Citometria de Flujo

DIPLOMADO DE DIPLOMADO DE HEMATOLOGÍA Y HEMATOLOGÍA Y

HEMOSTASIA APLICADO AL HEMOSTASIA APLICADO AL LABORATORIO CLÍNICOLABORATORIO CLÍNICO

IMPACTO DEL INMUNOFENOTIPO IMPACTO DEL INMUNOFENOTIPO EN EL DIAGNÓSTICO DE LOS EN EL DIAGNÓSTICO DE LOS

SINDROMES SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOSLINFOPROLIFERATIVOS

CITOGENCITOGENÉTICAÉTICA

CITOMETRCITOMETRÍA ÍA DE FLUJODE FLUJO

MORFOLOGMORFOLOGÍA Y ÍA Y CITOQUÍMICACITOQUÍMICA

BIOLOGBIOLOGÍA ÍA MOLECULARMOLECULAR

DIAGNDIAGNÓSTICOÓSTICO

CLCLÍÍNICANICA

MORFOLOGIA CELULAR

+

CITOQUIMICA

INMUNOFENOTIPO

FAB MIC

GENETICA

REAL OMS1976

1986

1999

2001

CLASIFICACIONES Y SU EVOLUCION

OMS2008

BIOLOGIA MOLECULAR

OMS 2008OMS 2008

DefiniciónDefinición ICD ICD

EpidemiologíaEpidemiología EtiologíaEtiología

CompromisoCompromiso ClínicaClínica

MorfologíaMorfología Variantes Variantes morfológicasmorfológicas

Cito/histoquímicaCito/histoquímica Inmunofenotipo Inmunofenotipo

Genética y Biología molecular Genética y Biología molecular

Factores pronósticos y predictivosFactores pronósticos y predictivos

TerapiaTerapia

MIELOIDES :MIELOIDES : - Neoplasias mieloproliferativas- Neoplasias mieloproliferativas - Neoplasias mieloides y linfoides con- Neoplasias mieloides y linfoides con eosinofilia y anormalidades de PDGFReosinofilia y anormalidades de PDGFR - Neoplasias Mieloproliferativas y - Neoplasias Mieloproliferativas y MielodisplásicoMielodisplásico - SMD- SMD - Leucemias mieloides agudas y - Leucemias mieloides agudas y neoplasias precursoras relacionadasneoplasias precursoras relacionadas - Leucemias Agudas de Linaje Ambiguo- Leucemias Agudas de Linaje Ambiguo

WHO 2008 - TUMORES WHO 2008 - TUMORES HEMATOPOYÉTICOS Y LINFOIDESHEMATOPOYÉTICOS Y LINFOIDES

WHO 2008 - TUMORES WHO 2008 - TUMORES HEMATOPOYÉTICOS Y LINFOIDESHEMATOPOYÉTICOS Y LINFOIDES

LINFOIDES:LINFOIDES:

- Neoplasias linfoides precursoras- Neoplasias linfoides precursoras- Neoplasias maduras B- Neoplasias maduras B- Neoplasias maduras T y NK- Neoplasias maduras T y NK- Linfoma Hodgkin- Linfoma Hodgkin- Desórdenes linfoproliferativos- Desórdenes linfoproliferativos asociados a inmunodeficienciasasociados a inmunodeficiencias- Neoplasias histiocíticas y dendríticas- Neoplasias histiocíticas y dendríticas

SSíntomas y signosíntomas y signos LaboratorioLaboratorio

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

MorfologMorfología ía + citoqu+ citoquímicaímica

CitogenCitogenéticaética

InmunofenotipoInmunofenotipo

BiologBiología molecular/FISHía molecular/FISH

Fuentes biológicasFuentes biológicas

Médula óseaMédula ósea

Sangre periférica Sangre periférica

Líquidos corporales Líquidos corporales (cavidades,lavados) (cavidades,lavados)

Tejidos sólidos (piel, ganglios linfáticos, Tejidos sólidos (piel, ganglios linfáticos, otrosotros))

ProcesamientoProcesamiento

Recepción: datos clínicos y dx. presuntivoRecepción: datos clínicos y dx. presuntivo

Lisado glóbulos rojos no nucleados (muestras Lisado glóbulos rojos no nucleados (muestras hematológicas)hematológicas)

Lavado y filtrado (muestras no hematológicas)Lavado y filtrado (muestras no hematológicas)

Aplicación de Ac : paneles (fases)Aplicación de Ac : paneles (fases)

Adquisición y almacenamiento de dataAdquisición y almacenamiento de data

Análisis e interpretaciónAnálisis e interpretación

Impresión e informeImpresión e informe

La célulaLa célula

Características físicas :Características físicas : Tamaño, forma celular y nuclear, Tamaño, forma celular y nuclear, complejidad celular o granularidad, etc.complejidad celular o granularidad, etc.

