Centrifugación

CENTRIFUGACIÓN

República Bolivariana de VenezuelaUniversidad del ZuliaFacultad de MedicinaEscuela de Bioanálisis

Cátedra: Análisis Instrumental

Centrifugación

Es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual comprime la mezcla. Un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentación del sólido o de las partículas de mayor densidad

Principio físico-químico

Difusión: La difusión es proceso físico irreversible, en el que partículas materiales se introducen en un medio que inicialmente estaba ausente, aumentando la entropía del sistema conjunto formado por las partículas difundidas o soluto y el medio donde se difunden o disolvente.


Sedimentación: es el transporte de partículas en un campo de fuerza de centrifugación: permite determinar el peso molecular, densidad y forma de macromoléculas y organelos celulares.


Principio de Arquímedes: Afirma que todo cuerpo sumergido en un fluido experimenta una fuerza hacia arriba igual al peso del volumen del fluido desplazado por dicho cuerpo. Todo cuerpo sumergido en un líquido, recibe un empuje de abajo hacia arriba igual al peso del líquido desalojado. Esta fuerza se mide en Newtons y su ecuación se describe como:

Donde ρf y ρs son respectivamente la densidad del fluido y del sólido sumergido; V el volumen del cuerpo sumergido; y g la aceleración de la gravedad


Principio de Stokes: Algunos de los principios básicos en la teoría de la sedimentación se derivan de la Ley de Stokes. Para simplificar el problema se suele considerar que las partículas a aislar en Biología son esferas; cuando éstas se encuentran en un campo gravitacional y alcanzan una velocidad constante, la fuerza neta sobre cada esfera es igual a la fuerza de resistencia que opone el líquido a su movimiento


Si las partículas están cayendo verticalmente en un fluido viscoso debido a su propio peso puede calcularse su velocidad de caída o sedimentación igualando la fuerza de fricción con la fuerza de gravedad.

Donde: Vs es la velocidad de caída de las partículas g es la aceleración de la gravedad, ρp es la densidad de las partículas y

ρf es la densidad del fluido.

Fuerzas que intervienen en el

proceso Fuerza Centrífuga (FC): Es una fuerza de

rotación que expulsa las partículas a moverse del centro de la rotación a la periferia, está dada por la siguiente ecuación:

Fc = w2.r.m Donde w = velocidad angular R= radio (distancia) m: masa de la partícula


proceso Fuerza Centrípeta (FT): es la fuerza

encargada de atraer las partículas hacia el centro de la rotación o centro de gravedad. Es una fuerza de oposición, tiene las magnitudes pero en sentido contrario a la fuerza centrífuga, está dada por la siguiente ecuación:

(FT)= w2.r.m w= velocidad, r=radio, m= masa del medio


proceso Fuerza friccional(FF): se inicia por

desplazamiento de las partículas y su interacción por las moléculas del medio. También puede oponerse a la separación de las partículas. Está dada por la siguiente ecuación:

FF= F.V donde F es el cociente de fricción y V= velocidad del desplazamiento.

Cabe mencionar que las partículas cuando alcanzan el equilibrio, la sumatoria de las fuerzas es igual a 0 Fc + Ft + Ff= 0.

Componentes de la Centrífuga


•Rotor (eje de gravitación o gravitacional): Es el eje que gira a las aspas de un abanico. En una barra metálica cilíndrica que gira en el interior de la centrífuga, en otras palabras, la parte giratoria de una centrifuga y dependiendo del tipo de cabezal se clasifican en:•Rotores Flotantes•Rotores de ángulo fijo o angulares•Rotores verticales


Cada tipo de rotor es adecuado para un tipo determinado de separación:

Tipos de Rotor Sedimentar Centrifugación zonal

Centrifugación isopicnica

Angulo fijo Excelente Pobre Bueno

Vertical Pobre Bueno Excelente

Flotante Ineficiente Bueno Adecuado

Motor: es un componente que tiene la finalidad de aportar velocidad al rotor, es decir, el dispositivo que impulsa el instrumento.

Cámara de vacio: espacio donde se gira el rotor (eje de rotación más cabezal). En las centrifugas de alta velocidad esta cámara se cierra al vacio y se le controla la temperatura.


Control de velocidad: viene dado en r.p.m. es el que mantiene la velocidad del aparato. Pueden ser un panel de mandos digitales, cuyo selector de velocidad es regulable en fracciones de 100rpm, 600rpm, 8000 rpm y más de acuerdo al rotor.

