UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

ESCUELA DE GRADUADOS

MAGISTER EN CIENCIAS

MENCION MICROBIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

CITOMETRIA DE FLUJO EN LA

EVALUACION DE POTENCIAL DE

MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR

DE Helicobacter pylori

JUAN LUIS CASTILLO NAVARRETE

CONCEPCION, CHILE

2005

i

UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN

ESCUELA DE GRADUADOS

Esta tesis ha sido realizada en el Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana,

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de

Concepción y en Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador, y

ha sido aprobada por la siguiente Comisión de Evaluación: Dra. Apolinaria García C. Bioquímico. Magíster en Tecnología del DNA Recombinante. Magíster en Microbiología. Doctor en Ciencias Biológicas.

-------------------------------- Profesor Guía

Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción

Dr. Carlos González C. Bioquímico. Magíster en Microbiología Doctor en Ciencias

-------------------------------- Comité de Tesis

Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción

Dr. Fernando Kawaguchi P. Médico Gastroenterológo Doctor en Medicina

-------------------------------- Comité de Tesis

Facultad de Medicina Universidad de Concepción

Dr. Jaime Madariaga B. Médico Anatomopatólogo

-------------------------------- Comité de Tesis

Facultad de Medicina Universidad de Concepción

Dr. Gerardo González R. Licenciado en Biología. Magíster en Microbiología Doctor en Ciencias Biológicas

------------------------------- Jefe de Programa Magíster en

Ciencias con Mención Microbiología

ii

“Different people see microorganisms from “Different people see microorganisms from “Different people see microorganisms from “Different people see microorganisms from

different perspectives”different perspectives”different perspectives”different perspectives”

Howard M. Shapiro

iii

Con amor a Carmen Gloria,

Francisco, Loreto, Cristina, Tata, Tete y Marcelo

iv

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos, sin duda lo más difícil de esta tesis, la cual al igual que las

asignaturas del programa de Magíster, no habrían prosperado sin el aliento

constante de muchos, la ayuda de otros y el apoyo incondicional de aquellos. Son

muchos los que se me escaparán, pero a ellos también les debo mucho.

Agradezco y reconozco públicamente, que sin el apoyo incondicional, paciencia,

consejos y amor de Carmen Gloria, esta empresa no habría llegado a puerto; no

puedo dejar de recordar aquellas noches de certámenes, en los me acompañó en mi

vigilia para que “no me durmiera”, así como también sus constantes “tu eres

capaz”….. Gracias y perdón por el tiempo que no te entregué…….

A Francisco, mi hijo y “padawan”, por su paciencia, comprensión (en especial

cuando me decía…“ya sé papá, es tu trabajo”….) y por su entereza al decirme las

cosas de frente.

A mi “princesa” Loreto, que con su cariño espontáneo me recargó mis baterías en

innumerables ocasiones.

A la “Señorita Titi”, Cristina, mi hija, mi “araña peluda”, la cual llegó a mi vida a

fines del primer año de Magíster, y que desde entonces sólo me ha entregado amor

incondicional junto con el misterio de la profundidad de sus ojos…

Como no agradecer a mi Padre, quién desde niño me inculcó las bases para buscar

información y siempre ir más allá en la búsqueda del conocimiento, por muy

particular que este sea. Además con su ejemplo de tesón, entrega y sacrificio, así

v

como entrañable amor me ha apoyado en mis locuras y siempre me ayudado a

levantarme, cuando ha sido necesario…..para ti “papito”…..

Y que decir la “chica”, mi madre que con su paciencia y sencillez, hasta la fecha

(y gracias a Dios), me acompaña y apoya.

Un abrazo de agradecimiento a mi colega, compadre y hermano Marcelo, quién

siempre me acompañado en mis tonteras y locuras y con quién tuve el privilegio

de ser compañero de algunas asignaturas del programa de Magíster, gracias

“manito”.

A mi profesor guía, “Pola”, por su apoyo y por creer en mi, así como su especial

sencillez que permite entregar desinteresadamente apoyo y

consejo…..Gracias…….

A la comisión evaluadora de esta tesis, Dr. Fernando Kawaguchi, Dr. Carlos

González y Dr. Jaime Madariaga, por su constante apoyo y aportes con ideas

interesantes, gracias.

Al Centro de Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada, administrador del

Laboratorio de Citometría de flujo del Hospital del Trabajador Concepción, por su

confianza y por permitirme usar sus instalaciones.

A mi “yunta” (o llunta) Natalia, con la cual sufrimos codo a codo durante el

primer año del programa.

A mi amigo, Oscar Venegas, por su incondicional apoyo y constantes palabras de

aliento, gracias…

A mis amigos y socios comerciales, sin cuyo apoyo no habría podido intentar esta

aventura, gracias…

vi

A todos los docentes del Departamento de Microbiología que participaron directa

o indirectamente en mi formación académica; particularmente, a Carlos González,

Ángel Oñate, Gerardo González y Miguel Martínez por todos los conocimientos

aportados.

Especial agradecimiento al profesor Mario Henríquez, quién no sólo me entregó

conocimientos, si no que me entregó experiencia, confianza, sabiduría y amistad.

Al personal auxiliar del Departamento de Microbiología, que me tuvo paciencia y

siempre mostraron muy buen voluntad para ayudarme, gracias…

A mis colegas y personal del Laboratorio Clínico del Hospital del Trabajador,

quienes me permitían hacer mis siembras, traspasos e incubaciones en sus

instalaciones, gracias…

Quizás cuántos son los que se me quedan afuera de estas palabras, ellos me sabrán

disculpar por no mencionarlos, gracias a todos ellos…

vii

INDICE GENERAL

Página

Índice General vii

Índice de Figuras xi

Índice de Tablas xv

Resumen xvi

Abstract xx

1. INTRODUCCION 1

1.1 Citometría de flujo 1

1.1.1. Fundamentos básicos 1

1.1.2. Presentación de datos y análisis 3

1.1.3. Citometría de flujo en estudios microbiológicos 5

1.2. Potencial de Membrana (∆Ψ)(∆Ψ)(∆Ψ)(∆Ψ) 8

1.2.1. Bases físico químicas del potencial de membrana 8

1.2.2. Medición de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ usando micro electrodos 11

1.2.3. Medición indirecta de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en suspensiones celulares

usando ensayos de distribución

12

1.2.4. Estimación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ por citometría de flujo 14

1.2.4.1. Compuestos para ensayos potenciométricos 14

1.3. Viabilidad celular 18

1.3.1. Definiciones y evaluación por citometría de flujo 18

viii

1.4. Helicobacter pylori 20

1.4.1. Características microbiológicas 21

1.4.2. Patogénesis de la infección por H. pylori 22

1.4.3. Tratamiento de la infección por H. pylori 22

1.5. Hipótesis 25

2. MATERIALES Y METODOS 29

2.1. Reactivos 29

2.2. Cepas bacterianas 30

2.3. Condiciones de cultivo 30

2.4. Preparación de suspensiones celulares para evaluación

de patrones de tamaño bacteriano por citometría de

flujo

31

2.5. Preparación de controles negativos para viabilidad

celular, ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y eflujo bacteriano a bromuro de etidio

32

2.5.1. Preparación de células muertas por calor 32

2.5.2. Preparación de células muertas por shock frío 33

2.6. Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo. 34

2.7. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ por citometría de flujo. 34

2.8. Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por

citometría de flujo

34

2.9. Citometría de flujo 35

2.10. Análisis de patrones de tamaño 35

ix

2.11. Análisis de viabilidad bacteriana 37

2.12. Análisis de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y cálculo de razón de fluorescencia

roja/verde

38

2.13. Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio. 41

3. RESULTADOS 42

3.1. Determinación de calibración base 42

3.2. Análisis de patrones de tamaño 43

3.3. Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus 49

3.4. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en E. coli y S. aureus 59

3.5. Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori: 68

3.6. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en H. pylori 69

3.7. Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E. coli y S.

aureus

70

3.8. Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori 72

3.9. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y el

probable eflujo de bromuro de etidio en S. aureus

73

3.10. Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y

MC207.110, sobre la viabilidad celular, el potencial de

membrana y el eflujo de bromuro de etidio en E. coli

74

3.11. Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y

MC207.110, sobre H. pylori

77

4. DISCUSION 79

x

4.1. Citometría de flujo y bacterias 80

4.2. Análisis de patrones de tamaño 81

4.3. Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus 84

4.4. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en E. coli y S. aureus 85

4.5. Ensayo de viabilidad celular y ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en H. pylori 89

4.6. Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en E. coli y S.

aureus

89

4.7. Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en H. pylori 95

4.8. ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en H. pylori 95

5. CONCLUSIONES 99

6. PROYECCIONES 100

7. GLOSARIO 102

8. SOLUCIONES 109

9. REFERENCIAS 110

xi

INDICE DE FIGURAS Página Figura 1 : Distintas formas gráficas de presentar los mismos

datos. 5

Figura 2 : Esquema de medición de medición de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en

eucariontes usando micro electrodos. 12

Figura 3 : Selección de ventana de análisis en función de FSC

y SSC. 36

Figura 4 : Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis

de estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ. 40

Figura 5 : Selección de calibración base. 42 Figura 6 : Superposición de histogramas para la señal de FSC-

H, representando distintos patrones de tamaño bacteriano.

44

Figura 7 : Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a

diferentes antibióticos. 46

Figura 8 : Patrón de tamaño de cepas de H. pylori después de

incubación por 72 horas. 48

Figura 9 : Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de

PI. 49

Figura 10 : E. coli. Bacterias vivas y bacterias muertas por

calor. 50

Figura 11 : Evaluación de linealidad, mediante incorporación de

PI, en células de E. coli muertas por calor. 51

Figura 12 : Células de S. aureus muertas por calor. Formación

de agregados y el aumento de la destrucción celular. 52

Figura 13 : Evaluación de linealidad, mediante incorporación de

PI, en células de S. aureus muertas por calor. 52

xii

Figura 14 : Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de diversas sustancias.

54

Figura 15 : Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la

acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

54

Figura 16 : Incorporación de PI en células de E. coli tratada por

30 minutos a 70ºC. 55

Figura 17 : Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la

acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

55

Figura 18 : Incorporación de PI en células de S. aureus, en

diversas situaciones. 57

Figura 19 : Incorporación de PI en células de S. aureus

sometidas a shock frío. 57

Figura 20 : Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a

shock frío. 58

Figura 21 : Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a

shock frío. Ensayo triplicado. 58

Figura 22 : Incorporación de PI en células de S. aureus

sometidas a shock frío. Ensayo triplicado. 59

Figura 3 : S. aureus y ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ: Gráfico de FL2-H v/s FL1-H

mostrando células polarizadas y depolarizadas 60

Figura 24 : S. aureus: Histograma representando la razón

FL2/FL1 en células depolarizadas y polarizadas. 61

Figura 25 : Incorporación de PI en células de S. aureus muertas

por shock frío. Evaluación de linealidad. 62

Figura 26 : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).

Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en triplicado.

63

Figura 27 : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). 63

xiii

Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde) en triplicado.

Figura 28 : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).

Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).

64

Figura 29 : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío).

Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde).

64

Figura 30 : E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer

usado. 66

Figura 31 : Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI

de células de E. coli en PBS-EDTA. 66

Figura 32 : Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas

(shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en triplicado.

67

Figura 33 : Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas

(shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde). Ensayo en triplicado

67

Figura 34 : H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA). 68 Figura 35 : H. pylori en PBS-EDTA. Evaluación de

∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). 69

Figura 36 : Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo

(células vivas) y en B control de negativo (células muertas).

70

Figura 37 : E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de

linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET.

71

Figura 38 : S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de

linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET.

72

xiv

Figura 39 : Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular y el eflujo a BrEt.

73

Figura 40 : Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre

el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde). 74

Figura 41 : Células vivas de E. coli. Acción de diversos

compuestos sobre la viabilidad celular. 75

Figura 42 : Células vivas de E. coli. Acción de diversos

compuestos sobre el eflujo a BrEt. 76

Figura 43 : Células vivas de E. coli. Acción de diversos

compuestos sobre la razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ).

76

Figura 44 : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre

incorporación de PI. 77

Figura 45 : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre el

eflujo a BrEt. 78

Figura 46 : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre la

razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ). 78

Figura 47 : Relación entre ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, DIOC2(3), tamaño celular,

formación de agregados y fluorescencias. 87

xv

INDICE DE TABLAS

Página Tabla 1 : CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos

usados. 32

Tabla 2 : Protocolo básico de trabajo. 33 Tabla 3 : Patrones de estimación de tamaño definidos por el

porcentaje de la gate para cada marcador. 37

Tabla 4 : Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja

sobre verde usando programa Flow Explorer 4.0. 40

Tabla 5 : Detalle de calibración base utilizada (Citómetro de

flujo FACSCalibur) 43

Tabla 6 : Patrones de tamaño de cepas control. 45 Tabla 7 : Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de

diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5 y 2 veces la concentración mínima inhibitoria).

47

Tabla 8 : Patrones de tamaño para diferentes cepas de H.

pylori después de un cultivo de 72 horas. 48

xvi

RESUMEN

El potencial de membrana (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ) cumple un papel fundamental en la

fisiología bacteriana. Como un componente de la fuerza protón motriz, se

encuentra íntimamente involucrado en la generación de ATP. Además, participa en

varios procesos como auto lisis bacteriana, transporte de glucosa, quimiotaxis y

sobrevida a pH bajo. Los ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados

por diferencias en la concentración de iones en lados opuestos de la membrana

celular. Esta diferencia de potencial es negativa en el interior de la membrana,

variando entre –100 y –200 mV. Una disminución y un incremento en la

magnitud del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ se conocen como depolarización eléctrica e hiperpolarización,

respectivamente. El ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, la cual se vuelve

permeable irreversiblemente a compuestos como el yoduro de propidio (PI),

usados para estudios de viabilidad celular. Bajo este concepto, por un lado, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ,

y por otro, la impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias fluorescentes,

se han usado como los principales indicadores del estado fisiológico de la

membrana citoplasmática y de la viabilidad, respectivamente. El demostrar la

captación de estos compuestos impermeables (PI, TO-PRO3 y Sytox Green) por

células, es considerado un indicador de muerte celular.

La medición de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias en crecimiento activo, es esencialmente

imposible, a raíz de su pequeño tamaño. Sin embargo, existen varios compuestos

fluorescentes que se pueden usar para estimar el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias. Los compuestos

xvii

para ensayos potenciométricos, permiten efectuar mediciones de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en organelos

y en células que son muy pequeñas para permitir el uso de micro electrodos. En

mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de de la fluorescencia

de estos compuestos es dependiente no sólo del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, si no que también del tamaño

celular.

Considerando la importancia fisiológica del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias, y la

capacidad de H. pylori de sobrevivir en el estómago, al parecer, gracias a la

generación de un potencial bioenergético sobre un amplio rango de acidez, se

planteó como objetivos generales, determinar por citometría de flujo, los

parámetros de tamaño, forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana

en bacterias y determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y

la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta

bacteria. De igual forma, se plantearon como hipótesis de trabajo, que «Usando

citometría de flujo es posible estudiar los parámetros de tamaño y forma celular,

potencial de membrana y viabilidad celular en Helicobacter pylori » y « Los

diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por

Helicobacter pylori producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de

tamaño y morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad

celular, parámetros determinables mediante citometría de flujo».

Se desarrolló un método de análisis de patrones de tamaño bacteriano,

basado en los datos de FSC correspondientes a diferentes tipos bacterianos

xviii

(Acinetobacter ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli y Bacillus

subtillis), el cual se aplicó exitosamente en E. coli K12 bajo la acción de diversos

antibióticos, así como también en cultivos de H. pylori.

La determinación de viabilidad celular, mediante la incorporación de PI

tanto en S. aureus y E. coli (previa permeabilización de la membrana externa con

EDTA), así como la estimación de potencial de membrana usando DiOC2(3) (una

carbocianina catiónica) se lograron implementar exitosamente mediante citometría

de flujo. En el caso de H. pylori, no fue posible lograr la incorporación de PI en

células muertas, ni tampoco determinar células polarizadas. A fin de indagar en la

posibilidad de que la presencia de un sistema de eflujo impidiera la incorporación

de PI y el ingreso de DiOC2(3) al interior de células polarizadas, se implementó

exitosamente la medición de eflujo a bromuro de etidio (BrEt), tanto en E. coli,

como en S. aureus. En H. pylori, no fue posible evaluar la presencia de eflujo a

BrEt, así como también el uso de inhibidores metabólicos e inhibidores de

sistemas de eflujo (CCCP, azida de sodio, valinomicina y MC 207.110) sobre la

incorporación de PI y la estimación de ∆Ψ.

En el caso particular de H. pylori, junto con considerar la naturaleza

sorprendente de esta bacteria, se debe considerar la posibilidad de que tenga un

potencial de membrana positivo o que éste se encuentre íntimamente regulado por

el medio y pH del mismo.

Se concluye que la evaluación por citometría de flujo de viabilidad celular

en E. coli y S. aureus, puede ser definida por la determinación conjunta de tamaño

xix

y forma celular, potencial de membrana, incorporación de PI y eflujo a BrEt. Lo

anterior tienen una potencial aplicación en el estudio del efecto que diversas

sustancias puedan ejercer sobre E. coli y S. aureus, aportando información

adicional sobre la acción de éstas.

xx

ABSTRACT

The membrane potential (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ) plays a fundamental role in the bacterial

physiology. Like a component of the proton motive force, is intimately involved

in the ATP generation. In addition, it participates in several processes like

bacterial autolysis, glucose transport, Chemotaxis and survives at low pH. In

metabolically active bacteria, ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ are generated by differences in the concentration

of ions in opposed sides of the cellular membrane. This difference of potential is

negative inside the membrane, varying between -100 and -200 mV. A diminution

and an increase in the magnitude of ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ are known like electrical depolarization

and hyper polarization, respectively. ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ Is reduced to zero, if the membrane is

broken, which irreversibly becomes permeable to compound like propidium iodide

(PI), used for studies of cellular viability. On this way, the ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ for one side and

the impermeability of the membrane to certain fluorescent substances for the other

side, has been used like the main indicators of the physiological state of the

cytoplasmic membrane and the viability, respectively. Demonstrating the pick up

of these impermeable probes (PI, To-pro3 and Sytox Green) by cells is considered

an indicator of cellular death. The measurement of ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ in active growing bacteria

in, it is essentially impossible, as a result of his small size. Nevertheless, there are

several fluorescent probes that can be used to estimate ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ in bacteria. The

potentiometric probes allow carrying out measurements of ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ in organelles and

cells that are very small to allow the use of microelectrodes. In measurements

xxi

conducted by flow cytometry, the intensity of the fluorescence of these probes

depends of the ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ and of the cellular size.

