Citometría de flujo multicolor para cuantificar...

Citometría de flujo multicolor para cuantificar EMR.

Dr. Elías Pérez Becerra Adscrito al departamento de Hematología y

responsable del área de Citometría de Flujo

En las últimas décadas, los avances en quimioterapia, radioterapia y en el trasplante de precursores hematopoyéticos han mejorado de forma considerable las posibilidades de supervivencia de los pacientes afectados de cáncer hematologico.

!Sin embargo, el riesgo de recurrencia continúa siendo,

en muchos casos, un obstáculo importante para su curación.

Introducción

Factores que influyen en la respuesta al tratamiento.

Relevancia clínica de la medición de EMR

La detección de enfermedad mínima residual (EMR) constituye un procedimiento de gran i n t e r é s c on o b j e to d e a d e c u a r l o s requerimientos terapéuticos y además en algunos casos tiene una clara trascendencia pronostica.

Relevancia clínica de la medición de EMR

EMR para evaluar pronostico

EMR en Leucemia linfoblastica en niños

EMR LLA-T VS LLA-B

EMR en Leucemia Mieloblastica Aguda

Impacto de la EMR en distintas fases del tratamiento.

!Brugiatelli M et al.

(Cancer 1989)

Robertson LE et al. (Blood 1992)

Leonormand B et al. (Leukemia 1994)

Cabezudo E et al. (Leukemia, 1997)

García-Vela A et al. (Leukemia, 1999)

Rawstron AC et al. (Blood 2001)

Maloum K et al. (Br J Haematol 2002)

Gupta R et al. (Am J Clin Pathol 2004)

Bottcher S et al. (Leukemia 2004)

Moreton P et al. (J Clin Oncol 2005)

Sensitivity

10-2 !

10-2 !

10-3 !

10-3 !

10-4 !

10-4 !

10-4 !

10-3

!10-4

!10-5

!

Aberrant criteria

sIgκ+/sIgλ+ ratio !

sIgκ+/sIgλ+ ratio !

CD19+/CD5+ !

CD19+/CD5+ !

CD19+/CD79b+d !

CD19+/CD20+d/CD5+/CD79b+d !


CD19+/CD5+ !

CD19+/CD5+/CD43+/CD20+d !


Prognostic value

Yes !

Yes !

Yes !

Yes !

Yes !

Yes !

Yes !

Not analyzed !

Not analyzed !

Yes !

Yes

Significancia clínica

Report Cases Aim Samples Time points (cut-off levels) Conclusion

Campana et al (Blood,1990)

28 Predict relapse

BM Positive vs negative Prognostic factor

Drach et al (Cytometry,1992)

8 Predict relapse

BM End of induction (0.5-4x10-2)

Prognostic factor

Griesinger et al (Blood,1997a)

48 Predict relapse

BM CR Prognostic factor

Ciudad et al. (J Clin Oncol,1998)

24 child 29 adult

Predict relapse

BM Sequential Prognostic factor

Coustan-Smith et al (Lancet,1998)

158 children

Predict relapse

BM End of induction/wk 6 (10-2) Continuation therapy/wk 14 (10-3), Wk

32 (10-4), Wk 56 (10-2)

Prognostic factor

Coustan-Smith et al (Blood,2000)

195 children

Predict relapse

BM End of induction/wk 6 (10-2) Continuation therapy/wk 14 (10-3), Wk

32 (10-4), Wk 56 (10-2)

Prognostic factor

Malec et al (Leukemia, 2001)

30 Predict relapse

BM End induction Prognostic factor

Coustan-Smith et al (Blood, 2002)

201 children

Predict relapse

PB End induction (10-4)

Prognostic factor

Vidriales et al (Blood, 2003)

Coustan-Smith et al (Blood, 2006)

102 adults 328

children

Predict relapse Predict relapse

BM !

