Diagnóstico de Laboratorio por Citometría de Flujo

La Plata 13 de Noviembre de 2010La Plata 13 de Noviembre de 2010

Diagnóstico de Diagnóstico de Laboratorio por Laboratorio por Citometría de Citometría de

FlujoFlujoLuis Pistaccio. Hospital de Niños “Sor María Ludovica”.Luis Pistaccio. Hospital de Niños “Sor María Ludovica”.

La Plata.La Plata.

Diagnóstico desde el Laboratorio de Diagnóstico desde el Laboratorio de LALA

Morfología.Morfología.

Citoquímica.Citoquímica.

Citogenético.Citogenético.

Biología Molecular.Biología Molecular.

Citometría de Flujo.Citometría de Flujo.

MorfologíaPte: con palidez, dolor articular, hematomas, Pte: con palidez, dolor articular, hematomas, fiebre, decaimiento y hepato esplenomegalia.fiebre, decaimiento y hepato esplenomegalia.Hemograma : GB: 100.000 /mmHemograma : GB: 100.000 /mm33 , Hto: 16 %, , Hto: 16 %, Plaq: 15.000 /mmPlaq: 15.000 /mm33 . Fla dif 100% linfocitos tipo . Fla dif 100% linfocitos tipo L1L1

Consulta hematológicaConsulta hematológica

MorfologíaPte: dolor articular, fiebre y hepato Pte: dolor articular, fiebre y hepato esplenomegalia.esplenomegalia.Hemograma : GB: 8.000 /mmHemograma : GB: 8.000 /mm33 , Hto: 27 %, Plaq: , Hto: 27 %, Plaq: 150.000 /mm150.000 /mm33 . Fla dif 52% linfocitos tipo L1, . Fla dif 52% linfocitos tipo L1, 38% neutrófilos y 10% monocitos38% neutrófilos y 10% monocitos

Consulta hematológicaConsulta hematológica

Observación, conocimientoObservación, conocimiento

Citometría de FlujoCitometría de Flujo

Esquema de ComponentesEsquema de ComponentesMuestraMuestra

Fluido isotónicoFluido isotónico

LáserLáser Sistema Sistema de de

detectordetectoreses

Celda de conteoCelda de conteo

Dispersión de luzLa dispersión de la luz. Parámetros físicos, La dispersión de la luz. Parámetros físicos, (morfométricos). Propiedades intrínsecas.(morfométricos). Propiedades intrínsecas.

Forward Scatter (FSC). Desde 0.5-1° a 10-20°.Forward Scatter (FSC). Desde 0.5-1° a 10-20°.

Side Scatter (SSC). Aprox. 90° a la derecha del haz Side Scatter (SSC). Aprox. 90° a la derecha del haz incidente. incidente.

Absorción de luz por fluorocromos pegados a las células y Absorción de luz por fluorocromos pegados a las células y emisión de luz fluorescente. Propiedades extrínsecas ya emisión de luz fluorescente. Propiedades extrínsecas ya que es necesario el agregado de un compuesto exógeno.que es necesario el agregado de un compuesto exógeno.

Fluorocromos unidos a Ac Mo.Fluorocromos unidos a Ac Mo.

Fluorocromos que se unen a componentes Fluorocromos que se unen a componentes celulares.celulares.


1 láser 3 colores1 láser 3 colores

Time

Time

FL1

Time

FL3

Data Processor

SSC

FSC FL2

3 lásers 8 colores3 lásers 8 colores

FL8

Data Data ProcessingProcessing

SSC

FSC FL1

FL3

FL2

FL5

FL6

FL7

FL4

Histograma

FL 1

Cou

nt

Positividad

Histograma

FL 1

Cou

nt

Positividad

Intensidad de fluorescencia

Histograma de dos parámetros (Quad-stat)

FL2

FL1

B3B3

B1B1 B2B2

B4B4

B1 positivo para FL1B1 positivo para FL1B2 Doble positivoB2 Doble positivoB3 Doble negativoB3 Doble negativoB4 Positivo para FL2B4 Positivo para FL2

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.FLUJO PARA EL ESTUDIO DE L.A.

Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Subclasificación inmunológica de LLA B y T.Subclasificación inmunológica de LLA B y T. Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA. Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.