Considering the importance physiological of ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ in bacteria, and the

capacity of H. pylori to survive in the stomach, apparently, thanks to the

generation of a bioenergetics potential on an ample rank of acidity, considered like

general missions, to determine by flow cytometry, the size parameters, cellular

forms, cellular viability and membrane potential in bacteria and to determine the

effect of diverse substances upon the membrane potential and the cellular viability

of H. pylori. Indeed the work hypothesis raised said "In Helicobacter pylori, using

flow cytometry, is possible to study the size parameters and cellular forms,

membrane potential and cellular viability" and "the diverse bacteriological agents

used in the treatment of the infection by Helicobacter pylori, produce alterations in

the cells bacterial, as much of size and morphology, like also in the potential of

membrane and cellular viability, parameters that are determinable by flow

cytometry". A method of analysis of patterns of bacterial size was developed,

based on the FSC data corresponding to different bacterial types (Acinetobacter

ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli and Bacillus subtillis), which

were applied successful in E. coli K12 under the antibiotic action diverse, as well

as in cultures of H. pylori. The determination of cellular viability, by the

incorporation of PI in S. aureus and E. coli (previous permebilization of the

external membrane with EDTA), as well as the estimation of membrane potential

xxii

using DiOC2(3) (a cationic carbocianine) were implement successful by flow

cytometry.

In the case of H. pylori, was not possible to obtain the incorporation of PI

in died cells, and to either determine polarized cells. In order to investigate the

possibility that the presence of an efflux system prevented the incorporation of PI

and the entrance of DiOC2(3) to the interior of polarized cells, it was successful

implemented the measurement of BrEt efflux in E. coli and S. aureus. In H.

pylori, was not possible to evaluate the presence of BrEt efflux, as well as the

metabolic and efflux system inhibitors (CCCP, sodium azide, valinomicin and MC

207,110) on the incorporation of PI and the estimation of ∆Ψ.

In the particular case of H. pylori, indeed with to consider the surprising

nature of this bacterium, it must be considered the possibility that it has a positive

membrane potential or that this is intimately regulated by environment and pH

itself.

It is concluded that the flow cytometric evaluation of cellular viability in E

coli and S. aureus, can be defined by the integrated determination of size and

forms cellular, membrane potential, incorporation of PI and BrEt efflux. This has

a potential application in the study of the effect that diverse substances can exert

on E coli and S. aureus, contributing additional information on the action on these

molecules.

1

1. INTRODUCCION

1.1 Citometría de flujo.

1.1.1. Fundamentos básicos.

La citometría de flujo permite evaluar características físicas y químicas de

células en suspensión. Entrega información sobre el tamaño celular, la

granularidad o complejidad interna, así como también de la intensidad de

fluorescencia relativa que poseen las células en estudio. Esta tecnología hace

posible medir los más diversos parámetros celulares como antígenos de superficie,

citoplasmáticos y nucleares, contenido de ácidos nucleicos, actividad enzimática,

flujo de calcio, potencial de membrana (∆Ψ)∆Ψ)∆Ψ)∆Ψ) y pH entre otros (Bono y col., 1998;

Castillo y col, 1999; Castillo, 2005).

El principio básico de la citometría de flujo, es la interacción de una fuente

de luz, específicamente un rayo láser, con células en suspensión, las cuales son

canalizadas e "interrogadas" individualmente por el láser, recogiéndose la

información obtenida de dicha interacción. De este modo, es posible la medición

de un gran número de células, en forma individual, en un período muy corto de

tiempo mientras se desplazan en un sistema de flujo o torrente líquido (100-25000

células por segundo, en sangre periférica u otros líquidos corporales). Cada célula

pasa por un punto donde son impactadas por un láser que emite fluorescencia a

2

una longitud onda dependiente de cada tipo de láser, y cuya luz es desviada o

alterada de acuerdo a características propias de cada célula. La variación de la

longitud de onda así producida, es captada y depurada por un complejo sistema de

lentes y espejos especiales, que concentra esta luz y la transforma en pulsos de

voltaje. Estos son codificados e interpretados por un computador provisto del

programa adecuado. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy

versátilmente, siendo de gran confiabilidad y exactitud. Existen equipos que

cuentan con uno, dos o más rayos láser, siendo lo común, la presencia de un láser

que emite a 488 nm (láser de argón) (Castillo, 2005).

La interacción de una célula con la luz del láser (ligth scatering), puede

producir la desviación de esta última, en un ángulo menor a 10 grados, lo que se

conoce como dispersión frontal o FSC (forward scatter) y su vez la desviación de

la luz en más de 10 grados, pero en menos de 90, se conoce como dispersión

lateral o SSC (side scatter). Es así como FSC y SSC son parámetros intrínsecos a

la célula.

Si a la suspensión celular se agrega un fluorocromo que tenga afinidad por

algún componente celular y que además este fluorocromo sea excitable con el rayo

láser en uso, se podrá detectar un cambio en la longitud de onda de emisión del

fluorocromo; lo anterior se traducirá en formación de rangos o canales de

fluorescencia, la cual es posteriormente detectada, facilitando la identificación de

subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares (Bono y col.,

1998; Castillo y col, 1999; Castillo, 2005). Estas moléculas fluorescentes pueden

estar acopladas a anticuerpos monoclonales específicos o en solución. Por

3

ejemplo, la fluoresceína, fluorocromo ampliamente usado tanto en microscopía de

fluorescencia como en citometría de flujo, tiene una excitación máxima a 490 nm,

siendo su emisión máxima a 520 nm. En los citómetros de flujo actuales, con

aplicación en clínica, es posible detectar simultáneamente desde 1 hasta 12 rangos

o canales de fluorescencia, lógicamente usando fluorocromos que emitan en

diferente longitud de onda.

Dado que ciertos fluorocromos se pueden unir a proteínas, es posible

disponer anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos. Si a esto se le suma

el explosivo desarrollo de la producción y comercialización de anticuerpos

monoclonales, conjugados con diversos fluorocromos, las potencialidades son

enormes. Es así como hoy se dispone de anticuerpos contra una infinidad de

moléculas biológicas, lo que se ha traducido en un gran desarrollo de los estudios

de caracterización inmunofenotípica de diversos tipos celulares, muchos de ellos

con una aplicación clínica concreta (Castillo, 2005).

1.1.2. Presentación de datos y análisis.

Un citómetro de flujo, a pesar de tener un sistema de fluidos, un sistema

óptico y un sistema electrónico, es un equipo controlado informáticamente,

existiendo para ello, diversas plataformas (PC y Macintosh principalmente), las

cuales, mediante los programas adecuados permiten tanto la adquisición como el

análisis de los datos obtenidos.

4

La acción de evaluar una suspensión de células en un citómetro de flujo, se

llama adquisición (se adquiere la información de un determinado número de

células en un tiempo determinado). Una vez adquirida la información sobre una

suspensión celular, esta se almacena como un archivo, y éste es posible

visualizarlo de diversas formas, dependiendo del programa de análisis que se use.

Es así como los datos se pueden visualizar como gráficos de puntos, contorno,

densidad, histogramas, tridimensional, etc., obteniéndose, en cada caso

información numérica como por ejemplo coeficiente de variación, media de

intensidad de fluorescencia, mediana, media geométrica, etc. (Figura 1) (Castillo,

2005).

Un concepto fundamental al efectuar un análisis es la correcta selección de

la región de interés a estudiar, la que se conoce como “gate” o ventana de análisis.

Por ejemplo, si se han analizado bacterias, es posible acotar aún más el análisis, al

seleccionar la población de bacterias, y así eliminar partículas de similar tamaño

que puedan interferir con el análisis, para lo cual se dibuja una “gate”.

Posteriormente, se puede obtener información específica sólo de la región

seleccionada (Figura 3). Es posible combinar varias de estas regiones al momento

de hacer un análisis, lo que se traduce en una gran capacidad y versatilidad en el

manejo de la información (Castillo, 2005).

5

FIGURA 1: Distintas formas de presentar los mismos datos: SSC (granularidad) y CD45 (antígeno leucocitario común). (A) Gráfico de puntos; (B) gráfico de densidad; (C) gráfico tridimensional; (D) gráfico de contorno; (E) histograma que representa sólo SSC. (Adaptado con autorización de: Hematología: Fisiopatología y Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J. Editorial Universidad de Talca)

1.1.3. Citometría de flujo en estudios microbiológicos.

La citometría de flujo permite la medición de diversas características

físicas y químicas a células individuales en suspensión, en microsegundos,

proporcionando así una indicación de la heterogeneidad de una población de

células eucarióticas o procarióticas en cuestión de minutos (Álvarez-Barrientos y

col., 2000; Davey y col., 1996; Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000,

2001, 2003).

6

La detección directa de microorganismos por citometría de flujo, ya sean

bacterias, hongos, parásitos y virus, tanto en sus parámetros intrínsecos (FSC y

SSC) como en sus características químicas, ha sido objeto de diversos estudios

(Álvarez-Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). Es así como la detección

directa de bacterias, usando anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos, ha

permitido la identificación rápida de diversos patógenos, como por ejemplo

Haemophilus spp., Salmonella spp., Mycobacerium spp., Brucella spp.,

Branhamella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomona spp.,

Bacteroides fragilis, Legionella pneumophila, Bacillus spp, S. aureus y E. coli,

entre otros (Álvarez-Barrientos y col., 2000; Bhushan y col., 1997; Bowden y col.,

1995; Davey y col., 1996; Ozanne y col, 1996), con la ventaja de que es un ensayo

que no necesita cultivo y además es rápido, comparado con el tiempo que toma un

cultivo tradicional. De igual forma, se ha descrito la detección directa de hongos y

levaduras, como por ejemplo la serotipificación de Candida spp. (Davey y col.,

1996, Mercure y col., 1996), incluso demostrándose la etiología mixta de

onicomicosis (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de parásitos,

también ha permitido analizar rápidamente un gran número de muestras y con alta

sensibilidad, en casos de giardiasis, así como también detectar antígenos de

Plasmodium spp., en eritrocitos y evaluar la viabilidad de este parásito una vez

fagocitado (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de virus, en

células eucariontes infectadas, ha permitido la detección y cuantificación de

antígenos y ácidos nucleicos virales, en diversas patología infecciosas, como por

7

ejemplo VIH, citomegalovirus, Herpes, Hepatitis B y C, entre otros (Álvarez-

Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996).

Aunque diversos investigadores han usado citometría de flujo para estudiar

las interacciones de bacterias y agentes antibacterianos, la literatura internacional

se ha centrado, principalmente, en el desarrollo de ensayos rápidos para la

determinación de susceptibilidad antimicrobiana. (Davey y col., 1996; Jepras y

col., 1997; Mason y col., 1995; Mortimer y col., 2000; Suller y col., 1998;

Wickens y col., 2000). Es así como, a partir de las primeras pruebas de

susceptibilidad por citometría de flujo, que datan de 1980, durante la década del

90 se produjo un considerable aumento de los informes internacionales, sobre la

respuesta microbiana frente a diversos compuestos antimicrobianos. La gran

ventaja de estos estudios, es que en pocas horas, se pueden evaluar poblaciones

microbianas, tanto desde el punto de vista de individual y poblacional, así como

también sus capacidades funcionales, es decir vías metabólicas, potencial de

membrana, acumulación y utilización de polihidroxibutirato, entre otros (Álvarez-

Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). De este modo, dentro de los

parámetros metabólicos posibles de evaluar por citometría de flujo, los estudios de

tamaño celular, potencial de membrana y viabilidad celular, sin duda serán

fundamentales y proporcionarán valiosa información para entender el efecto de

nuevos agentes antibacterianos.

8

1.2. Potencial de Membrana (∆Ψ)(∆Ψ)(∆Ψ)(∆Ψ)

1.2.1 Bases físico químicas del potencial de membrana.

En la mayoría de las células eucariotas y procariotas, existen diferencias de

potencial eléctrico a través de sus membranas y también entre el citosol y el

interior de organelos como cloroplastos y mitocondrias. Estas diferencias de

potencial se deben, en parte, a la existencia de gradientes de concentración de

iones Na+, K+, H+ y Cl- a través de la membrana celular y en parte, a la presencia

de varias bombas electrógenas.

En células de mamíferos en reposo, la diferencia de potencial a través de la

membrana citoplasmática tiene un rango de magnitud de 10 a 90 mV, siendo el

interior negativo, respecto del exterior. Existe además una diferencia de potencial

de 100mV o más, a través de la membrana de mitocondrias energizadas, con el

interior negativo respecto del exterior. Este ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ desaparece cuando el metabolismo

energético desaparece. En células procariotas, las diferencias de potencial a través

de estas membranas dependen del metabolismo energético, variando entre 100 y

200 mV.

Por convención, un ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ negativo en el interior se expresa como un número

negativo, después de una hiperpolarización de la membrana, lo cual se define

9

como un incremento en la magnitud del potencial de membrana, y cuyo valor es

típicamente menor que antes.

Los resultados de la depolarización eléctrica de la membrana pueden ser

más complejos. Mientras que en la mayoría de las situaciones, la depolarización

de una bacteria es completa cuando el ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ llega a cero, en el caso de células

nerviosas y musculares, el interior se vuelve transitoriamente positivo con respecto

al exterior.

Las bacterias aeróbicas, generan un gradiente electroquímico de protones a

través de la membrana interna, lo que se conoce como la fuerza protón motriz.

Este gradiente se logra gracias a oxidoreductasas orientadas a través de la

membrana bacteriana, de modo tal que los protones son exportados y los

electrones son ingresados, generándose de esta manera tanto un gradiente de

protones, como un gradiente eléctrico, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ (Sach y col., 1996).

El ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ cumple un papel fundamental en la fisiología bacteriana. Como un

componente de la fuerza protón motriz, se encuentra íntimamente involucrado en

la generación de ATP (Dimroth y col. 2000). Además, participa en varios

procesos, como por ejemplo, autólisis bacteriana, transporte de glucosa,

quimiotaxis y sobrevida a pH bajo (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000,

2001, 2003). De esta manera, en las bacterias, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, refleja tanto el estado del

metabolismo energético como la integridad física de la membrana citoplasmática.

Organismos neutrófilos, como Escherichia coli, mantienen una fuerza

protón motriz constante, ajustando la diferencia de potencial a través de la

10

membrana para compensar los cambios del gradiente de pH (Sach y col., 1996).

Los ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados por diferencias en la

concentración de iones en lados opuestos de la membrana celular. Esta diferencia

de potencial es negativa en el interior de la membrana, y varia entre –100 y –200

mV (Novo y col.,1999, 2000; Sach y col., 1996; Shapiro, 1997, 2000, 2001,

2003).

Una disminución en la magnitud del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ se conoce como depolarización

eléctrica. A su vez, un incremento en la magnitud del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, se refiere como

hiperpolarización. El ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, como es el caso

del desarrollo de agujeros lo suficientemente grandes como para permitir que

iones inorgánicos crucen libremente; por ejemplo, en células muertas por

calentamiento, congelamiento, tratamientos químicos (concentraciones de

aldehídos o alcoholes que actúen como fijadores) y ciertas clases de drogas

antibacterianas, fundamentalmente antibióticos beta lactámicos.

El ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en reposo a través de la membrana citoplasmática se estima

frecuentemente a partir de la ecuación de Goldman:

11

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ : Potencial de membrana

R : Constante de gas

T : Temperatura en grados Kelvin

F : Faraday

[[[[X]]]]i : Concentración de iones X dentro de la célula

[[[[K+]]]]o : Concentración de iones X fuera de la célula

Px : Permeabilidad de la membrana a iones X

1.2.2. Medición de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ usando micro electrodos

El ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ se puede medir directamente usando micro electrodos implantados,

técnica muy difícil de aplicar a células pequeñas. Sin embargo, con estas

mediciones directas se ha logrado detectar cambios en el potencial de membrana

en respuesta a interacciones ligando receptor, así como también durante el impulso

nervioso. En las células de gran tamaño, el potencial a través de la membrana

plasmática se puede medir con un micro electrodo insertado dentro de la célula y

que se construye mediante el llenado de un tubo de vidrio de diámetro muy

pequeño con un líquido conductor (por ejemplo KCl), de manera tal que la

membrana de superficie se selle alrededor del electrodo. Además se coloca un

electrodo de referencia en el líquido extracelular. Ambos electrodos se conectan

con un voltímetro capaz de medir pequeñas diferencias de potencial.

12

Figura 2: Esquema de medición de medición de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en eucariontes usando micro electrodos.

1.2.3. Medición indirecta de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en suspensiones celulares usando ensayos de

distribución.

La estimación indirecta de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ se puede obtener monitoreando la

distribución de indicadores catiónicos lipofílicos radiomarcados (3H-

triphenylmethylphosphonium) o fluorocromos catiónicos lipofílicos, como

cianinas y safraninas. Los indicadores lipofilícos son usados porque pueden pasar

libremente la porción lipídica de la membrana.

13

Una depolarización de las células provocará la liberación del indicador de

las células al medio, mientras que una hiperpolarización hará que ingrese el

indicador desde el medio. La distribución del indicador no representará

adecuadamente el nuevo valor de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ hasta que se logre un equilibrio. Este

proceso requiere de períodos de tiempo que van desde unos pocos segundos a

varios minutos.

Es así como, mientras los ensayos de distribución son adecuados para la

detección de cambios lentos en el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, no se pueden usar para monitorear cambios

rápidos que ocurren durante la propagación de potenciales de acción en tejidos

como el nervioso y muscular.

El uso de fluorocromos catiónicos lipofílicos es una alternativa un poco

menos compleja que el uso de cationes lipofílicos radiomarcados. Este úlitmo

método requiere que un mínimo volumen conocido de células (u organelos) en

suspensión esté en equilibrio con el indicador, para luego calcular la cantidad de

indicador unido a la célula mediante un contador de centelleo.

La adición de células a soluciones micromolares de fluorocromos, como

por ejemplo DiOC6(3) (3,3´dihexyloxacarbocianina), produce una suspensión con

una fluorescencia menor que la solución original, indicando que a concentraciones

externas micromolares, la fluorescencia del fluorocromo captado por las células

disminuye. La estimación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ de células en suspensión usando cianinas se

realiza en un espectrofluorómetro.

