimentación (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética) Departamento de Biología Celular, Bioquímica y Biología Molecular (Sección de Bioquímica y Biología Molecular) EQUIPO INVESTIGADOR Gregorio Varela Moreiras (Coordinador) Elena Alonso Aperte (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética) Gonzalo Martín Peña (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética y Hospital General de Móstoles) Henar Ortega (Sección de Bioquímica y Biología Molecular) María García de Pablo (Sección de Bioquímica y Biología Molecular) María Achón y Tuñón (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética) Ángela García González (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética) Ángeles Arrate García (Sección de Nutrición, Bromatología y Dietética) 1. DISEÑO EXPERIMENTAL

El Proyecto consta de una parte de Análisis sensorial, en la que se pretende evaluar las características organolépticas y la aceptación de una leche experimental, y una parte de ensayo en voluntarios, en la que se pretende evaluar el efecto del consumo de la leche experimental. Las voluntarias se constituyeron en un grupo de mujeres en menopausia, en las que se evaluó el efecto del consumo de la leche experimental sobre el perfil de los principales lípidos sanguíneos y otros factores de riesgo cardiovascular, así como factores nutricionales, antropométricos y dietéticos relacionados.

1.1. ANÁLISIS SENSORIAL

Se reclutaron un total de 102 catadores cuyo único requisito era ser consumidor habitual y comprador potencial del producto a ensayar. Se realizaron dos tipos de pruebas:

- Pruebas discriminativas: para ver si los consumidores diferencian la leche enriquecidas frente a la no enriquecida.

- Pruebas afectivas: el consumidor, en este tipo de pruebas, expresa su reacción subjetiva ante el producto, indicando si le gusta o le disgusta, si lo acepta o lo rechaza.


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1.2. ENSAYO EN VOLUNTARIOS SUJETOS SELECCIONADOS Y CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Las mujeres candidatas a participar en el estudio fueron mujeres sanas que acudieron a la consulta de menopausia del Hospital de Móstoles donde el/la Ginecólogo/a les informó brevemente de la posibilidad de participar en el mismo y les facilitó la hoja de información tras lo que se les remitió al Dr. Martín Peña quien les explicó la finalidad del estudio, la posibilidad de participar en el mismo y el calendario de pruebas analíticas.

Se reclutaron 25 mujeres postmenopaúsicas sanas, con edades comprendidas entre 25

y 65 años, a través de los médicos participantes en el estudio, seleccionadas tras examinar los criterios de inclusión/exclusión correspondientes. Del total de participantes reclutados una mujer reclutada en el mes de Julio rechazó en el mes de Septiembre participar en el estudio, y otra abandonó el mismo a los 15 días por problemas familiares. En total el estudio se extendió desde los meses de Julio a Diciembre de 2003.

Criterios de Inclusión. Fue necesario la ausencia de criterios de exclusión y la firma del consentimiento informado.

Criterios de Exclusión. Presencia de alguna de las siguientes enfermedades y/o condiciones:

- Historia clínica compatible con intolerancia a lactosa. - Aversión a la leche - Alergia a los productos lácteos - Colesterol sérico < 220 mg/dl - Colesterol sérico >260 mg/dl - Triglicéridos > 200 mg/dl - Cardiopatía isquémica o enfermedad compatible con arteriosclerosis - Insuficiencia cardiaca - Insuficiencia respiratoria - Apnea del sueño - Diabetes mellitus tipo I o tipo II - Hipotiroidismo - Síndrome nefrótico o enfermedad renal crónica - Hepatopatía crónica - Hepatitis aguda - Enfermedad del tejido conectivo - Fibromialgia - Trastornos de la conducta alimentaria - Bajo peso: IMC < 20 - Obesidad con IMC >30 - Enfermedad ósea degenerativa con IMC>25 - Bypass gástrico - Gastrectomía - Síndrome de colon irritable - Enfermedad inflamatoria intestinal - Enfermedades que cursen con malabsorción


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- Infección por HIV conocida (no se realizará determinación de HIV) - Fumadora activa - Alcoholismo - Gammatía monoclonal - Mieloma - Linfoma - Cáncer tratado en los 5 años anteriores - Enfermedades neurológicas que cursen con demencia o déficit neurológico que impida

acudir al hospital - Tratamiento farmacológico con Anticoagulantes orales, Tiacidas, Betabloqueantes,

Ciclosporina, Glucocorticoides, Resincolestinamina, Estatinas, Fibratos, Colestipol, Estrógenos, Progestágenos, Esteroides anabolizantes

Violación de los criterios de inclusión. Los criterios de inclusión se respetaron de

manera explícita.

Tratamientos concomitantes permitidos y prohibidos. Se permitió a los pacientes tomar cualquier medicación concomitante que precisaron, excepto la especifica en los criterios de exclusión. DESARROLLO TEMPORAL DEL ESTUDIO

El estudio constó de una fase de inclusión de una semana, seguido de tres periodos de un mes cada uno en que se utilizó la leche con fitoesteroles el primer y tercer mes con un mes de lavado entre ambos meses experimentales.

Fase de selección A las mujeres incluidas en el estudio se les realizó en la semana siguiente a la

inclusión en el mismo: - Historia clínica completa. - Estudio Antropométrico - Evaluación del estado nutricional mediante el estudio cualitativo y cuantitativo de la

dieta a través de un Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos, de tipo general, validado y Encuesta Recuerdo de 24 horas. Se incluyeron, además, los items necesarios para cuantificar el consumo de alimentos de tipo funcional.

- Dos determinaciones analíticas separadas en un intervalo de una semana, que se analizaron en los laboratorios de la Universidad San Pablo CEU. En el caso de que el sujeto se ajustase a los parámetros bioquímicos antes indicados, la muestra se identificó como control 0 o inicial.

Primer periodo: Periodo experimental con suplementación de 3 g/día de

fitoesteroles: duración 28 días Las mujeres seleccionadas recibieron en su domicilio la leche correspondiente al

primer periodo de estudio (leche enriquecida con fitoesteroles, 30 envases de 750 ml, junto con un vaso dosificador de 250 ml), indicándoles la pauta de ingesta: diariamente 3 tomas de 250 ml en desayuno, comida y cena durante un mes. A los 14 días se les citó en la consulta para evaluar la adherencia al tratamiento a través del número de envases consumidos y


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detectar posibles efectos adversos. En el día 28 del estudio se realizó un nuevo estudio dietético a través de Encuesta Recuerdo de 24 horas, evaluación antropométrica y una nueva extracción de sangre que se procesó en los laboratorios de la Universidad San Pablo CEU, identificada como control 1.

Segundo periodo: Periodo de lavado o Periodo de leche sin fitoesteroles: duración 28 días

Tras completar el periodo de estudio con la leche enriquecida con fitoesteroles, las voluntarias recibieron en su domicilio la leche de la segunda fase de estudio (leche control, 30 bricks de 750 ml, junto con un vaso dosificador de 250 ml), así como las indicaciones de administración: 3 tomas diarias de 250 ml cada una repartidas en desayuno, comida y cena durante un mes. A los 42 días desde su inclusión en el estudio se les citó en la consulta para evaluar la adherencia al tratamiento, cuantificado por número de envases consumidos y detectar posibles efectos adversos. En el día 56 desde su inclusión en el estudio se realizó un nuevo estudio dietético a través de Encuesta Recuerdo de 24 horas, evaluación antropométrica y una nueva extracción de sangre, para su procesamiento en los laboratorios de la Universidad San Pablo CEU.

Tercer periodo: Periodo experimental con suplementación de 3 g/día de fitoesteroles: duración 28 días

Tras completar el periodo de lavado con la leche libre de fitoesteroles, los voluntarios recibieron en su domicilio la leche de la tercera fase de estudio (leche enriquecida con fitoesteroles, 30 envases de 750 ml, junto con un vaso dosificador de 250 ml), así como las indicaciones de administración: 3 tomas diarias de 250 ml cada una repartidas en desayuno, comida y cena durante un mes. A los 70 días desde su inclusión en el estudio se les citó en la consulta para evaluar la adherencia al tratamiento, cuantificado por número de envases consumidos y detectar posibles efectos adversos. En el día 84 desde su inclusión en el estudio se realizó un nuevo estudio dietético a través de Encuesta Recuerdo de 24 horas, evaluación antropométrica y una nueva extracción de sangre, para su procesamiento en los laboratorios de la Universidad San Pablo CEU.

En síntesis, el diseño experimental queda reflejado en el siguiente esquema:

Entre las medidas para garantizar y valorar el cumplimiento, el investigador o un miembro autorizado del equipo estimó el cumplimiento del paciente en cada visita, fundamentalmente a través de la recogida de los tapones de los envases y corroborando la información en las encuestas dietéticas.

Ingesta de leche desnatada con fitoesteroles

Ingesta de leche desnatada

Ingesta de leche desnatada con fitoesteroles

Inicial Fitoesteroles Lavado Fitoesteroles IIDía 0 28 56 84


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2. MATERIALES Y MÉTODOS


Se realizaron dos tipos de pruebas: A. Pruebas discriminativas: Con el fin de evaluar si los consumidores diferencian la

leche enriquecida frente a la no enriquecida. Concretamente se realizaron dos tipos de pruebas.

- Prueba triangular: se presentaron tres muestras, de las cuales dos eran iguales y se les pidió que identificaran la muestra diferente.

- Prueba duo-trío: Se presentaron tres muestras, de las cuales dos eran iguales. Una de las iguales se presentó como patrón y se les pidió que determinaran cuál de las otras dos es idéntica al patrón.

B. Pruebas afectivas: El consumidor, en este tipo de pruebas, expresa su reacción

subjetiva ante el producto, indicando si le gusta o le disgusta, si lo acepta o lo rechaza. Realizados dos tipos de pruebas.

