¿ QUÉ ES LA CITOMETRIA DE FLUJO?

Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles de células/segundo) frente a un haz de luz láser de longitud de onda adecuada.

Esta técnica permite obtener múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultánea.Estas características de las células son evaluadas debido a que las células pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 células por segundo.

ParámetrosLa citometría de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos de la biología. Una de susprincipales ventajas es la posibilidad de realizar análisis multiparamétricos los cuales permiten determinar la presencia de varios marcadores simultáneamente, tanto en la membrana como en el citoplasma o núcleo de las células, sean éstas de origen animal o vegetal. La identificación de marcadores celulares permite evaluar al interior de una muestra heterogénea la proporción relativa de una población.

¿ Cómo funciona esta técnica?

La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el estudio de poblaciones de células de sangre periférica. Actualmente ,el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante un citómetro de flujo. La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas. Las células pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia.Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio, en función de sus propiedades fisicoquímicas y del marcaje efectuado. Para la separación celular ,este aparato lleva acoplado un sistema que carga eléctricamente las células y ,con placas deflectoras, se realiza su separación. Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, también lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio, como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc.La señal, producida como consecuencia de la excitación del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de células reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imágenes en dos dimensiones (Dot-Plot), o en una dimensión (Histograma), en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA?

-Su tamaño relativo. (Forward scatter-FSC)- Su granularidad o su complejidad citoplasmática.(Side scatter-SSC)-Su intensidad de fluorescencia relativa.(FL1, FL2, FL3 o FL4)

COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA?El citómetro de flujo detecta la interacción entre una célula y un rayo láser. La forma que la célula:-Desvía la luz incidente.-Emite fluorescencia.

El como la célula desvía los rayo de luz nos da información acerca del tamaño y la granularidad de cada célula.

Los citómetros de flujo están constituidos fundamentalmente por tres sistemas:

sistema de fluidos

sistema óptico de iluminación y detección

el sistema electrónico

SISTEMA FLUÍDRICO: Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad (sheath fluid). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan porque circulan a diferente presión.

SISTEMA ÓPTICO: Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: La óptica de excitación, compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el

haz de luz; y La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego

de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.

FILTROS OPTICOS: Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:

DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas); DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos: Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640

nm) Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada

( Por ej: < 575 nm) Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada

(Por ej: > 520 nm)

SISTEMA ELECTRICO: El sistema electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en la computadora.

reactivos

Las moléculas asociadas a las células pueden ser reconocidas por anticuerpos u otras proteínas,como son lectinas, hormonas, avidina o estreptoavidina, entre otras. También el DNA oRNA son susceptibles de ser visualizados con reactivos fluorescentes. Esto es la base de laversatilidad de la citometría de flujo. Así, aunque las mediciones de FSC y SSC permiten identificartipos celulares dentro de una población heterogénea, son realmente las sondasfluorescentes las que nos permiten clasificarlas con certeza en subtipos, determinar el contenido de DNA y analizar las propiedades fisiológicas de las células.Las señales fluorescentes de cada célula son detectadas sólo unos pocos milisegundos despuésde ser excitadas con la luz. El fluorocromo más utilizado en microscopía y citometría de flujo es isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las ventajas que FITC ofrece por sobre otros fluorocromos son: su alto coeficiente de extinción, su eficiencia cuántica y sus características de absorción y emisión máxima,Sin embargo, también presenta algunos inconvenientes tales como la transferencia deenergía entre moléculas de FITC situadas muy próximas lo que hace disminuir la intensidad globalde fluorescencia obtenida (“quenching” de fluorescencia). De este modo, en el caso de utilizaranticuerpos marcados con FITC, el resultado final en términos de intensidad de fluorescencia nodepende sólo del número de partículas fluorescentes unidos a la célula, sino también deotras características como la proximidad espacial entre ellos. Si se requiere un segundo o terceranticuerpo para marcajes simultáneos, se utilizan fluorocromos que se exciten a la misma longitudde onda que la fluoresceína, como R-ficoeritrina (PE) por ejemplo cuyos rangos de emisión sondistinguibles del verde de la fluoresceína y por tratarse de un fluorocromo muy sensible que nopresenta fenómenos de “quenching” es el elegido en el caso de buscar antígenos presentes en altadensidad. La mayoría de los restantes fluorocromos empleados, más que fluorocromos individuales, son grupos de dos fluorocromos unidos entre ellos de forma natural (por ejemplo, la proteína peridilclorofila o PerCP) o artificialmente (por ejemplo la ficoeritrina-cianina 5, PE/Ci5, conocida tambien como Tricolor).

El SIDA se desarrolla cuando el nivel de Linfocitos T CD4 desciende por debajo de 200 células por mililitro de sangre.

La citometría de flujo ayuda a la determinación del nivel de linfocitos T CD4.

El análisis de las subpoblaciones de linfocitos en sangre periférica se puede aplicar para evaluar el estado inmunológico e incluso proporciona información importante para la identificación de diferentes padecimientos. En el SIDA se ha comprobado que el monitoreo de las subpoblaciones linfoides, específicamente el conteo absoluto de linfocitos CD4, tiene tanto valor pronóstico como terapéutico.

La caracterización de subpoblaciones linfocitarias es una herramienta de gran utilidad en el seguimiento de la progresión de cuadros de inmunodeficiencia. Esto permite detectar con alta sensibilidad subpoblaciones poco representadas dentro de la población total, como son los linfocitos T CD4+ en el SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida).