Citometría de Citometría de FlujoFlujo

Citometría de FlujoCitometría de FlujoCitometría de FlujoCitometría de FlujoAnálisis celular multiparamétricoAnálisis celular multiparamétrico

Láser focalizado = señales celulares Láser focalizado = señales celulares recogidas por diferentes detectores.recogidas por diferentes detectores.

Tamaño y complejidadTamaño y complejidad

Inmunofenotipo.Inmunofenotipo.

Señales de dispersión.Señales de dispersión.

Señales de fluorescencia.Señales de fluorescencia.

ParámetrosParámetros

Dispersión:Dispersión:

*FSC: Tamaño*FSC: Tamaño

*SSC: Complejidad.*SSC: Complejidad.

Fluorescencia:Fluorescencia:

Uniones AG-ACUniones AG-AC

Marcaje con Marcaje con fluorocromos.fluorocromos.

Poblaciones celulares Poblaciones celulares

detectadas detectadas simultáneamente.simultáneamente.

VentajasVentajas

Múltiples marcajes.Múltiples marcajes.

Analizar un elevado Analizar un elevado numero de partículas numero de partículas en un corto periodo en un corto periodo de tiempo.de tiempo.

Cuantificación de la Cuantificación de la actividad antigénica.actividad antigénica.

Mayor sensibilidad y Mayor sensibilidad y objetividad.objetividad.

Análisis de Análisis de poblaciones celulares poblaciones celulares

Almacenamiento de Almacenamiento de la información para la información para análisis posteriores.análisis posteriores.

FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS

Absorben luz a una Absorben luz a una Emiten a otra.Emiten a otra.

Espectros de excitación y de emisión.Espectros de excitación y de emisión.

Uso Uso Tipo de láser y su long.de onda.Tipo de láser y su long.de onda.

Corto estado de excitación.Corto estado de excitación.

Fotoestables.Fotoestables.

Alto rendimiento cuántico.Alto rendimiento cuántico.

FLUOROCROMO

DESCRIPCION

FITC Isotiocianato de Fluoresceína

PE Ficoeritrina

PerCP Proteína Clorofila Peridinina

TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570

PEC Ficoeritrina cianina

RT Rojo Texas 596----615nm

PC Ficocianina 620---650nm

APC Aloficocianina 650-----660nm

TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm

ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes

CITOMETROCITOMETRO

SISTEMAS OPTICOSSISTEMAS OPTICOS

Como se preparan las Como se preparan las muestras??muestras??

TIPO de MX.TIPO de MX.

Médula ósea.Médula ósea.- Sangre periférica. - Sangre periférica. - Exudados y trasudados - Exudados y trasudados

- LCR.- LCR.- BAL.- BAL.- Tejidos sólidos como ganglios. - Tejidos sólidos como ganglios. - Células procedentes de cultivos celulares.- Células procedentes de cultivos celulares.- Productos de aféresis. - Productos de aféresis.       

CITOGRAMASCITOGRAMAS

Línea BlancaLínea Blanca

LoLoRojoRojo

NoNoAzulAzul

EoEoAmarilloAmarillo

MoMoVerdeVerde

PQ y Rcel.PQ y Rcel.NegroNegro

CITOGRAMASCITOGRAMAS

Línea Roja:Línea Roja:

HH Rojo Rojo

PQPQVerdeVerde

ResiduosResiduosAzulAzul

FUNDAMENTOS DE LAFUNDAMENTOS DE LA

CITOMETRÍA DE FLUJO CITOMETRÍA DE FLUJO

¿Qué es la citometría de flujo?¿Qué es la citometría de flujo?

FSC

90º90º2- 4º

Columna de muestra

Meeting pointMeeting pointLáserLáser

Detecto

res de lu

z

Detecto

res de lu

z

AmplificaciónAmplificacióndigitalizacióndigitalización

RepresentaciónRepresentación y Analisis y Analisis

FlujoFlujo

¿Cómo funciona un citómetro?¿Cómo funciona un citómetro?

1.1. Sistema de flujoSistema de flujo

2.2. Dispersión de la luzDispersión de la luz

3.3. FluorescenciaFluorescencia

4.4. Separación y detección de la luzSeparación y detección de la luz

5.5. AmplificaciónAmplificación

6.6. Corrección de errores: solapamiento Corrección de errores: solapamiento espectral y formación de dobletesespectral y formación de dobletes

7.7. Digitalización y almacenamiento de la Digitalización y almacenamiento de la informacióninformación

1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA1.1. SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA

MUESTRAMUESTRA

AIREAIRE

FLUJOFLUJOMUESTRAMUESTRA

1.2. Cámara1.2. Cámara de flujo de flujo

FSC

90º90º

Fluido envolvente

Columna de muestra

Luz dispersada lateralmente Luz dispersada lateralmente y luz fluorescente, y luz fluorescente, = 90= 90º

Luz incidenteLuz incidente

Luz dispersada hacia delante, Luz dispersada hacia delante, ==2- 4º

Luz dispersada a 90 grados (Side SCattered light )

Detector FSC

Detector de 90º SSC

Laser

DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)DELANTE (FORWARD SCATTERED LIGHT, FSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particulapulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE SCATTERED LIGHT, SSC)SCATTERED LIGHT, SSC)

FSCFSC

SSCSSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos (granularidad)(granularidad)

0 256 512 768 1024

4C5144001 FSC-Height ->

GranulocitosGranulocitosCD15+CD15+

MonocitosMonocitosCD14+CD14+

LinfocitosLinfocitosCD3+CD3+

T2abT2abT1gdT1gdCD4+CD4+CD8+CD8+

CD56+CD56+CD19+CD19+

CD5+CD5+CD5-CD5-

Morfología y antígenos de diferenciación en el Morfología y antígenos de diferenciación en el análisis de la heterogeneidad celularanálisis de la heterogeneidad celular

Laser

Detectores de fluorescencia

Freq

Fluorescencia

Detector

Detector de fluorescencia(PMT3, PMT4 etc.)

