FUNDAMENTOS DE LAFUNDAMENTOS DE LACITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

RelevanciaRelevancia

Estudio directo de las patologías Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología:mediante esta tecnología:

ConocimientoConocimiento y y búsquedabúsqueda de de información de carácter diagnóstico y información de carácter diagnóstico y pronósticopronóstico

¿Qué es la citometría de flujo¿Qué es la citometría de flujo??

FSC

90º90º2- 4º

Columna de muestra

Meeting pointMeeting pointLáserLáser

Detecto

res de lu

z

Detecto

res de lu

z

AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización

RepresentaciónRepresentación y Analisis y Analisis

FlujoFlujo

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJOFLUJO

- Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes - Medidas multiparamétricas (x, y, z) en grandes números de células individuales (miles).números de células individuales (miles).- Aumento en la representatividad de las muestras - Aumento en la representatividad de las muestras estudiadas y en la precisión de las medidas.estudiadas y en la precisión de las medidas.

CámaraCámara de flujo de flujo

FSC

90º90º

Fluido envolvente

Columna de muestra

Luz dispersada lateralmente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, y luz fluorescente, = 90= 90º

Luz incidenteLuz incidente

Luz dispersada hacia delante, Luz dispersada hacia delante, ==2- 4º

Información Que Se Obtiene: LuzInformación Que Se Obtiene: Luz

- - Propiedades Al Atravesar La Luz:Propiedades Al Atravesar La Luz: - Luz Reflejada O Difractada - Luz Reflejada O Difractada

Propiedades Fluorescentes:Propiedades Fluorescentes: - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…) - Fluorocromos (Fitc, Pe, Apc, Tc…)

Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light )

Detector FSC

Detector de 90º SSC

Laser

DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD HACIA DELANTE (FORWARD

SCATTERED LIGHT, FSC)SCATTERED LIGHT, FSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de FSC convierte luz dispersada El detector de FSC convierte luz dispersada hacia adelante en un pulso de voltaje hacia adelante en un pulso de voltaje

proporcional al tamaño de la célula/particulaproporcional al tamaño de la célula/particula

DETECCION DE LUZ DISPERSADA DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT,

SSC)SSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l

contenido en orgánulos membranosos contenido en orgánulos membranosos (granularidad)(granularidad)

R5

R6

R7

GranulocitosGranulocitosMonocitosMonocitos

LinfocitosLinfocitos

Morfología y antígenos de diferenciación en el Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celularanálisis de la heterogeneidad celular

Laser

Detectores de fluorescencia

Freq

Fluorescencia

Detector

Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)

FluorescenciaFluorescencia

FSCFSC

FL-1FL-1

FL-2FL-2

FluorescenciaFluorescenciaProceso por el que una molécula absorbe luz, Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.emitiendo un fotón. Parte de la energía se pierde en las transiciones Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.que fue absorbido.

t (t (s)s)

EE

11<<22

11

22

EspectrosEspectrosEspectro de AbsorciónEspectro de Absorción – Representación de la intensidad de absorción de Representación de la intensidad de absorción de

luz de distintas las longitudes de onda por una luz de distintas las longitudes de onda por una sustancia.sustancia.

Espectro de EmisiónEspectro de Emisión – Representación de la intensidad de emisión de una Representación de la intensidad de emisión de una

sustancia excitada con luz de una determinada sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda.longitud de onda.

nm

excitaciónexcitación medidamedida

Inte

nsid

ad d

eIn

tens

idad

de

fluor

e sce

ncia

fluor

e sce

ncia

Fluoresceina (FITC)Fluoresceina (FITC)

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Rela

tive Inten

sity

Wavelength

ProteinasProteinas

ExcitaciónExcitaciónEmisiónEmisión300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Proceso de señalesProceso de señales 1. Separación de señales luminosas1. Separación de señales luminosas

2. Detección de señales luminosas2. Detección de señales luminosas 3. Amplificación de señales eléctricas3. Amplificación de señales eléctricas 4. Corrección de errores 4. Corrección de errores

– Compensación de señalesCompensación de señales– Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).Discriminación de señales debidas a dobletes (proceso de pulsos).