Diagnóstico: M.O. normal

LinfocitosLinfocitos MonocitosMonocitos

Mieloide madura Mieloide madura Mieloide inmadura Mieloide inmadura

EritroideEritroide

Diagnóstico: Leucemia Aguda

Diagnóstico Diagnóstico

En general la población a estudiar es un En general la población a estudiar es un porcentaje considerable (20 %). porcentaje considerable (20 %). Alteración de la distribución normal de los Alteración de la distribución normal de los componentes de la MO. componentes de la MO. Aparición de una población con Aparición de una población con inmunofenotipo anómalo.inmunofenotipo anómalo. Asignación de linaje según inmunofenotipo Asignación de linaje según inmunofenotipo obtenido.obtenido.


Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.Diagnóstico de línea: linfoide-mieloide.

Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA. Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.

Subclas. Inmunológica de LLA B y T Subclas. Inmunológica de LLA B y T

cCD22+, cCD79a+, CD19+, HLA-DR+

Clasificación LLA de precursores Clasificación LLA de precursores BB

Pro B: CD10 -

Común: CD10+, cad -

Pre B: CD10+/-, cad +, Ig Sup -

B madura: CD10+/-, Ig Sup+ ( ó )

Clasificación EGIL Clasificación EGIL

cCD3+, CD7+, TCR+/-, HLA-DR-

Clasificación LLA de precursores Clasificación LLA de precursores TT

Pro T: CD2 -, CD5 - , CD8 -

Pre T: CD2+,y/o CD5+ y/o CD8+

Intermedia: CD1a+,CD4+/CD8+,CD3+/-

T madura: CD1a-, CD3+ , TCR

Clasificación EGIL Clasificación EGIL



Detección de LLA hiperdiploides.Detección de LLA hiperdiploides. Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.


Diagnóstico de línea de LMA.Diagnóstico de línea de LMA.

Diagnóstico de Linaje en LMADiagnóstico de Linaje en LMA

La correlación con la clasificación FAB es La correlación con la clasificación FAB es limitada.limitada.

Hasta hace unos años sólo diagnóstico en M0 y Hasta hace unos años sólo diagnóstico en M0 y M7.M7.

Al aumentar el número de fluorocromos y los Ac Al aumentar el número de fluorocromos y los Ac Mo disponibles mayor capacidad diagnóstica.Mo disponibles mayor capacidad diagnóstica.

Correlación inmunofenotipo-genotipo.Correlación inmunofenotipo-genotipo.

Score EGIL Puntuación Score EGIL Puntuación BifenotípicasBifenotípicas

Linaje B Linaje T Linaje mieloide Puntos

cCD79a cCD3 aMPO 2

cIgM TCR 2

cCD22 TCR 2

CD19 CD2 CD13 1

CD20 CD5 CD33 1

CD10 CD8 CD117 1

Tdt Tdt CD14 0.5

CD7 CD15 0.5

CD1a CD64 0.5

Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Para asignar un linaje determinado a los blastos, el score debe ser >2Una LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linajeUna LA se define como bifenotípica si el puntaje resulta >2 para más de un linaje



Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión. Detección de EMR.Detección de EMR.



Diagnóstico de LLA hiperdiploidesDiagnóstico de LLA hiperdiploides

Indice de ADN

•Importante en pronóstico de LLA.Importante en pronóstico de LLA.



Detección de proteinas de fusión.Detección de proteinas de fusión.



Diagnóstico de LLA hiperdiploidesDiagnóstico de LLA hiperdiploides

Detección de EMR.Detección de EMR.

EMR: DEFINICIONEMR: DEFINICION

Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, Enfermedad indetectable a la microscopía óptica, que puede expandirse en cualquier momento, que puede expandirse en cualquier momento, haciéndose evidente como una recaída de la haciéndose evidente como una recaída de la enfermedad. (enfermedad. (Foroni et al. 2002).Foroni et al. 2002).

Consiste en la permanencia de un clon anormal, en Consiste en la permanencia de un clon anormal, en cantidades indetectables para la microscopía óptica, cantidades indetectables para la microscopía óptica, durante o al finalizar el tratamiento.durante o al finalizar el tratamiento.

Actualmente es un pilar básico para:Actualmente es un pilar básico para:

• Seguimiento de la enfermedad.Seguimiento de la enfermedad.