Características biológicas:Características biológicas: composición composición bioquímica, partículas lipo proteicas, bioquímica, partículas lipo proteicas, antígenos RNA, DNA, antígenos RNA, DNA,

Ambas sufrenAmbas sufren modificacionesmodificaciones durante durante los estadíos de maduraciónlos estadíos de maduración

COMPARTIMENTOS CELULARES

MEMBRANA CELULAR :

>CDs

CITOPLASMA : MPO, CD79a, Ig, CD22, CD3

NÚCLEO : TdT

HEMATOPOYESIS

Stem cell

Lymphoid precursor

Myeloid precursor

T-lymphocytesB-lymphocytesNK-cellsPlasmacytoid DC

Erythroid cellsMegakaryocytic cellsNeutrophilsMonocytesMonocytic DCEosinophilsBasophilsMast cellsMyeloid DC

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10277.008CD45 PERCPCY5,5 ->

MMÉDULA ÓSEA NORMALÉDULA ÓSEA NORMAL

Rojos nucleados

Neutrófilos

Monocitos

CD34+ HPC

Eosinófilos

Linfocitos

DISTRIBUCIÓN DE POBLACIONES EN MÉDULA DISTRIBUCIÓN DE POBLACIONES EN MÉDULA ÓSEA NORMALÓSEA NORMAL

SUBPOBLACIONES MO % NORMAL MO% CD34+ 1.1 0.6 (0.3-2.6)% CD34+ y/o CD117+ 2.2 1.4 (0.6-6)% Eritroide 4.7 2.1 (2-9)% Neutrófilos 67 6.1 (57-80)% Monocitos 4.3 1.4 (2-6.5)% Eosinófilos 2.5 1.3 (0.8-5)% Basófilos 0.4 0.7 (<0.1-2.4)% Mastocitos 0.02 0.01 (<0.03)% Plasmáticas 0.2 0.2 (0.01-0.5)% Linfocitos B maduros 2.9 1.5 (1.6-6.3)% Linfocitos B precursores 0.9 1.5 (0.1-3.9)% Linfocitos T 9.2 4.5 (2.6-18)% Linfocitos NK 2.8 1.4 (0.7-5)

ANTANTÍGENOS Y LINAJESÍGENOS Y LINAJES LINAJ E T Y NK

LINAJ E B MIELOIDE INMADUREZ

TCR αβ/ γδ CD3 (Sm,Cy)

CD79a , I g M, CD22 I g D, I g A, I g G, k, l

MPO CD33, CD13 Lisozima

TdT, CD34, CD117,

CD1a, CD2,

CD4, CD5,

CD7, CD8,

CD10, CD19

CD20, CD11c

CD25, FMC7

CD103

CD14, CD15,

CD16,

CD64,CD11b

CD38

HLA-DR

CD56, CD57

CD16

Gly-A, CD71,

CD41a ,CD61

FITC PE PerCP/Cy5.5 APCcCont. cCont. CD45 CD34nTdt cMPO CD45 CD34cCD3 CD7 CD45 CD34CD19 cCD79a CD45 CD34CD20 CD10 CD19 CD34sCont. sCont. CD45 CD34HLADR CD117 CD45 CD34HLADR CD123 CD45 CD34CD11b CD13 CD45 CD34CD15 CD16 CD45 CD10CD36 CD64 CD45 CD14CD33 CD61 CD45 CD34CD71 GphA CD45 CD34CD2 CD56 CD45 CD34

COMBINACIONES X 4 FL

¿ ¿ QUÉ CARACTERIZA A LAS CQUÉ CARACTERIZA A LAS CÉÉLULAS NORMALES ? LULAS NORMALES ?