- Pruebas de preferencia: se les presentaron dos tipos de muestras, una de leche desnatada enriquecida y otra de leche desnatada no enriquecida y se les pidió que indicaran cuál de las dos preferían.

- Pruebas de medición del grado de satisfacción: se les presentó una muestra de leche desnatada enriquecida y se les pidió que valorasen una serie de descriptores, característicos de cada atributo, de la leche según la normativa de la International Dairy Federation [1].

2.2. ENSAYO EN VOLUNTARIOS PRUEBAS ANALÍTICAS EN SANGRE

Obtención de las muestras

La sangre se recogió por venopunción tras ayuno de 8 horas, en tubos Vacutainer con EDTA-Na2 (1 mg/ml, concentración final), como anticoagulante y quelante de cationes divalentes libres. Desde este momento, y durante su manipulación, las muestras se mantuvieron en baño de hielo. El plasma se separó del componente celular por centrifugación a 3000 g durante 20 minutos a 4ºC y se dividió en distintas alícuotas según las determinaciones a realizar, guardándose a -80ºC hasta el momento de su análisis. El tiempo que transcurrió desde la obtención de la muestra hasta la separación del plasma fue inferior a 2 horas para evitar la degradación de determinados analitos [2]. Aunque se ha descrito que la purificación de las lipoproteínas a partir de plasma congelado a -80ºC, no modifica la estructura de las mismas [3-4] la alícuota de plasma destinada a la purificación de lipoproteínas se procesó inmediatamente.

Aislamiento de las lipoproteínas

Las lipoproteínas se obtuvieron por ultracentrifugación secuencial en equilibrio de densidad a partir de plasma fresco (sin congelar) [5-6]. Para ello, la densidad del plasma se fue ajustando a cada una de las densidades límite entre las diferentes familias de


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lipoproteínas, de manera que al ultracentrifugar floten solamente aquellas cuya densidad sea menor a la que se ajustó el plasma. Brevemente, por ultracentrifugación del plasma a su densidad normal (d=1,006) durante 2 horas a 100.000 rpm, se obtienen los quilomicrones, si los hubiera, y las VLDL. El infranadante de la anterior centrifugación se ajusta con KBr a una densidad de 1,063 g/ml y se somete a centrifugación durante 3 horas y 100.000 rpm, lo que permite separar las LDL. Finalmente, el infranadante resultante se lleva a una densidad de 1,215 g/ml para obtener las HDL; en esta ocasión, el proceso de ultracentrifugación se prolonga durante 6 horas, tiempo necesario para lograr una buena separación entre las HDL y el resto de los componentes plasmáticos. Para minimizar la oxidación de las mismas durante su purificación y en consecuencia su composición lipídica, todas las soluciones utilizadas contuvieron EDTA 1mmol/L [7-8].

Valoración de los lípidos plasmáticos

La concentración de colesterol total, colesterol libre, triglicéridos y fosfolípidos, tanto en el plasma como en cada una de las fracciones lipoproteícas purificadas, se determinó a través de métodos enzimáticos (Spinreact). La concentración de colesterol esterificado se estimó como la diferencia entre el colesterol total y el colesterol libre (Wako). El colesterol unido a HDL se determinó mediante precipitación con ácido wolfrámico y la concentración de colesterol unido a LDL se estimó a partir de la fórmula de Friedewald ( cLDL=CT-(TG/5)-cHDL (mg/dl) [9]. En todas las valoraciones, la variación inter-ensayo se controló a través de sendos plasmas control de alta y baja concentración (Spinreact).

Valoración de vitaminas

La concentración de vitaminas liposolubles A y E se evaluó mediante HPLC en gradiente y detección por UV/visibles, siguiendo el método descrito [10]. Se determinaron concentraciones plasmáticas de retinol y retinol palmitato (vitamina A), β-caroteno (carotenoide provitamina A), licopeno (carotenoide no provitamina A) y α-tocoferol y γ-tocoferol (vitamina E). Los resultados se validaron empleando en cada análisis el suero control Standard Reference Materials NIST.

Ácido Fólico. Las muestras fueron analizadas mediante una técnica de inmunoanálisis

quimioluminiscente de micropartículas (CMIA) de proteína folato-ligante para la determinación cuantitativa de folato en plasma, utilizando un analizador ARCHITECT system (Abbott).

Valoración de otros marcadores de riesgo cardiovascular

Homocisteína. Todas las muestras fueron analizadas mediante la técnica de inmunoensayo automático basado en la fluorescencia polarizada y que utiliza un anticuerpo monoclonal contra S-adensilhomocisteína [11], utilizando un analizador IMx (Abbott). La sensibilidad del ensayo es de < 0,50µmol/L.


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PRUEBAS DE ANTROPOMETRÍA

Se han realizado las siguientes medidas y pruebas antropométricas:

- Peso y altura: se realizaron las medidas en una báscula romana con tallímetro incorporado, con precisión de 200g para el peso y de 1mm para la altura. La altura de vertex se realizó con el sujeto descalzo, en bipedestación, con los talones juntos y plano de Frankfurt en posición horizontal.

- Indice de masa corporal: se determinó a partir de éstas de acuerdo a la fórmula de Quetelét.

[ ]2)()(

malturaKgpesoIMC =

El Índice de masa corporal es el mejor indicador de la relación peso –altura y los valores de referencia utilizados son los establecidos por la OMS [12]:

Obesidad IMC>30 Sobrepeso 25<IMC<29,9 Normal 20<IMC<24,9 Desnutrición IMC<19,9

- Composición corporal: para determinarla se realizaron las siguientes medidas:

Pliegues subcutáneos: Todos los pliegues se midieron en la parte no dominante del cuerpo, mediante lipocalibre de presión constante 10 g/mm2, tipo Holtain, precisión 2 mm. o Pliegue tricipital: se mide en el punto medio entre el borde inferior del

acromion y el olécranon, en la cara posterior del brazo. o Pliegue bicipital: se mide en la cara anterior del brazo a nivel del punto medio

sobre el vientre del músculo bíceps. o Pliegue subescapular: se mide en la zona inmediatamente por debajo del borde

de la escápula, siguiendo una línea imaginaria que forme un ángulo de 45º con la columna vertebral.

o Pliegue suprailíaco: se mide en la línea media axilar por encima de la cresta ilíaca anterosuperior.

o Pliegue suprailíaco espinal: se mide 2 cm superior a la espina ilíaca anterior, haciendo un ángulo de 45º con la línea medioaxilar.

Con estos pliegues y utilizando la fórmula de Durnin Womerley [13], se estimó el porcentaje de grasa corporal total

( )∑×

×

SPIESUB,BT, PT,log 0,074 -1,7665 =(varon) d

1004,5-d

4,95 =GC%


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GC: grasa corporal total PT: pliegue tricipital (mm) BT: pliegue bicipital (mm)

SUB: pliegue subescapular (mm) SPIE: pliegue suprailíaco espinal (mm)

Circunferencias: se tomaron con una cinta métrica inextensible, de fibra de vidrio. Recogimos las siguientes medidas: o Circunferencia de la cintura: se mide en el punto medio entre el último borde

costal y la cresta ilíaca, aplicando la cinta métrica horizontalmente. o Circunferencia de la cadera: se mide en el punto de máxima circunferencia

sobre las nalgas. o Circunferencia del brazo: se mide en el punto medio entre el borde inferior del

acromion y el olécranon. El brazo debe de estar relajado y con el codo formando un ángulo de 90º

o Circunferencia de la muñeca: se mide donde se dobla, distal al proceso estiloide, en el brazo derecho.

Se calculó el Índice Cintura/ Cadera a efectos de determinar si el acumulo de grasa era de patrón central (ICC > 0,80) o periférico [14]. ESTUDIO DE LA DIETA

En el momento de comenzar el estudio, se realizó a todas las mujeres participantes un cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos de tipo general (Cuestionario adaptado de Martín Moreno [15]) con especial énfasis sobre el consumo de alimentos enriquecidos y/o fuente de fitoesteroles y una Encuesta recuerdo de 24 horas. En cada visita se realizó asimismo una Encuesta recuerdo de 24h. Todas las encuestas dietéticas se realizaron mediante entrevista personal.

El consumo de alimentos se transformó, a través del programa informático

Alimentación y Salud diseñado por José Mataix Verdú y comercializado por ASDE informática (versión 0698.0406), en ingesta de nutrientes para poder compararlos con las ingestas recomendadas y los objetivos nutricionales [16-19]. 2.3. TRATAMIENTO DE DATOS

El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS v. 11.5. Se determinaron parámetros descriptivos de centralización, dispersión y la normalidad de la distribución de cada variable, mediante la prueba de Kolomogorov-Smirnov. Los resultados se compararon mediante la aplicación de la T de Student para datos apareados y prueba de Wilcoxon, en aquellas variables cuya distribución era no normal. Las pruebas de análisis sensorial fueron

( )∑×

×

SPIESUB,BT, PT,log 0,0717 -1,1567 =(mujer) d

1004,5-d

5,01 =GC%


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analizadas mediante pruebas de χ2 . Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p<0,05. 3. RESULTADOS


Se han realizado las pruebas sensoriales en una muestra total de 102 catadores, cuyo único requisito era ser consumidor habitual y comprador potencial del producto a ensayar. A continuación se muestran los resultados obtenidos en las pruebas discriminativas, cuyo objetivo es evaluar si los consumidores son capaces de diferenciar la leche enriquecida con fitoesteroles de la no enriquecida. En las siguientes tablas se muestran los resultados considerando el panel total de catadores, clasificándolo en cuanto a su forma habitual de consumo de leche y teniendo en cuenta el sexo. No se llega a alcanzar el número de respuestas mínima necesario para establecer una diferencia estadísticamente significativa en ninguno de los casos. Por tanto, concluimos que el panel de catadores no logra diferenciar el tipo de leche que se les presenta. Tabla 1. Pruebas Discriminativas. Resultados del panel de catadores total (102 catadores)

Prueba Triangular Prueba Duo-Trío NºRespuestas 102 102 NºRespuestas correctas 30 31

NºRespuestas para exista diferencia significativa 43 59

Tabla 2. Pruebas Discriminativas. Resultados en función de la forma de consumo habitual de leche

Prueba Triangular Prueba Duo-Trío Toman leche solaNo toman leche solaToman leche solaNo toman leche sola

NºRespuestas 41 61 41 61 NºRespuestas correctas15 15 17 14 NºRespuestas para exista diferencia significativa

19 28 26 37

Tabla 3. Pruebas Discriminativas. Resultados en función del sexo

Prueba Triangular Prueba Duo-Trío Hombres Mujeres Hombres Mujeres

NºRespuestas 26 76 26 76 NºRespuestas correctas 5 25 7 24NºRespuestas para exista diferencia significativa 13 32 18 43


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En ningún caso se observan diferencias significativas, por tanto nuestro panel de catadores no logra diferenciar los dos tipos de leche.