6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales6. Transformación de señales eléctricas analógicas en digitales 7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante7. Almacenamiento matricial (list mode) de la información resultante

PMT

PMT

PMT

PMT

FiltrosDicroicos

BandpassFiltros

Optica en los citómetros de flujo

Laser

1

2

3

4

Flujo Celular

EtidioEtidio

PEPE

Acido ParináricoAcido Parinárico

Texas RedTexas Red

PE-TR Conj.PE-TR Conj.

PIPI

FITCFITC

600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Laseres

comunes

DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIATC

PerCPQR

Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores

FluorocromosFluorocromos

Compensación de señalesCompensación de señalesFundamento Fundamento Superposición Superposición de espectros de emisión. de espectros de emisión. Parte de la señal de emitida Parte de la señal de emitida por un fluorocromo es leída por un fluorocromo es leída por el detector de otro colorpor el detector de otro colorConcepto Concepto sustracción de sustracción de una parte de la señal medida una parte de la señal medida en un color a la señal en un color a la señal medida en otro colormedida en otro color

FL-2FL-2 - %FL1- %FL1

excitaciónexcitación

medidamedida

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

iaIn

tens

idad

de

fluor

esce

ncia

FL-1FL-1 FL-2FL-2

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓNINFORMACIÓN

NN

1122334455667788......

1000010000

FSCFSC

2222334433442222......

SSCSSC

1111222211223388......

FL-1FL-1

1111334411112211......

FL-2FL-2

1122331122331122......

FL-3FL-3

1133334411113344......

FL-4FL-4

2222333355551122......

TIEMPOTIEMPO

1111111122222222......

Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en Los pulsos de“Voltaje”(señales analógicas) son transformadas en señales digitalesseñales digitales Las señales digitales Las señales digitales almacenanalmacenan en un soporte informático en en un soporte informático en modo listado (almacenamiento multiparamétrico).modo listado (almacenamiento multiparamétrico).

PROCESO DE INFORMACION

HistogramasHistogramasDiagramas biparamétricosDiagramas biparamétricos

Proceso de la información Proceso de la información generadagenerada

1.1. Representación de la informaciónRepresentación de la información

2.2. Selección de la informaciónSelección de la información

3.3. Reducción de la informaciónReducción de la información

4.4. De la célula a la población celularDe la célula a la población celular

Representación monoparamétrica de datos. Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de x (intensidad de fluorescencia) el número de

células que emiten esa intensidadcélulas que emiten esa intensidad..

M1

HistogramasHistogramas

SSCSSC

FSCFSC

FL-1FL-1

FL-2FL-2

FL-3FL-3

Representación biparamétrica en 2DRepresentación biparamétrica en 2DDiagrama de puntos / dot plot

+

+--

Representación Representación simultánea de dos simultánea de dos parámetros parámetros XX e e Y Y para un para un conjunto de células.conjunto de células. XX representa el valor de la representa el valor de la señal de un parámetroseñal de un parámetro. .

YY representa el valor de la representa el valor de la señal del otro.señal del otro.

++-

-FL-1FL-1

FL-2

FL- 2

Diagrama de dot plot density

Usa colores para representarUsa colores para representardensidaddensidad

Estadisticas biparamétricasEstadisticas biparamétricas

Cuadrantes Cuadrantes Combinación de Combinación de

dos umbrales de positividad dos umbrales de positividad

para dos parámetrospara dos parámetros

Número de célulasNúmero de células

% de células% de células

+--

++

-

+-

Quadrant Statistics

File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear ValuesSample ID: Patient ID: Tube: tube #7 Panel: BronquirisAcquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No GateGated Events: 5000 Total Events: 5000X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)Quad Location: 15, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo MeanUL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43

UULL UURR

LLLL LLRR