ExpresiónExpresión del linaje celular y estadío de maduración.del linaje celular y estadío de maduración.

¿ EN QU¿ EN QUÉ É DIFIEREN LAS ANORMALES ? DIFIEREN LAS ANORMALES ?

Reflejan desarreglos de expresión proteica conReflejan desarreglos de expresión proteica con

fenotipos aberrantes con o sin anomalías genéticasfenotipos aberrantes con o sin anomalías genéticas

asociadas asociadas

CARACTERIZACICARACTERIZACIÓÓN INMUNOFENOTN INMUNOFENOTÍÍPICAPICA

DE LAS CDE LAS CÉÉLULAS LULAS

APLICACIÓN CLAPLICACIÓN CLÍÍNICA EN NICA EN NEOPLASIAS NEOPLASIAS

LINFOHEMATOPOYÉTICASLINFOHEMATOPOYÉTICAS DIAGNDIAGNÓÓSTICOSTICO

Identificación de poblacionesIdentificación de poblaciones CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓN

LinajesLinajesEstadíos de maduraciónEstadíos de maduraciónFenotipo/genéticaFenotipo/genética

PRONPRONÓSÓSTICOTICO MONITORIZACIMONITORIZACIÓÓN DEL TRATAMIENTON DEL TRATAMIENTO

Fenotipos aberrantesFenotipos aberrantes

Intensidad fluorescente anormal por Ac Intensidad fluorescente anormal por Ac

Ausencia o sobreexpresión de AcAusencia o sobreexpresión de Ac

Expresión asincrónica madurativaExpresión asincrónica madurativa

Maduración/compartimento biológicoMaduración/compartimento biológico

Curva de maduración anormalCurva de maduración anormal

ExpresiExpresión antigénica de varios linajesón antigénica de varios linajes

%%LA BifenotLA Bifenotípicaípica 100100

LLA-TLLA-T 9999LLA-BLLA-B 9595

DLPC-BDLPC-B 9595GammapatGammapatía monoclonalía monoclonal 9090

LMALMA 7575DLPC-TDLPC-T NANA

SMD/SMPSMD/SMP NANA

FRECUENCIA DE FENOTIPOS ABERRANTES POR FRECUENCIA DE FENOTIPOS ABERRANTES POR

CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

ORIGEN Y MADURACION : LINFOCITOS B

MEDULAOSEA :

PRECURSOR

SANGREGANGLIO L.

BAZO, OTROS:PERIFERICO

Stem Cell

Pro B

TdT

B Común

Pre B

TdT

TdT

TdTHLA-DR

HLA-DR

HLA-DR

HLA-DR

19

19

79a

10

10

79a

19

20

20

34

CyIgM

34

34

79a

SmIg

HLA-DR 19

79a

20

B Madura

Linf B Naïve circulante

INMUNOFENOTIPO DE PRECURSORAS INMUNOFENOTIPO DE PRECURSORAS B NORMALES - MB NORMALES - MÉDULA ÓSEAÉDULA ÓSEA

CD34

TdT

CD38

CD45

CD10

CD19CD22 CD20

I II III IV

CyIgM

SmIgM

Precursores B-ALL: CD79a+ CD19+ CD34+ o -

- B I ó pro-B (CD10-/IgM-/CD20-) - B II ó común (CD10+/IgM-/CD20+) - B III ó pre-B (CD10+/CyIgM+/CD20+) - B IVó � madura (CD10-/SmIgM+/CD20+)

Precursor T-ALL:- T I (CD7+/CyCD3+)- T II (CD2+ y/o CD5+ y/o CD8+)- T III (CD1a+/CyCD3+)- T IV (CD1a-,SmCD3+)

CLASIFICACIÓN DE MADURACIÓN DE

PRECURSORES LINFOIDES

“FLOW CYTOMETRIC IMMUNOPHENOTYPING OF PRECURSOR

B-ALL WITH STANDARDIZED TRIPLE-STAININGS”

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

P Lucio, G Gaipa et al., Leukemia, 2001, 15: 1185-1192

0 64 128 192 256

14563.002Forward Scatter ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.004CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.004CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.008Anti-TdT FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14563.009Anti-Cy IgM FITC ->

CD45++ CD34++ CD19++ TdT neg a + CD79a +

CD10- CD20- IgM -

Leucemia/Linfoma Linfoblástico de células B precursoras

estadío Pro-B Pro-B.