BM

Day 14, end of induction (10-3- 10-4)

Day 19 (10-4)

Prognostic factor Prognostic factor

Significancia clínica

Métodos para la detección de EMR

Biología molecular

Campana&Coustan-Smith, Best Pract Res Clin Haematol, 2002

Detección por inmunoflourescencia EMR en un paciente con LLA-‐T

cCD3TdT

Celula LLA-T CD3+ TdT+

Linfocito T normal CD3+

Linfoblastos T normal TdT+

Métodos para la detección de EMR

Los métodos de estudio para detectar EMR deben cumplir requisitos previos para poder ser considerados útiles. Dichos requisitos incluyen una elevada sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y aplicabilidad de la técnica.

!Los procedimientos que actualmente cumplen

estos requisitos son la inmunofenotipificación por citometría de flujo y algunas técnicas de biología molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Métodos de biología molecular basados en PCR para valorar EMR

La PCR es una técnica molecular que permite amplificar secuencias específicas de ADN o ARN expresadas en las células tumorales.

!Con la RT-PCR, se puede analizar el ARN de transcripción expresado en

dichas células. Esto nos permite el estudio de los genes alterados por translocaciones primarias y de otros genes característicos asociados a determinados tipos de tumor.

!En la monitorización de la EMR es importante la cuantificación de ésta

mediante la PCR en tiempo real, de manera que la comparación de su nivel de amplificación con los estándares adecuados, proporciona una medida cuantitativa del grado de afectación.

!Posee una sensibilidad que se sitúa entre 1 x 104 y 1 x 105

Blancos moleculares para EMR

Citometría de flujo en la valoración de EMR

Tecnología utilizada para analizar y definir el perfil inmunofenotípico de las células neoplásicas y establecer así la presencia de IAL.

!Se basa en la utilización de anticuerpos monoclonales

específicos, dirigidos contra proteínas de membrana o intracitoplasmáticas, que llevan apareado un fluorocromo para su detección y visualización mediante un citometro de flujo

!Posee una sensibilidad superior a 1 x 104 (1 x 105)

* Increased through the usage of additional molecular markers (e.g.: WT1, NMP1 & FLT3 mutations

MRD. Applicability

FCM immunophenotyping PCR/RT-PCR analyses (sensitivity) (sensitivity) Disease category LAIP sIgκ/sIgλ Junctional Reg Chromosomal or TCRVβ Ig/TCR genes aberrations (10-3-10-4) (10-2-10-3) (10-3-10-6) (10-4-10-6) ! Precursor B-ALL Children >90% NA 95% 40-50% Adults >95% NA 90% 35-45% T-ALL Children >95% 30-35% >95% 10-25% Adults >95% ? 90% 5-10% ! Chronic B-cell leukemias >95% >95% >95% 10-25% Chronic T-cell leukemias 70-80% 60-65% 95% <5% B-cell lymphomas 90% >95% 70-80% 25-30% T-cell lymphomas 75-90% 50-60% 95% 10-15% Multiple myeloma >97% >97% 70-80% NT !

Citómetro de Flujo

Suspensión celular teñida

Laser

FSC

FL1

FL2

FL3

SSC

o

o

o

o

o

Fluído

Filtr

os

Fluo

rocr

omos

Programas •adquisición •análisis

PMT

Celda de flujo

Punto de interrogación

Sistema óptico Sistema electrónico Sistema de fluido líquido Sistema de computación

Fundamentos de la Citometría de Flujo

C

Emisiónmáxima

La emisión fluorescente cubre un rango amplio de longitudes de onda

Longitud de o

nda

mas la

rga con

menor e

nergía

Fluore

scenciaLongitud de onda

corta con alta

energía

Excitación

LáseresAzul

(488 nm) Rojo

(635nm)Violeta (405nm)

Ultravioleta Infrarojos

(Máxima exitación)

Espectro luminoso

bloquea

bloquea

bloqueabloquea

BP !!LP !!!SP !!D

FILTROS

Max Em 519 578 615 694 785 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5

525BP 575BP 620BP/30 695BP/30 755LP

488 nm

D

B

A

FILTROS

Absorcion de energia

Emisio

n de ener

gia

E

“Bright” = good resolution sensitivity

W2

W1

D

WD(SI)Index Stain =

Where D = difference between positive and negative peak medians, and W = 2 x rSD (robust standard deviation)

Holden Maecker, Ph.D.

