CITOMETRÍA DE CITOMETRÍA DE FLUJO FLUJO

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

Citómetro de flujo es al aparato que es capaz de medir Citómetro de flujo es al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de células y organelas componentes y propiedades de células y organelas celulares que fluyen en una suspensión celular. celulares que fluyen en una suspensión celular.

Con la capacidad adicional de separar partículas Con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente de la suspensión líquida. selectivamente de la suspensión líquida.

La CMF se puede emplear para estudiar características La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en estructurales y funcionales de células o partículas en suspensión.suspensión.

E citómetro de flujo mide características celulares E citómetro de flujo mide características celulares individuales de un gran número de células, y además individuales de un gran número de células, y además permite medir características de poblaciones en permite medir características de poblaciones en muestras heterogéneas.  muestras heterogéneas. 

APLICACIONES: APLICACIONES:

La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes La CMF se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos: objetivos: En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje

reticulocitario, análisis de médula ósea. reticulocitario, análisis de médula ósea. En farmacología: estudios de cinética celular. En farmacología: estudios de cinética celular. En inmunología: subpoblaciones T, tipaje tisular, En inmunología: subpoblaciones T, tipaje tisular,

estimulación linfocitaria. estimulación linfocitaria. En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar

tratamiento. tratamiento. En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico,

sensibilidad a antibióticos. sensibilidad a antibióticos. En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico

prenatal.prenatal.

PROCESAMIENTO DE LAS PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:MUESTRAS:

La muestra a analizar debe encontrarse en forma La muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensión monodispersa. Hay muestras de suspensión monodispersa. Hay muestras como la sangre periférica, médula ósea, o otros como la sangre periférica, médula ósea, o otros fluidos biológicos, que precisan de un mínimo fluidos biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento; en cambio los tumores sólidos o procesamiento; en cambio los tumores sólidos o las muestras parafinadas necesitan de una las muestras parafinadas necesitan de una disgregación más o menos intensa (mecánica, disgregación más o menos intensa (mecánica, enzimática, etc.). enzimática, etc.).

CARACTERISTICAS GENERALES DE CARACTERISTICAS GENERALES DE

LOS CITÓMETROS DE FLUJO:LOS CITÓMETROS DE FLUJO: Para la lectura por citometría de flujo, las células Para la lectura por citometría de flujo, las células

son teñidas con fluorocromos que se unen son teñidas con fluorocromos que se unen específicamente a un constituyente celular. específicamente a un constituyente celular.

Las células son inyectadas en un flujo líquido Las células son inyectadas en un flujo líquido laminar y pasan una a una por un punto de laminar y pasan una a una por un punto de medida iluminado con luz de alta intensidad medida iluminado con luz de alta intensidad (láser).(láser).

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica deLa Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular análisis celular multiparamétricomultiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.una en una por delante de un haz de láser focalizado.

Cada célula en el punto de interacción produce Cada célula en el punto de interacción produce una señal fluorescente que es de intensidad una señal fluorescente que es de intensidad proporcional a su contenido en fluorocromo. proporcional a su contenido en fluorocromo.

Uno o varios detectores recogen la fluorescencia Uno o varios detectores recogen la fluorescencia emitida y transforman la señal a pulsos emitida y transforman la señal a pulsos eléctricos. También se recoge la luz dispersada eléctricos. También se recoge la luz dispersada por la célula, que es función del tamaño, forma, por la célula, que es función del tamaño, forma, y estructura de la misma. y estructura de la misma.

ESTRUCTURA BÁSICA DE UN ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO CITÓMETRO DE FLUJO

SISTEMA FLUÍDRICO - SISTEMA FLUÍDRICO - Inyección de la Inyección de la . muestra. . muestra.

- Cámara de flujo.- Cámara de flujo.* SISTEMA OPTICO - * SISTEMA OPTICO - Fuentes de luz.Fuentes de luz. - Detectores - Detectores

* SISTEMA ELECTRICO - * SISTEMA ELECTRICO - Amplificador Amplificador . . convertidor. convertidor. - Sistema . - Sistema . . informatico . informatico

SISTEMA FLUÍDRICO:SISTEMA FLUÍDRICO: Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en suspension a la muestra y otro Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en suspension a la muestra y otro

que lo envuelve a fin de darle estabilidad). Las células deben pasar una a una por que lo envuelve a fin de darle estabilidad). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan porque circulan a diferente presión. porque circulan a diferente presión.