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.004CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.004CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

15016.009Anti-Cy IgM FITC ->

CD10++ CD19++ CD20 +++ CD79a+ CD45 neg a + TdT neg a + IgM-

Leucemia Linfoma Linfoblástico de células B precursoras ComúnComún .

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HG30672.002CD10 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HG30672.006CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HG30672.008CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HG30672.010CD13 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.007CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.008CD10 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.008CD13 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RFR7690.011CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

UVJ39869.002CD34 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

UVJ39869.004CD13 PE ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

MO21489004CD34 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

AP36452.003CD10 ->

Normal BM CD34+ B-cells

DNA diploid Bcr/abl+ ALL

DNA aneuploid Bcr/abl+ ALL

CD10 CD13 CD34 CD34

CD10 CD13 CD34 CD34

CD10 CD13 CD34 CD34

CD

19

CD

19

CD

19

CD

45

CD

45

CD

45

CD

38

CD

38

CD

38

CD

19

CD

19

Inmunofenotipo de LLA-B con fenotipo BCR/ABLInmunofenotipo de LLA-B con fenotipo BCR/ABL

DIFERENCIACIDIFERENCIACIÓN ÓN T, NK Y DCT, NK Y DC

CD34CD34++

HPCHPC

Lymph/pDCLymph/pDCprecursorprecursor

c-kitc-kit

TTprecursorprecursor TT

pDCpDCprecursorprecursor

NKNKprecursorprecursor

CD34CD34++

CD117CD117++

CD135CD135++

CD38CD38++

HLA DRHLA DR++

CD10CD10--

CD45CD45+/-+/-

CD34+CD34+CD13-/+CD13-/+CD33-/+CD33-/+CD38+CD38+HLA DR+HLA DR+CD10+CD10+CD45RA+CD45RA+

CD44CD44LOLO

CD5CD5++

CD34CD34++

NK/pDCNK/pDCprecursorprecursor

CD44CD44HIHI

CD5CD5--

CD34CD34++

CD34CD34++

CD161CD161++

CD122CD122++

CD56CD56--

BBprecursorprecursor

CD34+CD34+HLADRHLADRHIHI

CD4CD4++

CD40+CD40+CD36+CD36+CD123+++CD123+++

Células

estromales

ORIGEN Y MADURACION : LINFOCITOS T

Early

Thymocyte

Cortical

Thimocyte

Mature

Thymocyte

BONEMARROW

- P.B.- LYMPH NODE- SPLEEN

StemCell

Pro T

2

73 TdT

73

34

TdT

34

2

7

3 TdT

5

73

2

TdT

2

7

3 TdT 1

5

4

8 2

7

1 5

8

43

2

7

5

4

3

αβ

αβ

2

7

5

3αβ

8

2

7

5

3αβ

4

2

7

5

3αβ

8HELPER

/CITO SUPPRESSOR

2

7

5

αβ

27

3γδ

27

3γδ

3

2

7

5

3

αβ

MEDULA

THYMUS

CORTEZA

CITOTOXIC s

(5%)(10%)

αβ LINEAGE γδ LINEAGE

sDoble

Negative5%

Doble

Positive80%

EarlyThymocyte

CommonThymocyte

MatureThymocyte

IMMUNOFENOTIPO DE CIMMUNOFENOTIPO DE CÉLULASÉLULAS NORMALES vs T-ALL BM CD7+NORMALES vs T-ALL BM CD7+

CD4 CD2 CD5

CD5 CD2 CD4 C

D8

CD

3

CD

3

CD

8

CD

3

CD

3

A Porwit-MacDonald, et al. Leukemia 2000: 14, 816-825

A Porwit-MacDonald, et al. Leukemia 2000: 14, 816-825

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.005CD8 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.006CD7 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.007CD5 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.010Anti-TCR-alpha-beta-1 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.012CD3 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14971.005CD3 APC ->

CD45++ CD2++ CD4 neg a + CD7+ CyCD3+ a ++ CD5 neg a + CD8 neg a + TdT neg a + TCRs neg CD1a neg CD34 neg CD10 neg

Leucemia/Linfoma Linfoblástico- Células T precursorasLeucemia/Linfoma Linfoblástico- Células T precursoras

