Citometra de flujo

INTRODUCCIN La citometra de flujo se inici en la dcada de los 60 como un importante avance en el proceso de contar y medir el tamao de partculas o clulas en poblaciones no homogneas.

Citmetro de flujo Aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de clulas y organelos celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. Los sorters tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citmetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar partculas selectivamente

Parmetros medibles por CMF

APLICACIONES La CMF se puede emplear para estudiar caractersticas estructurales y funcionales de clulas o partculas en suspensin. Las aplicaciones fundamentales de esta tcnica se dan en biologa y medicina y son la identificacin de antgenos celulares mediante tcnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.

La CMF se ha utilizado En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje reticulocitario, anlisis de mdula sea. En farmacologa: estudios de cintica celular. En inmunologa: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulacin linfocitaria. En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento. En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos. En gentica: cariotipo, diagnstico de portador, diagnstico prenatal.

HISTORIA DE LA CMF El primer contador celular automtico fue desarrollado por Moldavan (1934) y consista en un tubo capilar por el que se hacan pasar clulas teidas, el capilar estaba montado sobre un microscopio ptico con un objetivo sobre el cual haba un detector fotoelctrico que registraba el paso de clulas como un cambio en la luz que reciba. Tuvo muchos problemas con el grosor del capilar y obstruccin del mismo, dificultad en el mantenimiento de presiones, etc..

Cmara de flujo y fluido de arrastre Un importante avance para el desarrollo de la citometra de flujo se consigui en 1953 al inventar Crosland y Taylor una cmara de flujo basada en la inyeccin de la muestra en el seno de un fluido de arrastre a travs de un capilar que se estrecha y centra el flujo de la misma

Con este sistema se evitaban dos grandes problemas el capilar tiene mayor dimetro con lo que su obstruccin es mucho ms difcil permite mejor el enfoque de la muestra con la fuente de luz. Es la base de las cmaras que se usan en la actualidad.

Citmetro de Coulter W. Coulter describi (1949) el principio que lleva su nombre. Desarroll un contador celular basado en el cambio que produce una partcula al pasar por un agujero en el que hay una diferencia de potencial conocida. En 1966 tambin us cambios en ondas de radiofrecuencia.

Contador diferencial En 1953 Parker y Horst describen el primer contador diferencial hematolgico usando clulas teidas en rojo (hemates) y azul (leucocitos), luz visible y detectores para luz roja o azul.

el uso de la espectrofotometra (luz absorbida) para cuantificar ADN la medida multiparamtrica de luz dispersada. Fue el primero en emplear histogramas biparamtricos. Algo ms tarde desarroll un sorter neumtico. Introduciendo el empleo de sustancias fluorescentes que permiten una mejor seal/ruido que los colorantes de absorcin.

Katmentsky (1965) introdujo dos avances capitales en CMF

1967-69 Van Dilla Describe el primer citmetro de flujo con configuracin ortogonal usando la cmara descrita por Crosland-Taylor. Demostraron la relacin existente entre ploida e intensidad de fluorescencia en la cuantificacin de ADN, y producen histogramas donde se pueden visualizar las fases del ciclo celular (G0G1, fase S, G2M)

Configuracin ptica de un CMF

Sorter electrosttico Fulwyler describe el proceso de sorter electrosttico en 1965 basndose en la tecnologa de las impresoras de chorro de tinta. Sistema mayoritariamente empleado en la actualidad.

Durante los aos 60 y 70 se producen avances en la tecnologa y su aplicacin a la citometra de flujo pero hasta final de los aos 70 y principio de los 80 existan pocas aplicaciones de la citometra de flujo de inters biolgico. Los esfuerzos se dirigan principalmente en mejorar las prestaciones de los instrumentos que se estaban desarrollando.

Avances en las aplicaciones de la CMF en la investigacin mdico-biolgica Reinherz (1975) emplea la tecnologa de los anticuerpos monoclonales de Kholer y Milstein para identificar subpoblaciones celulares en funcin de antgenos de superficie. Loken (1977) mide simultneamente dos antgenos celulares con un solo lser, emplea la compensacin electrnica de la seal entre isotiocianato de fluorescena (FITC) y la tetralmetilrodamina. Oi (1982) introduce las ficobiliprotenas como flourocromos (ficoeritrina).

Avances en las aplicaciones de la CMF en la investigacin mdico-biolgica Dazrynkiewicz y Traganos (1976-79) estudian con naranja de acridina el ADN y ARN. Andreeff usa dicha tcnica para clasificar las leucemias. Grynkiewicz (1985) introduce el Indo 1 para medir concentracin intracelular de calcio. Entre 1979-80 varios autores describen tcnicas citomtricas para medir condiciones fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superficie), y Thorell (estado redox).

Avances en las aplicaciones de la CMF en la investigacin mdico-biolgica Hedley (1983) pone a punto una tcnica para el estudio por citometra de flujo del ADN de ncleos de muestras parafinadas. Gratzner (1975) describe la tcnica de la bromodeoxiuridina (BrdU) y los anticuerpos contra ella, que permite ampliar el estudio de las fases del ciclo celular. Gray (1975) realiza el cariotipo por citometra de flujo. Este procedimiento fue posteriormente mejorado por Carrano.

Fluorocromos Ofrecen un mtodo sensible para obtener informacin acerca de la estructura, funcin y vitalidad de las clulas. Modo de uso:1. unin covalente del fluorocromo a molculas que se unen especficamente a componentes celulares, y 2. fluorocromos que varan sus caractersticas en funcin del microambiente que les rodea.

Fluorocromos utilizados en CMF

Propiedades ideales de un fluorocromo alto coeficiente de extincin a la longitud de onda de excitacin (probabilidad de absorber la luz), alto rendimiento cuntico (emisin de luz), elevada fotoestabilidad, corto estado de excitacin.

Si el fluorocromo va a estar unido a algo, ste ser insensible a cambios de pH, polaridad y microambiente. Recordar que a longitudes de onda inferiores a 500 nm se produce una alta autofluorescencia celular debido a las flavinas.

Marcadores fluorescentes de unin covalente Son fluorocromos que reaccionan y se usan para marcar protenas, lpidos, o bien otras molculas biolgicas. Deben ser suficientemente selectivos y reactivos. Por su capacidad de unin se emplean cromforos con grupos isotiocianato, clorotrirzinil, y steres de succinimida.

Fluorocromos covalentes ms empleados (excitables a 488 nm) FLUORESCEINA. RODAMINA, ROJO TEXAS, CIANINAS FICOERITRINA (ficobiliprotena) , famoso por su gran absorcin, rendimiento y fotoestabilidad.

Fluorocromos que se unen no covalentemente a estructuras celularesDebido a su composicin molecular se unen a determinados componentes celulares. Marcadores del contenido en ADN y ARN Segn el tipo son ms o menos especficos para el ADN, ARN, o determinadas bases. Hoechst 33342 (Unin a A-T, vital), DAPI (A-T), DIPI (A-T), cromomicina A3 (Unin a G-C), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C). Naranja de acridina se une al ADN y ARN pero tiene la particularidad de emitir en diferente longitud segn al tipo de cido nucleico al que est unido. Ioduro de propidio (unin intercalante) que se excita con un lser de 488 nm.

Fluorocromos que se unen no covalentemente a estructuras celulares Marcadores del potencial de membrana Cianinas y la rodamina 123. Tambin marcar mitocondrias debido a la alta diferencia de potencial entre su membrana.

Marcadores de membrana y lpidos marcadores que diferencian compartimentos con distinto pH: poco usados en citometra de flujo.

Marcadores fluorescentes que son sensibles al microambiente que les rodea Varan su espectro de absorcin o emisin en funcin de las caractersticas del microambiente que les rodea. Se emplean para la determinacin de diversos estados funcionales celulares pH (6-carboxi-fluorescena, 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno, hidroxipireno trisulfato), calcio (quin II, fura-2, indo-1), potencial red-ox (diclorofluorescena, NADH, NADHP), actividad enzimtica (substratos que por accin del enzima varan su fluorescencia o espectro), polaridad (anilino-naftalina-sulfato o ANS), viscosidad/fluidez.

Tcnicas inmunofluorescentes, inmunofenotipaje En la diferenciacin y maduracin celular se expresan genes, algunos de los productos especficos se expresan en la superficie celular, esto permite caracterizar subpoblaciones celulares. La produccin de inmunoglobulinas (anticuerpos) a partir de un solo linfocitos B (anticuerpos monoclonales) permite identificar antgenos muy especficamente. El fluorocromo que se conjuga al anticuerpo acta como un simple marcador con el que se pueden marcar distintos anticuerpos (facilita la standardizacin del sistema ptico del citmetro).

Uso de sorters La unin del anticuerpo a la clula no la mata, lo que permite utilizar sorters para la caracterizacin funcional o bioqumica posterior en funcin de marcadores celulares de superficie.

Factores limitantes La frecuencia relativa de las clulas condiciona la estrategia de marcaje para su bsqueda La elevada diferencia de expresin en la superficie celular de los antgenos (incluso en poblaciones clonadas). La estrategia tambin depende de lo precisos que deban ser los resultados.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDO Aumento de la seal fluorescente: Antisueros policlonales: mezcla de anticuerpos heterlogos. Son necesarios antgenos puros para inmunizar y el suero necesita de repetidas purificaciones para que sea suficientemente especfico. Tienen la ventaja frente a los anticuerpos monoclonales que son heterogneos y pueden reconocer diferentes partes de la molcula del antgeno, y el resultado final es que producen una seal fuerte de fluorescencia.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDO Aumento de la seal fluorescente: Anticuerpos monoclonales: Los clonas resultantes producen cantidades de anticuerpo monoclonal que puede ser purificada y obtenido indefinidamente. La ventaja es que no se necesita de antgenos puros para inmunizar puesto que se seleccionan clulas determinadas y el anticuerpo es muy especfico ( se elige el mejor, ms especfico, ms fcil de conjugar con el fluorocromo, etc.).

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDO Aumento de la seal fluorescente:

Tincin inmunofluorescente: se pueden usar tcnicas directas (poco background pero fluorescencia dbil) o indirectas (aumenta el background pero aumenta la fluorescencia por amplificacin de la unin). Para reducir el marcaje inespecfico por receptores Fc se pueden emplear fragmentos F(ab)2 o la tcnica de la streptavidina-biotina.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDO Aumento de la seal fluorescente:

Seleccin del fluorocromo: es importante el nmero de molculas unidas al anticuerpo, porque si aumenta, aumenta la fluorescencia, hasta que por proximidad se produce artefactuacin de la emisin o del espectro.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDODisminucin del background y ruido: Background (marcaje inespecfico): Se puede reducir utilizando slo la parte F(ab)2 de los anticuerpos, Evitar clulas muertas que captan al anticuerpo de modo inespecfico (o discriminar con ioduro de propidio); procesamiento de controles negativos y seleccin de seal inespecfica, correccin informtica de solapamiento espectral en doble marcaje. Hay que tener en cuenta el proceso de transferencia de energa cuando se marca con dos fluorocromos (muy cercanos en el espacio).

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDODisminucin del background y ruido:

Autofluorescencia: la cantidad de autofluorescencia depende del tipo celular y de sus estado de activacin , y se atribuye a las flavinas y otros coenzimas. Depende tambin de la longitud de onda del lser (disminuye al aumentar la longitud de onda). Tambin hay que eliminar el ruido producido por el aparato con filtros pticos eficientes y compensacin de color.

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDODisminucin del background y ruido:

Otras tcnicas : Aumentar la frecuencia relativa de las clulas deseadas en una poblacin heterognea mejora su discriminacin del restante de clulas: Se puede conseguir purificando las clulas antes de su procesamiento por citometra (lisis de los hemates centrifugacin, etc.) con anlisis multiparamtrico (emplear dispersin frontal y lateral de luz para diferenciar a los linfocitos, la resistencia elctrica para discriminar en funcin de tamao, ioduro de propidio para eliminar las clulas muertas, etc..).

INCREMENTO DE LA SEAL/RUIDODisminucin del background y ruido:

Almacenamiento de las muestras : La partculas o clulas deben ser analizadas inmediatamente despus del marcaje inmunofenotpico o deben ser fijadas. Las clulas vivas se deben guardar en medios de cultivo y con un 0,1 % de NaH3 en hielo (4 grados) para evitar cambios en las condiciones biolgicas. Si se puede (no se precisa viabilidad celular) las clulas se pueden fijar en un 1 % de paraformaldehido en PBS y guardar a 4 grados en oscuro, con lo que no disminuye la fluorescencia ni cambian las caractersticas de dispersin de la luz y se puede demorar la lectura varios das.

PRESTACIONES DE LOS CITMETROS DE FLUJO Sensibilidad: cantidad mnima de molculas de un fluorocromo determinado que pueden ser medidas con cierta precisin (resolucin), para la luz dispersada, es el tamao menor o ndice de refraccin que puede ser medido con cierta precisin. Depende de muchos factores, incluso del fluorocromo. La sensibilidad aumenta si se disminuye la velocidad de flujo (paso) manteniendo constante el dimetro del flujo interno (muestra).

PRESTACIONES DE LOS CITMETROS DE FLUJO Resolucin (expresado como coeficiente de variacin): es la reproductibilidad de la seal producida por clulas o partculas idnticas.

Coefficient of Variation%CV Definition =

St.Dev x 100 MEAN

CV=3.0 CV=3.0

MEAN Crucial in establishing: alignment Fluidic stability Staining of cells

PRESTACIONES DE LOS CITMETROS DE FLUJO Velocidad de medida: Es la velocidad media mxima a la que las clulas pueden ser medidas sin exceder una frecuencia determinada de coincidencias (dos clulas detectadas como una sola). En los citmetros lser oscila alrededor de 5.000 clulas/segundo.

Ciclo celular y aneuploida estudiados por CMF Los cidos nuclicos son polmeros formados por un esqueleto de fosfatoazcar (ribosa/desoxirribosa) 5-3-5 y esta ltima con una base (ADN: AT y GC; ARN: AU y CG). Los cidos nuclicos pueden ser de hebra sencilla o apareados en una doble hebra complementaria. Para una buena lectura interviene: el fluorocromo, equipo, muestra, etc..

Fluorocromos en el anlisis del DNA: La seal fluorescente es proporcional a la unin estequiomtrica del fluorocromo al cido nucleico. Se clasifican en funcin de su mecanismo de unin en: intercalantes (bromuro de etidio, ioduro de propidio, naranja de acridina); unin preferente a AT (DAPI, DIPI, Hoechst); unin preferente a CG (mitramicina, olivomicina, cromomicina A3).

Fluorocromos en el anlisis del DNA: Phenantidium: del tipo del bromuro de etidio y ioduro de propidio. Especificidad por el ADN y ARN de doble cadena (tratamiento con ARNasa si slo se desea medir ADN). Excitacin en el azul/verde-rojo. Precisan de clulas muertas y fijadas, disminuye la intensidad de la seal y la especificidad la unin secundaria a los grupos fosfato, proteasas, ADN estructura Z, bromodeoxiuridina. No se afecta por el pH y la composicin de bases.

Fluorocromos en el anlisis del DNA: Bismenimidazoles y afines: tipo Hoechst, DAPI y DIPI. Tienen elevada especificidad por el ADN y se unen a las bases AT. Excitacin en el ultravioleta-azul. Tien clulas vivas. Disminuye su intensidad con el pH cido (que aumenta la unin secundaria), concentracin en exceso, bromodeoxiuridina, y la unin secundaria. El DAPI y DIPI se usan para hacer las bandas cromosmicas.

Fluorocromos en el anlisis del DNA: Cromomicina y similares: como la cromomicina A3, mitramicina, olivomicina. Se unen a las bases CG del ADN. Excitacin en el espectro ultravioleta-azul/verde. Requieren del in magnesio (Mg) para la unin, pueden teir clulas vivas. No afecta el pH.

Otros: quinacrina (intercalante), naranja de acridina (unin al ADN y ARN bicatenario, emisin diferencial).

Factores que influyen en la unin del fluorocromo al cido nucleico Muestra a analizar: depende de la composicin de bases (AT, CG), de la presencia de bases modificadas (bromodeoxiuridina) o metilacin, estructura del ADN.

la unin entre las protenas cromosmicas (histnas) y ADN, una unin fuerte entre ellos (formol) dificulta la incorporacin del fluorocromo, se puede hacer incubacin con proteasas. la membrana citoplasmtica (el ioduro de propidio no la atraviesa), y componentes intracelulares.

Qumica, cintica y equilibrio de la unin: depende de

Factores que influyen en la unin del fluorocromo al cido nucleico la concentracin de sales del medio (favorece la disociacin histona-ADN), fuerza inica (inhibe unin secundaria), la cromomicina necesita Mg, el pH (el pH cido favorece la unin secundaria del Hoescht). Se debe tener cuidado con la concentracin, las condiciones y el tiempo de incubacin.

Ciclo celular y aneuploida

Tcnicas para medir la sntesis de ADN, y el ciclo celular La intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de fluorocromo, que es proporcional a la cantidad de ADN de la clula. Hay cierta variacin entre el resultado terico y el obtenido, por ello se define el coeficiente de variacin (CV) que nos da una idea de la semejanza de los resultados obtenidos a la realidad.

Tcnicas para medir la sntesis de ADN, y el ciclo celular A partir del histograma, para calcular la fase S, se pueden emplear varios mtodos informticos: rectangular, lineal, polinomial, Gauss. El resultado vara segn el mtodo. Se puede hacer doble marcaje con ioduro de propidio y la tcnica de la bromodeoxiuridinaantibromodeoxiuridina para conocer la sntesis real.

Anlisis del ciclo celular por CMF

2n

4n

Deteccin de aneuploida de ADN El trmino aneuploida significa presencia de una poblacin con un contenido en ADN diferente a un control de clulas semejantes y en igual fase del ciclo celular.

ndice de ADN (ID) Es el cociente entre la moda del pico G0G1 de la poblacin problema y la moda del pico G0G1 del control (en %). A partir de ah se define: diploide si ID igual 1, aneuploide si ID diferente de 1, hiperploide si ID superior a 1, hipoploide si ID inferior a 1, poliploide si ID es igual a 1.5, 2, 2.5, etc., haploide si ID es igual a 0.5).

Discriminacin de dobletes Un doblete es cuando el citmetro analiza dos clulas al mismo tiempo. La solucin se debe buscar en la tcnica, criterios de standardizacin y soluciones citomtricas de anlisis de la seal.

Criterios para considerar aneuploida presencia de dos poblaciones en la muestra, coeficiente de variacin de la poblacin aneuploide mayor que la euploide, presencia de clulas en la regin de G2M de la poblacin problema dudosamente aneuploide, proporcionalidad entre las fases, comprobar los picos con distintas tcnicas.

Estndares y Controles en CMF Estndares (Patrones de normalidad): Un estndar es un material estable que tiene valores determinados de fluorescencia o dispersin de luz. Se usan para alinear o calibrar las prestaciones del citmetro de flujo. Hay comerciales o se los puede preparar uno mismo.