Las pruebas afectivas pretenden valorar la reacción subjetiva del consumidor al

producto ensayado. En la Gráfica 1 se representa la preferencia de los catadores al presentarles la leche adicionada de fitoesteroles y la leche sin adición de los mismos. En conjunto se observa una marcada preferencia hacia la leche adicionada de fitoesteroles, siendo ésta estadísticamente significativa especialmente en la valoración del aspecto y el color. Gráfica 1. Pruebas Afectivas de Preferencia: Leche desnatada enriquecida frente a leche desnatada no enriquecida

Leche desnatada enriquecida vs Leche desnatada no enriquecida

0

20

40

60

80Sabor

Color

Olor

Aspecto

Enriquecida No enriquecida

En las pruebas de medición del grado de satisfacción, se les presentó a los catadores una muestra de leche desnatada enriquecida con fitoesteroles y se les pidió que valorasen una serie de descriptores, característicos de cada atributo de la leche según la normativa de la International Dairy Federation nutricionales [1]. Los resultados se muestran en las siguientes gráficas. A la hora de valorar el olor de la leche en estudio destaca “el olor a leche pero a otro olor diferente”, junto con un “olor a nada” o “no claro”. En cuanto al sabor, se ve una tendencia clara a decir que les recuerda al “sabor de la leche pero con un regusto diferente”. En el caso del aspecto, el panel de catadores destaca la presencia de una “superficie heterogénea” junto con “grasa en la pared”. Por último, a la hora de valorar el color de la leche estudio, hay una tendencia a declinarse por el color blanquecino o amarillento.


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Gráfica 2. Pruebas de medición del grado de satisfacción de la leche enriquecida con fitoesteroles. Valoración del Olor

05

1015202530

Me recuerda a leche habitual

A leche, pero olor diferente

Queso

Acaramelado

Acartonada

Aceite

Jabón Fruta

Mohoso

Rancio

No claro

Nada

Otros

Gráfica 3. Pruebas de medición del grado de satisfacción de la leche enriquecida con fitoesteroles. Valoración del Sabor

0

10

20

30

40

50Me recuerda a leche habitual

A leche, pero regusto diferenteAguado

Insípido

Amargo

Cocido

Acaramelado

Quemado

Acartonado

Sabor químico

Sabor a comidaSabor extraño

FrutaMetálicoMohosoAceitosoJabonoso

Oxidado

Salado

Ácido

Agrio

Seboso

Levadura

Rancio

AñejoNo claro

Otros


12

Gráfica 4. Pruebas de medición del grado de satisfacción de la leche enriquecida con fitoesteroles. Valoración del Aspecto

0

10

20

30

40

S. Heterogenea

Partículas extrañas

Capa de crema

Masa de cremaSedimentación

Multitud de partículas de grada

Grasa en la pared

Gráfica 5. Pruebas de medición del grado de satisfacción de la leche enriquecida con fitoesteroles. Valoración del Color

0

10

20

30

40

50

60

Blancecino

Grisáceo

AmarillentoMarrón

Color atípico

3.2. ENSAYO EN VOLUNTARIOS PRUEBAS ANALÍTICAS EN SANGRE

No se produjo hemólisis de las muestras ni transcurrieron más de dos horas desde la obtención de la sangre hasta la separación del plasma del componente celular, lo que permite asegurar la estabilidad de los analitos valorados. Los resultados se encuentran avalados por el empleo de dos sueros control (normal y patológico) de concentración certificada (Spinreact). La variabilidad inter-ensayo e intra-ensayo para cada analito estudiado (tabla 4) se encuentra dentro de lo aceptado por el Comité Científico de la Comisión de Lípidos y Lipoproteínas de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular [20].

En la tabla 5 se muestran las concentraciones plasmáticas de lípidos de cada período. Los resultados encontrados en condiciones iniciales en la población estudiada, coinciden con lo descrito en la bibliografía. Inicialmente todas las mujeres analizadas mostraron una


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concentración de colesterol superior a 200 mg/dl y de cLDL por encima de 100 mg/dl. En el 70% de los casos, la concentración de triglicéridos estuvo por debajo de 100 mg/dl, mientras que la concentración de cHDL fue en todos los casos superior a 40 mg/dl. En 3 mujeres la relación colesterol/cHDL fue menor de 3 y en el 65% se encontró por encima de 4. Tabla 4. Coeficiente de variación inter-ensayo de un suero control normal y patológico

Control normal Control patológicon mg/dl C.V. n mg/dl C.V.

Colesterol 30 89,0 8,4 % 30 199,1 5,5 %Triglicéridos 20 97,1 4,4 % 27 168,1 5,0 %Fosfolípidos 17 119,9 11,4 % 15 189,6 12,0 %Colesterol libre 17 22,4 5,7 % 19 51,6 4,4 % Apolipoproteína A 6 145,1 2,7 % Apolipoproteína B 6 126,5 2,2 %

Tabla 5. Parámetros lipídicos en el plasma

INICIAL FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES II (mg/dl) n Media ± D.E. n Media ± D.E. n Media ± D.E. n Media ± D.E. p

Colesterol 24 250,6 ± 27,3 a 23 224,6 ± 25,0 b 23 220,9 ± 31,7 b 22 218,9 ± 31,9 b 0,0008 Triglicéridos 24 78,2 ± 36,4 23 78,1 ± 34,0 23 68,1 ± 30,7 22 78,3 ± 48,5 n.s. Fosfolípidos 24 184,4 ± 50,3 23 191,9 ± 22,5 23 173,8 ± 31,4 22 173,1 ± 24,1 n.s. Colesterol libre 24 67,6 ± 17,1 23 68,8 ± 12,3 23 75,3 ± 13,4 22 65,6 ± 10,6 n.s. Colest.esterificado 24 183,0 ± 31,1 a 23 155,7 ± 21,4 b 23 145,5 ± 28,5 b 22 153,3 ± 25,0 b 0,0000 cHDL1 24 59,0 ± 15,9 a 23 56,2 ± 9,1 a 23 51,5 ± 10,5 ab 22 46,0 ± 9,1 a 0,0013 cLDL2 24 176,0 ± 22,1 a 23 152,7 ± 22,0 b 23 155,7 ± 30,9 b 22 157,3 ± 29,5 ab 0,0132 Apolipoprot. A 24 146,6 ± 23,3 23 143,0 ± 20,9 23 139,0 ± 20,1 22 141,1 ± 20,0 n.s. Apolipoprot. B 24 117,1 ± 20,7 23 110,4 ± 18,9 23 113,7 ± 18,5 22 110,7 ± 20,1 n.s. col/cHDL 24 4,44 ± 0,87 ab 23 4,08 ± 0,74 a 23 4,43 ± 1,00 ab 22 5,55 ± 3,25 b 0,0337 cLDL/cHDL 24 1,43 ± 0,78 ab 23 1,44 ± 0,71 a 23 1,40 ± 0,78 ab 22 1,95 ± 1,34 b 0,0355 apoB/apoA 24 0,820 ± 0,169 23 0,779 ± 0,128 23 0,823 ± 0,173 22 0,796 ± 0,171 n.s. cLDL/apoB 24 1,53 ± 0,24 23 1,40 ± 0,21 23 1,38 ± 0,25 22 1,45 ± 0,24 n.s.

Los resultados se expresan como media y desviación estándar 1 cHDL: colesterol unido a HDL 2 cLDL: colesterol unido a LDL Superíndices con letras diferentes indican diferencias significativas n.s.: no significativo

La administración de 3 g diarios de fitoesteroles a través de la ingesta de 750 ml de leche fue capaz de inducir una reducción de un 11% en la concentración de colesterol total y de un 14% en la concentración de cLDL respecto a las concentraciones iniciales. El efecto de los fitoesteroles también afectó a la concentración de colesterol esterificado, produciendo una reducción de un 10% respecto a los valores iniciales. Aunque la concentración de cHDL al final del estudio fue significativamente inferior a la presente el inicio del estudio, no se apreció una reducción significativa del mismo durante la primera fase de ingesta de fitoesteroles ni posteriormente en la fase de lavado.


