Manuel Oviedo MartínezHematología

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CITOMETRIA DE FLUJO

Consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara.

De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular.

La banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda.

En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico.

Lectura y ajuste de concentración celular: Como se cuentan los linfocitos presentes en 4 cuadrados grandes del retículo, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en 1 cuadrado grande.

Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados grandes es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éstos y el cubre es de 0´1mm; hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar el número de linfocitos existentes, no en 0´1mm3 , sino en 1mm3 .

En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula:

RL= L/4 x 10 x D RL= Recuento de linfocitos (número de

linfocitos por mm3 de la suspensión celular).L = Linfocitos contados en 4 cuadrados grandes.D= Factor de dilución.

Es una técnica de análisis celular multiparametrico 

Es una tecnología (proceso) que permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula.

Estas medidas son realizadas mientras las células (partículas) pasan en fila, a una velocidad de 500 a 4000 células por segundo, a través del aparato de medida en una corriente de fluido .

Fluidos Optica Electrónica

para introducir y restringir las células para análisis

fuente de excitación un sistema colección.

Para convertir las señales ópticas en señales electrónicas proporcionales y digitalizarlas para análisis computacional.

Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.

Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas

Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

Un fluorocromo es una  molécula química que absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA)

Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.

Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos El fluorocromo absorbe energía del láser El fluorocromo libera energía absorbida por : Vibración y disipación del calor. Emisión de fotones a una mayor longitud de onda llamada  fluorescencia (1,2,3).

El citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :

desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)

emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3)(1).

Fase pre-citometría: preparación de los reactivos, preparación de las células, diseño del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.

Fase de citometría de flujo : involucra el procesamiento de las células marcadas y la recolección de los datos para cada una de las medidas (parámetros) realizados en cada célula individual.

Fase de análisis: análisis de los datos recolectados

La mezcla de células teñidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a través de una aguja creando una delgada fila de líquido que contiene las células.

A medida que cada célula pasa en frente del láser, desvía el rayo incidente y las moléculas teñidas unidas a la célula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente.

Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la información es digitalizada y procesada por el computador.

Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots"

Hematología : tipificacion y conteo de células , reticulocitos y análisis de medula ósea .

Farmacología :estudios de cinética celular Inmunología :subpoblaciones de

linfocitos ,tipaje tisular Oncología :Diagnostico y

pronostico ,monitores de tratamientos Microbiología :diagnostico bacteriano y

virico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos

Genética : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 100.000 células).

Múltiples marcajes de una sola célula. Análisis de alto numero de partículas en corto

tiempo (5.000 eventos /seg. ). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada célula (no sólo el

promedio). Medidas cuantitativas : discriminación de las

células según la cantidad de marcador. Múltiples parámetros : define subpoblaciones

complejas. Miles de células por segundo .

Poca información morfológica de la célula No proporciona información de la

localización celular en un tejido Puede analizar solamente una cantidad

limitada de material (10 millones de células / hora)

Necesita suspensión de células individuales.

Costos de la tecnología Método destructivo. Incapacidad de visualizar las células que

se analizan.

Pipetas volumétricas Pipetas de Ostwald-Folin Pipetas graduadas Micropipetas

Bulbo TD Volumen Tiempo de

almacenamiento Temperatura con gran

exactitud no están graduadas y

sólo permiten medir un volumen único.

Tubo de vidrio delgado Para pequeños volúmenes de sangre Se calibran para soplar

Se calibran con agua

No son muy exactas

Es más exacta la que esté más cercana

Se calibran con mercurio

Debe enjuagárseles con el líquido de dilución

Azul de Cresilo BrillanteSolución fisiológica al 0.5% para tinción de reticulocitos, la substancia granulo filamentosa de éstos se tiñe de azul negro.Presentación por 100 ml.

Reactivo de TurkSolución de violeta de genciana ácido acético, lista para su uso.Para conteo de leucocitos en Cámara de Neubauer.

Thrombo - CountSolución de oxalato de potasio con cloruro de mercurio, Para conteo directo de trombocitos.Presentación por 50 ml.

Reactivo de Hayem´sSolución de cloruro de mercurio isotónica para conteo en eritrocitos en la cámara.

El ácido acético contenido en la solución de Türk hemoliza los eritrocitos y el colorante contenido tiñe los leucocitos.

Llenado de la pipeta Aspirar sangre en una pipeta de leucocitos

hasta la marca 1.0, seguidamente aspirar solución de Türk hasta la marca 11.

La dilución es 1:10. También es posible una dilución de 1: 20

(sangre hasta la marca 0.5 y solución de Türk hasta la marca 11). Mezclar cuidadosamente la sangre