14

Sin embargo, estas técnicas proporcionan un valor promedio de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ de la

suspensión celular completa, y no proporcionan información de variaciones de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ

célula a célula, dentro de poblaciones celulares (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro,

2000, 2001, 2003), siendo el interés de estas observaciones, las que estimularon el

desarrollo de técnicas que utilizaran la citometría de flujo para estimar ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ.

1.2.4. Estimación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ por citometría de flujo

La estimación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en células eucariotas y bacterianas individuales, por

citometría de flujo, usando fluorocromos, se ha efectuado por más de 20 años. El

primer informe de la medición de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ usando citometría de flujo data de 1979,

cuando Howard Shapiro empleó cianinas y oxonoles, fluorocromos usados

originalmente para mediciones volumétricas con espectrofluorometría (Shapiro y

col., 1979). Sólo recientemente, la disponibilidad metodológica ha permitido

determinaciones más precisas en términos de medias poblacionales,

heterogeneidad poblacional y detección de cambios en el tiempo.

1.2.4.1. Compuestos para ensayos potenciométricos.

Existen varios compuestos fluorescentes que se pueden usar para estimar el

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias. Compuestos fluorescentes del tipo cianinas, junto con otros

compuestos lipofílicos que tienen una carga positiva, como la rodamina 123, y que

15

añadidos a suspensiones celulares, son concentrados en la bacteria, en respuesta al

gradiente de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ negativo en el interior. De este modo, la fluorescencia de

organismos expuestos a bajas concentraciones de estos compuestos, se incrementa

con la hiperpolarización y disminuye con la depolarización (Novo y col., 1999,

2000; Rabinovitch, 1990; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003).

La mayoría de los fluorocromos ahora usados como pruebas para ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ,

fueron desarrollados durante la búsqueda sistemática hecha por Lawrence Cohen y

colaboradores, en la Universidad de Yale, Estados Unidos (Cohen y col, 1978;

Shapiro, 2003), para obtener materiales que exhibieran cambios rápidos, en sus

propiedades ópticas, para responder a los potenciales de acción de células

nerviosas. Muchos de los fluorocromos evaluados, se distribuían a través de

membranas celulares, en respuesta a cambios de potencial lentos. La mayoría de

estos fluorocromos catiónicos lipofílicos caen en esta categoría.

Los compuestos para ensayos potenciométricos, permiten efectuar

mediciones de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en organelos y en células que son muy pequeñas para permitir

el uso de micro electrodos. La selección del compuesto más adecuado para los

fines a estudiar, puede ser complicada a raíz de variaciones substanciales en su

respuesta óptica, fototoxicidad e interacciones con otras moléculas (Haugland,

2002; Shapiro, 1997, 2003). Los compuestos para ensayos potenciométricos se

pueden dividir en dos grandes grupos, basándose en su mecanismo de respuesta:

• Compuestos de respuesta rápida (Fast response probes): Actúan por un

cambio en su estructura electrónica, y en consecuencia en sus propiedades

16

fluorescentes, en respuesta a un cambio en el campo eléctrico del medio. Su

respuesta óptica es lo suficientemente rápida para detectar cambios transitorios

de potencial (milisegundos). Sin embargo, la magnitud del cambio de

fluorescencia dependiente de potencial, es a menudo muy pequeña, mostrando

un cambio de fluorescencia de 2 – 10 % por 100 mV (Haugland, 2002).

• Compuestos de respuesta lenta (Slow response probes): Muestran cambios

dependientes de potencial en su distribución de transmembrana, que son

acompañados de un cambio en la fluorescencia. La magnitud de su respuesta

óptica es mucho más grande que los compuestos de respuesta rápida,

mostrando un cambio de fluorescencia de 1% por mV. Este grupo incluye

carbocianinas y rodaminas catiónicas y oxonoles aniónicos, siendo adecuados

para detectar cambios en el ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ promedio de células no excitables (Haugland,

2002).

Dentro de las carbocianinas se pueden distinguir los derivados indo (DiI),

thia (DiS) y oxa (DiO), los cuales son moléculas de entre uno a siete átomos de

carbono. Son compuestos lipofílicos con una carga positiva localizada; su

estructura presenta dos anillos heterocíclicos idénticos, unidos por un puente

polimetilo (Haugland, 2002).

17

De acuerdo con la nomenclatura

usada por primera vez por Sims y col.,

en 1974, estos compuestos pueden ser

llamados DiYCn+1(2m+1). Donde Y

corresponde a los sustituyentes en el

anillo:

O : átomos de oxígeno

S : átomos de azufre

I : Grupo (C(CH3)2)

La hidrofobicidad de estos compuestos, con valores idénticos de m e Y,

aumenta con la longitud de la cadena lateral N-alkyl (aumentando n). Estos

fluorocromos catiónicos se acumulan en membranas hiperpolarizadas y son

translocados dentro de la bicapa lipídica (Haugland, 2002; Rabinovitch, 1990,

Shapiro, 2003). En mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de

la fluorescencia de estos compuestos es dependiente no sólo del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, si no que

también del tamaño celular. Aprovechando estas características, Novo y col.

(1999), desarrollaron un método para medir ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias usando citometría de

flujo, basándose en la razón del aumento de emisión de fluorescencia roja de

DiOC2(3) (3,3´-dietiloxacarbocianina iodada).

18

1.3. Viabilidad celular.

1.3.1. Definiciones y evaluación por citometría de flujo

Por un lado, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, y por otro lado, la impermeabilidad de la membrana a

ciertas sustancias fluorescentes, han sido usados como los principales indicadores

del estado fisiológico de la membrana citoplasmática y de la viabilidad del

microorganismo, respectivamente. Aunque células de diferentes especies, pueden

exhibir diferencias en la permeabilidad de la membrana, se cree que ciertas clases

de compuestos, incluyendo compuestos orgánicos que tienen al menos dos cargas

positivas y compuestos orgánicos cargados negativamente, son excluidos por

membranas celulares intactas, tanto de bacterias como de eucariontes (Guindulain

y col., 2002; López-Amorós y col., 1997; Novo y col., 2000; Shapiro, 2001, 2003;

Vives-Rego y col., 2000.). El demostrar la captación de estos compuestos

impermeables por células, es considerado un indicador de muerte celular. Los

colorantes que pueden entrar y teñir células vivas, han sido descritos como

colorantes vitales, aún cuando la mayoría de ellos son tóxicos para la célula.

Existe un problema semántico en lo que se refiere a definir viabilidad celular.

Generalmente se considera clonogenicidad o viabilidad reproductiva como

sinónimo de viabilidad celular. Lo anterior presenta dos notables desventajas:

19

1. La definición de viabilidad en términos de capacidad reproductiva, excluye

a células completamente diferenciadas y funcionales como es el caso de

células nerviosas y musculares en el caso de eucariontes y a células

vegetativas, en el caso de procariontes. En esta situación, la preservación

de alguna función celular específica sería más acorde con el criterio de

viabilidad.

2. Mientras que la reproducción celular en cultivo proporciona una evidencia

inequívoca de viabilidad, la falla en reproducir células se puede deber a

una falla en la metodología usada más que a un daño celular.

Howard Shapiro (2003), propone usar el término “células intactas”, para

describir a células que no han sido tratadas con fijadores o agentes lizantes, y que

no muestran una alteración morfológica y funcional. Entre los parámetros

considerados como característicos de células intactas, se encuentran: la integridad

de la membrana, la permeabilidad y fluidez de la membrana, el ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y el pH.

Para poder teñir o marcar constituyentes no localizados en la superficie de

células intactas, un colorante o fluorocromo debe ser capaz de cruzar la membrana

celular, ya sea por difusión o por alguna forma de transporte activo. La mayoría de

los colorantes descritos como tinciones vitales, son pequeñas moléculas que son

relativamente solubles en lípidos y son, ya sea, cargadas positivamente o

eléctricamente neutras a pH fisiológico. Una alta solubilidad en lípidos favorece el

paso desde un medio acuoso a la fase lipídica de la bicapa de la membrana

20

celular. Compuestos orgánicos conteniendo al menos dos cargas positivas (DAPI,

PI, TO-PRO-1), son impermeables a las membranas intactas. El Bromuro de etidio

(BrEt), comparte la estructura de anillo heterocíclico del ioduro de propidium

(PI), pero sólo presenta una sola carga positiva. Ambos fluorocromos forman

complejos con ADN y ARN, y son tóxicos para las células, una vez que son

internalizados. Sin embargo el BrEt, entra normalmente en la célula y es

expulsado al exterior por algunas bacterias, mientras que el PI es excluido por su

carga positiva adicional.

1.4. Helicobacter pylori

Por muchos años, se pensó que la presencia de secreción ácida en el

estómago no sólo ayudaba al proceso de digestión, sino que también actuaba como

una barrera para infecciones bacterianas. El aislamiento de Helicobacter pylori en

el estómago, al menos en parte, refutó esa idea. H. pylori es un patógeno

gastroduodenal humano, cuyo hábitat es la mucosa gástrica (Blaser y col., 1992,

1994). Se le considera uno de los factores etiológicos fundamentales de la

enfermedad péptica ulcerosa, siendo también agente etiológico importante de la

dispepsia no ulcerosa, de gastritis superficial crónica (denominada también

gastritis tipo B) y linfoma MALT. Específicamente coloniza y produce la

inflamación del antro del estómago (Blazer y col, 1992) y, desde 1994, la IARC

(grupo de estudio del cáncer, O.M.S., 1994) lo ha incluido entre los agentes

21

carcinógenos tipo 1, constituyéndose así en una de las especies bacterianas de

mayor interés en patología humana (De Fuigereido y col., 1998).

1.4.1. Características microbiológicas

Esta bacteria tiene morfología heterogénea. Puede presentarse en forma

helicoidal, espiralada o curva, con 2 a 6 flagelos lofótricos cubiertos por una

vaina; sin embargo, en cultivos envejecidos tiende a presentar forma cocoide.

Mide 0.5 a 1.0 µm de diámetro por 2.5 a 5.0 µm de longitud (Geis y col., 1989;

Goodwin y col., 1993). Las colonias son no pigmentadas, translúcidas y de 1 a 2

mm de diámetro. Entre sus características metabólicas destaca la producción de

una potente ureasa, con una actividad cercana al doble de la ureasa de Proteus

mirabilis (Mobley y col., 1988). Esta alta tasa hidrolítica, es muy importante para

la colonización de la mucosa gástrica (Hazell y col., 1986), pues en presencia de

urea forma amonio que neutraliza los iones hidrógeno que rodean la bacteria lo

que permite su sobre vivencia en el jugo gástrico (McNulty y col., 1987; Megraud

y col., 1989).

Es además, catalasa y oxidasa positivo. Desde el punto de vista de su

metabolismo respiratorio, la especie es microaerofílica, es decir, requiere una

atmósfera con 5% de O2 y 5 a 10% de CO2. Su temperatura óptima de

crecimiento es 37ºC, pero puede crecer a 30ºC, aunque no a 25ºC (Goodwin y col.,

1986). El crecimiento se manifiesta entre el 2º y 5º día de incubación. Los medios

22

de cultivo deben ser suplementados con sangre, suero de bovino fetal, carbón

activado, almidón de maíz o hemina (Buck y col., 1987; Kehler y col., 1994). H.

pylori, tiene un pH óptimo de crecimiento in Vitro (en ausencia de urea) entre pH

6.0 y pH 7.0 y no crece a pH menores a 4.5 o sobre 8.0, por lo que considerando

esta información, presenta características correspondientes a una bacteria

neutrófila (Sach y col., 1996).

1.4.2. Patogénesis de la infección por H. pylori

H. pylori accede al epitelio gastrointestinal pasando a través del moco y la

mucosa gástrica gracias a su morfología espiral y a la presencia de los flagelos.

Penetra la capa mucosa hasta quedar en contacto con las células secretoras de

mucus, donde se asocia a los receptores de superficie celular para formar

pedestales de adhesión. En este ambiente, encuentra un nicho ideal para

desarrollarse, pues obtiene todos los nutrientes necesarios y mantiene un pH

neutro producto de la secreción de bicarbonato realizada por las células más

internas del epitelio gástrico y la pared mucosa a diferencia de otras bacterias

(Axón, 1993).

1.4.3. Tratamiento de la infección por H. pylori

En la actualidad, uno de los mayores desafíos clínicos que presenta H.

pylori se relaciona con la toma de decisión en cuanto a cuándo realizar un

23

tratamiento de erradicación y cómo efectuarlo y pese a que las indicaciones para el

tratamiento se han expandido, aún no existe un acuerdo en relación con la terapia

óptima (Well y col., 1996), aunque existe consenso del beneficio de la

erradicación de H. pylori en todo paciente con úlcera péptica documentada (NIH

Consensus Conference, 1994.). La erradicación de H. pylori no es simple y se

requiere la administración de varias drogas en conjunto, incluyendo antibióticos e

inhibidores de la bomba de protones. Existen numerosos esquemas de tratamiento,

que incluyen neutralización del pH ácido en el interior del estómago y protección

de la mucosa. La neutralización del pH ácido se realizaba inicialmente con

bicarbonato, pero en la década del 70 se introdujeron en la terapia, los antagonistas

de protones, que reducen la secreción de ácido bloqueando los receptores que

permiten a la histamina estimular a las células productoras de ácido (Goodwin y

col., 1986; Rauws y col., 1988). En la actualidad, se cuenta con fármacos, como

por ejemplo el Omeprazol, que bloquean la bomba de protones. Estos fármacos

tienen mayor eficacia en inhibir la producción de ácido y lo hacen en menor

tiempo (Wood y col., 1995). No obstante que estos últimos fármacos han

mejorado los resultados de la terapia, en muchos pacientes reaparece la úlcera a

los pocos meses de finalizado el tratamiento y los cuadros se pueden presentar con

mayor intensidad e incluso las recaídas pueden manifestarse sin sintomatología

previa acompañada de hemorragia o perforación.

Los actuales esquemas de tratamiento varían ampliamente, entre una terapia

dual de 14 días hasta terapias triples o cuádruples de 7 a 10 días. Los tratamientos

utilizados incluyen inhibidores de la bomba de protones (omeprazol, lansoprazol,

24

pantoprazol, rabeprazol), antagonistas de los receptores H2 (ranitidina, famotidina,

cimetidina) y antibacterianos como sales de bismuto, beta lactámicos

(amoxicilina), macrólidos (azitromicina, claritromicina y roxitromicina),

nitroimidazoles (metronidazol, tinidazol) o tetraciclina (González, y col., 2001).

25

1.5. Hipótesis

No está claro, por qué H. pylori coloniza el estómago y que propiedades

especiales posee esta bacteria, que le permiten desenvolverse en un medio ácido

hostil. Esta propiedades, parecen ser muchas, siendo la principal, la capacidad de

resistir al menos en parte, cierto grado de acidez, en una forma más eficiente que

una bacteria aeróbica como E. coli. Bajo estas condiciones, el ajuste de las

características bioenergéticas de H. pylori frente a un medio ácido o alcalino,

tendría un papel importante en la capacidad de la bacteria para sobrevivir en el

estómago (Matin y col., 1996; Sach y col., 1996). En este contexto, la generación

de un potencial bioenergético sobre un rango amplio de acidez y en especial el

potencial de membrana de H. pylori, serían factores fundamentales en la

viabilidad, crecimiento y proliferación en un medio adverso, así como el efecto

que sobre dicho potencial puedan ejercen diversos compuestos con acción contra

H. pylori.

Por lo anterior, el desarrollar un protocolo para evaluar el potencial de

membrana en poblaciones bacterianas, toma un destacado papel en la

comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de la infección por H. pylori,

así como en su terapia. Al respecto, y considerando la disposición de un

citómetro de flujo en nuestra ciudad, se plantearon las siguientes hipótesis de

trabajo:

26

1. «Mediante citometría de flujo, es posible determinar los

parámetros de tamaño, forma celular, potencial de membrana y

viabilidad celular en Helicobacter pylori. »

2. « Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento

de la infección por Helicobacter pylori, producen alteraciones en la

células bacteriana, tanto de tamaño, morfología, como también en

el potencial de membrana y viabilidad celular; parámetros

determinables mediante citometría de flujo.»

Estas hipótesis se sustentan en los antecedentes previamente descritos en

diversos trabajos:

Característica Estudiada Autores

Estimación de bio volumen

bacteriano.

Bouvier y col., 2001; Robertson y col.,

1998, Shavalov y col., 2000.

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en Staphylococcus aureus y

Micrococcus luteus.

Novo y col., 1999, 2000; Shapiro,

1997, 2000, 2001, 2003; Wickens y

col., 2000.

Análisis monoparamétrico de

poblaciones celulares por

citometría de flujo.

Carbonari M.2002; Lampariello y col.,

1998; Watson, 2001.

Marcación de ácidos nucleicos y Alberghina y col. 2000; Guindulain y

27

viabilidad celular, por citometría

de flujo, en bacterias.

col., 2002; López-Amorós y col.,

1997; Mette y col., 1994; Steen y col.,

1994, 1999.

Estudios, por citometría de flujo,

del efecto de antimicrobianos sobre

bacterias.

Jernaes y col., 1994; Jepras y col.

1997; Mortimer y col., 2000; Stten y

col., 2000; Suller y col., 1997, 1998;

Vives-Rego y col., 1997; Walberg y

col., 1997, 1999; Wickens y col.,

2000.

Características bio energéticas de

H. pylori.

Matin y col, 1996; Sach y col., 1996;

Scout y col., 1998; Stingl y col., 2001,

2002.

Considerando por un lado, la capacidad de H. pylori de sobrevivir en el

estómago, debido, entre otras razones, a la generación de un potencial

bioenergético sobre un amplio rango de acidez, gracias a la síntesis y actividad

de la enzima ureasa, cuya acción (hidrólisis de urea, y formación de

(NH4)2CO3), es capaz de elevar el pH ácido en el medio ambiente cercano a la

bacteria, hasta valores relativamente neutros (Matin A. y col., 1996; Sach G. y

28

col., 1996), y por otro lado la importancia fisiológica del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias, se

planteó como objetivos generales:

1. Determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño,

forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana en

bacterias.

2. Determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y

la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen

acción contra esta bacteria.

Objetivos Específicos:

1. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de

tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en E.

coli y S. aureus.

2. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de

tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en H.

pylori.