103

102

101

SEGMENTADOMETAMIELOCITOMIELOCITOPROMIELOCITOMYELOBLASTO

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33

CD11b

CD64

CD65

CD54

CD10

CD35

CD13

CAMBIOS FENOTÍPICOS DE DIFERENCIACIÓN NEUTROFÍLICA NORMAL

MPO

CD15

CD16

SERIE MIELOIDE : SERIE MIELOIDE : Maduración normal y subpoblacionesMaduración normal y subpoblaciones

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10944.005CD36 FITC ->

DIFERENCIACIÓN MONOCÍTICA EN MO NORMAL

CD36-FITC

CD

64

-PE

HLADR CD64 CD36 CD14 IREM2

10 10 10 10 100 1 2 3 4

12784.031MAR FITC -> IREM-2 FITC

CD

14

-PE

CTIF b11DC

EP 61DC

CD34/ CD10 APC

MON2-L.N.002

10 10 10 10 100 1 2 3 4

MON2-L.N.002CD11b FITC ->

Maduración de neutrófilos

CD11b-FITCCD11b-FITC

CD

16

-PE

CD34/CD10-APC

103

102

101

CAMBIOS FENOTÍPICOS DE MADURACIÓN NORMAL DE CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMACITOIDES EN MO

ESTADÍO I ESTADÍO IVESTADÍO IIIESTADÍO II

CD 123 PE

HLA DR PERCP

CD 34 APC

CD 117 APC

CD 33 APC

CD 36 FITC

BDCA2 PE

BDCA4 PE

CAMBIOS FENOTCAMBIOS FENOTÍPICOS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ÍPICOS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN NORMAL DE MASTOCITOSNORMAL DE MASTOCITOS

CD34

CD203c

HLA-DR

cytB12 (Tryptase)

FceRI

CD117

cytG4 (Triptasa)

cytG3 (Triptasa)

CAMBIOS FENOTCAMBIOS FENOTÍPICOS DURANTE ÍPICOS DURANTE DIFERENCIACIÓN DE BASÓFILOSDIFERENCIACIÓN DE BASÓFILOS

CD34

HLA-DRCD117

FceRI

CD123

CD203

2D7

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.003CD15 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.004CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.005CD8 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.007Anti-HLA-DR FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.008CD64 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.009CD71 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14939.011Anti-Myeloperoxidase ( ->

CD45++ CD13+ CD34+ a ++ CD33+ a ++ CD15 + HLA-DR++ CD71+ CD117+ a ++ MPO+ CD64 neg a +

Negativas: CD4, CD7, CD56, CD14, CD11b

Leucemia Aguda Mieloide, no Promielocítica,componente monocítico maduro, probable FAB M2.

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.002CD13 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.003CD15 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.005CD8 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.007Anti-HLA-DR FITC ->