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En las VLDL purificadas por ultracentrifugación, la administración de fitoesteroles no ejerció ningún efecto estadísticamente significativo sobre su composición lipídica (tabla 6). Tabla 6. Parámetros lipídicos en las VLDL

INICIO FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES IIn media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. p

Colesterol 24 16,0 ± 10,7 23 16,4 ± 8,3 23 13,7 ± 10,2 22 16,9 ± 17,1 n.s. Triglicéridos 24 53,5 ± 38,7 23 61,2 ± 31,0 23 47,8 ± 26,9 22 61,2 ± 51,7 n.s. Fosfolípidos 24 15,6 ± 13,0 23 19,0 ± 10,5 23 16,9 ± 12,0 22 18,5 ± 20,3 n.s. Colesterol libre 24 6,24 ± 4,24 23 7,70 ± 4,39 23 6,69 ± 4,98 22 6,35 ± 8,04 n.s. Colesterol esterif. 24 9,77 ± 7,74 23 8,72 ± 6,77 23 7,03 ± 6,21 22 10,5 ± 10,2 n.s. % Col. Libre 24 43,8 ± 21,2 ab 23 54,1 ± 33,1 a 23 47,8 ± 16,9 ab 22 33,8 ± 16,9 b 0,0289 % Col. Esterificado 24 56,2 ± 21,2 ab 23 45,9 ± 33,1 a 23 52,2 ± 16,9 ab 22 66,2 ± 16,9 b 0,0289

Los resultados se expresan como media y desviación estándar Superíndices con letras diferentes indican diferencias significativas n.s.: no significativo

La ingesta de fitoesteroles produjo una reducción significativa de la concentración de colesterol transportado en las LDL respecto a la existente en el plasma en las fases iniciales y de lavado (tabla 7). No se apreció un "efecto rebote" como consecuencia de la retirada de los fitoesteroles de la leche, como se deduce que tras el periodo de lavado la concentración de colesterol en las LDL no aumentó; al final del estudio el descenso en la concentración de colesterol llegó a ser de un 20%. La concentración de colesterol esterificado disminuyó tras la ingesta de fitoesteroles en mayor proporción que lo hizo la concentración de colesterol libre. Tabla 7. Parámetros lipídicos en las LDL

INICIO FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES IIn media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. p

Colesterol 24 136,9 ± 23,2 a 23 126,4 ± 18,3 ab 23 120,2 ± 23,4 b 22 112,6 ± 19,3 b 0,0016 Triglicéridos 24 27,1 ± 8,5 a 23 21,9 ± 4,6 b 23 23,2 ± 4,0 ab 22 27,6 ± 10,6 a 0,0221 Fosfolípidos 24 70,3 ± 19,8 ab 23 69,8 ± 11,1 ab 23 60,5 ± 12,4 ab 22 59,7 ± 11,3 b 0,0120 Colesterol libre 24 43,6 ± 15,2 23 45,9 ± 14,5 23 48,6 ± 14,6 22 38,8 ± 10,8 n.s. Colesterol esterif. 24 93,3 ± 20,2 a 23 80,5 ± 12,6 ab 23 71,6 ± 17,9 b 22 73,8 ± 17,0 ab 0,0045 % Col. Libre 24 31,7 ± 9,5 a 23 35,9 ± 7,7 ab 23 40,3 ± 8,7 b 22 34,8 ± 9,2 ab 0,0138 % Col. esterificado 24 68,3 ± 9,5 a 23 64,1 ± 7,7 ab 23 59,7 ± 8,7 b 22 65,2 ± 9,2 ab 0,0138


Respecto a la concentración de colesterol transportado en la fracción de HDL, se observa un incremento tras la administración de fitoesteroles, aunque no alcanzó significación estadística (tabla 8). El incremento en la concentración de triglicéridos y colesterol esterificado observado tras el tratamiento con fitoesteroles probablemente refleja un incremento en el tamaño de estas lipoproteínas.


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Tabla 8. Parámetros lipídicos en las HDL

INICIO FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES IIn media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. n media ± D.E. P

Colesterol 24 58,3 ± 18,9 23 65,4 ± 18,4 23 54,3 ± 21,5 22 54,6 ± 15,5 n.s. Triglicéridos 24 4,82 ± 1,98 a 23 5,47 ± 0,87 a 23 5,52 ± 4,63 b 22 5,90 ± 3,57 b 0,0008 Fosfolípidos 24 60,9 ± 25,2 23 63,9 ± 15,9 23 46,9 ± 17,0 22 46,0 ± 11,4 n.s. Colesterol libre 24 15,2 ± 5,7 23 17,3 ± 4,2 23 16,3 ± 7,8 22 13,8 ± 3,8 n.s. Colesterol esterif. 24 43,1 ± 16,8 23 48,1 ± 15,3 23 37,9 ± 14,6 22 40,8 ± 14,6 n.s. % Col. Libre 24 27,1 ± 8,4 23 27,1 ± 5,3 23 29,7 ± 5,8 22 26,2 ± 7,9 n.s. % Col. esterificado 24 72,9 ± 8,4 23 72,9 ± 5,3 23 70,3 ± 5,8 22 73,8 ± 7,9 n.s.


La concentración de vitaminas liposolubles A y E encontrada en esta población coincide con la descrita por otros autores [21-23]. No se detectó ningún caso con deficiencia en ninguna de las vitaminas estudiadas. La administración de fitoesteroles no afectó a los niveles de retinol (vitamina A) ni de su precursor carotenoide β-caroteno, que se mantuvieron constantes a lo largo del estudio (tabla 9). Esto indica que con la concentración empleada en este estudio, la administración de fitoesteroles no interfiere en la absorción de vitamina A o de β-caroteno, de carácter marcadamente apolar, contrastando con los resultados encontrados en otros estudios en los que se aprecia una reducción en la concentración de carotenoides [23-25]. Sin embargo, la ingesta durante un mes de fitoesteroles redujo significativamente la concentración de α-tocoferol (vitamina E) respecto a la encontrada inicialmente, reducción que se mantuvo durante la fase de lavado hasta el final del estudio; la misma tendencia se observó con la concentración de γ-tocoferol (vitamina E). Así mismo, se apreció una reducción en la concentración de licopeno (carotenoide no provitamina A) tras la administración de fitoesteroles respecto a los valores iniciales, reducción que alcanzó significación estadística tras la segunda administración de los esteroles (fitoesteroles II). Tabla 9. Concentración de vitaminas liposolubles A y E y carotenoides en plasma en las distintas fases del estudio

INICIAL FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES II(µmol/L) n media±D.E. n media±D.E. n media±D.E. n media±D.E. Retinol 24 2,47±0,62 23 2,42±0,69 23 2,30±0,52 22 2,28±0,45 n.s. γ-tocoferol 24 3,06±0,86 a 23 3,13±0,62 a 23 2,44±0,45 b 22 2,78±0,94 ab 0,0840α-tocoferol 24 47,3±1,4 a 23 34,4±5,9 b 23 31,9±6,3 b 22 32,6±7,3 b 0,0000retinol palmitato24 0,070±0,040ab 23 0,063±0,035ab 23 0,035±0,029a 22 0,088±0,069 b 0,0029Licopeno 24 0,617±0,241a 23 0,450±0,173ab 23 0,513±0,340ab 22 0,418±0,219 b 0,0393β-caroteno 24 1,09±1,07 23 0,364±1,023 23 0,791±0,516 22 0,782±0,681 n.s. Los resultados se expresan como media y desviación estándar Superíndices con letras diferentes indican diferencias significativas n.s.: no significativo

Debido a la alta relación existente entre los niveles de vitaminas liposolubles y de lípidos, la concentración de vitaminas se corrigió por la concentración de lípidos (entendiendo como tales la suma de colesterol y de triacilglicéridos), con el fin de determinar si el efecto


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observado sobre las vitaminas podría estar mediado por el efecto de los fitoesteroles sobre la concentración sanguínea de otros lípidos. De hecho, para algunas vitaminas como el caso de α-tocoferol, es éste valor el que define con más precisión la existencia de una deficiencia vitamina E [26]. Como se observa en la tabla 10, se confirma que la administración de fitoesteroles no altera la concentración de vitamina A, ya que incluso tras corregir por la concentración de colesterol y triacilglicéridos, no se apreciaron cambios en la concentración de retinol y β-caroteno a lo largo del estudio. Por su parte, las diferencias apreciadas en la concentración de licopeno desaparecieron al corregir por la concentración de lípidos, lo que indica que el descenso apreciado en términos absolutos podría estar mediado por la reducción ejercida por los esteroles sobre la concentración de colesterol y en especial de cLDL, lipoproteína en la que principalmente se transporta el licopeno. Sin embargo, la administración durante un mes de la leche enriquecida en fitoesteroles redujo significativamente la concentración de α-tocoferol corregida por lípidos lo que indica que el efecto producido por los fitoesteroles sobre la concentración de vitamina E no está mediado por la reducción en la concentración de colesterol. Este efecto se ha descrito en un trabajo, atribuyéndose específicamente a la acción de sitoestanol [27]. Tabla 10. Concentración de vitaminas liposolubles A y E y carotenoides corregidas por lípidos en plasma en las distintas fases del estudio.

INICIAL FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES II (µmol/ mmol lípidos) n media±D.E. n media±D.E. n media±D.E. n media±D.E.Retinol 24 0,336±0,078 23 0,364±0,106 23 0,359±0,089 22 0,355±0,085 n.s. γ-tocoferol 24 0,420±0,124ab 23 0,473±0,100a 23 0,378±0,068b 22 0,429±0,143ab 0,0482α-tocoferol 24 6,44±1,38 a 23 5,16±0,70 b 23 4,91±0,58 b 22 4,96±0,63 b 0,0000retinol palmitato24 0,009±0,005ab 23 0,009±0,004ab 23 0,005±0,004a 22 0,013±0,009b 0,0005Licopeno 24 0,085±0,034 23 0,068±0,027 23 0,079±0,048 22 0,066±0,036 n.s. β-caroteno 24 0,145±0,120 23 0,131±0,141 23 0,121±0,069 22 0,116±0,077 n.s. Los resultados se expresan como media y desviación estándar Superíndices con letras diferentes indican diferencias significativas n.s.: no significativo

En cuanto a otros parámetros sanguíneos indicativos de riesgo cardiovascular, se determinaron las concentraciones plasmáticas de Homocisteína, aminoácido recientemente identificado como factor de riesgo en la enfermedad cardiovascular, y folato, principal vitamina implicada en la regulación nutricional de la homocisteinemia. El consumo de leche, enriquecida o no enriquecida, véase Tabla 11, durante el estudio no provocó diferencias estadísticamente significativas en cuanto a las concentraciones plasmáticas de Homocisteína a lo largo del mismo. En cambio, en cuanto a las concentraciones de folato plasmático, se observa una disminución estadísticamente significativa respecto a los valores iniciales. Este resultado es difícil de explicar puesto que los fitoesteroles, de naturaleza liposoluble, no tienen por qué interaccionar con los folatos, de naturaleza hidrosoluble. La modificación en las concentraciones de folatos en sangre podrían deberse a una disminución en la ingesta de la vitamina, aunque en nuestro estudio la ingesta de folatos en el periodo experimental muestra una tendencia a la disminución, pero no es realmente estadísticamente significativa.