Control de tiempo: va a depender del tipo de centrífuga y el tipo de muestra que es la que determina el tiempo necesario de centrifugación.


Control de temperatura: mantiene los niveles de temperatura deseada dependiendo de la centrífuga utilizada. La programación de la temperatura se puede hacer a través de un termostato digital que puede ir de 0º a 40ºC con un rango de 1ºC.


Masa: la masa es proporcional a la velocidad de centrifugación debido a que se permite separar las partículas de diferente masa por las altas velocidades.

Densidad de la partícula: si la densidad de la partícula es mayor que la del medio la centrifugación se realiza en menor tiempo.

Densidad del medio: al aumentar la densidad del medio, disminuye la velocidad, realizándose en mayor tiempo la centrifugación.

Variables que afectan la centrifugación

Aceleración de la gravedad: Al aumentar la fuerza centrípeta aumenta el giro del homogeneizado cuando la gravedad se acelera o aumenta, la velocidad se altera, ya que aumenta.

Coeficiente de difusión: se refiere a la densidad de corriente de partículas, es decir, al número de partículas que atraviesan en la unidad de tiempo, un área unitaria perpendicular a la dirección en la que tiene lugar la difusión, la densidad de corriente de partículas es proporcional al gradiente de concentración.


Tiempo: depende del tipo de centrífuga y de la composición de la muestra.

Temperatura: El movimiento de las partículas va a incrementar la temperatura, es decir, a mayor movimiento, mayor será la temperatura por lo que es necesario controlar la acción de centrifugación.


Velocidad: cada partícula se sedimenta proporcionalmente a la fuerza centrifuga aplicada y a la aceleración a la cual se somete la muestra en la centrifugación ya que al aumentar la fuerza aumenta la velocidad de separación.

Presión: depende del tipo de análisis.


Las centrífugas: las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que los rodea

Centrifuga simple, de sobremesa, o clínicas:Pequeño tamañoSin refrigeraciónMáxima velocidad 5000r.p.m.Útil para las partículas grandes. (Células, precipitaciones de sales insolubles)

Tipos de Centrífuga

Centrifuga de alta velocidad:Velocidad de 18000 y 25000 rpm.Refrigeradas algunas con sistema de vacíoÚtiles en la separación de fracciones celularesInsuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas.

Microfugas: variante de las anterioresVelocidades altas 1000rpm. Y tubos cortosVolúmenes muy pequeñosÚtiles en biología molecular.


Ultracentrífuga:Velocidad a partir de 50000rpm.Presentan sistemas auxiliares: sistemas de

refrigeración, sistema de alto vacío.2tipos:Analíticas: obtención de datos precisos de

propiedades de sedimentación.Preparativas: aislamiento de partículas de bajo

S. (microsomas, virus, macromoléculas).


Centrifugación analítica: la medición analítica involucra la medición de las propiedades físicas de las partículas sedimentadas como el coeficiente de sedimentación o peso molecular. Los métodos ópticos se emplean en la ultra centrifugación analítica. Para poder aplicar la tecnología de la centrifugación analítica deben cumplirse una serie de requisitos:Que se aplica a sustancias lo más puras posibles no a

grandes mezclas.Que presenten una mayor capacidad de giro, en torno

a las 100.000rpm.Su principal objetivo es aislar partículas específicas

dentro de la centrifugación preparativa.

Tipos de Centrifugación

Centrifugación preparativa: diferencial y en gradiente de densidad

El objetivo de la centrifugación preparativa es aislar partículas específicas.

Existen dos métodos de separación en centrifugación preparativa: Diferencial y En gradiente de densidad.


Centrifugación diferencial: Es el método más común de separación, y es rara la purificación enzimática que no lo utiliza. En este método, el tubo de centrífuga se llena con una mezcla uniforme problema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. El método es bastante inespecífico, y a priori no se puede saber si la partícula buscada quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos; sin embargo es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares.


Centrifugación en gradiente de densidad: Este método es algo más complicado que la centrifugación diferencial, sin embargo presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica no solo permite la separación de varios, si no todos, los componentes de la muestra, sino que también permite realizar medidas analíticas.

Existen dos variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad: Centrifugación zonalCentrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica


Centrifugación zonal: La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga las partículas comenzarán a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa.

Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica: Separa las partículas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y la centrifugación llevada a cabo


Las centrífugas pueden usarse para la separación rápida de sustancias que en condiciones normales se separarían lentamente bajo la influencia de la gravedad, por ejemplo, puede acelerarse el secado de un sólido al centrifugarse.