CD45++ CD33++ hom CD13+ het CD15 neg a + Negativas: CD34 HLA-DR CD2 CD56

Leucemia Aguda Promielocítica con t(15;17). FAB M3 clásica

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14558.006CD7 FITC ->

Diagnosis Genetic Aberrant immunophenotype

B-ALL t(9;22)* CD34hi,CD10+,CD38lo,CD13lo

t(12;21) CD34het,CD10+,CD20-,CD13lo

11q23/t(4;11) CD34+,CD10-,7.1+,CD15+

AML t(15;17) CD34-/+,CD15-/lo,CD2-/

lo,CD13het

Inv(16) MPOhi,CD2-/lo

t(8;21) CD19+,CD56+

11q23 CD56+,7.1-/+,CD19-/lo,CD2-/+

AL: GENOTYPIC-PHENOTYPIC ASSOCIATIONS

GENGENÉÉTICA Y LEUCEMIASTICA Y LEUCEMIASAML-M2 con t(8;21) AML1/ETOAML-M2 con t(8;21) AML1/ETO: 2/3 de novo : 2/3 de novo CD19+ , y usualmente CD34+. Favorable.CD19+ , y usualmente CD34+. Favorable.AML-M2 con t(8;21)AML-M2 con t(8;21) : 1/2 de novo expresan : 1/2 de novo expresan CD56, periodo corto de remision y disminucion CD56, periodo corto de remision y disminucion de sobrevida. [Arber,D. AJCP Ene2002;117(3)]de sobrevida. [Arber,D. AJCP Ene2002;117(3)]AML-M3 con t(15;17) PML/RARAML-M3 con t(15;17) PML/RARαα:: HLA-DR-, HLA-DR-, CD15-. Favorable.CD15-. Favorable.AML-M3 variante ,no t(15;17):AML-M3 variante ,no t(15;17): HLA-DR+, CD15+ HLA-DR+, CD15+AML-M3 con CD56+:AML-M3 con CD56+: recaída temprana y/o recaída temprana y/o resistencia a ATRA.resistencia a ATRA.AML-M7 con t(1;22) OTT/MAL:AML-M7 con t(1;22) OTT/MAL: CD61,CD41,HLA- CD61,CD41,HLA-DR con MPO-, CD13-, CD33-, CD117-, DR con MPO-, CD13-, CD33-, CD117-, CD34-,CD15, CD14-CD34-,CD15, CD14-

Hrusak, O y Porwit-MacDonald. Leukemia 2002, Sep16, 1233-1258

ENFERMEDAD ENFERMEDAD MMÍÍNIMA RESIDUALNIMA RESIDUAL

Factores que influyen en la repuesta a la Factores que influyen en la repuesta a la terapia en pacientes con Leucemia Agudaterapia en pacientes con Leucemia Aguda

LEUKEMIA CELL

Umbral tumoral

Crecimiento cel

- Resistencia a drogas

Terapia

Dosis

Interacción

Huesped

Edad

Farmacogenómica

Respuesta a terapia

British Journal Haematology 2003;121,823-838

Morfología

EMR

TREATMENT

1010

108

1 célula detectada entre

10,000 normales

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

15550.002CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15550.003CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15550.005CD38 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15550.009CD5 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15550.009CD5 FITC ->

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

15117.002CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15117.005CD5 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15117.008CD38 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