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Tabla 11. Concentraciones plasmáticas de Homocisteína y Ácido Fólico

INICIO FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES IIHomocisteína (µmol/L) 9,48± 2,35 9,29± 2,00 9,48± 2,99 9,63± 3,31

Ácido fólico (ng/mL) 7,33± 3,43 6,28± 2,90 ** 6,10± 2,87 ** 5,78± 2,90 ** Valores expresados como la media ± desviación estándar. ∗∗Diferencias significativas (p<0,01) respecto a la concentración inicial. PRUEBAS DE ANTROPOMETRÍA

En la Tabla 12 se presentan las características iniciales de las 23 mujeres, en estado de menopausia, que participaron en el estudio.

La edad, peso, talla e Índice de Masa Corporal del grupo de voluntarias se corresponde

con valores habituales obtenidos en nuestro laboratorio y correspondientes a mujeres españolas en estado de menopausia (edad superior a 45 años, índice de masa corporal con tendencia al sobrepeso y obesidad).

Se estudiaron los posibles cambios en la composición corporal inducidos por la intervención nutricional con leche adicionada de fitoesteroles, haciendo hincapié en el porcentaje de masa grasa corporal y en la distribución del tejido adiposo. En la Tabla 13 observamos los parámetros antropométricos medidos y su comparación entre valores basales y valores finales. No se produjo ganancia ni pérdida de peso ni variaciones en el compartimiento graso de forma estadísticamente significativa. Luego el consumo de 750 ml de leche estudio al día durante un periodo total de tres meses no produce variaciones en la composición corporal.


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Tabla 12. Características del grupo de voluntarias

N media ± D.E.Edad (años) 23 54,78 ± 5,04Peso ((kg) 23 69,87 ± 9,17Talla (cm) 23 159,74 ± 0,04IMC (kg/m2) 23 27,31 ± 3,43

Tabla 13. Antropometría en mujeres antes de comenzar el estudio y al final del mismo

Basal Final Peso (kg) 70,18± 9,53 69,81± 10,06

Talla (cm) 159,74± 0,05 159,65± 0,05Pliegue bicipital (mm) 25,87± 4,56 25,24± 5,14 Pliegue tricipital (mm) 13,20± 4,91 13,42± 4,29

Pliegue subescapular (mm) 24,80± 5,57 26,05± 6,48 Pliegue suprailiaco (mm) 23,29± 5,44 21,89± 5,67 Perímetro del brazo (cm) 30,61± 2,32 30,11± 2,10 Perímetro de cintura (cm) 88,61± 10,20 89,21± 9,85

Perímetro de la cadera (cm) 106,96± 8,11 107,38± 7,27Perímetro de la muñeca (cm) 16,46± 1,39 16,38± 1,24

IMC1 (kg/m2) 27,31± 3,43 27,24± 3,75 ICC2 0,83± 0,05 0,83± 0,06

Grasa corporal (%) 40,19± 2,29 39,95± 3,33 Valores expresados como la media ± desviación estándar. No existen diferencias significativas en la prueba de comparación de medias. 1 Índice de Masa Corporal 2 Índice Cintura Cadera

ESTUDIO DE LA DIETA

El estudio de la dieta se valoró bajo dos premisas fundamentales: o Determinar si las voluntarias modifican sus hábitos alimentarios en el

transcurso del periodo experimental, o Evaluar la repercusión de introducir una ingesta habitual de 750 ml de la leche

experimental en los hábitos dietéticos y la calidad nutricional de la dieta de las voluntarias.

La tabla 14 muestra el consumo individual de leche antes de comenzar el estudio y

durante los tres periodos experimentales. Para obtener la cantidad de fitoesteroles deseada, se recomendó el consumo de 750 ml diarios de leche experimental. Puede observarse que durante el periodo experimental, el consumo de leche es el recomendado en la mayor parte de las voluntarias, a pesar de que supone un incremento del 87 % en su consumo habitual de leche.


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Tabla 14. Consumo diario individual de leche, antes de iniciar el estudio y durante los tres periodos experimentales

CODIGO INICIO

(ml/día de leche) FITOESTEROLES I

(ml/día de leche) LAVADO

(ml/día de leche) FITOESTEROLES II

(ml/día de leche) 1 200 750,00 750,00 750,00 2 600 642,86 669,64 669,64 3 200 535,71 562,50 508,93 4 450 750,00 508,93 589,29 5 200 642,86 709,82 776,79 6 600 830,36 723,21 736,61 7 100 750,00 750,00 750,00 8 200 750,00 750,00 750,00 9 400 750,00 750,00 750,00

10 200 883,93 776,79 723,21 11 300 642,86 669,64 696,43 12 600 696,43 723,21 750,00 13 400 776,79 750,00 803,57 14 400 750,00 750,00 616,07 15 450 750,00 750,00 750,00 18 300 830,36 696,43 750,00 19 500 776,79 723,21 723,21 20 200 750,00 750,00 750,00 21 600 723,21 723,21 294,64 22 200 750,00 723,21 750,00 23 800 750,00 776,79 750,00 24 500 669,64 696,43 750,00 25 400 750,00 750,00 750,00

Media 382,608696 734,86 714,48 701,67 D.E. 177,915891 71,45 62,40 108,35

Con el fin de determinar si las modificaciones obtenidas en los parámetros sanguíneos analizados se deben únicamente al consumo de la leche experimental, es necesario controlar la dieta de las voluntarias durante el periodo experimental, con especial énfasis en aquellos parámetros dietéticos que también puedan influir en las determinaciones sanguíneas analizadas. En el presente estudio se optó por permitir a la voluntarias que mantuvieran su dieta habitual, recomendándolas que no modificasen sus hábitos durante el periodo de intervención nutricional. Para comprobar que las voluntarias no modifican su dieta, ésta se analizó periódicamente y se compararon los datos correspondientes de la Encuesta recuerdo de 24h, realizado al comienzo del estudio, con las tres Encuestas recuerdo de 24h, realizados en el transcurso del mismo. La Tabla 15 muestra los resultados obtenidos.


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Tabla 15. Ingesta media diaria de Energía y Nutrientes antes y durante el periodo experimental, valorada a través de las Encuestas Recuerdo de 24 horas

INICIAL FITOESTEROLES I LAVADO FITOESTEROLES II

N Media ± D.E. Media ± D.E. Media ± D.E. Media ± D.E. p

Energía (kcal) 23 1818,7 ± 427,6 a 1722,4 ± 448,8 a 2073,4 ± 550,3 b 2026,2 ± 518,7 a,b <0,05 Proteína (% ETC)1 23 19,4 ± 5,6 23,6 ± 9,6 22,4 ± 9,6 23,7 ± 7,3 n.s. Lípidos (% ETC)1 23 39,8 ± 8,0 35,4 ± 12,7 35,6 ± 8,1 34,4 ± 8,4 n.s. Carbohidratos (% ETC)1 23 38,2 ± 7,7 43,4 ± 8,7 39,3 ± 9,6 39,6 ± 9,0 n.s. AGS2 (% ETC)1 23 8,9 ± 3,4 8,1 ± 4,7 8,2 ± 2,8 8,5 ± 3,8 n.s. AGM3 (% ETC)1 23 17,2 ± 5,0 14, 7 ± 5,4 15,6 ± 4,4 14,7 ± 3,7 n.s. AGP4 (% ETC)1 23 5,4 ± 2,3 4,7 ± 1,5 4,8 ± 1,8 4,8 ± 1,4 n.s. Proteína (g) 23 87,4 ± 30,6 a 92,2 ± 22,5 a 112,9 ± 35,3 b 116,0 ± 41,6 b <0,05 Lípidos (g) 23 81,6 ± 25,1 62,6 ± 17,7 83,0 ± 32,5 79,3 ± 38,4 n.s. Hidratos de carbono (g) 23 188,7 ± 64,7 211,1 ± 69,1 221,3 ± 77,9 207,5 ± 54,34 n.s. AGS2 (g) 23 18,4 ± 9,1 13,5 ± 4,7 19,2 ± 10,5 19,8 ± 13,5 n.s. AGM3 (g) 23 35,3 ± 12,7 26,2 ± 9,2 36,6 ± 15,4 33,2 ± 14,2 n.s. AGP4 (g) 23 11,2 ± 5,8 8,5 ± 2,9 11,1 ± 4,7 11,3 ± 6,1 n.s. Colesterol (mg) 23 293,2 ± 186,5 317,6 ± 296,3 393,2 ± 245,7 373,9 ± 109,7 n.s. Fibra (g) 23 18,0 ± 7,6 18,4 ± 6,9 19,7 ± 8,7 21,8 ± 13,1 n.s. Vitamina A (ER5, µg) 23 663,6 ± 634,4 520,5 ± 505,7 743,2 ± 527,7 933,8 ± 677,1 n.s. Vitamina B1 (mg) 23 1,5 ± 0,5 1,7 ± 0,7 1,7 ± 0,8 1,7 ± 0,4 n.s. Vitamina B2 (mg) 23 2,1 ± 0,9 2,6 ± 1,2 2,5 ± 0,7 2,4 ± 0,6 n.s. Niacina (EN6, mg) 23 29,5 ± 7,7 31,4 ± 9,3 29,0 ± 11,7 33,4 ± 10,7 n.s. Vitamina B6 (mg) 23 2,2 ± 0,8 2,3 ± 1,0 2,1 ± 0,9 2,2 ± 0,8 n.s. Folatos (µg) 23 389,4 ± 544,1 279,3 ± 131,4 377,2 ± 222,4 316,8 ± 172,4 n.s. Vitamina B12 (µg) 23 10,6 ± 15,5 13,2 ± 13,7 10,2 ± 11,7 14,3 ± 15,1 n.s. Vitamina D (µg) 23 4,4 ± 6,9 5,0 ± 5,9 5,2 ± 6,2 6,4 ± 10,9 n.s. Vitamina E (mg) 23 9,9 ± 6,0 8,0 ± 4,4 9,0 ± 3,3 8,4 ± 4,0 n.s. Vitamina C (mg) 23 182,0 ± 131,0 178,5 ± 90,5 242,9 ± 109,6 198,3 ± 118,7 n.s. Sodio (mg) 23 1476,1 ± 764,1 1443,1 ± 637,2 2322,5 ± 1523,3 2547,8 ± 3497,8 n.s. Potasio (mg) 23 3436,2 ± 1266,7 3216,7 ± 1005,1 3733,2 ± 932,2 3447,5 ± 1054,6 n.s. Calcio (mg) 23 1013,2 ± 387,6 a 1118,0 ± 374,8 a 1525,6 ± 425,8 b 1334,2 ± 317,9 b <0,05 Fósforo (mg) 23 1421,5 ± 507,3 1524,1 ± 544,7 1775,4 ± 741,3 1811,5 ± 720,2 n.s. Yodo (µg) 23 132,0 ± 118,1 151,4 ± 104,2 166,1 ± 54,0 148,0 ± 43,2 n.s. Zinc (mg) 23 10,4 ± 3,2 a,b 9,7 ± 3,0 b 11,9 ± 4,1 a 12,3 ± 4,7 a <0,05 Magnesio (mg) 23 352,6 ± 144,0 a 397,7 ± 112,3 a 446,9 ± 137,4 a,b 450,5 ± 82,3 b <0,05 Hierro (mg) 23 25,2 ± 25,8 30,0 ± 44,6 24,0 ± 27,6 18,4 ± 4,9 n.s. Los resultados se expresan como media y desviación estándar 1 ETC: Energía total consumida 2 AGS: Ácidos grasos saturados 3 AGM: Ácidos grasos monoinsaturados 4 AGP: ácidos grasos poliinsaturados 5 ER: equivalentes de retinol 6 EN: equivalentes de niacina Superíndices con letras diferentes indican diferencias significativas n.s.: no significativo