FluorescenciaFluorescencia

FSCFSC

FL-1FL-1

FL-2FL-2

FluorescenciaFluorescencia

Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.energía y vuelve al estado basal emitiendo un fotón.

Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía distintos estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.(mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.

t (t (s)s)

EE

11<<22

11

22

Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl (fluorescencia)(fluorescencia)Citómetros de 2 láser: 2D y 4 FlCitómetros de 2 láser: 2D y 4 Fl

TIPOS DE LASERTIPOS DE LASERLáser Violeta 405 nmLáser Violeta 405 nmLáser Azul 488 nm (Argón)Láser Azul 488 nm (Argón)Láser Verde 543 nmLáser Verde 543 nmLáser Rojo 633-635 nm (He-Ne)Láser Rojo 633-635 nm (He-Ne)

Citometros FlujoCitometros FlujoCitometros FlujoCitometros Flujo

EspectrosEspectros

Espectro de AbsorciónEspectro de Absorción Representación de la intensidad de absorción de luz Representación de la intensidad de absorción de luz

de distintas longitudes de onda por una sustanciade distintas longitudes de onda por una sustancia

Espectro de EmisiónEspectro de Emisión Representación de la intensidad de emisión de una Representación de la intensidad de emisión de una

sustancia excitada con luz de una determinada sustancia excitada con luz de una determinada longitud de onda.longitud de onda.

nm

excitaciónexcitación medidamedida

Inte

nsi

dad

de

I nt e

ns i

da d

de

flu

ore s

c en

c ia

flu

ore s

c en

c ia

DETECCIÓN DE FLUORESCENCIADETECCIÓN DE FLUORESCENCIA

TCPerCP

QR

Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores

FluorocromosFluorocromos

EscalasEscalas

FSC Ej: LinealFSC Ej: Lineal FL-1 Ej: LogarítmicaFL-1 Ej: Logarítmica

Compensación de señalesCompensación de señales

Fundamento Fundamento Superposición de Superposición de espectros de emisión. espectros de emisión. Parte de la señal de Parte de la señal de emitida por un emitida por un fluorocromo es leída por fluorocromo es leída por el detector de otro colorel detector de otro colorConcepto Concepto sustracción de sustracción de una parte de la señal una parte de la señal medida en un color a la medida en un color a la señal medida en otro colorseñal medida en otro color

FL-2FL-2 - %FL1- %FL1

ll

excitaciónexcitación

medidamedida

Inte

nsi

dad

de

flu

or e

scen

cia

Int e

nsi

dad

de

flu

ore

scen

cia

FL-1FL-1 FL-2FL-2

Representación monoparamétrica de datos.Representación monoparamétrica de datos. Histogramas. Histogramas. Se representa en cada valor de x (intensidad de Se representa en cada valor de x (intensidad de fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.fluorescencia) el número de células que emiten esa intensidad.

M1

HistogramasHistogramas

SSCSSC

FSCFSC

FL-1FL-1

FL-2FL-2

FL-3FL-3

Representación biparamétrica en 2DRepresentación biparamétrica en 2DDiagrama de puntos / dot plot

+

+--

++-

-FL-1FL-1

FL

-2F

L-2

Representación 3D Representación 3D Countour plotCountour plot / / Diagramas de

contornosX, Y más una tercera dimensión. X, Y más una tercera dimensión.

La altura representa el número de células La altura representa el número de células con una determinada combinación de con una determinada combinación de ambos parámetros.ambos parámetros.Densidad=alturaDensidad=altura

Diagrama de dot plot density

Usa colores para representarUsa colores para representardensidaddensidad

Selección de subpoblaciones Selección de subpoblaciones definidas en diagramas definidas en diagramas monoparamétricos monoparamétricos Sitúan los valores límite Sitúan los valores límite superior e inferior de un superior e inferior de un parámetro que definen a las parámetro que definen a las células de interés.células de interés.

Selección de la informaciónSelección de la informaciónGates (Puertas) / ventanas (windows)Gates (Puertas) / ventanas (windows)

M1

M2

Estadisticas biparamétricasEstadisticas biparamétricas

Cuadrantes Cuadrantes Combinación de dos Combinación de dos

umbrales de positividad para dos umbrales de positividad para dos

parámetrosparámetros

Número de célulasNúmero de células

% de células% de células

MFI mean, geo meanMFI mean, geo mean

+--

++

-

+-

Quadrant Statistics

File: FEN-A11R.007 Log Data Units: Linear Values

Sample ID: Patient ID:

Tube: tube #7 Panel: Bronquiris

Acquisition Date: 5-Jun-98 Gate: No Gate

Gated Events: 5000 Total Events: 5000

X Parameter: FL1-H CD2 FITC (Log) Y Parameter: FL2-H CD16 PE (Log)

Quad Location: 15, 17

Quad Events % Gated % Total X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean

UL 785 15.70 15.70 5.42 4.50 1553.17 1274.92

UR 877 17.54 17.54 62.04 52.73 1159.04 700.05

LL 951 19.02 19.02 2.81 2.37 3.67 3.17

LR 2387 47.74 47.74 70.94 63.08 6.30 5.43

UULL UURR

LLLLLLRR