Estndares y Controles en CMF Alineamiento y prestaciones: el uso de estndares de alineamiento proporciona un buen mtodo para detectar cambios y problemas en la configuracin ptica y seal de un da a otro. El citmetro de flujo se considera alineado cuando se consigue una elevada fluorescencia o seal con un bajo CV. Se debe comprobar para todas las seales y llegar a un compromiso entre ellas porque a veces cuando una aumenta la otra disminuye.

Estndares y Controles en CMF Calibracin (ajuste de escalas): los citmetros de flujo ofrecen una informacin relativa, no absoluta. Para cuantificar hay que correlacionar los canales con resultados de muestras conocidas. El mtodo ms sencillo consiste en ajustar el voltaje del fotodetector (produce cambios exponenciales o no-lineales de la seal) y/o ganancias (crecimiento lineal) para conseguir un pico de una intensidad determinada de un standard estable cada da. Es el equivalente a reseleccionar el citmetro a una escala de intensidad relativa constante. Tambin es til hacer una calibracin cruzada de escalas logartmicas y lineales.

Estndares y Controles en CMF Compensacin de color: en las aplicaciones citomtricas con dos o ms fluorescencias nuestro objetivo es marcar las clulas con fluorocromos distintos que reflejen las diversas propiedades celulares diferentes y detectar la seal proporcional a la primera fluorescencia (FL1) en un detector y la de la segunda (FL2), etc, sin desviaciones producidas por interferencias de la seal. Los fluorocromos tienen espectros de emisin que en ocasiones se superponen y los filtros no son perfectos, por ello los citmetros poseen un sistema informtico de compensacin o sustraccin de seal. Es difcil predecir tericamente el grado de compensacin y hay que ajustarlo individualmente. Generalmente se debe extraer FL1 (fluorescena) de FL2 (ficoeritrina), y tambin FL3 (ioduro de propidio) a FL2 y FL1 (fluorescena).

Estndares y Controles en CMF El tiempo como standard: en los citmetros que lo permiten, se pueden hacer grficas del nmero de clulas procesadas, del canal de fluorescencia, etc.. a lo largo del tiempo. Se puede usar para ver la estabilidad de las mediciones del citmetro con el tiempo y detectar la presencia de algn problema.

Estndares y Controles en CMF Control de calidad: Hay que asegurarse que el citmetro funciona bien cada da para poder comparar los resultados. Hay dos mtodos: (1) no variar las condiciones de lectura y apuntar el canal medio del pico standard y hacer curvas de da a da, y (2) fijar la posicin constante del pico del standard variando las condiciones de lectura (fotodetectores) y hacer curvas.

Las dos son vlidas pero es ms sencilla la primera por que la segunda tiene una variacin no-lineal. Se pueden hacer ambas.

Controles Los controles son materiales que produce resultados esperados (conocidos). Se usan para monitorizar las prestaciones o reproducibilidad de los reactivos y la calidad de los mtodos de preparacin celular. Son importantes en los anlisis de ADN e inmunofluorescencia. Se usan controles de ploida y controles de inmunofluorescencia positivos y negativos.

Para cuantificacin de ADN y anlisis de las fases del ciclo celular: Como control de ploida se debe usar un control interno, procesado en el mismo tubo que la muestra, para descartar o asegurar aneuploida y calcular en ndice de ADN (tambin se puede procesar por separado y mezclar), y otro tubo para calcular las fases del ciclo celular.

Para cuantificacin de ADN y anlisis de las fases del ciclo celular: Las mejores clulas de referencia son clulas diploides del mismo individuo e igual tejido, sin de igual tejido, y sin de diferente individuo y tejido, y por ltimo de otra especie animal. Para realizar una buena lectura de ADN se debe tener al citmetro de flujo en perfectas condiciones y ser cuidadoso en el proceso de preparacin de la muestra y tincin. Se deben usar controles. El anlisis e interpretacin se hace mediante el software adecuado.