15117.005CD5 FITC ->

DLPC 20,000 eventos totales (05/01/07) 3,79%

MRD 426,180 eventos totales y 1,147 eventos CD19 (04/07/07) 0,17%

Enfermedad Mínima ResidualEnfermedad Mínima Residual

R1

R2

R3R6

R4R13

R7R8 R9

R13

R10

R11R12R13

File: PT 5 .BM.012

Acquisition Date: 13-Jun-01

Gate: G1

Gated Events: 3341

Total Events: 3387

Gate Events % Gated % Total

G1 3341 100.00 98.64

G2 353 10.57 10.42

G3 2180 65.25 64.36

G4 280 8.38 8.27

G5 195 5.84 5.76

G6 133 3.98 3.93

G7 2536 75.91 74.87

G8 70 2.10 2.07

G9 166 4.97 4.90

G10 173 5.18 5.11

G11 150 4.49 4.43

G12 2674 80.04 78.95

G13 168 5.03 4.96

G14 133 3.98 3.93

G15 2180 65.25 64.36

G16 353 10.57 10.42

File: PT 5 .BM.012


Gate: G16

Gated Events: 353

Total Events: 3387


G1 353 100.00 10.42

G2 353 100.00 10.42

G3 0 0.00 0.00

G4 166 47.03 4.90

G5 109 30.88 3.22

G6 3 0.85 0.09

G7 10 2.83 0.30

G8 17 4.82 0.50

G9 113 32.01 3.34

G10 105 29.75 3.10

G11 130 36.83 3.84

G12 32 9.07 0.94

G13 32 9.07 0.94

G14 3 0.85 0.09

G15 0 0.00 0.00

G16 353 100.00 10.42

File: PT 5 .BM.012


Gate: G15

Gated Events: 2180

Total Events: 3387


G1 2180 100.00 64.36

G2 0 0.00 0.00

G3 2180 100.00 64.36

G4 8 0.37 0.24

G5 43 1.97 1.27

G6 0 0.00 0.00

G7 2046 93.85 60.41

G8 29 1.33 0.86

G9 28 1.28 0.83

G10 36 1.65 1.06

G11 3 0.14 0.09

G12 2072 95.05 61.18

G13 61 2.80 1.80

G14 0 0.00 0.00

G15 2180 100.00 64.36

G16 0 0.00 0.00

File: PT 5 .BM.012


Gate: G14

Gated Events: 133

Total Events: 3387


G1 133 100.00 3.93

G2 3 2.26 0.09

G3 0 0.00 0.00

G4 11 8.27 0.32

G5 23 17.29 0.68

G6 133 100.00 3.93

G7 23 17.29 0.68

G8 5 3.76 0.15

G9 18 13.53 0.53

G10 22 16.54 0.65

G11 5 3.76 0.15

G12 27 20.30 0.80

G13 71 53.38 2.10

G14 133 100.00 3.93

G15 0 0.00 0.00

G16 3 2.26 0.09

CCÁÁ

LCU

LO D

E

EM

RLC

ULO

DE

E

MR

CALC. EMR Version3.lx

SINDROMES SINDROMES LINFOPROLIFERATIVOS LINFOPROLIFERATIVOS CRCRÓÓNICOS-NEOPLASIAS NICOS-NEOPLASIAS

DE CDE CÉÉLULAS MADURASLULAS MADURAS

PANEL BASE - DLPCPANEL BASE - DLPC

FL-1FL-1 FL-2FL-2 FL-3FL-3 FL-4FL-4

Tubo 1*Tubo 1* CD10CD10 CD20CD20 CD45CD45 CD19CD19

Tubo 2Tubo 2 kappakappa CD20CD20 CD19CD19

Tubo 3Tubo 3 lambdalambda CD20CD20 CD19CD19

Tubo 4Tubo 4 CD5CD5 CD23CD23 CD19CD19

Tubo 5Tubo 5 CD8CD8 CD4CD4 CD45CD45 CD3CD3

Tubo 6Tubo 6 CD13CD13 CD11bCD11b CD45CD45 CD34CD34

* Previo control sin anticuerpos

Panel complementario Linfoide B Panel complementario Linfoide B CD5+CD5+



Tubo 2Tubo 2 IgMIgM IgDIgD CD19CD19

Panel complementario Linfoide B CD5 -Panel complementario Linfoide B CD5 -


Tubo 1Tubo 1 CD11cCD11c CD20CD20 CD19CD19


Tubo 3Tubo 3 IgMIgM IgDIgD CD19CD19

SLPC : Pan B CD5 +SLPC : Pan B CD5 +

CD10CD10 CD23CD23 CD103CD103 Cy D1Cy D1 FMC7FMC7 CD43CD43 IgIg

CLLCLL -- ++ -- -- -- ++ kappa kappa -/+-/+

SLLSLL -- ++ -- -- -- ++ LambLamb -/+-/+

PLL*PLL* -- -- -- -- ++ -- IgMIgM

MCLMCL -- -- -- ++ ++ ++ lamblamb

LBLLBL -- -- -- -- -- -- ++

* CD5+ en 1/3 de casos

SLPC : Pan B CD5 -SLPC : Pan B CD5 -CD10CD10 CD23CD23 CD43CD43 CD11cCD11c CD30CD30 CD38CD38 IgIg CyD1CyD1 Bcl6Bcl6

LFLF ++ -- -/+-/+ -- -- -- +/-; +/-; -- --

LBLLBL ++ -- -- -- ++ -- ++ -- ++

MWMW -- -- +/-+/- -- -- + + ++ -- --

LEMLEM -- -- -- -- -- -- +; +; -- --

HCLHCL -- -- -- ++ -- -- +; +; -- --

MMMM -- -- -- ++ -- ++ +;+;// -- --

MALTMALT -- -- +/-+/- +/-+/- -- -- IgMIgM -- --

BuLBuL ++ -- -- -- -- -- +; +; -- ++

PLLPLL -- -- -- -- -- -- ++ -- --

Otros marcadores : HCL(CD25,CD103), LBL(bcl-2) MM(CD56, CD138) ,

LBL-variante anaplásica(IHQ: Cy ALK nuclear Anaplásico verdadero T)

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA08.002CD19 PCy5 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA08.002CD22 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA05.006Lambda FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA03.002CD22 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA03.002CD19 PCy5 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