La centrifuga es hoy un aparato indispensable en cualquier laboratorio, como veremos al enumerar las distintas actividades en las que la centrifuga se nos ofrece como técnica de separación.

Separación del suero o plasma, concentración de células, separar quilomicrones de suero o fraccionar las distintas lipoproteínas.

Importancia de las centrífugas en la

separación y análisis de muestras

Las centrífugas se deben comprobar por lo menos una vez al ano por un técnico especializado (para cada centrifuga debe llevarse un libro de control).

Las centrifugas deben disponer de una tapa protectora con cierre de seguridad. El funcionamiento impecable del cierre debe comprobarse continuamente por el técnico mecánico.

La carga máxima y el número de revoluciones por unidad de tiempo indicadas en la placa de identificación no se deben sobrepasar.

Medidas de seguridad para el manejo de la

Centrífuga

Las centrífugas instaladas en locales especialmente protegidos contra el riesgo de explosión deben estar provistas de los mismos elementos de protección (correa de transmisión conductora de la electricidad). Si se centrifugan materias combustibles, se debe trabajar bajo atmósfera de nitrógeno.

Hasta que la centrífuga no está detenida por completo, está terminantemente prohibido vaciarla o limpiarla con paletas u otros utensilios.

Medidas de seguridad para el manejo de la

Centrífuga

Para un adecuado funcionamiento de la centrifuga es necesario seguir las siguientes recomendaciones: Utilizar tubos resistentes a la F.R.C. Poner un

amortiguador en el fondo del adaptador como anti choque y para evitar que el sobrenadante pueda ser movido. Tener cuidado de que no sobresalga el tubo del porta tubos, ya que puede impedir la oscilación en las centrífugas de cabezal oscilante.

Control y funcionamiento de la

Centrífuga

Equilibrar correctamente la centrífuga colocando los tubos, cubetas, etc. De igual peso, forma y tamaño en posiciones opuestas en el interior de los contenedores, manteniendo una disposición geométrica simétrica; se pueden emplear tubos con agua cuando falte alguno. Esto es necesario, pues la descompensación del rotor puede causar vibraciones que si son pequeñas pueden no notarse, produciéndose poco a poco un desgaste de la centrífuga que aumentará la frecuencia de las roturas de los tubos y llevará a una peor sedimentación, que puede resuspenderse cuando la centrifuga desacelera para parar.


Centrífuga

Tapar los recipientes para evitar la evaporación que puede causar el aumento de la temperatura que se produce en el interior de la cámara debido al rozamiento, así como para impedir la formación de aerosoles que pueden ser contaminantes

No forzar el paro de la centrífuga con el freno de mano o con alguna maniobra manual, evitando de este modo la posible mezcla de las dos partes ya separadas, y además peligro de accidente.


Centrífuga

Chequeo de la velocidad de centrifugación, por lo menos cada tres meses mediante un estroboscopio ligero o un tacómetro externo de conocida exactitud.

Limpieza periódica, o tras rotura de algún tubo, de la cámara y los contenedores para impedir en lo posible la propagación de agentes infecciosos. El temporizador de la centrífuga debe ser chequeado cada semana frente a un temporizador de referencia, la temperatura de una centrifuga refrigerada cada mes; los conmutadores, cepillos y escobillas del motor, cada tres meses, y reemplazarlos cuando sea necesario.


Centrífuga

Ventajas y desventajas de su uso

Análisis clínicos: Separación del suero o plasma: éste se separa del

paquete celular, es una de las actividades primordiales en los laboratorios clínicos

Concentración de células: estos componentes de los líquidos biológicos se concentran para facilitar el diagnóstico microscópico del sedimento

Separación de sustancias Aclarar líquidos orgánicos Separar quilomicrones del suero o fraccionar las

distintas lipoproteínas Averiguar si un aislado es puro

Aplicación de la técnica en varios tipos de

análisis.

Análisis ambientales:

Separación de sustancias sólidas de suspensiones altamente concentradas.

Separación de aceites con bajo contenido de unidades de sedimentación presentes en agua

Separación de lodos aceitosos de agua.


análisis.

Análisis alimenticios:

En los alimentos se utiliza para separar la grasa de la leche del agua, y usar esta grasa para la producción de nata, mantequillas, entro otros

Filtrar los zumos de fruta, aceites, cervezas, desaguar el almidón


análisis.

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