Visión General de los Fluorocromos

Características Intrínsicas Coeficiente de Extinción El rendimiento cuántíco Solapamiento de la emisión

espectral

Optica del Instrumento Selección de filtros Sensibilidad de los PMT Potencia del Láser

Comparación de la intensidad de conjugados del anti-‐CD8

FITC PE ECD PC5 PECy5.5 PC7

APC Alexa 700 APCAlexa 700 APC-‐H7 APCAlexa 750

Pacific Blue

Excitación

Blue

Red

Violet

+Qdot NanocrystalsKrome Orange

Ag expresión altaAg expresión baja

(http://www.mcg.edu/cancer/shared/flow/fluorophores.html)

INDICE DE COLOR

Comparaciones de fluorocromos

Comparación de los conjugados anti-CD8 en diferentes instrumentos

Flurochrome Sensitivity Across Multiple Platforms

0

100

200

300

400

500

600

700

800

FC500 Gallios Inst X Inst Y

Sign

al to

Noi

se

FITCPEECDPECY5PECY5.5PECY7APCAlexa Fluor 700APCA700APCA750Pacific BluePacific Orange

Optima relación Señal/Ruido Saturación

!– Optima S/R para cada combinación

– Evaluación de interacciones

– Cuando sea posible, evaluar varias dosis • 2 variables – matriz simple • >2 variables – Utilizar matriz compleja

CD127-APC

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Dose (ug/test)

Fluo

resc

ence

nce

S/NPositive MFINegative MFI

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Dose (ug/test)

Fluo

resc

ence

nce

S/NPositive MFINegative MFI

CD x

2X 1x ½ x

CD y

2X 2,2 2,1 2, ½

1x 1,2 1,1 1,½

½ X ½, 2 ½, 1 ½, ½

Titulación de conjugados independientes

Combinación de matriz para finalizar dosis

Para ajustar la compensación es necesario considerar los diferentes reactivos de tándems como fluorocoromos diferentes

BCI OtroBCI

Otro

Sub

Sobre

Compensación

0

50

100

150

200

250

300

350

400

550 650 750 850

PECy7 ConjugadosMultiples Vendedores, Multiples Conjugados

Algunas consideraciones para obtener un resultados confiables

• Seleccion de Fluorocromos / Conjugados • Maximizar separacion espectral • PE / APC: Ag’s baja expresion y con expresion

continua • Colores en secuencia (“Tandem”):

Mediana-densidad → Antigenos brillantes

• Curvas de titulacion para cada conjugado • Determinar proporcion señal/ ruido • Escoger dosis optima

• Curva de area de saturacion • La mas alta S/N

• Siempre utilice controles: • Controles negativos:

• Poblacion negativa interna • FMO • Controles de isotipo • Control de autofluorescencia

Estrategia Optimización

Verificación

• Controles positivos: • Cada color independiente en un tubo • Muestra positiva conocida

• Evaluar las interferencias mayores • Interferencias • Uniones no especificas

Análisis de los resultados

Instrumento

Las cuatro reglas de los antígenosCD en cuanto a su utilidad para tipificar neoplasiashematológicas:

1. No existe un solo antígeno CD que sea específico de una enfermedad.

!2. Todos los antígenos CD que se emplean para

definir l inaje y estadío de las neoplasias hematológicas se expresan también en células normales.


3. Las neoplasias hematológicas se distinguen de las célulasnormales solamente por aberraciones en la expresión de antígenos por lo demás normales.

Cuantitativas. Infidelidad o promiscuidad de linaje. Cronológicas. Anatómicas. Numéricas.


4. En algunas ocasiones las células neoplásicas no presentan aberraciones en la expresión de los antígenos CD que permitan distinguirlas de las células normales.

ANÁLISIS CELULAR MUTIPARAMÉTRICO

Conocer la hematopoyesis normal. Reconocer cambios anormales. Contar con la instrumentación necesaria. Utilizar reactivos de excelente calidad. Utilizar técnicas adecuadas para el proceso de la

muestra. Interpretar los resultados en el contexto de la

enfermedad.