3. Evaluar el efecto de agentes antibacterianos usados comúnmente en

el tratamiento de erradicación de H. pylori, sobre el potencial de

membrana y viabilidad celular de H. pylori.

29

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Reactivos:

Yoduro de propidio (PI) : Sigma Chemical Co, Estados Unidos.

Preparado en PBS, solución madre de 2

mg/ml. Conservado en oscuridad y a 4ºC.

3,3`-dietiloxacarbocianina

iodada (DIOC2(3))

: Aldrich Chem. Co., Estados Unidos.

Preparado en DMSO, solución madre de 1

mM. Conservado a -30ºC.

Valinomicina : Sigma Chemical Co, Estados Unidos.

Preparado en DMSO. Conservado en

oscuridad y a 4ºC.

Carbonyl cyanide m-

chlorophenyl-hydrazone

(CCCP).

: Sigma Chemical Co, Estados Unidos.

Preparado en DMSO. Conservado en

oscuridad y a 4ºC.

Bromuro de etidio (BrEt) : Sigma Chemical Co, Estados Unidos.

Solución madre de 10 mg/ml. Conservado en

oscuridad y a 4ºC.

30

2.2. Cepas bacterianas:

• Escherichia coli ATCC 25922, utilizada en los ensayos de viabilidad

celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.

• Staphylococcus aureus ATCC 29213, utilizada en los ensayos de viabilidad

celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.

• Helicobacter pylori ATTC 43504, usada en los ensayos de viabilidad

celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana.

• Escherichia coli K12, Pseudomona aeuruginosa, Acinetobacter spp. y

Bacillus subtilis usados como referencia en los ensayos de estimación de

tamaño bacteriano.

2.3. Condiciones de cultivo:

Todas las cepas, a excepción de H. pylori fueron cultivadas en medio

líquido (caldo Müller Hinton) filtrado (filtro con poros de 0.20 µm de diámetro) a

37ºC durante 18 horas.

Escherichia coli K12 se usó para evaluar el efecto de algunos antibióticos

sobre la forma y tamaño bacteriano. La CMI para ampicilina, gentamicina,

tetraciclina y ceftazidima se determinó mediante dilución en caldo tripticasa de

31

soya filtrado (0.20 µm). La CMI se definió como la mínima concentración de

antibiótico a la cual no hubo crecimiento a simple vista.

En esta Tesis, también se utilizaron cepas de H. pylori aisladas de biopsias

gástricas antrales, provenientes de pacientes sometidos a endoscopía digestiva alta

(sin tratamiento antibiótico previo). Estas muestras fueron obtenidas en el Hospital

del Trabajador de Concepción. Las biopsias gástricas se maceraron en suero

glucosalino (NaCl 0.85 %, glucosa 1%) estéril hasta formar una suspensión

homogénea. Se sembraron 100 µl de esta suspensión en agar Columbia con 5% de

sangre de caballo, suplementado con un inhibidor selectivo de la flora bacteriana y

fúngica (DENT: Oxoid, Hampshire, Inglaterra). Los cultivos se incubaron durante

cuatro días a 37°C, en microaerofilia (5% de O2 y 5-10% de CO2) usando sistema

generador de microaerofilia GasPak (Difco: Detroit, Estados Unidos). La

identificación de las cepas se hizo en base a tinción de Gram modificada (con

fucsina como colorante de contraste), prueba de ureasa y reacción de catalasa

(Gonzalez C. y col., 2001).

2.4. Preparación de suspensiones celulares para evaluación de patrones de

tamaño bacteriano por citometría de flujo

En el caso de E.coli K12, ésta se cultivó en medio líquido, en presencia de

los antibióticos ampicilina, gentamicina, tetraciclina y ceftazidima a una

concentración de 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1). A partir de cada cultivo líquido,

32

se obtuvo un sedimento mediante centrifugación (800 g por 10 minutos), el cual se

lavó con PBS, se resuspendió en 0.5 ml de PBS, para luego adquirir en el

citómetro de flujo. En el caso de H. pylori, las bacterias fueron resuspendidas en

2.0 ml de PBS, a partir de placas incubadas en las condiciones adecuadas, lavadas

y resuspendidas en 0.5 ml de PBS y así adquiridas en el citómetro de flujo.

Tabla 1: CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos usados.

Antibiótico CMI 0.5 CMI 2 CMI

Ampicilina 8 µµµµg/ml 4 µµµµg/ml 16 µµµµg/ml

Gentamicina 16 µµµµg/ml 8 µµµµg/ml 32 µµµµg/ml

Ceftazidima 0.5 µµµµg/ml 0.25 µµµµg/ml 1 µµµµg/ml

Tetraciclina 1 µµµµg/ml 0.5 µµµµg/ml 2 µµµµg/ml

2.5. Preparación de controles negativos para viabilidad celular, ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y eflujo

bacteriano a bromuro de etidio

2.5.1. Preparación de células muertas por calor

A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una

emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 2.0 ml de medio conteniendo

bacterias y se sometió a baño María por 10 minutos para luego dejar enfriar. Se

centrifugó y luego se lavó el sedimento, para luego ser resuspendido en PBS.

33

2.5.2 Preparación de células muertas por shock frío

A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una

emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 1.0 ml de medio conteniendo

bacterias, se procedió a lavar con PBS, centrifugar y el sedimento se resuspendió

en 8.0 ml de etanol absoluto frío (conservado a -30ºC). Se incubó 1 hora a -30ºC,

para luego centrifugar, eliminar el sobrenadante y lavar con PBS, y finalmente se

resuspendió en PBS.

Con el objetivo de poder discriminar claramente bacterias vivas de

bacterias muertas, e incluso discriminar situaciones en que hubiera una mezcla de

bacterias vivas y muertas, se utilizó un protocolo básico de preparación de

suspensiones celulares (Tabla 2), el cual permitió la evaluación de una linealidad

en cuanto a la presencia de bacterias vivas y/o muertas a diferentes puntos,

siempre considerando 15 µl de bacterias (vivas o muertas) en 1.0 ml de PBS. La

concentración de bacterias vivas o muertas se pudo así relacionar directamente con

el inóculo del cultivo líquido usado.

Tabla 2: Protocolo básico de trabajo.

Tubo Bacterias vivas (µµµµl) Bacterias muertas (µµµµl)

1 15 0 2 12 3 3 9 6 4 6 9 5 3 12 6 0 15

34

2.6. Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo.

En 1.0 ml de PBS, se resuspendieron 15 µl de bacterias (vivas y/o

muertas), luego se adicionaron 10 µl de yoduro de propidio (PI) a partir de una

solución stock de 1 mg/ml en PBS (10 µg/ml concentración final). Luego de

incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, se adquiere en el

citómetro de flujo.

2.7. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ por citometría de flujo.

Tomando como base, el protocolo descrito por Novo y colaboradores en

1999, en 1.0 ml de buffer de marcación, se resuspendieron 15 µl de bacterias

(vivas y/o muertas), luego se adicionaron 30 µl de 3, 3`-dietiloxacarbocianina

iodada (DiOC2(3)) (30 µM concentración final), incubándose por 4 minutos a

temperatura ambiente y en oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de

flujo.

2.8. Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por citometría de

flujo.

Considerando el protocolo descrito por Mette y colaboradores (1994), se

utilizó BrEt a fin de evaluar la presencia de un eflujo a este compuesto. A partir de

35

una solución madre de 10 mg/ml de BrEt se preparó una solución de trabajo de 1

mg/ml. Para el ensayo de eflujo, en un 1.0 ml de PBS se resuspendieron 15 µl de

bacterias (vivas y/o muertas), se adicionaron 20 µl de BrEt (20 µg/ml

concentración final), incubándose por 5 minutos a temperatura ambiente y en

oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de flujo.

2.9. Citometría de flujo

Los estudios citométricos se efectuaron en el Laboratorio de Citometría de

Flujo del Hospital del Trabajador de Concepción (administrado por el Centro de

Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada). El citómetro de flujo utilizado es un

FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizando el programa de adquisición y análisis

CELLQuest v 1.1. La velocidad del flujo utilizada fue de 12 µl/min, lo que se

traduce en un máximo de 1.000 eventos celulares por segundo. Se adquirió un total

de 20.000 eventos celulares.

2.10. Análisis de patrones de tamaño

Se efectuó utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v

1.1. Se dibujó una ventana de análisis (gate), en función de FSC (Foward scatter o

dispersión frontal) y SSC (side scatter o dispersión lateral), de modo que más del

90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3).

36

Figura 3: Selección de ventana de análisis en función de FSC y SSC. En función de FSC y SSC, se dibujó una ventana de análisis (R1), de modo que incluyera más del 90% de los eventos celulares (A). Posteriormente se analizaron los datos contenidos en esta región (histogramas B, C y D).

Todos los datos se expresaron en forma de canales. Los valores de canales

en el citómetro de flujo modelo FACSCalibur tienen un rango que va desde 0 hasta

1.023. Cada histograma fue dividido por 8 marcadores consecutivos con un

espacio de 100 canales cada uno. El primero de estos marcadores comprendía el

rango de 300 +/- 50 canales. Se utilizó el porcentaje de la región de análisis para

todos los datos.

37

Para evaluar el rango de tamaños celulares de las células detectadas en cada

sección, se consideraron intervalos de FSC-H que contuvieran un número

significativo de eventos celulares, relacionado con el porcentaje de la región de

análisis dentro de cada marcador y el número de eventos celulares. Al considerar

lo anterior con la definición arbitraria de células cocoides, bacilos cortos, bacilos y

bacilos largos, se pudieron definir algunos patrones de tamaño (Tabla 3).

Tabla 3: Patrones de estimación de tamaño definidos por el porcentaje de la gate para cada marcador.

Marcador Rango de

canales Patrón de

estimación de tamaño

Sugerente (% gate)

Concordante (% gate)

M1 250-350 Cocoide (C) 5 – 15 > 15 M2 350-450 Cocoide (C) 5 – 15 > 15 M3 450-550 Bacilo corto (BC) 5 – 15 > 15 M4 550-650 Bacilo corto (BC) 5 – 15 > 15 M5 650-750 Bacilo (B) 5 – 15 > 15 M6 750-850 Bacilo (B) 5 – 15 > 15 M7 850-950 Bacilo largo (BL) 5 – 15 > 15 M8 950-1023 Bacilo largo (BL) 5 – 15 > 15

Un valor mayor de 15% se consideró en concordancia con el patrón dado para cada marcador. Un valor entre 5% y 15%, sugiere un patrón dado para cada marcador.

2.11. Análisis de viabilidad bacteriana.

Utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. se

dibujó una ventana de análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más

38

del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control

positivo, se utilizaron células viables, es decir células que no incorporaron PI y

como control negativo, células muertas, es decir células que sí incorporaron PI. Se

evaluó la intensidad de fluorescencia roja del PI (FL3-H: mayor de 640 nm). Bajo

este mismo concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas

situaciones en las cuales se evaluó viabilidad celular, incluyendo el control

negativo, es decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos

celulares dentro del segundo marcador descrito.

2.12. Análisis de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y cálculo de razón de fluorescencia roja/verde.

Tomando como base, el análisis descrito por Novo y colaboradores en 1999

(Novo y col., 1999, 2000), se utilizó el programa de adquisición y análisis

CELLQuest v 1.1. para lo cual se dibujó una ventana de análisis (R1) en función

de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos celulares estuvieran

incluidos (Figura 3). A continuación, en función de FL2-H v/s FL1-H, se definen

ventanas de análisis rectangulares a fin de abarcar células polarizadas y

depolarizadas (R2 y R3, respectivamente). Los resultados se expresan como

porcentaje de cada ventana de análisis respecto de R1.

Como el análisis descrito por Novo y colaboradores, considera el cálculo

de la razón de fluorescencia roja sobre fluorescencia verde y debido a que el

programa CELLQuest v 1.1. funciona en ambiente Macintosh y no permite

39

calcular dicha razón, a fin de poder efectuar el cálculo de la razón de fluorescencia

roja sobre fluorescencia verde se utilizó el programa Flow Explorer 4.0, el cual

funciona en ambiente PC siendo compatible con Windows 9x, NT, 2000 y XP, y

que entre sus características, permite explorar archivos con datos de citometría de

flujo. Este programa se puede obtener gratuitamente en la dirección web

http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Flowex2.htm.

Flow Explorer 4.0 tiene la capacidad de mostrar las propiedades de los

archivos con datos, como histogramas, gráficos de punto, contorno y densidad, así

como las estadísticas asociadas a ellos. Una característica muy importante de este

programa, es la capacidad de agregar notas y editar parámetros y hacer cálculos

con los datos. Dentro de los cálculos factibles de efectuar, está el cálculo de

razones entre parámetros; cálculos que son guardados como un nuevo archivo. En

la Tabla 4 se encuentra el protocolo de cálculo de la razón de fluorescencia roja

sobre verde.

Una vez obtenido el nuevo archivo (con el cálculo de la razón de

fluorescencia roja sobre verde), éste se convierte en un archivo con formato FCS

2.0 mediante el programa FACSConvert (Becton Dickinson), posterior a lo cual se

analizó nuevamente en programa CELLQuest v 1.1., donde se graficó y obtuvieron

las estadísticas correspondientes. En la Figura 4 se encuentra el diagrama

correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ.

40

Tabla 4: Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja sobre verde usando programa Flow Explorer 4.0.

1. Seleccionar fila 2. Elegir Math 3. Imput Parameters:

y1 = FL2-H y2 = FL1-H

4. Math formula: Seleccionar x = y1/y2

5. Output parameter: x = FL3-H

6. New label: Ratio FL2/FL1

7. File renaming: Ingresar nombre de nueva fila

8. Apply calculation to file 9. Confirmation 10. La nueva fila esta lista

Figura 4: Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de ∆Ψ.∆Ψ.∆Ψ.∆Ψ.

41

Al graficar la razón de fluorescencia roja sobre verde en un histograma, el

pico ubicado a la izquierda (incluido en el marcador 1) corresponde a células

depolarizadas, mientras que el pico ubicado a la derecha del histograma (incluido

en el marcador 2) corresponde a células polarizadas. Los resultados se expresan

como porcentaje de cada marcador de análisis respecto de R1.

2.13. Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio.

En forma semejante al análisis de viabilidad bacteriana, utilizando el

programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1., se dibujó una ventana de

análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos

celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control positivo, se utilizaron

células viables (E. coli), es decir células que no tenían fluorescencia (atribuible al

eflujo de bromuro de etidio) y como control negativo, células muertas, es decir

células que sí tenían fluorescencia (sin eflujo de bromuro de etidio). Se evaluó la

intensidad de fluorescencia roja del BrEt (FL2-H: 543-627 nm). Bajo este mismo

concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas situaciones en las

cuales se evaluó la presencia de eflujo al BrEt, incluyendo el control negativo, es

decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos celulares

dentro del segundo marcador descrito.

42

3. RESULTADOS

3.1 Determinación de calibración base

Debido a que no se tenía experiencia previa en el análisis de bacterias por

citometría de flujo, fue necesario establecer la correcta discriminación de bacterias

en función de FSC y SSC, logrando de este modo, para los diversos parámetros, un

adecuado ajuste de las diversas intensidades de señal, estableciéndose una

calibración base sobre la cual trabajar en los subsiguientes ensayos. En la Figura 5

se puede observa la selección de la mejor calibración base y en la Tabla 5 se

detalla la misma.

Figura 5: Selección de calibración base. En A y B se pierden los eventos pequeños (señal amplificada por un factor de 10), mientras que en C, se pierden los eventos grandes (señal amplificada por un factor de 1000). En D se aprecia la una adecuada discriminación de eventos pequeños y grandes (señal amplificada por un factor de 100). Bacteria usada: E.coli.

43

Tabla 5: Detalle de calibración base utilizada (Citometro de flujo

FACSCalibur)

Detector Voltaje Ganancia amplificador

Modo

FSC E02 1.78 Log SSC 450 1.00 Log FL-1 633 1.00 Log FL-2 681 1.00 Log FL-3 622 1.00 Log Threshold (umbral)

Parámetro primario SSC Valor 200 Parámetro secundario Ninguno

Compensación

FL1-0.0 % FL2 FL2-0.0 % FL1 FL2-0.0 % FL3 FL3-0.0 % FL2

3.2. Análisis de patrones de tamaño

Con el objeto de tener un punto de referencia con características similares,

en especial en lo que se refiere al índice de refracción, se utilizaron como control,

diversas bacterias con características conocidas, las que se representan el

histograma de la Figura 6, y en la Tabla 6, se puede apreciar los patrones de

tamaño para E. coli (bacilo), P. aeuruginosa (bacilo corto), Acinetobacter spp.

(Cocoide y bacilo corto) y Bacillus subtilis (bacilo a bacilo largo).

44

Figura 6: Superposición de histogramas para la señal de FSC-H. Representando bacterias con un patrón de tamaño que incluye, cocáceas, bacilos cortos, bacilos y bacilos largos. También se representa la posición de 8 marcadores (incluyendo +/- 100 canales).

En la Tabla 7 se muestran los patrones de tamaño para E. coli K12 bajo el

efecto de los antibióticos ampicilina, ceftazidima, gentamicina y tetraciclina a

concentraciones 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1).

45

Tabla 6: Patrones de tamaño de cepas control.

Marcador Canal E. coli P. aeuruginosa Acinetobacter

spp.

Bacillus subtilis

Rango % G Patrón % G Patrón % G Patrón % G Patrón

M1 250-350 0.00 - 0.40 - 14.79 c 5.22 c M2 350-450 0.00 - 4.00 - 25.05 C 6.69 c M3 450-550 0.00 - 36.60 BC 27.91 BC 5.00 Bs M4 550-650 2.40 bc 57.50 BC 14.69 bc 5.90 Bs M5 650-750 47.10 B 1.50 - 2.17 - 11.44 B M6 750-850 49.20 B 0.00 - 0.65 - 35.59 B M7 850-950 1.30 - 0.00 - 0.08 - 20.51 BL M8 950-1023 0.00 - 0.00 - 0.00 - 8.62 bl

%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas. Para E. coli, el patrón concordante es bacilo (marker 5 y 6). Para P. aeuruginosa el patrón concordante es bacilo corto (marker 3 y 4). Para Acinetobacter spp., el patrón concordante es entre cocoide y bacilo corto. Para Bacillus subtilis el patrón concordante es entre bacilo y bacilo largo.

Al comparar el control (patrón de bacilo a bacilo corto) con los ensayos

con una concentración de antibiótico al doble de la CMI, se puede apreciar un

patrón de células cocoides para ampicilina y gentamicina, un patrón de células

cocoides a bacilos cortos para ceftazidima y un patrón de células cocoides a

bacilares para tetraciclina. En el caso de los ensayos con una concentración de

antibiótico de 0.5 veces la CMI, el patrón de tamaño difiere respecto de los

ensayos con 2 veces la CMI. Un patrón, principalmente, de bacilo corto se observó

con ampicilina. Con ceftazidima y tetraciclina, cambió a un patrón de bacilo a

bacilo alargado y para gentamicina, cambió a un patrón bacilar (Figura 7).

46

Figura 7: Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a diferentes antibióticos. En rojo se representa la intensidad de señal para FSC de la bacteria sin antibióticos. La curva en negro representa 0.5 veces la CMI. La curva en azul representa 2 veces la CMI.

En el caso de H. pylori, la Tabla 8 muestra el patrón de tamaño para cinco

cepas diferentes, después de un cultivo de 72 horas en medio sólido sin ningún

antibiótico. Es interesante señalar que cuatro cepas tuvieron un patrón cocoide a

bacilo corto, mientras que una cepa (594-C) tuvo un patrón de bacilo a bacilo

alargado, diferencias que fueron claramente observadas.( Figura 8).

47

Tabla 7: Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5

y 2 veces la CMI).

Marcador Rango Control Ampicilina Ceftazidima Gentamicina Tetraciclina canal 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat.

M1 250-350 0.01 - 1.00 - 21.48 C 0.00 - 12.86 c 4.83 - 22.61 C 0.00 - 10.02 c M2 350-450 0.70 - 9.12 c 41.13 C 0.00 - 30.74 C 10.65 c 40.24 C 0.00 - 24.31 C M3 450-550 5.15 bc 27.01 BC 16.82 BC 0.02 - 17.19 BC 5.26 bc 16.45 bc 0.04 - 13.83 bc M4 550-650 42.02 BC 37.40 BC 6.56 bc 10.00 bc 5.19 bc 24.20 bc 7.44 sb 2.41 - 5.67 bc M5 650-750 37.00 B 17.37 B 5.28 b 67.29 B 11.78 b 44.60 B 3.95 - 45.82 B 13.33 b M6 750-850 11.30 b 6.07 b 3.30 - 18.15 B 16.00 B 8.10 b 2.89 - 42.07 B 24.26 B M7 850-950 3.10 - 2.03 - 1.58 - 4.45 - 3.57 - 1.78 - 1.45 - 7.70 bl 5.93 lb M8 950-1023 0.72 - 0.00 - 0.21 - 0.09 - 0.73 - 0.38 - 0.01 - 2.00 - 1.28 -

%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas.

48

Tabla 8: Patrones de tamaño para diferentes cepas de H. pylori después de

un cultivo de 72 horas en medio sólido sin antibióticos.

Marcador Rango Cepa 636-C Cepa 594-C Cepa 612-C Cepa 632-C Cepa 633-A canal % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat.

M1 250-350 10.50 c 8.62 c 18.27 C 10.89 c 15.45 C M2 350-450 18.36 C 4.08 - 17.22 C 20.31 C 19.84 C M3 450-550 19.47 BC 3.56 - 13.95 bc 26.39 BC 19.17 BC M4 550-650 17.77 BC 6.34 bc 12.41 bc 16.58 BC 14.87 bc M5 650-750 12.91 b 15.51 B 9.73 b 10.46 b 9.04 b M6 750-850 8.16 b 24.62 B 5.45 b 4.67 b 4.21 - M7 850-950 3.41 - 17.56 BL 1.34 - 0.87 - 1.38 - M8 950-1023 0.62 - 9.19 lb 0.44 - 0.27 - 0.67 -

%G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas.

Figura 8: Cepas de H. pylori después de incubación por 72 horas. Todas presentan un patrón cocoide a bacilo corto a excepción de la cepa 594-C, que presenta un patrón de bacilo a bacilo alargado.

49

3.3. Ensayo de viabilidad celular en E.coli y S. aureus:

En la Figura 9, se observa los histogramas correspondientes a la

evaluación de viabilidad celular mediante la incorporación de PI. En el histograma

correspondiente al control positivo, se dibujó a la izquierda un marcador que

incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del

histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células

incluidas en este segundo marcador corresponden a células que incorporaron PI, es

decir no viables.

Figura 9: Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de PI. (A) Control positivo (células vivas). (B) Mezcla 1:1 de bacteria vivas y muertas. (C) Control negativo (células muertas).

50

En el caso de E. coli, al preparar el control de células muertas por calor, en

función de FSC y SSC, se logró una buena discriminación de las bacterias, sin

alterarse el patrón de tamaño de la población entera (Figura 10).

Cuando se evaluó viabilidad en E. coli, en base al protocolo básico de

preparación de suspensiones previamente definido (con el cual es posible evaluar

linealidad), se obtuvo una muy buena linealidad (R = 0.997) como se puede

apreciar en la Figura 11.

Figura 10: E. coli. En A bacterias vivas. En B, bacterias muertas por calor.

51

Figura 11: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de E. coli muertas por calor.

A su vez, al preparar el control de células de S. aureus muertas por calor, se

formó un precipitado macroscópico que se mantuvo en suspensión, lo que se

tradujo en una alteración considerable de las características de FSC y SSC (Figura

12). Al evaluar viabilidad en S. aureus en base al protocolo básico de preparación

de suspensiones previamente definido, se obtuvo una baja linealidad (R = 0,692)

dada por la asimetría poblacional producto de la probable formación de agregados

(Figura 13).

52

Figura 12: Células de S. aureus muertas por calor. En B, se puede apreciar la formación de agregados y el aumento de la destrucción celular, con respecto a células vivas (A).

Figura 13: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de S. aureus muertas por calor.

53

Producto de lo anterior se realizaron una serie de experiencias tendientes a

lograr establecer un adecuado control de células muertas, tanto para E. coli como

para S. aureus, es decir que no alteraran las características de FSC y SSC, y que

además se lograra una buena correlación entre el porcentaje de células que

incorporan PI y la cantidad de células muertas. En el caso de E. coli se ensayó:

etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 14), e

incubación a distintos tiempos en una solución en base a paraformaldehído y

dietilenglicol (Figura 15) (FACSTM Lysing Solution; Becton Dickinson) y que

normalmente se usa para fijar y permeabilizar células eucariotas. En ninguno de

estos casos la incorporación de PI superó el 1.5%. Además, se ensayó una

incubación a 70º C por 30 minutos, con la cual se obtuvieron resultados muy

similares a la incubación a 100º C por 10 minutos (Figura 16).

A su vez, con S. aureus, se ensayó la acción de la agitación mecánica

vigorosa (vórtex) durante diferentes tiempos, así como también, la acción de

etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 17), e

incubación a distintos tiempos con solución de lisis (FACSTM Lysing Solution;

Becton Dickinson). Nuevamente, en ninguno de estos ensayos, la incorporación de

PI superó el 3.0%, a excepción del Tritón X-100 al 1%, que logró 7.21% (Figura

18). Al ensayar una incubación a 70º C por 30 minutos, se obtuvieron resultados

similares a la incubación por 10 minutos a 100º C, con la formación del

precipitado macroscópico ya mencionado.

54

Figura 14: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de diversas sustancias.

Figura 15: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

55

Figura 16: Incorporación de PI en células de E. coli tratadas por 30 minutos a 70ºC.

Figura 17: Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

56

En la búsqueda de un adecuado control de células muertas, se exploró el

concepto de fijación con etanol absoluto a baja temperatura. Este shock frío

permite por un lado que las células sean fijadas por el etanol y por otro lado, que

no se alteren las características de FSC y SSC, producto de la brusca baja de

temperatura. En la Figura 19 es posible apreciar que en el caso de S. aureus, se

logró una muy buena incorporación de PI por parte de células sometidas al shock

frío, al igual que con E. coli (Figura 20). Cabe destacar que para S. aureus, este

procedimiento permitió eliminar la formación de agregados y las características de

FSC y SSC fueron óptimas para un adecuado análisis. Además el posterior cultivo

en placa de estas células demostró que el shock frío, al menos las transforma en

células no cultivables.

Cuando se procedió a evaluar viabilidad de E. coli muertas por shock frío,

en base al protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido,

se obtuvo, en un ensayo en triplicado, una muy buena linealidad (R = 0.978) como

se puede apreciar en la Figura 21. A su vez para S. aureus, también en un ensayo

por triplicado, la linealidad obtenida fue muy buena (R = 0.981) (Figura 22).

57

Figura 18: Incorporación de PI en células de S. aureus, en diversas situaciones.

Figura 19: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío.

58

Figura 20: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío.

Figura 21: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío. Ensayo triplicado.

59

Figura 22: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío. Ensayo triplicado.

3.4. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en E. coli y S. aureus

Una vez establecidos los controles en base al protocolo de shock frío, y

demostrado que dichas células no son cultivables y no son viables (en base a la

incorporación de PI), se utilizaron como controles negativos para ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, es decir

estas células teóricamente presentaban una depolarización completa de su

membrana citoplasmática. En la Figura 23 se muestra un gráfico de FL2-H v/s

FL1-H donde se es posible apreciar las regiones correspondientes a células

polarizadas y depolarizadas. De igual forma, en la Figura 24, se muestra el

60

histograma que representa la razón de fluorescencia roja sobre verde (FL2-H/FL1-

H)

Figura 23: S. aureus y ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ. Gráfico de FL2-H v/s FL1-H, que permite dibujar regiones (R2 y R3), que corresponden a células polarizadas y depolarizadas, respectivamente.

61

Figura 24: S. aureus. Histograma representando la razón FL2/FL1. Se dibujan los marcadores M1 y M2 que corresponden a células depolarizadas y polarizadas, respectivamente.

En S. aureus, y usando el protocolo básico de preparación de suspensiones

previamente definido y evaluando igualmente viabilidad celular en cada serie de

ensayos, se observó nuevamente una muy buena correlación entre la incorporación

de PI y la cantidad de células muertas (Figura 25).

62

Figura 25: Incorporación de PI en células de S. aureus muertas por shock frío. Evaluación de linealidad.

A su vez, al medir ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, en ensayos en triplicado, se obtuvo una muy buena

correlación (R = 0.982) entre el porcentaje células que mostraban depolarización

y/o polarización y el número de células viables y/o muertas (Figura 26). Igual

situación ocurre al calcular la razón de fluorescencia roja/verde (Figura 27).

A fin de evaluar la estabilidad en el tiempo de la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en S.

aureus, usando DiOC2(3), se efectuaron mediciones en el tiempo a un mismo tubo

con bacterias viables, provenientes de un cultivo fresco, a intervalos de 2 minutos

durante 30 minutos (protegiendo el tubo de la luz ambiente). Tanto para células

polarizadas como para depolarizadas, la estabilidad se mantiene en el tiempo

(Figura 28). La misma situación se observa al calcular la razón de fluorescencia

roja/verde (Figura 29).

63

Figura 26: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en triplicado.

Figura 27: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde) en triplicado.

64

Figura 28: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).

Figura 29: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde).

65

Es importante señalar, que una vez cumplido exitosamente el proceso de

estandarización de la metodología de estimación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en S. aureus, se procedió a

los ensayos con E. coli. A fin de que la DiOC2(3) pueda acceder a la membrana

interna, es necesario permeabilizar la membrana externa de la bacteria, para lo cual

se utilizó una solución de PBS que además contenía TRIS 10 mM, EDTA disódico

1 mM y glucosa 10 mM. En la Figura 30 se puede observar la comparación entre

el uso de PBS-EDTA y sólo PBS. En este último caso, casi el 100% de las células

se observan como si estuvieran depolarizadas, y esto es atribuible a la incapacidad

de la DiOC2(3) de acceder a la membrana interna de la células, situación que se

revierte al usar PBS-EDTA. Es importante notar, sin embargo, que se observa un

porcentaje basal de células que aparecen como depolarizadas (16.5 %) y

lógicamente el porcentaje de células polarizadas es cercano al 83%.

Al efectuar el ensayo en triplicado, usando el protocolo básico de

preparación de suspensiones previamente definido, con PBS-EDTA, se logró una

muy buena correlación entre la incorporación de PI y la cantidad de células vivas

(Figura 31). Igual situación se observó entre el porcentaje células que mostraban

depolarización y/o polarización y el número de células viables y/o muertas

(Figura 32). Idéntica situación se observa al calcular la razón de fluorescencia

roja/verde, tanto para células polarizadas y depolarizadas (Figura 33).

66

Figura 30: E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer usado.

Figura 31: Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI de células de E. coli en PBS-EDTA.

67

Figura 32: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)). Ensayo en triplicado.

Figura 33: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde). Ensayo en triplicado.

68

3.5. Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori:

Para evaluar viabilidad en H. pylori ATTC 43504, se prepararon

suspensiones celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3

días de incubación. Luego de preparar células muertas (por calor y shock frío), una

alícuota se resuspende en PBS y se adiciona PI (10 µg/ml concentración final). En

la Figura 34 se muestra que el porcentaje de incorporación de PI por parte de

células teóricamente muertas, fue mínimo (no mayor al 13,8%). Luego de repetir

el ensayo, variando tanto el cultivo celular, como los tiempos de incubación con PI

(normalmente son 5 minutos), los resultados se mantuvieron, no descartándose que

el PI sea incapaz de acceder a la célula.

Figura 34: H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA).

69

3.6. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en Helicobacter pylori

Al igual que para el ensayo de viabilidad, se prepararon suspensiones

celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3 días de

incubación, resuspendiéndose en PBS-EDTA. Se observó cerca de un 80% de

células aparentemente depolarizadas, incluso en el caso de células teóricamente

viables y que deberían haber aparecido como polarizadas. El porcentaje de células

teóricamente polarizadas no superó el 6.5% (Figura 35). A fin de descartar la

presencia de un sistema de eflujo que expulse los fluorocromos hacia el exterior de

la células, se implementó la medición de eflujo a BrEt en E. coli, como base para

posteriores ensayos con H. pylori.

Figura 35: H. pylori en PBS-EDTA. Evaluación de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (marcación con DiOC2(3)).

70

3.7. Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E.coli y S. aureus:

Para analizar la presencia de un eflujo para BrEt, como se observa en la

Figura 36, en el histograma correspondiente al control positivo, es decir células

que sí presentaban eflujo a BrEt, se dibujó a la izquierda un marcador que

incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del

histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células

incluidas en este segundo marcador corresponden a células sin la capacidad de

eflujo al BrEt (no viables). Al ensayar tres puntos (células vivas, células muertas y

una mezcla 1:1 de ambas), se obtuvo una curva lineal muy similar a la producida

por el ensayo de viabilidad con PI (Figura 37).

Figura 36: Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo (células vivas) y en B control de negativo (células muertas).

71

Figura 37: E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET.

En S. aureus, si bien el control positivo mostró un valor coincidente con la

presencia teórica de un eflujo a BrEt, el control negativo, es decir células muertas

y que deberían haber mostrado una alta fluorescencia, mostró sólo un 61%; sin

embargo, se conservó la linealidad (Figura 38). Lo anterior se podría explicar por

la incapacidad de BrEt de ingresar completamente a la célula muerta.

72

Figura 38: S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET.

3.8. Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori:

Al ensayar tres puntos, se obtuvo una baja intensidad de fluorescencia

(cercana al 15 %), tanto en células vivas, células muertas y en la mezcla 1:1 de

ambas. Con este resultados se puede pensar, que H. pylori, no presentaría un

sistema de eflujo de BrEt, o bien por alguna razón el BrEt no es capaz de acceder a

la célula. A fin de intentar confirmar lo anterior, se intentó evaluar en H. pylori

(usando como referencia E. coli y S. aureus), viabilidad celular con PI, ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ con

DiOC2(3) y eflujo de BrEt bajo la acción de ionóforos, inhibidores de bombas de

eflujo y sustancias que alteran la cadena transportadora de electrones.

73

3.9. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y el probable eflujo de

bromuro de etidio en S. aureus:

A partir de un cultivo bacteriano líquido en fase exponencial, se ensayó la

acción de Carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone (CCCP) sobre S. aureus, a

diferentes tiempos (0, 10, 30, 60 y 120 minutos y a las 18 horas). En cada punto se

evaluó (incluyendo un control sin CCCP) viabilidad celular con PI, estimación de

∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y probable eflujo de BrEt, según los protocolos ya descritos.

La viabilidad celular y el probable eflujo de BrEt, no fue afectada por la

acción del CCCP (Figura 39), a diferencia de la clara acción ejercida en el tiempo

sobre el ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ (Figura 40), acción que se intensificó en el tiempo, demostrándose la

acción del CCCP como ionóforo de protones.

Figura 39: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular y el eflujo a BrEt.

74

Figura 40: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ (razón de fluorescencia roja/verde).

3.10. Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y MC207.110, sobre la

viabilidad celular, el potencial de membrana y el eflujo de bromuro de

etidio en E. coli

La viabilidad celular no fue afectada por la acción de ninguno de los

compuestos ensayados (Figura 41). El eflujo de BrEt no se afectó con

valinomicina y CCCP. Con azida de sodio y MC 207.110 se produjo una

disminución transitoria del eflujo de BRET, a los 60 minutos, la cual fue

posteriormente completamente revertida (Figura 42)

75

Figura 41: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la viabilidad celular.

Figura 42: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre el eflujo a BrEt.

76

El ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, no fue mayormente alterado por ninguno de los compuestos a

excepción de CCCP, con el cual, se produjo una depolarización considerable (pero

no completa), durante los primeros tiempos, para luego retornar a la normalidad

luego de 18 horas de incubación (Figura 43).

Figura 43: Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ).

77

3.11. Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y MC207.110, sobre H.

pylori:

En el caso de intentar medir viabilidad celular con PI, no se logró ningún

efecto sobre la incorporación de PI, con ninguno de los compuestos y a ningún

tiempo (Figura 44). Igual situación ocurrió con el intento de medir eflujo de BrEt

(Figura 45).

Finalmente, al intentar evaluar ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, los resultados fueron invariables con

respecto a lo previamente ensayado, no siendo posible, con DiOC2(3), evidenciar

la presencia de células polarizadas (Figura 46).

Figura 44: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre incorporación de PI.

78

Figura 45: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre el eflujo a BrEt.