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La comparación de los resultados obtenidos a través de las encuestas Recuerdo de 24 horas muestran muy pocas diferencias en cuanto a la dieta de las voluntarias antes de iniciar el estudio y durante la fase experimental. Concretamente, no se observan diferencias significativas en la ingesta media de aquellos nutrientes que pueden modificar los valores sanguíneos de colesterol (ingesta de energía, lípidos, colesterol, tipos de ácidos grasos, etc). Por tanto, puede concluirse que el efecto observado sobre los parámetros sanguíneos estudiados se debe sólo a la intervención nutricional con la leche experimental, es decir, al efecto de los fitoesteroles adicionados a la leche, y no a modificaciones en la dieta de las voluntarias por efecto de la intervención nutricional. No obstante, para confirmar está hipótesis se hizo una nueva comparación: se tomaron los resultados obtenidos en el Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos, que refleja la dieta habitual de las voluntarias durante el año anterior, y se compararon con los resultados obtenidos con la media de las tres encuestas Recuerdo de 24 horas, que pretenden reflejar la dieta de las voluntarias durante el periodo de intervención. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 16.

En este caso sí pueden observarse diferencias significativas en cuanto a la ingesta de algunos nutrientes. Por ejemplo, se observa una disminución significativa de la ingesta de proteínas, lípidos e hidratos de carbono y, en consecuencia, de energía. La disminución en la ingesta de lípidos se aprecia tanto en cuanto al contenido total de lípidos de la dieta como en cuanto al porcentaje de energía procedente de estos lípidos en relación con los otros nutrientes energéticos. No obstante, no se modifica cualitativamente la dieta en referencia al tipo de lípidos consumidos. Estas diferencias pueden deberse a que la toma de datos sobre ingesta alimentaria se lleva a cabo a través de metodologías diferentes (Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos y Encuesta Recuerdo de 24 horas). No obstante, con el fin de determinar si los cambios en los parámetros sanguíneos se deben al efecto de los fitoesteroles o a que las voluntarias modifican su dieta al participar en el estudio, se estimaron los cambios que podrían introducir los cambios dietéticos obtenidos en esta comparación sobre los valores sanguíneos. Para ello se utilizaron las Ecuaciones de Keys, Hegsted y Katan, que estiman el cambio en los valores sanguíneos de colesterol que teóricamente puede inducir una modificación dietética. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 17.


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Tabla 16. Ingesta media diaria de Energía y Nutrientes antes y durante el periodo experimental, valorada a través de Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos y Encuestas Recuerdo de 24 horas

Dieta inicial1 Dieta del periodo experimental2

Energía (kcal/día) 2625,79 ± 643,41 1960,96 ± 294,30 ∗Proteínas (g/día) 146,22 ± 41,84 109,91 ± 20,16 ∗Lípidos (g/día) 112,20 ± 31,95 75,56 ± 17,39 ∗Hidratos de carbono (g/día) 273,31 ± 86,96 213,15 ± 48,85 ∗Fibra (g/día) 31,33 ± 10,55 20,22 ± 6,05 ∗Proteínas (% ETC)3 22,37 ± 3,16 23,09 ± 4,35 Hidratos de carbono (% ETC)3 39,09 ± 7,48 41,52 ± 6,74 Lípidos (% ETC)3 38,47 ± 1,25 35,27 ± 5,28 ∗Fitosteroles (mg/día) 392,58 ± 300,80 584,12 ± 305,43 ∗Colesterol (mg/día) 398,35 ± 168,84 331,64 ± 124,67 AGS4 (g) 26,96 ± 9,41 18,70 ± 6,92 ∗AGM5 (g) 46,17 ± 13,66 33,96 ± 10,49 ∗AGP6 (g) 18,45 ± 16,46 10,50 ± 3,51 ∗AGS4 (% ETC)3 9,18 ± 2,20 8,37 ± 2,39 AGM5 (% ETC)3 15,94 ± 3,34 15,28 ± 3,34 AGP6 (% ETC)3 5,99 ± 3,65 4,74 ± 1,33 Ca (mg/día) 1436,10 ± 424,91 1426,02 ± 169,64 Hierro (mg/día) 29,75 ± 28,93 23,77 ± 20,48 Yodo (µg/día) 119,50 ± 37,04 167,43 ± 44,51 ∗Magnesio (mg/día) 489,09 ± 127,72 454,71 ± 53,76 Zinc (mg/día) 29,75 ± 28,93 11,89 ± 2,19 ∗Sodio (mg/día) 2900,51 ± 1176,51 2353,97 ± 20,48 ∗Potasio (mg/día) 4688,71 ± 1221,43 3522,46 ± 750,97 ∗Fosforo (mg/día) 1886,57 ± 526,75 1718,57 ± 84,84 Vitamina B1 (mg/día) 2,28 ± 0,95 1,70 ± 0,36 Vitamina B2 (mg/día) 2,78 ± 0,79 2,60 ± 0,46 Equivalentes de Niacina (mg/día) 45,81 ± 12,05 30,85 ± 5,99 ∗Vitamina B6 (mg/día) 3,31 ± 0,10 2,26 ± 0,60 Ácido Fólico (µg/día) 453,03 ± 141,82 323,06 ± 108,36 ∗Vitamina B12 (µg/día) 16,84 + 7,44 12,26 ± 8,19 Vitamina C (mg/día) 263,05 ± 130,84 220,06 ± 91,80 Equivalentes de Retinol (µg/día) 1273,61 ± 754,79 738,26 ± 368,22 Vitamina D (µg/día) 6,24 ± 3,40 4,42 ± 4,41 Vitamina E (mg/día) 12,12 ± 4,44 8,01 ± 3,01 ∗

Valores expresados como la media ± desviación estándar. 1 Corresponde con la dieta habitual de las voluntarias valorada a través de Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos 2 Corresponde con la dieta de las voluntarias durante el periodo experimental, valorada a través de la media de los tres Recuerdos de 24 horas 3 ETC: Energía total consumida 4 AGS: ácidos grasos saturados 5 AGM: ácidos grasos monoinsaturados 6 AGP: ácidos grasos poliinsaturados ∗ Diferencias significativas (p<0,05), dieta inicial vs. dieta en el periodo experimental


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Tabla 17. Predicción de las variaciones en valores sanguíneos de colesterol total, colesterol unido a LDL y colesterol unido a HDL inducidas por variaciones en la dieta

Dieta Inicial1 Dieta Experimental2 Incremento3 PÍndice de Keys4

∆Cho (mg/dl) 48,54 ± 24,48 37,94 ± 14,95 -7,50 ± 29,71 0,081 n.s.

Índice de Hegsted5

∆Cho (mg/dl) 54,76 ± 28,16 45,52 ± 16,42 -9,23 ± 32,29 0,184 n.s.

Índice de Katan6

∆Cho-LDL (mg/dl) 0,35 ± 0,28 0,27 ± 0,16 -0,08 ± 0,31 0,191 n.s.

Índice de Katan7

∆Cho-HDL (mg/dl) -0,22 ± 0,15 -0,15 ± 0,07 0,06 ± 0,16 0,062 n.s.