Para Inmunofluorescencia Se necesitan controles negativos para descartar unin inespecfica del fluorocromo y seleccionar el umbral de autofluorescencia. Son causas de tincin inespecfica los fragmentos Fc de la inmunoglobulinas, las clulas muertas, debrs, etc...

Para Inmunofluorescencia Si tenemos problemas con el control negativo se debe procurar procesar con cuidado las muestras preservando su viabilidad, utilizar fragmentos F(ab)2 o centrifugar el anticuerpo monoclonal para evitar agregados, eliminar las clulas muertas con doble marcaje con ioduro de propidio y diacetato de fluorecena.

Para Inmunofluorescencia Si a pesar de todo seguimos obteniendo una distribucin unimodal con considerable superposicin entre el control negativo y el control positivo, podemos asumir (con ciertas reservas) que la tincin es especfica pero de baja intensidad (no es seguro). Los controles positivos son tambin esenciales para comprobar que la tcnica funciona. Si no se emplean los resultados negativos de una muestra que se espera positiva no se sabe si son por alteracin antignica o fallo de marcaje.

Log/lin display

4 colors - simultaneous collectionFITCPE PETR PE-CY5

530 580 630 680 730 Emission wavelength (nm)

780

Detection Threshold (noise)1,000,000

100,000

Antibody Binding Capacity

10,000

1,000

100

10

1 0 50 100 150 200 250

Mean

98%

Histogram ChannelSlide from Dr. Abe Schwartz

Comparison of Windows of Analysis in Sample SpaceCoef. of Res = 85.3 (3 decade log amp) Coef. of Res = 64.0 (4 decade Log amp)

255

Zero Channel Value

0ABC Sample SpaceSlide from Dr. Abe Schwartz

Basics of Flow CytometryFluidics cells in suspensionflow in single-file throughan illuminated volume where they

Optics

scatter light and emit fluorescence that is collected, filtered and converted to digital values that are stored on a computer

Electronics[RFM]

Flow Cytometry: The use of focused light (lasers) to interrogate cells delivered by a hydrodynamically focused fluidics system.Flow CellSheath fluid

Fluorescence signals

Focused laser beam

Fluidics SystemsPositive Pressure Systems

Based upon differential pressure between sample and sheath fluid. Require balanced positive pressure via either air or nitrogen Flow rate varies between 6-10 ms-1

+++ +++ +++

Positive Displacement Syringe Systems

3-way valve

Flowcell

1-2 ms-1 flow rate Syringe Fixed volume (50 l or 100 l) Absolute number calculations possible Usually fully enclosed flow cells

100 l

Sample Sample loop

Waste

Fluidics - Particle Orientation and Deformationa: Native human erythrocytes near the margin of the core stream of a short tube (orifice). The cells are uniformly oriented and elongated by the hydrodynamic forces of the inlet flow.

b: In the turbulent flow near the tube wall, the cells are deformed and disoriented in a very individual way. v>3 m/s.

[RFM]

Image fromV. Kachel, et al. Melamed Chapt. 3

Hydrodynamic SystemsSample inSheath Piezoelectric crystal oscillator Sheath in

Fluorescence Sensors Laser beamSheath Core

Scatter Sensor

Hydrodynamically focused fluidics

Hydrodynamically focused fluidics

Signal

Increase Pressure: Widen Core Increase turbulence

Hydrodynamic SystemsFlow CellInjector TipSheath fluid

Fluorescence signalsFocused laser beam

Flow CellInjector TipSheath fluid

Fluorescence signals

Focused laser beam

Fluorescence collection lens, optical filters, dichroic filter, band pass filter

J.Paul Robinson Professor of Immunopharmacology School of Veterinary Medicine, Purdue University

From laser

reflector Beam shaping lens