Figura 46: H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre la razón de fluorescencia roja/verde (∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ).

79

4. DISCUSION

Las aplicaciones de la citometría de flujo son múltiples así como también

las áreas en las que es posible usarla como una herramienta de apoyo. La

microbiología no ha sido la excepción, siendo innumerables los estudios en

parásitos, hongos, bacterias y virus, en los cuales se ha usado ésta técnica. El

estudio de bacterias por citometría de flujo ha cobrado cada vez mayor interés, en

la medida que los bacteriólogos han tomado conciencia de las potencialidades y

ventajas que les puede ofrecer esta técnica, en especial el hecho de poder evaluar

simultáneamente miles de bacterias, en segundos, y obtener así información

acerca de una población bacteriana dada. De este modo, no es extraño encontrar en

la literatura científica internacional, estudios centrados en las características

fisiológicas de las bacterias y sus interacciones con el medio, en especial bajo la

acción de antibacterianos, así como también, susceptibilidad a los mismos. Dentro

de este concepto, los estudios de viabilidad celular (mediante la inclusión y/o

exclusión de sustancias fluorescentes) y la evaluación del ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ y sus interacciones

con los sistemas de eflujo, han entregado información vital sobre lo que sucede

con una población bacteriana, en especial durante sus diferentes fases de

crecimiento.

En teoría, es posible usar un citómetro de flujo para medir los mismos

parámetros tanto en bacterias y células eucariontes. En la práctica, dado que en

una bacteria la señal de estos parámetros es aproximadamente la milésima parte de

80

los de una célula eucarionte, es difícil hacer una buena medición. Lo anterior es

producto, por un lado, de variaciones fotoeléctricas que hacen indetectables

algunos componentes bacterianos, y por otro lado, los citómetros comerciales,

diseñados para medir células eucariontes, presentan altos niveles de ruido de fondo

o background. Independiente de lo anterior, muchos citómetros comerciales logran

satisfacer las necesidades de sus usuarios, logrando una buena discriminación y

evaluación de parámetros bacterianos (Shapiro, 2003).

Coincidente con lo anterior, y considerando las limitaciones de un

citómetro de flujo diseñado para medir células eucariontes, en esta Tesis se evaluó

la detección de bacterias, en sus parámetros intrínsecos (FSC y SSC), así como

también de ciertos parámetros fisiológicos, como son viabilidad celular, eflujo

bacteriano y ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ.

4.1. Citometría de flujo y bacterias.

A pesar de no existir experiencia previa en el análisis de bacterias por

citometría de flujo, se logró establecer la correcta discriminación de éstas,

mediante la amplificación logarítmica de la señal (modo log). El principal

problema lo presentó el ruido de fondo, el cual es atribuible a la presencia de

micro cristales propios de la solución usada tanto como diluyente como para

resuspender las bacterias (PBS), y a la formación de micro burbujas producto del

paso de líquido a presión por la cámara de lectura del citómetro de flujo. Este

81

ruido de fondo se traduce en eventos con una señal de FSC levemente menor a la

de bacterias, pero que en el caso de células pequeñas, produce una contaminación

de la señal. Por otro lado este ruido, presenta una señal de SSC menor que la de

bacterias, por lo que es discriminable sin mayor dificultad. Producto de lo anterior,

se definió el umbral de detección o threshold en función de SSC con un valor de

200. Lo anterior se traduce en que cualquier evento celular que produzca una señal

de SSC inferior a 200, no será considerado y por lo tanto eliminado del total de

eventos almacenados para ese conjunto de datos o fila de almacenaje. Finalmente

la adecuada detección de la señal de FSC se consiguió amplificando la señal de

voltaje por un factor de 100 y la ganancia del amplificador se ajustó en 1.78. La

amplificación de la señal de FSC por un factor de 10 o de 1000, produjo la pérdida

de elementos celulares pequeños o grandes, respectivamente (Figura 9).

4.2. Análisis de patrones de tamaño.

Las mediciones de FSC se han usado ampliamente para estimar tamaño

celular, desde que fue demostrado por Mullaney y colaboradores, en 1969, que la

intensidad de la luz desviada en pequeños ángulos (0.5 – 2.0º) desde una luz láser

incidente, era proporcional al volumen de una partícula dada (Bouvier y col.,

2001; Shapiro 2003).

La medición FSC es el resultado de un haz de luz que pasa a través de un

líquido (agua), impactando la partícula medida, refractando el haz de luz, lo que

es detectado en dirección frontal. Debido a que el índice de refracción entre las

82

células y el medio que las suspende también afecta las mediciones de FSC, si el

índice de refracción de las células fuera igual al del medio que las suspende, las

células no dispersarían la luz del incidente. La diferencia en los índices de

refracción entre las células y el medio que las suspende, es mantenida en parte, por

la acción de la membrana como una barrera de la permeabilidad a solutos y agua.

De esta forma, las señales de partículas más grandes no son necesariamente más

grandes que señales de partículas más pequeñas.

Las mediciones de FSC pueden ser útiles, considerando cuidadosamente

sus limitaciones, las que proviene del hecho de que muchos factores distintos del

tamaño celular son capaces de afectar la dispersión frontal de la luz incidente

(Shapiro, 2003). Diversos intentos de estimar tamaño celular bacteriano han sido

propuestos (Robertson y col., 1998; Shapiro, 2003; Shvalov y col., 1999, 2000).

Algunas técnicas analíticas actualmente en uso, estiman el porcentaje de células

positivas, basado en diferentes criterios de comparación del control negativo y del

estudio en cuestión (Lampariello y col., 1998; Shapiro, 2003).

Pocos trabajos analíticos comparables, se han efectuado para el análisis de

datos monodimensionales. Tradicionalmente se corre una muestra control,

delimitando según apreciación visual lo que corresponde al control negativo, y en

función de éste, definir las células positivas (Figura 5 y 36). Si ambas poblaciones

están completamente separadas, no existe mayor problema para discriminarlas, a

diferencia de poblaciones superpuestas, donde la diferenciación es difícil. (Watson

y col., 2001).

83

La utilidad del método de análisis propuesto aquí, se puede ilustrar por la

estimación del efecto producido por la acción de diversos antibióticos sobre el

tamaño celular en E .coli K12 (Tabla 6 y Figura 10). En el caso de ceftazidima,

esta droga se une a varias proteínas que unen penicilina (PBPs: penillin binding

protein); a baja concentración, se une con alta afinidad a PBP3, produciendo

filamentación de las bacterias, mientras que a altas concentraciones, tiene afinidad

por la PBP1, produciendo lisis bacteriana. Del mismo modo, la inhibición de

PBP2 produce la formación de células esféricas, esto se puede apreciar en la Tabla

6 y Figura 10 donde a concentraciones de antibiótico de 0,5 veces la MIC, las

células mostraron un aumento en el patrón del tamaño respecto del control (de

bacilos cortos a bacilos), mientras que a concentración del antibiótico de 2 veces la

CMI, los patrones del tamaño correspondieron a células cocoides y a bacilos

cortos a bacilos.

Para H. pylori, la aplicación de este método de análisis, permite discriminar

claramente y eficientemente, diferentes patrones de tamaño, en especial células

cocoides de bacilos y de bacilos largos, como se puede apreciar en la Tabla 7 y

Figura 11, donde se muestran varias cepas con diferentes patrones de tamaño, que

van desde células cocoides a bacilos largos.

Si se consideran, las diversas aplicaciones de los estudios de tamaño celular

en bacterias, bajo diferentes condiciones (exposición a antimicrobianos,

condiciones ambientales, etc.) y el uso de parámetros intrínsecos a un citómetro

de flujo, junto con un método de análisis e interpretación sencillo, como el

84

desarrollado, posibilitan integrar fácilmente información sobre poblaciones

bacterianas con otros estudios (genéticos, moleculares, fisiológicos, etc.).

4.3. Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus

Como se planteó previamente, es difícil estructurar una definición de

viabilidad, considerándose viabilidad reproductiva o clonogenicidad, como

sinónimos de viabilidad celular. En consecuencia, al evaluar viabilidad en E. coli y

S. aureus, se deben definir muy bien los criterios a considerar para un control

positivo (células vivas) y para un control negativo (células muertas). Por lo

anterior, en esta Tesis, se consideró que la definición de control negativo, no debe

alterar significativamente las propiedades de FSC y SSC, a fin de que existiera la

mayor similitud posible con el control positivo (células vivas) y sólo hubiera una

clara diferencia en el parámetro a evaluar (viabilidad y potencial de membrana).

Estas condiciones se cumplieron en el caso de células de E. coli muertas por calor,

no así para S. aureus donde se produjo la agregación macroscópica ya descrita.

Cuando se consideró el concepto de criofijación, se obtuvieron las

condiciones ideales para un control negativo, tanto en E. coli como en S. aureus.

Lo anterior se logró gracias a que por un lado que las células son fijadas por el

etanol y por otro lado, la brusca baja de temperatura no permite que se alteren las

características de FSC y SSC.

Con el protocolo básico de preparación de suspensiones celulares definido

(Tabla 2), fue posible evaluar exitosamente la linealidad de la incorporación de PI

85

por parte de células vivas y/o muertas. Es así como el alto coeficiente de

correlación obtenido en los ensayos en triplicado, tanto para E. coli y S. aureus

(0.978 y 0.981, respectivamente), permiten concluir que el protocolo de evaluación

de incorporación de PI en las bacterias ensayadas es adecuado, y si consideramos

la definición de viabilidad bacteriana en función de la incorporación de PI, esta

metodología es adecuada para medir viabilidad bacteriana en E. coli y S. aureus,

bajo las condiciones ensayadas.

4.4. Ensayo de ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en E. coli y S. aureus.

La estimación de potencial de membrana por citometría de flujo ya sea en

eucariontes, organelos (mitocondrias) y bacterias está ampliamente establecida, y

son muchos los estudios que así lo demuestran (Haugland, 2002; Novo y col.

1999, 2000; Shapiro 2000, 2001, 2003). De hecho son innumerables los

compuestos para ensayos potenciométricos disponibles en el mercado (Haugland,

2002; Shapiro 2003) y de fácil acceso. Incluso la empresa Molecular Probes, en su

página web (www.probes.com) tiene disponible una manual de compuestos

fluorescentes donde se discute ampliamente sobre los diversos compuestos para

ensayos potenciométricos disponibles (Haugland, 2002;

www.probes.com/handbook/sections/2200.html).

En cuanto a la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en bacterias, son muchos los estudios en

los cuales se usa citometría de flujo, tanto para determinar el estado metabólico de

86

bacterias en sus medios naturales, como también en ensayos de respuesta frente a

agentes antibacterianos.

Dado que los fluorocromos presumiblemente se unen a sitios hidrofóbicos,

células con más sitios, captan más moléculas de fluorocromos. De este modo, se

produce una variación considerable célula a célula y lógicamente, altamente

dependiente del tamaño. Más aún si se considera la alta hidrofobicidad de estos

compuestos, los cuales en alta concentración y en medio acuoso, precipitan o por

lo menos forman agregados, en especial en el citoplasma (acuoso) de una célula.

Lo anterior es especialmente importante en el caso de S. aureus, por su tendencia a

formar agregados, de modo que la fluorescencia de “n” células, es “n” veces más

brillante que la de una sola célula.

En el caso de carbocianinas, y en especial DIOC2(3), en altas

concentraciones (como la usada), desarrollan un segundo pico de emisión cercano

a los 610 nm (rojo). El primero se produce cerca de los 560-580 nm (verde). Novo

y col. demostraron que en S. aureus, usando DIOC2(3) a una concentración de 30

µM, no se observa un cambio significativo de la fluorescencia verde en función

del ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y sí lo es proporcional al tamaño celular, a diferencia de lo observado con

la fluorescencia roja que es dependiente del tamaño y de la formación de

agregados de DIOC2(3).

87

Figura 47: Relación entre ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, DIOC2(3), tamaño celular, formación de agregados y fluorescencias.

En la Figura 47, se esquematiza lo anterior. Si se considera dos células,

una pequeña y otra de mayor tamaño y que ambas tienen el mismo ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, al unirse

DIOC2(3), molécula catiónica, la fluorescencia verde será proporcional al tamaño,

ya que la célula más grande tiene mas cargas negativas en su interior. A su vez la

fluorescencia roja, dependiente del tamaño y sensible a la presencia de agregados

insolubles de DIOC2(3) será mayor en la célula más grande. La fluorescencia roja

es producto de la formación de agregados de moléculas de fluorocromo, a altas

concentraciones intracelulares en el medio acuoso del citosol, debido a la baja

solubilidad en agua del fluorocromo. La intensidad de fluorescencia roja

88

proporciona una medida de la cantidad total de agregados del fluorocromo en la

célula, función del tamaño celular y de la concentración intracelular.

La consecuencia lógica de lo anterior es la utilización de una razón

matemática que permita eliminar la contribución de diferencias célula a célula, en

lo que se refiere a la unión del fluorocromo, entregando distribuciones más

angostas y haciendo fácil identificar heterogeneidad poblacional.

La razón de fluorescencia roja/verde elimina el efecto de variaciones de

tamaño, ya que es independiente de este y es sensible al ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ. Si bien, esta razón es

fundamental en el cálculo de un número real de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, en esta Tesis sólo se estimó

en forma porcentual, es decir qué porcentaje de las células analizadas se

encontraban ya sea polarizadas o depolarizadas. Bajo estas condiciones, la

reproducibilidad queda demostrada por el alto coeficiente de correlación obtenido.

En el caso de E. coli, la situación es muy similar, con la diferencia que es

necesario permeabilizar la membrana externa usando EDTA, con lo cual se logró

una buena estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, lo que nuevamente quedó demostrado por el alto

coeficiente de correlación obtenido. De esta forma, la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en S.

aureus y E. coli, se logró exitosamente de acuerdo a lo ya descrito en la literatura

internacional, lo cual posibilita su aplicación en otros géneros bacterianos con

características fisiológicas y estructurales semejante a los controles ensayados, en

especial, en estudios del efecto que diversos antimicrobianos ejerzan sobre

bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas (estafilococos,

estreptococos, enterobacterias y bacilos no fermentadores, entre otras).

89

4.5. Ensayo de viabilidad celular y ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ ∆Ψ en Helicobacter pylori.

Bajo el mismo criterio analítico usado exitosamente para E. coli y S.

aureus, se procedió a evaluar, en H. pylori, tanto viabilidad celular mediante la

incorporación de PI y ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ con DIOC2(3). Bajo las condiciones ensayadas, no fue

posible evidenciar la incorporación de PI en H. pylori muertos, lo que sumado a la

imposibilidad de evidenciar células polarizadas en H. pylori vivos (sólo se

visualizaban como depolarizadas), hizo plantear la posibilidad de que por alguna

razón el fluorocromo, ya sea PI o DIOC2(3) no eran capaces de ingresar a la

células, y si lo hacían eran rápidamente excluidos por algún sistema de eflujo. A

fin de poder evidenciar lo anterior, basándose en la literatura internacional, se

efectuaron una serie de pruebas tendientes a evaluar la posible presencia de

sistemas de eflujo, así como el efecto inhibidores de estos.

4.6. Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en E. coli y S. aureus

La tinción vital, en bacterias es más compleja que para células eucariontes,

debido a la estructura más compleja de la membrana de las bacterias (Jernaes y

col., 1994). Dentro de los compuestos ya mencionados para estudios de viabilidad

celular, el PI pertenece a un subgrupo de compuestos que son excluidos de células

viables y sólo ingresan al interior de éstas, cuando se altera la barrera de

90

permeabilidad de la membrana. El otro subgrupo lo constituyen compuestos que

son incorporados por células viables. Para que estos últimos alcancen su blanco,

deben superar por un lado la barrera de permeabilidad de la membrana

citoplasmática y en el caso de bacterias Gram negativas, también la barrera de

permeabilidad de la membrana externa, así como también la presencia de

mecanismos de eflujo situados en la membrana citoplasmática que pueden expeler

compuestos en forma muy eficiente (Gibbons y col., 2003; Walberg y col., 1999).

Los sistemas transportadores que efluyen múltiples sustratos, incluyendo

antibióticos, no han evolucionado en respuesta al estrés de la era antibiótica. Por el

contrario, todos los genomas bacterianos estudiados contienen varias bombas de

eflujo diferentes, lo que indica su origen ancestral, estimándose que entre el 5 a

10% de todos los genes bacterianos están involucrados en el transporte, y un gran

número de estos codifican bombas de eflujo. Aunque en plásmidos se pueden

encontrar bombas de eflujo, la existencia de genes de bombas de eflujo en el

cromosoma bacteriano, da a la bacteria un mecanismo intrínseco, que permite la

supervivencia en un medio ambiente hostil (presencia de antibióticos), de modo

tal, que bacterias mutantes que sobre expresan genes de bombas de eflujo, pueden

ser seleccionados sin la adquisición de nuevo material genético. Incluso, se acepta

que la resistencia intrínseca de bacterias Gran negativas a ciertos antibióticos en

relación con bacterias Gram positivas, es el resultado de la actividad de sistemas

de eflujo. Se han descrito sistemas de eflujo en diversas bacterias, como por

ejemplo Campylobacter jejuni (CmeABC), E. coli (AcrAB-OprM, MexCD-OprJ,

MexEf-OprN y MexXY-OprM), Streptococcus pneumoniae (PmrA), Salmonella

91

typhimurium (AcrB), Staphylococcus aureus (NorA) y Pseudomona aeruginosa

(Li y col., 2000; Webber, 2003). La sobre expresión de una bomba de eflujo se

puede traducir en resistencia a antibióticos de más de una clase, así como también

algunos colorantes y fluorocromos, detergentes y desinfectantes (incluyendo

algunos biocidas comúnmente usados).

Se han descrito cinco grandes grupos o familias de transportadores:

1. MFS : Major facilitator superfamily

2. ABC : ATP binding cassette family

3. RND : Resistance modulation division family

4. SMR : Small multidrug resistance family (miembro de

drug/metabolite transporter (DMT) superfamily)

5. MATE : Multidrug and toxic compound extrusion family

Los transportadores de la familia RND no son exclusivos de bacterias

Gram negativas, pero si son muy comunes y son los más importantes desde el

punto de vista clínico. Operan como parte de un sistema tripartito que incluye una

proteína de fusión de membrana periplásmica (MFP) y una proteína de membrana

externa (OMF: factor de membrana externa). Los sistemas de eflujo del tipo RND-

MFP-OMF se acomodan a un amplio rango de estructuras moleculares no

relacionadas, que pueden incluir la mayoría de las clases de antibióticos y

biocidas, fluorocromos, detergentes, inhibidores metabólicos, hidrocarburos

aromáticos (solventes orgánicos), péptidos catiónicos antimicrobianos, ácidos

92

grasos tóxicos y sales biliares, entre otros, y son responsables de contribuir a la

resistencia antimicrobiana, siendo descritos en un rango amplio de patógenos y no

patógenos, tanto en humanos, animales y plantas (Poole y col., 2004).