• Diagnóstico precoz de recaída.Diagnóstico precoz de recaída.

• Conducta pretransplante. Conducta pretransplante.

ALLIC BFM 20ALLIC BFM 201010: C: Clasificaciónlasificación

DIAGNÓSTICO

DIA 8

DÍA 15

DÍA 33

GRUPOS DE RE RI RA

RIESGO 13% 66% 21%

RECAÍDAS 5% 22% 40%

EDAD 1-5aGB <20 x 109/L

BLASTOS D8 <1000

EDAD <1 ≥6aGB ≥20 x 109/L

BLASTOS D8 <1000

t(9;22) t(4;11)BLASTOS D8 ≥1000

HIPODIPLOIDIA

M1/M2 M3 M1/M2 M3 M1/M2/M3

M1 M2/M3 M1 M2/M3 M1/M2/M3

<0.1% >01- <10% >10%ERM Día 15 >01- <10% >10% TODAS

EMR: Métodos de DetecciónEMR: Métodos de Detección

SensibilidadSensibilidad

10-1 a 10 –2

10-2

10-1 a 10-2

10-1 a 10-4

10-3 a 10-5

Citogenética convencionalCitogenética convencional

FISHFISH

Southern BlotSouthern Blot


Biología Molecular: PCRBiología Molecular: PCR

Citometría de Flujo: Caracterización de Citometría de Flujo: Caracterización de blastos en EMRblastos en EMR

FSC- SSC particular.FSC- SSC particular.

Antígenos: Antígenos:

Aumento de expresión (over expression)Aumento de expresión (over expression)

Disminución de la expresión (under expression).Disminución de la expresión (under expression).

Asincronismo madurativo.Asincronismo madurativo.

Infidelidad de linaje.Infidelidad de linaje.

LAIP Inmunofenotipo asociado a Leucemia aguda.LAIP Inmunofenotipo asociado a Leucemia aguda.

LLA- B LLA-T

AAsincroníasincronía

MMadurativaadurativaCD34+CD34+//CD10+d CD10+d

CD34+ CD20+CD34+ CD20+

CDCD7+7+/CD/CD34+ 34+ (ectópico)(ectópico)

SobreexpresSobreexpresiónión CD10CD10; CD58; CD34; ; CD58; CD34; CD11a;CD11a; CD19 etc.CD19 etc.

CD7CD7; CD99; CD99

Disminución de Disminución de la expresiónla expresión

CD45CD45; CD38; CD20; ; CD38; CD20; CD11a; CD19 etc.CD11a; CD19 etc.

CD3 superfCD3 superf; CD45; ; CD45;

Infidelidad de Infidelidad de linajeslinajes

LLA-My+LLA-My+

CD13 CD13

CD33 CD33

LLA-My+LLA-My+

CD13 CD13

CD33 CD33

CF: LLA Fenotipos aberrantesCF: LLA Fenotipos aberrantes

EMR por CF: conceptos EMR por CF: conceptos importantesimportantes

Panel completoPanel completo de marcación al diagnóstico para de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP)seguimiento. (LAIP)

Conocimiento de la expresión de los marcadores en Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. (MO normales y en MO en regeneración. (Caminos Caminos madurativosmadurativos))

Evaluación de posibles Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cambios fenotipícos en cada casocada caso..

Evaluación de cambios en la intensidad de Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el expresión por el tratamientotratamiento..

EMR por CF: ¿Qué paneles EMR por CF: ¿Qué paneles utilizar? utilizar?

Los distintos grupos usan paneles de marcación y de EMR Los distintos grupos usan paneles de marcación y de EMR según su experiencia, conocimiento y posibilidades.según su experiencia, conocimiento y posibilidades.

La mayoría utiliza una columna (“backbone”) de 2, 3 o 4 La mayoría utiliza una columna (“backbone”) de 2, 3 o 4 marcadores con el mismo fluorocromo (CD45, 19 , 34 y CD10 marcadores con el mismo fluorocromo (CD45, 19 , 34 y CD10 en LLA B y CD45, CD7, CD3 y/o CD5 en LLA T) que se en LLA B y CD45, CD7, CD3 y/o CD5 en LLA T) que se repite en los distintos tubos.repite en los distintos tubos.