SISTEMA ÓPTICOSISTEMA ÓPTICO::

Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: -          La -          La óptica de excitaciónóptica de excitación, compuesta de el láser , compuesta de el láser

y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz; y y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz; y -          La -          La óptica de lectura, óptica de lectura, compuesta por las lentes compuesta por las lentes

de recolección de luz emitida luego de la interacción de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes. específicas hacia los detectores correspondientes.

·         ·         FILTROS OPTICOSFILTROS OPTICOS: Son aquellos que seleccionan las : Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser: pueden ser:

-          DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long -          DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas); -         de onda no deseadas); -         

DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos: éstos hay tres tipos:

·         Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de ·         Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm) onda (Por ej: 620 – 640 nm)

·         Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud ·         Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm) de onda determinada ( Por ej: < 575 nm)

·         Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una ·         Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm) longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm)

SISTEMA ELECTRICO:SISTEMA ELECTRICO: El sistema El sistema electrónico convierte todo en señales digitales electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en la computadora para almacenar en la computadora

De forma esquemática, las células teñidas entran De forma esquemática, las células teñidas entran en la cámara de flujo de una en una y, al pasar en la cámara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son filtros y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información se recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema integra y analiza adecuadamente por un sistema informático. informático.

INFORMACION OBTENIDA POR INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO

Básicamente podemos obtener los siguientes Básicamente podemos obtener los siguientes datos: datos:

-          Tamaño de la célula -          Tamaño de la célula -          Complejidad de la membrana celular -          Complejidad de la membrana celular -          Con el uso de fluorocromos se puede -          Con el uso de fluorocromos se puede

deterctar hasta 3 colores con un mismo laser deterctar hasta 3 colores con un mismo laser

Señales de dispersión:Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión:miden dos fracciones de dispersión:-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección -La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.tamaño de la partícula que produce la dispersión.-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la -La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. complejidad de la estructura interna de la partícula.

Señales de Fluorescencia:Señales de Fluorescencia: Un Un fluorocromofluorocromo es una molécula química que absorbe luz es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula. (www.citometriadeflujo.com) fluorescentes de la partícula. (www.citometriadeflujo.com)

PROCESAMIENTO DE LOS DATOS. EL ANÁLISIS DE PROCESAMIENTO DE LOS DATOS. EL ANÁLISIS DE

DATOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO:DATOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO: Los citómetros producen una gran cantidad de información que puede ser Los citómetros producen una gran cantidad de información que puede ser

guardada en forma de histogramas que consiste en guardar toda la guardada en forma de histogramas que consiste en guardar toda la información obtenida para cada evento de modo que se pueden modificar las información obtenida para cada evento de modo que se pueden modificar las regiones de análisis y reconstruir los histogramas en función de nuevos regiones de análisis y reconstruir los histogramas en función de nuevos parámetros de selección. Para evitar interpretaciones subjetivas y aprovechar parámetros de selección. Para evitar interpretaciones subjetivas y aprovechar al máximo la información obtenida es necesario la ayuda de la informática y al máximo la información obtenida es necesario la ayuda de la informática y pruebas matemáticas estadísticas.  pruebas matemáticas estadísticas. 

La citometría de flujo permite el estudio de múltiples características celulares La citometría de flujo permite el estudio de múltiples características celulares combinando las lecturas sobre señales de dispersión de luz y señales combinando las lecturas sobre señales de dispersión de luz y señales fluorescentes. El empleo de fluorocromos con longitudes de onda de fluorescentes. El empleo de fluorocromos con longitudes de onda de excitación compatibles con la fuente de luz del citómetro y con distintos excitación compatibles con la fuente de luz del citómetro y con distintos espectros de emisión posibilita el estudio simultáneo de varias propiedades o espectros de emisión posibilita el estudio simultáneo de varias propiedades o características sobre celulas incluso en muestras heterogéneas. características sobre celulas incluso en muestras heterogéneas.

FINFIN