Los resultados se expresan como media y desviación estándar 1 Dieta Inicial: hace referencia a la dieta habitual de las voluntarias, medida a través de Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos 2 Dieta Experimental: hace referencia a la dieta de las voluntarias durante el periodo experimental, medida a través de Recuerdo de 24 horas 3 Incremento: modificación del parámetro sanguíneo en función de la diferencia entre la dieta experimental y la dieta inicial 4 Índice de Keys:

∆colesterol = 1,26 (2 ∆saturados – ∆poliinsaturados) + (100 ∆colesterol dietético/∆Energía total)1/2 ∆colesterol: cambio en la concentración de colesterol en sangre producido al pasar de una dieta a otra de

distinta composición en ácidos grasos (mg/dl) ∆saturados: cambio en el contenido de glicéridos saturados (expresado como porcentaje en energía)

∆poliinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos poliinsaturados (expresados como porcentaje en energía) ∆colesterol dietético: cambio en el contenido de colesterol en las dietas (expresado en mg)

5 Índice de Hegsted ∆colesterol = 2,16 ∆saturados – 1,65 ∆poliinsaturados + 0,0677 ∆colesterol dietético

∆colesterol: cambio en la concentración de colesterol producido al pasar de una dieta a otra de distinta composición en ácidos grasos (mg/dl)

∆saturados: cambio en el contenido de glicéridos saturados (expresados como porcentaje en energía) ∆poliinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos poliinsaturados (expresados como porcentaje en energía)

∆colesterol dietético: cambio en el contenido de colesterol en las dietas (expresado en mg/100 kcal) 6 Índice de Katan

∆colesterol-LDL = 0,033 ∆saturados – 0,006 ∆monoinsaturados + 0,014 ∆poliinsaturados ∆colesterol-LDL: cambio en la concentración de colesterol unido a LDL producido al pasar de una dieta

a otra de distinta composición en ácidos grasos (mg/dl) ∆saturados: cambio en el contenido de glicéridos saturados (expresados como porcentaje en energía)

∆monoinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos monoinsaturados (expresados como porcentaje en energía)

∆poliinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos poliinsaturados (expresados como porcentaje en energía) 7 Índice de Katan

∆colesterol-HDL = 0,012 ∆saturados – 0,009 ∆monoinsaturados + 0,007 ∆poliinsaturados ∆colesterol-HDL: cambio en la concentración de colesterol unido a HDL producido al pasar de una

dieta a otra de distinta composición en ácidos grasos (mg/dl) ∆saturados: cambio en el contenido de glicéridos saturados (expresados como porcentaje en energía)

∆monoinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos monoinsaturados (expresados como porcentaje en energía)

∆poliinsaturados: cambio en el contenido de glicéridos poliinsaturados (expresados como porcentaje en energía)

Al aplicar las ecuaciones observamos que la modificación de la dieta de las voluntarias debida a la intervención nutricional podría dar lugar a una ligera disminución de los valores de colesterol sanguíneo total y de colesterol unido a LDL, además de un ligero aumento en el colesterol unido a HDL, aunque las diferencias no son estadísticamente significativas. Por tanto, esta nueva comparación nos permite concluir que las modificaciones en los parámetros


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sanguíneos observados en nuestras voluntarias se deben únicamente al efecto de los fitoesteroles añadidos a la leche experimental.

Finalmente, con los datos obtenidos a partir del estudio de la dieta pudimos evaluar la repercusión de introducir una ingesta habitual de 750 ml de la leche experimental en los hábitos dietéticos y la calidad nutricional de la dieta de las voluntarias. Para ello, se tomaron los datos de dieta habitual recogidos a través del Cuestionario Frecuencia de Consumo de Alimentos y se analizó el patrón de consumo de alimentos (tabla 18) además de la ingesta media diaria de energía y nutrientes (tabla 19). A partir de estos datos se estimó la repercusión de introducir la leche experimental sobre la calidad nutricional de la dieta sustituyendo el consumo habitual de leche en las voluntarias con el consumo recomendado de 750 ml diarios de leche añadida de fitoesteroles. Los resultados se muestran en las tablas 18 y 19. Tabla 18. Patrón de Consumo Alimentario habitual en las voluntarias comparado con el Patrón de Consumo Recomendado

Patrón de consumo habitual Patrón de consumo recomendado1

Grupo de Alimentos g/día Raciones/día g/día Raciones/día Cereales y derivados 156,71+ 63,73 2,76 226,66-339,96 4-6 Leche y derivados lácteos 590,86+ 238,09 5,56 212,5-425 2-4 Huevos 19,13+ 7,92 0,27 20-30 0,28-0,43 (2-3 semana)Aceite de oliva 26,30+ 5,48 2,63 30-50 3-5 Otros aceites y grasas 24,75+ 34,23 0,93 Ocasional Ocasional Frutas frescas 251,81+ 136,02 1,43 > 525 > 3Frutos secos 21,70+ 24,30 0,72 8,57-12,86 0,28-0,43 (2-3 semana)Verduras y hortalizas 541,36+ 261,27 2,41 > 450 > 2Legumbres 33,17+ 19,19 0,47 20-30 0,28-0,43 (2-3 semana)Carnes y derivados cárnicos 212,57+ 102,03 1,70 35,71-53,57 0,28-0,43 (2-3 semana)Pescados 138,79+ 121,19 0,92 42,86-64,29 0,28-0,43 (2-3 semana)Bebidas alcohólicas 136,46+ 167,07 1,81 - - Refrescos 204,93+ 157,14 1,02 Ocasional Ocasional Dulces y azúcar 72,66+ 51,22 2,20 Ocasional Ocasional

Los resultados se expresan como media y desviación estándar 1 Adaptado de la Pirámide de la Alimentación saludable diseñada por la SENC (Sociedad Española de Nutrición Comunitaria) [16].

En cuanto al Patrón de Consumo de Alimentos habitual en las voluntarias y comparando con el patrón de consumo recomendado [16] es destacable un muy alto consumo de carnes y derivados cárnicos, además de un alto consumo de leche y derivados lácteos, legumbres y pescados. El consumo de aceite de oliva está por debajo de lo recomendado y es sustituido por otras grasas y aceites, cuyo consumo se recomienda que sea sólo ocasional. Es bajo el consumo de cereales y derivados y frutas frescas, aunque el consumo de verduras y hortalizas coincide con el recomendado. También se observa en el grupo estudiado un consumo moderado de bebidas alcohólicas y refrescos.

En la situación de menopausia en la que se encuentran las voluntarias del estudio, se recomienda especialmente el consumo de leche y derivados lácteos, fundamentalmente por su contenido en calcio y vitamina D y la posible relación de estos nutrientes con el problema de la osteoporosis. Nuestras voluntarias consumen una cantidad importante de este grupo alimentario, por encima de las raciones recomendadas. Si se sustituye su consumo habitual de leche por 750 ml de leche añadida de fitoesteroles, el consumo de leche y derivados lácteos


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pasaría a ser de 925,26 ± 150,59, es decir, en torno a 8,71 raciones diarias, bastante por encima de las 2 a 4 raciones diarias recomendadas. Por tanto, la inclusión de 750 ml de leche añadida de fitoesteroles aumenta el consumo de un grupo alimentario muy importante para este grupo de edad, pero no supone una mejoría notable en la calidad de la dieta. No obstante, se podría recomendar a las voluntarias que sustituyeran no sólo la leche habitual, sino también parte de los derivados lácteos que habitualmente consumen (yogures, quesos) por la leche adicionada de fitoestroles, lo que seguramente mejorará su consumo dietético de lípidos. Tabla 19. Calidad nutricional de la dieta habitual de las voluntarias y de la dieta estimada introduciendo el consumo diario de 750 ml de leche adicionada de fitoesteroles

Dieta habitual1 Dieta estimada2 Recomendación nutricional3

Energía (kcal/día) 2625,79 ± 643,41 2762,03 ± 618,07 ∗ 2075 Proteínas (% ETC)4 22,34 ± 3,16 22,98 ± 2,82 ∗ <15 Hidratos de carbono (% ETC) 4 39,09 ± 7,48 39,75 ± 7,16 ∗ 55-60 Lípidos (% ETC)4 38,47 ± 5,60 35,05 ± 5,44 ∗ 30-35 Fitosteroles (mg/día) 379,88 ± 304,91 667,19 ± 312,41∗ -Colesterol (mg/día) 398,14 ± 168,70 389,52 ± 165,37 <300 AGS5 (% ETC)4 9,18 ± 2,20 7,91 ± 2,02 ∗ 7-10 AGP6 (% ETC)4 5,99 ± 3,65 5,75 ± 3,52 ∗ 8-10 AGM7 (% ETC)4 15,94 ± 3,34 14,90 ± 3,11 ∗ 10-15 Equivalentes de Retinol (µg/día) 1273,61 ± 754,79 1205,82 ± 719,09 ∗ 800 Vitamina B1 (mg/día) 2,28 ± 0,95 2,42 ± 0,92 ∗ 0,8 Vitamina B2 (mg/día) 2,78 ± 0,79 3,30 ± 0,59 ∗ 1,2 Equivalentes de Niacina (mg/día) 45,81 ± 12,05 44,40 ± 11,66 ∗ 14 Vitamina B6 (mg/día) 3,31 ± 0,99 3,41 ± 0,94 ∗ 1,6 Vitamina B12 (µg/día) 16,84 ± 7,44 17,92 ± 7,42 ∗ 2Vitamina C (mg/día) 263,05 ± 130,84 271,90 ± 129,74 ∗ 60 Vitamina D (µg/día) 6,24 ± 3,40 6,19 ± 3,40 ∗ 10 Vitamina E (mg/día) 12,12 ± 4,44 11,97 ± 4,39 ∗ 12 Ácido fólico (µg/día) 453,03 ± 141,82 478,00 ± 137,54 ∗ 400 Ca (mg/día) 1436,10 ± 424,91 1841,65 ± 349,32 ∗ 800 Hierro (mg/día) 35,24 ± 40,05 36,45 ± 39,85 ∗ 10 Yodo (µg/día) 119,50 ± 37,04 166,58 ± 27,18 ∗ 110 Magnesio (mg/día) 489,09 ± 127,72 624,56 ± 108,59 ∗ 300 Zinc (mg/día) 14,99 ± 3,74 17,24 ± 3,51 ∗ 15 Sodio (mg/día) 2900,51 ± 1176,51 2784,42 ± 1204,81 ∗ 1300 Potasio (mg/día) 4688,71 ± 1221,43 4365,89 ± 1070,85 ∗ 4700 Fosforo (mg/día) 1886,57 ± 526,75 1578,35 ± 498,49 ∗ 700