En S. aureus, NorA, miembro de la superfamilia MFS, es una bomba de

eflujo dependiente de la fuerza protón motriz y entre sus sustratos se encuentran

fluoroquinolonas hidrofílicas y compuestos orgánicos monocatiónicos como por

ejemplo acriflavina, bromuro de etidio y bromuro de tetrafenilfosfonio (Kaatz y

col., 2002).

El BrEt cruza la membrana por difusión pasiva y se intercala entre las

bases de polinucleótidos inhibiendo el crecimiento y produciendo efectos

mutagénicos (Bolhuis y col., 1994). Cuando el BrEt se une en el estado

intercalado, existe un gran incremento de la fluorescencia (aproximadamente 25

veces), como resultado del medio ambiente hidrofóbico que rodea a la molécula de

BrEt (Morgan y col., 1979-a; Morgan y col., 1979-b).

Es así como el influjo de BrEt se ha tomado como una medida de la

permeabilidad de la pared bacteriana, considerándose la intensidad de

fluorescencia como una medida del contenido celular del fluorocromo,

representando el efecto neto del influjo de fluorocromo debido a la permeabilidad

de la pared celular y el flujo externo del fluorocromo causado por la bomba de

eflujo conducida metabolitamente (Jernaes y col., 1994). Bajo estas condiciones, el

contenido celular del fluorocromo se considera que representa un balance en el

influjo del fluorocromo, el cual es un proceso pasivo guiado por el gradiente de

concentración del fluorocromo a través de la pared celular, y el eflujo, el cual por

93

definición, debe ser un proceso activo, ya que requiere energía, porque trabaja

contra el mismo gradiente de concentración.

La exclusión de una sustancia, puede ser el efecto combinado de un bajo

influjo y de una actividad de eflujo dependiente de energía, guiada por el gradiente

electroquímico a través de la membrana citoplasmática proceso que es alterado por

inhibidores metabólicos, lo que es evidenciado por el uso de sustancias

desacoplantes de protones, como CCCP (Jernaes y col., 1994; Bolhuis y col.,

1994; Walberg y col., 1999).

La función fisiológica de los sistemas de extrusión de BrEt se podría

relacionar con la necesidad del organismo de extrudir compuestos tóxicos

encontrados en el hábitat natural, como toxinas producidas por microorganismos o

plantas, muchos de los cuales son tanto solubles en lípidos como también en agua

(Bolhuis y col., 1994).

La citometría de flujo es una herramienta eficiente para estudiar la

captación y eflujo de sustancias fluorescentes, tanto en eucariontes como en

procariontes. Quizás la gran ventaja de este método, es que permite la distinción

de subpoblaciones de células. Además, las células pueden ser medidas mientras

están en una solución con el fluorocromo, sin ninguna contribución de

fluorescencia por parte del fluorocromo extracelular. De este modo, la capacidad

de discriminar la fluorescencia intracelular de la extracelular es la principal razón

por la cual la citometría de flujo tiene un rango más dinámico que la medición de

fluorescencia de células en suspensión en cubetas. Los primeros estudios de

permeabilidad bacteriana, se efectuaron con suspensiones celulares en cubetas,

94

donde está tácitamente implicado el hecho de que todas las células, deben ser

esencialmente similares, lo que puede ser groseramente erróneo.

En concordancia con la literatura internacional, la demostración, por

citometría de flujo, de un eflujo a BrEt, tanto en E.coli y S. aureus, es un

parámetro metabólico más a considerar al momento de efectuar estudios de

viabilidad celular, lo que se demuestra claramente y en forma categórica en las

Figuras 37 y 38. Más aún al considerar el efecto que diversas sustancias ejercen

sobre la incorporación de PI, el eflujo a BrEt y la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ. Si bien, en E.

coli, el uso de CCCP sólo alteró la medición de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y el eflujo a BrEt, este último

sólo en parte, la concentración de CCCP usada fue baja, por lo que su acción, a

pesar de evidenciarse, permitió la recuperación de la población celular completa,

en términos de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y eflujo a BrEt, lo que en conjunto con la incorporación de PI,

permiten definir viabilidad celular en la población analizada.

El compuesto phe arg-b-naphthylamide o MC 207,110, es un inhibidor

activo contra las bombas de eflujo de P. aeruginosa MexAB-OprM, MexCD-OprJ

y MexEF-OprN, así como contra la bomba de eflujo de E. coli, AcrAB (Ribera y

col., 2002; Sánchez y col., 2003 ). Su utilización en los ensayos de eflujo a BrEt,

en E. coli, no evidenciaron acción, lo que permite concluir, en concordancia con la

literatura internacional, que el sistema de eflujo a BrEt no es inhibido por la acción

de MC 207,110.

95

4.7. Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en H. pylori

Como ya se mencionó, en H. pylori, la imposibilidad de lograr evidenciar

tanto la incorporación de PI como de DiOC2(3), necesariamente plantea la

posibilidad de que el fluorocromo no pueda llegar a la célula o bien que éste sea

rápidamente expulsado al exterior. A fin de poder evidenciar esta última

posibilidad, se evaluó el eflujo a BrEt, bajo las mismas condiciones analíticas

usadas en E. coli y S. aureus. Si bien en H. pylori se ha identificado un operón

hefABC (Nº aceso AF059041) (Alm y col., 1999; Poole y col., 2004; Tomb y col.,

1997), no se descrito el producto de ese gen, ni tampoco un sistema de eflujo

similar. Con ninguno de los compuestos utilizados se logró evidenciar algún grado

de marcación ya sea con PI, BrET o DiOC2(3), lo que indicaría que de existir un

sistema de eflujo en H. pylori, este no es inhibido por los compuestos utilizados y

no involucraría a BrEt.

4.8. ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ en H. pylori

Como una bacteria neutrófila capaz de crecer en el estómago, H. pylori es

único en su capacidad de tolerar ambientes ácidos. Stingl y colaboradores (2002),

demostraron que en presencia de urea y sin ninguna adaptación previa, son

capaces de sobrevivir por varias horas después de un incremento del pH del medio

hasta pH 1.0 (Stingl y col., 2001, 2002), una condición importante y frecuente en

96

el lumen gástrico. A este pH, los organismos acidófilos tendrían un valor de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ

positivo en el interior de la membrana (Stingl y col., 2002). Si bien en H. pylori, el

signo y valor de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ a un valor de pH extracelular bajo es asunto de debate; se ha

descrito a pH menor a 3.0, un ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ positivo en el interior, el cual sin embargo no es

sensible a la adición de un ionóforo de protones (Matin y col., 1996). En otros

estudios, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ permanece negativo en el interior de la membrana, con valores de

pH externo menor a 3.0 (Scott y col., 1998). Finalmente hay trabajos que indican

que en presencia de urea, el ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ permanece negativo en el interior frente a rangos

de pH extracelular entre 1.2 y 7.0 (Stingl y col., 2002). Más aún la adición de urea

a células de H. pylori a un pH extracelular bajo, producen una rápida y

considerable hiperpolarización de la membrana (Scott y col., 1998; Stingl y col.,

2001, 2002), probablemente por extrusión de cationes NH4+ desde el citoplasma.

Se debe recordar que en el citoplasma, el NH3 (un producto de la reacción

catalizada por la ureasa), une protones desde el medio ácido. Esto ocurre por que

todos los procariontes, incluyendo los acidófilos, poseen una membrana

citoplasmática con cierta permeabilidad para protones, removiéndose desde el

citoplasma, los iones NH4+ producidos (Stingl y col., 2001, 2002).

Si el planteamiento de que H. pylori posea un ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ positivo, a rangos bajos

de pH, es correcto, podría explicar porqué no fue posible marcar con DiOC2(3);

compuesto catiónico y que frente a un teórico ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ positivo, simplemente no

lograría entrar en la célula. Ahora bien, cabe la posibilidad de que H. pylori

presente un ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ positivo, no sólo en presencia de un pH ácido, si no que también

97

frente a estresantes del medio en que se encuentra y que estos sean capaces de

alterar en alguna medida la capacidad de intercambio iónico de la membrana

plasmática. A fin de poder evaluar ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ por citometría de flujo, en H. pylori, se

debiera ensayar la metodología propuesta en presencia de urea y a diferentes

rangos de pH, así como también usando fluorocromos aniónicos como por ejemplo

oxonoles. Entre estos últimos destaca el bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine

oxonol o DiBAC4(3), el cual tiene un alto grado de sensibilidad de voltaje y es

capaz de entrar en células depolarizadas a diferencia de las carbocianinas que

ingresan en células polarizadas (Haugland, 2002; Shapiro, 2003).

Otro factor que podría explicar, en algún grado, el no lograr una marcación

con los fluorocromos usados, es una barrera de impermeabilidad de la membrana

externa de H. pylori. La membrana externa de bacterias Gram negativas, funciona

como una eficiente barrera de permeabilidad, que es capaz de excluir

macromoléculas (como bacteriocinas o enzimas) y sustancias hidrofóbicas

(antibióticos hidrofóbicos). La propiedad de barrera de permeabilidad de la

membrana externa se debe en gran parte a la presencia del LPS. Ciertos agentes

externos que liberan LPS u otros componentes de la membrana externa o que se

intercalan en la membrana, pueden alterar la integridad de la membrana externa,

con la pérdida de la función de barrera de permeabilidad. Estos agentes llamados

permeabilizantes, incluyen entre otros EDTA, el cual es un quelante de cationes

divalentes que estabilizan las interacciones moleculares en la membrana externa de

tal forma que el LPS es liberado. No se debe descarta que la permeabilización

98

efectuada con EDTA no sea la adecuada para las características de la membrana de

H. pylori, siendo necesario ensayar diversos compuestos alternativos que actúen a

distintos niveles y no sólo como quelantes de calcio.

Finalmente no se debe dejar de considerar la posibilidad, que esta

sorprendente bacteria posea características estructurales y fisiológicas

desconocidas en su membrana citoplasmática y que estas seguirán siendo un

desafío para los estudios fisiológicos, no descartándose más de alguna sorpresa al

respecto, por parte de H. pylori.

99

5. CONCLUSIONES

5.1 Se desarrolla un método de análisis que permite la estimación de patrones

de tamaño celular de células bacterianas por citometría de flujo.

5.2 En E. coli y S. aureus, la citometría de flujo evalúa exitosamente

viabilidad celular mediante la incorporación de yoduro de propidio, ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ,

usando DIOC2(3) y la presencia de eflujo a bromuro de etidio.

5.3 En E. coli y S. aureus, la evaluación por citometría de flujo de la

incorporación de yoduro de propidio, la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y la presencia

de eflujo a bromuro de etidio, en conjunto se pueden considerar criterios

para definir viabilidad celular

5.4 En H. pylori, bajo las condiciones experimentales ensayadas no fue

factible evaluar viabilidad celular, definida por la incorporación de

yoduro de propidio, ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ, usando DIOC2(3) ni evaluar la presencia de

eflujo a bromuro de etidio.

100

6. PROYECCIONES

6.1. El desarrollo de una metodología de estimación de patrones de tamaño

celular por citometría de flujo, así como la incorporación de yoduro de

propidio, la estimación de ∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de

etidio, ya sea en forma individual o en conjunto, tienen una potencial

aplicación en el estudio del efecto que diversas sustancias puedan ejercer

sobre E. coli, S. aureus y H. pylori, aportando información adicional

sobre la acción de estas, en especial en casos donde el desarrollo

bacteriano es escaso (pero suficiente para estudios por citometría de

flujo). Dentro de estas sustancias, no sólo se incluyen antimicrobianos de

uso terapéutico, si no que sustancias como por ejemplo, el resveratrol y

su efecto sobre cepas multiresistentes.

6.2. Los estudios de incorporación de yoduro de propidio, la estimación de

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de etidio realizados en esta

investigación, bajo las condiciones ya definidas, han proporcionado una

valiosa información que permitirá continuar con estos estudios bajo otras

condiciones metodológicas a desarrollar y que impliquen el uso de otros

fluorocromos así como también la búsqueda de otras condiciones de

permeabilización de H. pylori.

6.3. Este trabajo sienta las bases para el desarrollo de una línea de trabajo

relacionada con la evaluación de la presencia y actividad de sistemas de

101

eflujo en bacterias, desde un punto de vista fisiológico y funcional, lo que

sin duda, permitirá complementar los estudios microbiológicos,

moleculares y epidemiológicos, existentes y actualmente en desarrollo.

6.4. Una derivación importante de este trabajo, y con clara utilidad clínica, es

el estudio de sistemas de eflujo y resistencia a drogas en células

eucariontes, en especial, células neoplásicas y el fenotipo MDR (Multi

Drug Resistant), particularmente la presencia y actividad de eflujo de la

glicoproteína p (DIOC2(3) es sustrato de la glicoproteína p).

6.5. El estudio integral de viabilidad celular en E. coli y S. aureus

considerando la incorporación de yoduro de propidio, la estimación de

∆Ψ∆Ψ∆Ψ∆Ψ y la presencia de eflujo a bromuro de etidio por citometría de flujo,

realizado en esta investigación, es hasta donde se tiene conocimiento,

pionero en nuestro país, por lo que debiera fomentar el uso de la

citometría de flujo en estudios de microbiológicos y en especial

bacteriológicos.

102

7. GLOSARIO

Adquisición : Proceso durante el cual las células están

siendo analizadas en el citómetro de flujo, y

se registra la información referente a cada

una de ellas. El tiempo que dura la

adquisición dependerá de la concentración

celular de la suspensión celular usada y del

número total de células definido para el

análisis en particular.

Amplificador : Componente electrónico de un citómetro de

flujo que incrementa la señal en función de

un factor ajustable.

Archivo de datos : Un archivo que contiene datos en modo de

lista.

BrEt : Bromuro de etidio

Calibración : Ajustes automático o manuales de los

controles electrónicos de un citómetro de

flujo, para un análisis consistente y

103

reproducible.

Canal : El valor medido de un parámetro,

representando la intensidad de señal de un

evento después de amplificarlo. Para ser

graficado, los datos para un evento deben

estar incluidos en un canal dentro de 256

canales (0-255) o en un canal dentro de 1024

(0-1023) canales, dependiendo de la

resolución del gráfico.

Compensación : Un cálculo electrónico que remueve la

superposición de señales y que el sistema

óptico no puede remover. La compensación

de fluorescencias trabaja para específicos de

parámetros fluorescentes, como por ejemplo

FL1 Y FL2.

DiOC2(3) : 3,3`-dietiloxacarbocianina iodada

Escala : El número máximo de eventos mostrados por

canal, en un histograma. Un número bajo de

escala, magnifica los datos.

Escala lineal : Desde el punto de vista electrónico, es aquella

104

en que la salida es directamente proporcional

a la entrada. Cuando el control se posiciona

en lineal, la medición de voltaje es

directamente proporcional al canal en el cual

evento cae.

Escala logarítmica : Aquella en la cual los valores aumentan

logarítmicamente. Se usa cuando el

instrumento se posiciona en LOG. Existen

cuatro décadas a través de los 1024 canales

de un FACSCalibur (256 canales por

década). La escala fluctúa entre 1 a 10.000.

Para el FACSCalibur, el número de décadas

es fijo.

Evento : Una unidad de datos representando una

partícula o célula. Un evento tiene un valor

de intensidad relativa y un número de canal

por cada parámetro.

Filtro : Artículo óptico usado para detener

longitudes de onda en particular, mientras

deja pasar otras.

105

FL1 : Señal de fluorescencia verde recibida por el

tubo fotomultiplicador (PMT), FL1. El rango

de señal detectado es dependiente de los

filtros asociados con el fotomultiplicador.

Para citómetro FACSCalibur, FL1 mide luz

en rango verde del espectro (515 a 545 nm).

FL2 : Señal de fluorescencia roja recibida por el

tubo fotomultiplicador (PMT), FL2. Para

citómetro FACSCalibur, FL2 mide luz en

rango verde-naranjo del espectro (564 a 606

nm).

FL3 : Señal de fluorescencia roja recibida por el

tubo fotomultiplicador (PMT), FL3. Para

citómetro FACSCalibur, FL3 mide luz en

rango rojo del espectro (sobre 670 nm).

Fluorescencia : Una propiedad de las moléculas de absorber

luz a una longitud de onda y emitir luz a una

longitud de onda mayor. Un citómetro de

flujo detecta la emisión de fluorescencia en

un ángulo de 90 grados respecto de la fuente

de excitación.

106

Forward Scatter (FSC) : Parámetro que mide la luz desviada por las

células en menos de 10 grados respecto de la

luz láser. FSC se relaciona con el tamaño

celular.

Fotodiodo : Un elemento semiconductor usado para

detectar luz y generar una corriente

eléctrica. Típicamente se usa en la detección

de FSC.

Fotomultiplicador (PMT) : Un fotodetector con voltaje ajustable, que

traduce la señal óptica en una corriente

eléctrica. Los detectores PMT son usados

para SSC y los parámetros de fluorescencia.

Aumentando el voltaje del PMT, se aumenta

la señal de salida para una cantidad de luz

dada.

Ganancia : Un ajuste que modifica la respuesta del

amplificador. Aumentando la ganancia

aumenta el pulso electrónico (y el valor de

intensidad de fluorescencia relativa y el valor

del canal) en respuesta a una señal de luz.

107

Gate : Un límite que define una porción o una sub

población de eventos. Las gates se establecen

al dibujar los límites alrededor de los datos

en un gráfico. Las gates se usan tanto en

adquisición como en análisis.

Gating : El proceso de dibujar una gate en un gráfico

de puntos o en un histograma, con el mouse o

con las teclas del teclado.

Histograma : Un gráfico que representa datos de un solo

parámetro correspondiendo a valores de

intensidad de fluorescencia relativa o a

valores de canales.

Marker : Una línea separando regiones en un

histograma y que son estadísticamente

tratadas por separado.

Muestra de referencia : Una muestra con características conocidas y

que se usa como estándar.