LDSA03.006Lambda FITC ->

0 256 512 768 1024

LDSA03.004FSC-Height ->

B-CLPD: ABERRANT PHENOTYPES

Normal PB

B- CLPD PB

0 256 512 768 1024

LDSA02.006FSC-Height ->

B-cellsT-cells

T-cellsNormal B-cells

Leukemic B-cells

DESORDEN LINFOPROLIFERATIVO CRÓNICO - B

PB NORMAL

PB ANORMAL

CD45 ++ a +++ CD19 + CD20 + kappa + CD5 + CD23

neg a + IgD+

Negativas a : CD10 CD34 lambda CD38 IgM

DLPC-B : Leucemia Linfática Crónica/Linfoma de linfocitos

pequeños

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.002CD19 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.002CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.002CD10 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.003Anti-Kappa FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.004Anti-Lambda FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.005CD5 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.006CD8 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.009CD11c FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.010CD103 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14965.012Anti-Sm IgM FITC ->

CD45++ CD19+++ CD20+++ CD11c,++ CD25+ CD103+

Negativas: CD5, CD23, CD10, CD34, kappa, lambda, IgM, IgD .

Desorden Linfoproliferativo crónico B, Hairy Cell Leukemia

0 64 128 192 256


10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.002CD45 PerCP ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.002CD38 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.002CD19 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.002CD19 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.003CD38 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.004CD38 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.005CD38 FITC ->

CD38++ CD56+ CD28+ CD117++ CD138++ a ++

Negativas: CD45, CD19, Lambda, Kappa, Sm IgG, Sm IgA.

Desorden Linfoproliferativo Crónico, Neoplasia Maligna de Células Plasmáticas

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.009Anti-Kappa FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

14783.010Anti-Lambda FITC ->

DLPC-B BICLONAL O COMPUESTODLPC-B BICLONAL O COMPUESTO

LLC LLC // HCLHCL

Diagnóstico

typCLL

atypCLL

PLL

HCL

LPL

SMZL

FL

MCL

LCL

Total

Casos/total

12/353

4/29

0/5

3/13

0/12

1/14

0/22

1/19

2/10

23/477

% de casos

Incidencia de Biclonalidad del DLPCIncidencia de Biclonalidad del DLPC

(Sanchez et al, Blood, 2003)

3

14

0

23

0

7

0

5

20

4,8

Panel complementario Linfoide T/NKPanel complementario Linfoide T/NK




Tubo 3Tubo 3 CD5CD5 CD25CD25

Tubo 4Tubo 4 TCRTCRαβαβ TCRTCRγδγδ

CD30 : “Linfoma anaplásico” no por CF

CD45 ++ CD5 ++ CD4 ++ a +++ SmCD3 ++ CD25 + TCRαβ

+ a ++ CD2 neg a +

Negativas a: CD7 CD8 CD56 TCRγδ CD34 CD10

Desorden Linfoproliferativo Crónico de estirpe linfoide T,

probable ATL

10 10 10 10 100 1 2 3 4

003CD3 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

005Vb16 FITC Vb17 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

006Vb20 FITC Vb5.1 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

007Vb13.6 FITC Vb8 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

008Vb12 FITC Vb2 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

003Vb3 FITC Vb7 ->

Leucemias de células T: Clonalidad

Normal Leucémicas

10 10 10 10 100 1 2 3 4

PAF9989.001CD3 APC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

PAF9989.001CD8/Lambda FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

PAF9989.001CD4/CD19 PCy5 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


CD

56 /

sIg

kap

pa

- P

E

Tra

ns

form

ed

S

SC

CD8 / sIg lambda - FITCCD3 - APC

CD8 / sIg lambda - FITC

CD

4 /

CD

19 P

Cy5

CD4 / CD19 - PCy5

CD

3 -

AP

C

DETECCIDETECCIÓÓN RN RÁÁPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS PIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFEN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFÁÁTICOSTICOS

10 10 10 10 100 1 2 3 4

PAF9989.001CD4/CD19 PCy5 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

9663.001CD8/lambda FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

9663.001CD4/CD19 PERCP/CY5.5 ->

CD

56 /

sIg

kap

pa

- P

E

CD8 / sIg lambda - FITCCD4 / CD19 - PCy5

CD

3 -

AP

C

CD

56 /

sIg

kap

pa

- P

E

CD8 / sIg lambda - FITCCD4 / CD19 - PCy5

CD

3 -

AP

C

NORMAL

B-DLPC

DETECCIDETECCIÓÓN RN RÁÁPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS PIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFEN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFÁÁTICOSTICOS

Citometria de Flujo

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