Valores expresados como la media ± desviación estándar. 1 Corresponde con la dieta habitual de las voluntarias valorada a través de Cuestionario de Frecuencia de Consumo de Alimentos 2 Corresponde con la dieta estimada al sustituir el consumo de leche habitual de las voluntarias por el consumo diario de 750 ml de leche adicionada de fiteoesteroles 3 Recomendaciones nutricionales adaptadas de Moreiras y col. [17], SENC [16] y DRI [18-19] 4 ETC: Energía total consumida 5 AGS: ácidos grasos saturados 6 AGP: ácidos grasos poliinsaturados 7 AGM: ácidos grasos monoinsaturados ∗ Diferencias significativas (p<0,05), dieta habitual vs. dieta estimada

La introducción de 750 ml diarios de leche adicionada de fitoesteroles en la dieta habitual de las voluntarias estudiadas produce un ligero incremento en la energía consumida,


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básicamente porque supone un incremento en el consumo de leche total. Este incremento en la energía se acompaña, sin embargo, de un decremento en la ingesta lipídica: al tratarse de una leche desnatada, disminuye el consumo de lípidos totales en la dieta habitual, lo que supone un acercamiento a la recomendación nutricional para los lípidos. Este cambio en la ingesta lipídica no se acompaña de una modificación en la distribución del tipo de ácidos grasos consumido, ya que disminuye la ingesta de los tres principales tipos de ácidos grasos, manteniéndose una distribución muy próxima a la recomendada. El consumo de fitoesteroles, como era de esperar, se incrementa en un 75%. En cuanto a las vitaminas, la introducción de la leche con fitoesteroles en la dieta habitual de las voluntarias supone algunas diferencias, pero ninguna de importancia nutricional, ya que la ingesta vitamínica se encuentra por encima o próxima a las recomendaciones nutricionales. Únicamente cabe destacar que la ingesta de vitamina D es deficitaria en estas mujeres, tanto en su dieta habitual como en la dieta estimada. En lo que respecta a la ingesta mineral, la introducción de 750 ml diarios de leche adicionada de fitoesteroles produce un notable incremento en la ingesta de calcio (un 28%) en las voluntarias. Aunque en ambos casos las ingestas de calcio se encuentran por encima de la ingesta recomendada establecida para la población española (800 mg/día), posiblemente esta recomendación se incremente a cifras en torno a 1200-1500 mg diarios [19], fruto de los resultados obtenidos en las investigaciones relativas al efecto de la ingesta de calcio en la salud ósea. En conclusión, la introducción del consumo diario de 750 ml de leche adicionada con fitoesteroles mejora la calidad nutricional de la dieta en lo que respecta a la ingesta lipídica total, que se reduce, así como a la ingesta de calcio, que se incrementa. BIBLIOGRAFÍA 1.- International IDF Standard 99C: 1997. 2.- Zhang, D. J., Elswick, R. K., Miller, W. G., Bailey, J. L. "Effect of serum-clot contact time on clinical chemistry laboratory results." Clin Chem (1998) 44: 1325-1333. 3.- Princen, H. M. G., Duyvenvoorde, W. v., Buytenhek, R., Laarse, A. v. d., Poppel, G. v., Leuven, J. A. G., Hinsberg, V. W. M. v. "Supplementation with low doses of vitamin E protects LDL from lipid peroxidation in men and women." Arterioscler Thromb Vasc Biol (1995) 15: 325-333. 4.- Yoshida, H., Ishikawa, T., Nakamura, H. "Vitamin E/lipid peroxide ratio and susceptibility of LDL to oxidative modification in non-insulin-dependent diabetes mellitus." Arterioscler Thromb Vasc Biol (1997) 17: 1438-1446. 5.- Arranz, M. I., Lasuncion, M. A., Perales, J., Herrera, E., Lorenzo, I., Carcamo, C., Concostrina, L., Villar, J., Gasalla, R. "Fatty acid composition of lipoprotein lipids in hepatobiliary diseases." Eur J Clin Chem Clin Biochem (1996) 34: 701-709. 6.- Park, Y., Harris, W. S. "Omega-3 fatty acid supplementation accelerates chylomicron triglyceride clearance." J Lipid Res (2003) 44: 455-463. 7.- Jialal, I., Grundy, S. M. "Effect of dietary supplementation with alpha-tocopherol on the oxidative modification of low density lipoprotein." J Lipid Res (1992) 33: 899-906.


27

8.- Winklhofer-Roob, B. M., Ziouzenkova, O., Puhl, H., Ellemunter, H., Greiner, P., Müller, G., van´t Hof, M. A., Esterbauer, H., Shmerling, D. H. "Impaired resistance to oxidation of low density lipoprotein in cystic fibrosis: improvement during vitamin E supplementation." Free Radic Biol Med (1995) 19: 725-733. 9.- Friedewald, W. T., Levy, R. I., Fredrickson, D. S. "Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge." Clin Chem (1972) 18: 499-509. 10.- Ortega, H., Coperias, J. L., Castilla, P., Gómez-Coronado, D., Lasunción, M. A. "Liquid chromatographic method for the simultaneous determination of different lipid-soluble antioxidants in human plasma and low-density lipoproteins." J Chromatogr B (2004). 11.- Shipchandler MT, Moore EG, 1995. Rapip fully antomated measurement of plasma homocysteine with the abbot Imx Analyzer. Clin Chem 41:991-994 12.- National Heart, Lung and Blood Institute, 1998. Clinical guidelines on the identification, evaluation and treatment of overweight and obesity in adults. Washington DC:National Institutes of Health.US Department of Health and Human Services. 13.- Durnin J and Womersley J. 1974. Body fat assessment from total body density and its estimation from skinfold thickness. British Journal of Nutrition 32:77-97. 14.- Rankinen T, Kim SY, Perusse L, Depres JP and Bouchard C, 1999. The prediction of abdominal visceral fat level from body composition and anthropometry:ROC analysis. International Journal of Obesity and Related Metabolic Research. 24:1005-10 15.- Martin-Moreno JM, Int J Epidemiol, 1993, 22:512-519 16.- Guías alimentarias para la población española. Sociedad Española de Nutrición Comunitaria. 2001. 17.- Tablas de Composición de Alimentos. Moreiras, O., Carbajal, A., Cabrera, L., Cuadrado, C. Ediciones Pirámide. 2003. 18.- DRI. Dietary reference intakes for water, potassium, sodium, chloride and sulphate” Institute of Medicine, Food and Nutrition Board, 2004. National Academy Press. 19.- DRI. Dietary reference intakes for calcium, phosphorous, magnesium, vitamin D and fluoride” Institute of Medicine, Food and Nutrition Board, 1997. National Academy Press. 20.- Palacios, M., Esteban, M., Aguilar, J. A., Ortolá, J. B. "Recomendaciones para la determinación de la concentración en suero del colesterol de las lipoproteínas de alta densidad." Química Clínica (1999) 18: 33-40. 21.- Hallikainen, M. A., Sarkkinen, E. S., Gylling, H., Erkkilä, A. T., Uusitupa, M. I. (2000). "Comparison of the effects of plant sterol ester and plant stanol ester-enriched margarines in lowering serum cholesterol concentrations in hypercholesterolaemic subjects on a low-fat diet." Eur J Clin Nutr. 54(9): 715-725.


28

22.- Raeini-Sarjaz, M., Ntanios, F. Y., Vanstone, C. A., Jones, P. J. (2002). "No changes in serum fat-soluble vitamin and carotenoid concentrations with the intake of plant sterol/stanol esters in the context of a controlled diet." Metabolism. 51(5): 652-656. 23.- Gylling, H., Puska, P., Vartiainen, E., Miettinen, T. A. (1999). "Retinol, vitamin D, carotenes and alpha-tocopherol in serum of a moderately hypercholesterolemic population consuming sitostanol ester margarine." Atherosclerosis. 145(2): 279-285. 24.- Hallikainen, M. A., Sarkkinen, E. S., Uusitupa, M. I. (1999). "Effects of low-fat stanol ester enriched margarines on concentrations of serum carotenoids in subjects with elevated serum cholesterol concentrations." Eur J Clin Nutr. 53(12): 966-969. 25.- Weststrate, J. A., Meijer, G. W. (1998). "Plant sterol-enriched margarines and reduction of plasma total- and LDL-cholesterol concentrations in normocholesterolaemic and mildly hypercholesterolaemic subjects." Eur J Clin Nutr. 52(5): 334-343. 26.- Thurnham, D. I., Davis, J. A., Crump, B. J., Situnayake, R. D., Davis, M. (1986). "The use of different lipids to express serum tocopherol: lipid ratios for the measurement of vitamin E status." Ann Clin Biochem. 23: 514-520. 27.- Homma, Y., Ikeda, I., Ishikawa, T., Tateno, M., Sugano, M., Nakamura, H. (2003). "Decrease in plasma low-density lipoprotein cholesterol, apolipoprotein B, cholesteryl ester transfer protein, and oxidized low-density lipoprotein by plant stanol ester-containing spread: A randomized, placebo-controlled trial." Nutrition. 19(4): 369-374.

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