Los paneles de los distintos grupos son muy similares Los paneles de los distintos grupos son muy similares entre sí.entre sí.

“Flow cytometry for fast and sensitive diagnosis an follow-up of haematological malignancies”

Secuencia de Marcación

Euroflow.orgEuroflow.org

LLA linaje BLLA linaje B

BlastosBlastos

EMR por CF: conceptos EMR por CF: conceptos importantesimportantes

Conocimiento de la expresión de los marcadores Conocimiento de la expresión de los marcadores en MO normales y en MO en regeneración. en MO normales y en MO en regeneración. ((Caminos madurativosCaminos madurativos))

Evaluación de posibles Evaluación de posibles cambios fenotipícos en cambios fenotipícos en cada casocada caso..

Evaluación de cambios en la intensidad de Evaluación de cambios en la intensidad de expresión por el expresión por el tratamientotratamiento..

Panel completoPanel completo de marcación al diagnóstico de marcación al diagnóstico para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el para caracterizar al blasto con el fin de optimizar el seguimiento. (LAIP)seguimiento. (LAIP)

CD10

Diferenciación normal

Blastos B Blastos B

Blastos B

Blastos B

CD20

Caminos madurativos y blastosCaminos madurativos y blastos

CD20CD20

CD10CD10

DiagnósticoDiagnóstico

Día 15Día 15 Recaída postTtoRecaída postTto

Cambios Fenotípicos

10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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•Considerar Considerar cambios cambios fenotípicos en las fenotípicos en las recaídasrecaídas

Modulación con el tratamientoModulación con el tratamiento

Typical but not uniformpatterns (“normalization”):up: CD11a, CD20, CD45down: CD10, CD34, TdTCD99~ stable: CD19, CD58

Gaipa et al., Leukemia 19: 49 (2005)


SeguimientoSeguimiento Día 33Día 33

CD19 PC5CD19 PC5

CD10 PECD10 PE

MOMO SPSP

•ALL: drug-induced antigen expression modulationby steroid-containing induction therapy

10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 10104410100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044

10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044 10100 0 10101 1 10102 2 10103 3 101044

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Modulación con el tratamientoModulación con el tratamiento


Día 33Día 33

CD 10CD 10

CD 20CD 20

CD 20CD 20

CD 34CD 34

CD 34CD 34

CD 66cCD 66c

CD 66cCD 66c

10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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10100 0 10101 1 10102 2 10103 3

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3

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10

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Resumiendo...Resumiendo...

1.1.Actualmente imprescindible Citómetros de al Actualmente imprescindible Citómetros de al menos 4 colores.menos 4 colores.

2.2.Estudio de inmunofenotipo de M.O. Normales y Estudio de inmunofenotipo de M.O. Normales y regenerativas. regenerativas.

3.3. Diseñar paneles de tubos que determinen una Diseñar paneles de tubos que determinen una óptima sensibilidad diagnóstica. óptima sensibilidad diagnóstica.

4.4.Utilizar paneles de marcación lo más completos Utilizar paneles de marcación lo más completos posibles.posibles.

Resumiendo...Resumiendo...

5.5.Búsqueda de EMR en días preestablecidos del Búsqueda de EMR en días preestablecidos del tratamiento. Considerar cambios por el Tto.tratamiento. Considerar cambios por el Tto.

6.6.Considerar sobreexpresiones, subexpresiones Considerar sobreexpresiones, subexpresiones expresión aberrantes e infidelidades de linaje expresión aberrantes e infidelidades de linaje que nos faciliten la tarea en la búsqueda de EMR. que nos faciliten la tarea en la búsqueda de EMR.

7.7. Evaluar posibles cambios fenotípicos en Evaluar posibles cambios fenotípicos en recaídas.recaídas.

8.8.Estandarización del protocolo para el Estandarización del protocolo para el procesamiento de las muestras, el uso de procesamiento de las muestras, el uso de monoclonales, marcas comerciales de Ac Mo y monoclonales, marcas comerciales de Ac Mo y análisis de datos.análisis de datos.

Muchas gracias por su atención.Muchas gracias por su atención.

[email protected]@hotmail.comm

www.euroflow.orgwww.cure4kids.org

Diagnóstico de Laboratorio por Citometría de Flujo

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