El análisis multiparamétrico consiste en evaluar múltiples parámetros en todos los ángulos posibles

IDENTIFICACION DE POBLACIONES CELULARES

NORMALES: ❖ Valorando los patrones de diferenciación y maduración celular.

!!ANORMALES:

❖ > < Expresión antigénica. ❖ Asincronismo en la expresión de antígenos de maduración. ❖ Infidelidad de linaje celular. ❖ Expresión de antigenos producto de mutaciones moleculares.

Como identificamos

Reconoces las diferencias

Citometría de flujo multiparamétricaComprender la biología.

❖ Reconocer las distintas poblaciones celulares. ❖ Ontogenia de los antígenos de diferenciación leucocitaria.

Comprender la metodología. ❖ Clonas de anticuerpos monoclonales.

• Calidad. Titulación. ❖ Plataformas de los equipos.

• Láseres, PMTs, Filtros • Estandarización.

❖ Opciones de flourocromos • Características intrínsecas. • Tecnología de tandem. • Compensación.

Manejar la tecnologia. ❖ Diseño de protocolos de análisis. ❖ Software.

Conocer la patologia. ❖ Selección de los paneles de AcMo.

Hematopoyesis Normal

Hematopoyesis Normal

LEUCEMIAS AGUDAS MIELOIDES LEUCEMIAS AGUDAS LINFOIDES

Maturing

Neutrophils Eosinophils

Monocytic cells

Mature Lymphocytes

CD34+ B-‐cell precursors

HPC

NRBC

UNGATED EVENTS

Basophils pDC

!!CD34-‐ B-‐cell precursors CD45-PerCP

Tra

nsfo

rme

d S

SC

Normal bone marrow: multilineage differentiation

CANCER RESEARCH CENTER

Monocytic-‐ DC

Modified from Matarraz S et al. Clin Cytometry 2010

Maturing

Neutrophils Eosinophils

Monocytic cells

Mature Lymphocytes

CD34+ B-‐cell precursors

HPC

NRBC

UNGATED EVENTS

Basophils pDC

!!CD34-‐ B-‐cell precursors CD45-PerCP

Tra

nsfo

rme

d S

SC

Normal bone marrow: multilineage differentiation

CANCER RESEARCH CENTER

Monocytic-‐ DC


LMA LLA B LLA T

Phenotypic patterns of neutrophil maturation

Mieloblasto

Promielócito/

MielócitoMetamielócito

Neutrófilo Banda/

segmentado

CD11b

CD

13

Phenotypic patterns of neutrophil maturation

Identificación de células hematopoyéticas en maduración

ESTADIO I

ESTADIO II

ESTADIO III

ESTADIO IV

Línea de granulocito neutrófilo

Monocitos

Precursores Monociticos

Serie eritroide

Líneas monocítica y eritroide

Granulocito basófilo

CDp

Granulocito basófilo y CD plasmocitoideLínea linfoide B

CD19+

CyCD79a+


MONOCYTIC LINEAGE

Monoblast. Irregular shaped nuclei

Visible nucleoli

Basophil cytoplasm. N/C lower than myeloblast

Non-specific sterese stain for identification

cMPO+d/+/+d HLADR+/++ CD45+d/+ CD117+/- CD33+d/++ CD64+d/++ CD13+/-/+ CD11b-/+ CD15-/+++/+ CD16- CD10- CD66c CD300e

CD14

SERIE ERITROIDEMieloblasto

Eritrocito

Proeritroblasto Eritroblasto basófilo

Eritroblasto policromático

Eritroblasto ortocromático

Reticulocito

Multipotent hematopoietic precursor (“Stem cell”)

Common myeloid precursor

Megakaryoblast

Promegakaryocyte

Megakaryocyte

Platelets

cMPO- HLADR+/- CD45+d/- CD117+/- CD105+d/+/- CD71+dim/- CD36-/+++ CD33+d/- CD13+d/- CD11b- CD61-/++ CD41-/++ CD42a-/++

MEGAKARYOCYTIC LINEAGE

PRECURSORES NORMALES DE CELULAS B EN MO

CD34

TdT

CD38

CD45

CD10

CD19CD22 CD20

Pro-‐B Pre-‐B B-‐Tempranos B-‐Tardíos

Análisis del IAL para valorar EMR

Interpretar los cambios antigénicos de las poblaciones celulares en el contexto: ❖Población celular de estudio.