Parámetro : Una medida de intensidad de luz, desviada o

de fluorescencia emitida, por una partícula

cuando pasa a través del láser. Para los cinco

108

parámetros (FSC, SSC, FL-1, FL-2 y FL-3),

se usa el alto del pulso electrónico generado.

PBS : Buffer fosfato salino

Pulso : Señal electrónica generada por una partícula

(célula o núcleo) en un citómetro de flujo.

Rate : El número de eventos por segundo,

analizados por un citómetro de flujo, que son

procesado por el computador.

Side Scatter (SSC) : También llamada 90º scatter, right angle

scatter o dispersión lateral de la luz, la cual

es desviada en un ángulo de 90º cuando la

célula pasa a través del rayo láser. Esta

medida se relaciona con la granularidad o

complejidad interna de una partícula.

Umbral de detección : Conocido como threshold. Es el número más

bajo de canal para un parámetro

seleccionado, para el cual un evento puede

ser grabado. El citómetro de flujo envía al

computador, sólo eventos sobre el nivel de

threshold.

109

9. SOLUCIONES

PBS : • NaCl (7.650 g) • Na2HPO4 anhidrido (0.724 g) • KH2PO4 (0.210 g) • Disolver en H2O, ajustar pH a 7.4 • Llevar a 1 litro de H20

PBS-EDTA : • 10 mM TRIS (0.1211 g)

• 1 mM EDTA disódico (0.3722 g) • 10 mM Glucosa (0.0198 g) • Llevar a 100 ml de PBS, pH 7.4

110

9. REFERENCIAS

• Alberghina L, Porro D, Shapiro H, Srienc F, Steen H. 2000. Microbial

analysis at the single-cell level. J Microbiol Methods. 42 (1):1-2

• Alm RA, Ling LS, Moir DT, King BL, Brown ED, Doig PC, Smith DR,

Noonan B, Guild BC, deJonge BL, Carmel G, Tummino PJ, Caruso A, Uria-

Nickelsen M, Mills DM, Ives C, Gibson R, Merberg D, Mills SD, Jiang Q,

Taylor DE, Vovis GF, Trust TJ. 1999. Genomic-sequence comparison of two

unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature

397 (6715):176-80.

• Álvarez-Barrientos A., Arroyo J., Cantón R., Nombela C., Sánchez-Pérez M.

2000. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin

Microbiol Rev. 13:167-195.

• Axon A. 1993. Helicobacter pylori infection. J Antimicrob Chemother.

32:61-68.

• Bhushan R., Kirkham C., Sethi S., Murphy T. 1997. Antigenic

characterization and analysis of the human immune response to outer

membrane protein E of Branhamella catarrhalis. Infect. Immun. 65: 2668-

2675.

111

• Blaser M, Parsonnet J. 1994. Parasitism by the "slow" bacterium

Helicobacter pylori leads to altered gastric homeostasis and neoplasia. J Clin

Invest; 94: 4-8.

• Blaser M. 1992. Hypothesis on the pathogenesis and natural history of

Helicobacter pylori induced inflammation. Gastroenterol 102: 720-727.

• Bolhuis H, Molenaar D, Poelarends G, van Veen HW, Poolman B, Driessen

AJ, Konings WN. 1994. Proton motive force-driven and ATP-dependent

drug extrusion systems in multidrug-resistant Lactococcus lactis. J Bacteriol.

176: 6957-64.

• Bono M R , Simon V. 1998. Citometría de Flujo: Principios Básicos y

Aplicaciones. En Fundamentos de Inmunología. Palomo I, Ferreira A,

Sepúlveda C, Rosemblatt M, Vergara U. Ed. Universidad de Talca, pp. 647-

665.

• Bouvier T, Troussellier M, Anzil A, Courties C, Servais P. 2001. Using light

scatter signal to estimate bacterial biovolume by flow cytometry. Cytometry.

44: 188-94.

• Bowden R., Cloeckaert A., Zygmunt M., Bernard S., Dubray G. 1995.

Surface exposure of outer membrane protein and lipopolysaccharide epitopes

in Brucella species studied by enzyme-linked immunosorbent assay and flow

cytometry Infect. Immun. 63: 3945-3952.

• Buck G y Smith J. 1987. Medium supplementation for growth of

Campylobacter pyloridis. J Clin Microbiol 25: 597-9.

112

• Carbonari Maurizio, Tedesco Tiziana and Fiorilli Massimo. 2003. Human

peripheral B cells: A different cytometric point of view. Cytometry Part A

53A: 97-102.

• Castillo J.L., Kawaguchi F., Madariaga B., Venegas O., Lecannelier E.,

Ocampo S., Castillo M. 1999. Aspectos que afectan el análisis de contenido

de ADN por citometría de flujo. Rev Méd Chile 127: 1385-1397.

• Castillo J.L., 2005. Citometría de flujo: Estudio de Laboratorio de

Enfermedades Oncohematológicas. En Hematología: Fisiopatología y

Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J. Editorial Universidad de Talca,

pp 732-737.

• Cohen LB, Salzberg BM. 1978. Optical measurement of membrane

potential. Rev Physiol Biochem Pharmacol 83: 35-88.

• Davey, H., and D. Kell. 1996. Flow cytometry and cell sorting of

heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analysis.

Microbiol. Rev. 60: 641-696

• De Fuigereido T., De Magalhaes D., Nogueira A. 1998. The interrelationship

between Helicobacter pylori vacuolating by toxin and gastric carcinoma. Am

J Gastroenterol 93: 1841-1847.

• Dimroth P., Kaim G., Matthey U. 2000. Crucial role of the membrane

potential for ATP synthesis by F1F0 ATP synthases. J. Exp. Biol 203: 51-59.

113

• Geis G, Leving H, Suerbaum S, Mai U y Opferkuch W. 1989.

Ultraestructure and chemical analysis of Campylobacter pylori flagella. J

Clin Microbiol 27: 436-41.

• Gibbons S, Oluwatuyi M, Kaatz GW. 2003. A novel inhibitor of multidrug

efflux pumps in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 51: 13-7.

• González C., García A., Daroch F., Kawaguchi F., Solar H., Rivera N., Vega

E. 2001. Susceptibilidad in vitro de cepas de Helicobacter pylori:

Aislamiento de cepas resistentes a claritromicina. Rev Méd Chile 129: 643-

646.

• Goodwin C, Blake P, Blencow E. 1986. The minimum inhibitory and

bactericidal concentrations of antibiotics and antiulcers agent, against

Campylobacter pyloridis. J Antimicrob Chemother. 17: 309-14.

• Guindulain T., Vives-Rego J. 2002. Involvement of RNA and DNA in the

staining of Escherichia coli by SYTO 13. Letters Appl Microbiol 34: 1-7.

• Haugland H. 2002. Handbook of fluorescent probes and research products.

Molecular Probes Inc. (http://www.probes.com/handbook).

• Hazell S, Lee A, Brady L, Hennesey W. 1986. Campylobacter pyloridis

and gastritis association with intracellular spaces and adaptation to an

environment of mucus as important factors in colonization of the gastric

epithellium. J Infect Dis. 153: 658-63.

• Jepras R., Paul F., Pearson S., Wilkinson M. 1997. Rapid assessment of

antibiotic effects on Escherichia coli by bis-(1,3-Dibutylbarbituric acid)

114

trimethine oxonol and flow cytometry. Antimicrob Agents Chemother. 41:

2001-2005.

• Jernaes MW, Steen HB. 1994. Staining of Escherichia coli for flow

cytometry: influx and efflux of ethidium bromide. Cytometry 17: 302-9.

• Kaatz GW, Moudgal VV, Seo SM. 2002. Identification and characterization

of a novel efflux-related multidrug resistance phenotype in Staphylococcus

aureus. J Antimicrob Chemother. 50: 833-8.

• Kaatz GW, Seo SM, O'Brien L, Wahiduzzaman M, Foster TJ. 2000.

Evidence for the existence of a multidrug efflux transporter distinct from

NorA in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 44: 1404-6.

• Kehler E, Midkiff B y Westblom T. 1994. Evaluation of three commercially

available blood culture systems for cultivation of Helicobacter pylori. J Clin

Microbiol 32: 1597-1598.

• Lampariello F, Aiello A. 1998. Complete mathematical modeling method

for the analysis of immunofluorescence distributions composed of negative

and weakly positive cells. Cytometry 32: 241-54.

• Li XZ, Barre N, Poole K. 2000. Influence of the MexA-MexB-oprM

multidrug efflux system on expression of the MexC-MexD-oprJ and MexE-

MexF-oprN multidrug efflux systems in Pseudomonas aeruginosa. J

Antimicrob Chemother. 46: 885-93.

• López-Amorós R., Castel S., Comas-Riu J., Vives-Rego J. 1997. Assessment

of E. coli and Salmonella viability and starvation by Confocal Laser

115

Microscopy and Flow Cytometry using Rhodamine 123, DiBAC4(3),

Propidium iodide, and CTC. Cytometry 29: 298-305.

• Mason D., Power E., Talsania H., Phillips I., Gant V. 1995. Antibacterial

action of ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 39: 2752-2758.

• Matin A., Zychlinsky E., Keyhan M., Sachs G. 1996. Capacity of

Helicobacter pylori to generate ionic gradients at low pH is similar to that of

bacteria which grow under strongly acidic conditions. Infec Immun. 64:

1434-1436.

• McNulty C, Dent, J. 1987. Rapid identification of Campylobacter pyloris

by preformed enzymes. J Clin Microbiol. 25: 1683-1686.

• Megraud F, Bonnet F, Graier M, Lamouliatte H. 1989. Characterization of

Campylobacter pyloris by culture, enzymes profile protein content. J Clin

Microbiol. 22: 1027-40.

• Mercure S., Senechal S., Auger P., Lemay G., Montplaisir S. 1996. Candida

albicans serotype analysis by flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 34: 2106-

2112.

• Mette J., Stten H. 1994. Staining of Escherichia coli for Flow Cytometry

Influx and Efflux of Ethidium Bromide. Cytometry 17: 302-309.

• Mobley H, Cortesía M, Rosenthal L y Jones B. 1988. Characterization of

urease from Campylobacter pylori. J Clin Microbiol 26: 831-6.

116

• Morgan AR, Evans DH, Lee JS, Pulleyblank DE. 1979. Ethidium

fluorescence assay. Part II. Enzymatic studies and DNA-protein interactions.

Nucleic Acids Res. 7: 571-94

• Morgan AR, Lee JS, Pulleyblank DE, Murray NL, Evans DH. 1979.

Ethidium fluorescence assays. Part 1. Physicochemical studies. Nucleic

Acids Res. 7: 547-69.

• Mortimer F., Mason D., Gant V. 2000., Flow cytometric monitoring of

antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant

fluorescent probes. Antimicrob Agents Chemother. 44: 676-681.

• Novo D., Perlmutter N., Hunt R., Shapiro HM. 1999. Accurate flow

cytometric membrane potential measurement in bacteria using

Diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry 35: 55-63.

• Novo D., Perlmutter N., Hunt R., Shapiro HM. 2000. Multiparameter flow

cytometry analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane

permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and

Micrococcus luteus. Antimicrob Agents Chemother 44: 827-834.

• Ozanne V., Ortalo-Magne A., Vercellone A., Fournie J., Daffe M. 1996.

Cytometric detection of mycobacterial surface antigens: exposure of

mannosyl epitopes and of the arabinan segment of arabinomannans J.

Bacteriol. 178:7254-7259.

117

• Poole K. 2000. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-

positive bacteria and the mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother. 44:

2595-9.

• Poole K. 2000. Efflux-mediated resistance to fluoroquinolones in gram-

negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother. 44: 2233-41.

• Poole K. 2004. Efflux-mediated multiresistance in Gram-negative bacteria.

Clin Microbiol Infect. 10: 12-26.

• Rabinovitch P., June C. 1990. Intracellular ionized calcium, membrane

potential an pH. En Flow cytometry, a practical approach. Ormerod M.

Oxford University Press.

• Rauws E, Langnberg W, Tytgat G. 1988. Campylobacter pylordis

associated chronic active antral gastritis. A prospective study of this

prevalence and the effects of antibacterial and antiulcers treatment.

Gastroenterol. 94: 33-40.

• Ribera A, Ruiz J, Jiminez de Anta MT, Vila J. 2002. Effect of an efflux

pump inhibitor on the MIC of nalidixic acid for Acinetobacter baumannii

and Stenotrophomonas maltophilia clinical isolates. J Antimicrob

Chemother. 49: 697-8.

• Robertson BR, Button DK, Koch AL. 1998. Determination of the biomasses

of small bacteria at low concentrations in a mixture of species with forward

light scatter measurements by flow cytometry. Appl Environ Microbiol. 64:

3900-9.

118

• Sach G., Meyer-Rosberg K., Scott D., Melchers K. 1996. Helicobacter

pylori and the gastric environment. En Helicobacter pylori. Basic

mechanisms to clinical cure. Hunt R., Tytgat G. Kluwer Academic

Publishers.

• Sanchez P, Le U, Martinez JL. 2003. The efflux pump inhibitor Phe-Arg-

beta-naphthylamide does not abolish the activity of the Stenotrophomonas

maltophilia SmeDEF multidrug efflux pump. J Antimicrob Chemother 51:

1042-5.

• Scott DR, Weeks D, Hong C, Postius S, Melchers K, Sachs G. 1998. The

role of internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori.

Gastroenterology. 114: 58-70.

• Shapiro HM. 1997. Estimation of membrane potential by flow cytometry. In

Current Protocols in Cytometry 9.6.1-9.6.10.

• Shapiro HM. 2000. Membrane Potential estimation by Flow Cytometry.

Methods 21: 271-279.

• Shapiro HM. 2001. Multiparameter flow cytometry of bacteria: Implications

for diagnosis and therapeutics. Cytometry 43: 223-226.

• Shapiro HM. 2003. Practical Flow Cytometry. Fourth Edition. John Wiley,

INC., Publication.

• Shapiro HM., Natale P., Kamentsky L. 1979. Estimation of membrane

potential of individual lymphocytes by flow cytometry. Proc. Natl Acad Sci

USA 76: 5728-5730.

119

• Shvalov AN, Soini JT, Surovtsev IV, Kochneva GV, Sivolobova GF, Petrov

AK, Maltsev VP. 2000. Individual Escherichia coli cells studied from light

scattering with the scanning flow cytometer. Cytometry. 41: 41-5.

• Shvalov AN, Surovtsev IV, Chernyshev AV, Soini JT, Maltsev VP. 1999.

Particle classification from light scattering with the scanning flow cytometer.

Cytometry 37: 215-20.

• Sims P., Waggoner A., Wang C., 1974. Hoffman J. Studies on the

mechanism by which cyanine dyes measure membrane potential in red blood

cells and phosphatidyl vesicles. Biochemistry 13: 3315-3330.

• Steen HB, Jernaes MW, Skarstad K, Boye E. 1994. Staining and

measurement of DNA in bacteria. Methods Cell Biol ;42 Pt B:477-87

• Steen, H. 1999. Flow cytometers for characterization of microorganims. In

Current Protocols in Cytometry 11.1-11.9.

• Stingl K, Uhlemann Em EM, Deckers-Hebestreit G, Schmid R, Bakker EP,

Altendorf K. 2001. Prolonged survival and cytoplasmic pH homeostasis of

Helicobacter pylori at pH1. Infect Immun. 69: 1178-80.

• Stingl K, Uhlemann EM, Schmid R, Altendorf K, Bakker EP. 2002.

Energetics of Helicobacter pylori and its implications for the mechanism of

urease-dependent acid tolerance at pH 1. J Bacteriol. 184: 3053-60.

• Stten H. 2000. Flow cytometry of bacteria: glimpses from the past with a

view to the future. J. Microbiol Methods 42: 65-74.

120

• Suller M., Lloyd D. 1998. Flow cytometric assessment of the postantibiotic

effect of methicillin on Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents

Chemother. 42: 1195-1199.

• Suller M., Stark J., Lloyd D. 1997. A flow cytometric study of antibiotic-

induced damage and evaluation as a rapid antibiotic susceptibility test for

methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 40:

77-83.

• Tomb JF, White O, Kerlavage AR, Clayton RA, Sutton GG, Fleischmann

RD, Ketchum KA, Klenk HP, Gill S, Dougherty BA, Nelson K,

Quackenbush J, Zhou L, Kirkness EF, Peterson S, Loftus B, Richardson D,

Dodson R, Khalak HG, Glodek A, McKenney K, Fitzegerald LM, Lee N,

Adams MD, Venter JC, et al. 1997. The complete genome sequence of the

gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 388 (6642):539-47.

• Vives-Rego J., Lebaron P., Nebe-von Caron G. 2000. Current and future

applications of flow cytometry in aquiatic microbiology. FEMS Microbiol

Rev 24: 429-448.

• Walberg M, Gaustad P, Steen HB. 1997. Rapid assessment of ceftazidime,

ciprofloxacin, and gentamicin susceptibility in exponentially-growing E. coli

cells by means of flow cytometry. Cytometry. 27: 169-78.

• Walberg M, Gaustad P, Steen HB. 1997. Rapid discrimination of bacterial

species with different ampicillin susceptibility levels by means of flow

cytometry. Cytometry. 29: 267-72.

121

• Walberg M, Gaustad P, Steen HB. 1999. Uptake kinetics of nucleic acid

targeting dyes in S. aureus, E. faecalis and B.cereus: a flow cytometric

study. J Microbiol Methods. 35: 167-76.

• Watson JV. 2001. Proof without prejudice revisited: immunofluorescence

histogram analysis using cumulative frequency subtraction plus ratio

analysis of means. Cytometry. 43: 55-68.

• Webber MA, Piddock LJ. 2003. The importance of efflux pumps in bacterial

antibiotic resistance. J Antimicrob Chemother. 51: 9-11.

• Well J., Vanderhults R., Gerrits T. 1996. Heterogeneity in susceptibility to

metronidazole among Helicobacter pylori isolated from patients with

gastritis or peptics ulcers disease. J Clin Microbiol 34: 2158-2162.

• Wickens H., Pinney R., Mason D., Gant V. 2000. Flow cytometric

investigation of filamentation, membrane patency, and membrane potential

in Escherichia coli following ciprofloxacin exposure. Antimicrob Agents

Chemother. 44: 682-687.

• Wood A. 1995. The treatment of Helicobacter pylori infection management

of peptic ulcer disease. J Med. 333: 984 -91.