• Contar AcMo. Que la identifiquen. • Considerar la infidelidad de línea.

❖ Intensidad de la expresión antigénica. • Estadio de maduración • Expresión coordinada de antígenos.

❖ Intensidad de la expresión antigénica de otras poblaciones celulares

• Control interno de calidad de los reactivos. • Referencia interna.

DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL LEUKEMIA Dario Campana and Elaine Coustan-‐Smith

Importancia de la selección de marcadores a utilizar.

FCM: 8 Color staining protocol

PANELES PARA LA BUSQUEDA DE INMUNOFENOTIPOS ASOSIADOS A LEUCEMIAS

LINAGEMARCADORES UTILIZADOS USANDO 8 FLOUROCROMOS

FITC PE ECD PC5 PC7 APC APC-‐AF700 APC-‐AF750

LINFOIDE BCD10 CD49f CD45 CD34 CD15 CD58 CD19 CD20

CD10 7.1 (NG1) CD45 CD2 CD33 CD13 CD19 CD7

LINFOIDE TTdT CD7 CD45 CD4 cCD3 CD2 CD8 CD3

CD10 CD34 CD45 CD2 CD33 CD13 CD19 CD7

MIELOIDE

CD10 CD33 CD45 CD34 HLA-‐DR CD13 CD19 CD20

CD15 7.1 (NG1) CD45 CD34 CD33 CD13 CD56 CD117

CD15 CD2 CD45 CD34 CD33 CD13 CD7 CD11b

CD38

CD34

CD38

CD34

CD34

CD34

CD45

CD45

Normal MO

LLA-B

INMUNOFENOTIPO CELULAS B NORMAL VS LLA-B

INMUNOFENOTIPO DE CELULAS T NORMAL VS LLA-T

CD4 CD2 CD5

CD5 CD2 CD4

CD8

CD3

CD3

CD8

CD3

CD3

Diferencias inmunofenotipicas de los blastos en distintos pacientes con leucemia aguda.


Análisis del inmunofenotipo para identificar EMR

DIAGNOSTICO

MEDULA OSEA NORMAL

DIAGNOSTICO


DIAGNOSTICO

MEDULA OSEA NORMAL



Valoración EMR en pacientes con LLA

Valoración EMR durante las distintas etapas del tratamiento LLA-B


Valoración EMR durante las distintas etapas del tratamiento LMA

Importancia de la medicion de EMR en mieloma multiple

Inmunofenotipo de las células B

Valoración EMR en mieloma múltiple

Células plasmáticas. Mieloma múltiple vs normales

Expresión antigénica en mieloma múltiple

Diferencias en la expresión de antígenos de superficie durante el tratamiento

Cambios inmunofenotipicos en la población leucémica durante el tratamiento.

Histogramas analizados para valorar la presencia de EMR

10 COLO

RES

Podemos ver la complejidad al analizar solamente 3 marcadores y 1 dotplot en tres pacientes con LLA-‐B

Selección en células CD19+

N-DIMENSIONAL NEUTROPHIL MATURATION IN NORMAL BM VS AML

CD15 26.6CD117 19.4SSC 19.2FSC 19.0CD11b 6.0

Maturation stage of AML blasts

Aberrant phenotype of AML blasts

Aberrant markers

Sensibilidad

FMC7

CD5

CD23

CD22

Sensibilidad

Enfermedad mínima residual en LLASangre periférica vs Medula ósea


Enfermedad mínima residual en LLA-‐TSangre periférica vs Medula ósea


Solicitud de EMR

Demograficos completos del paciente. Tipo de muestra. Fecha y hora de la toma de muestra. Diagnostico. (Clínico) Inmunofenotipo al diagnostico.

DEPARTAMENTO DE HEMATOLOGIA

GRACIAS

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