1

2DIRECTORIO INSTITUCIONALSECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA DESARROLLO RURAL PESCA Y

ALIMENTACIN

Lic. Enrique Martnez MartnezSecretario

Lic. Jess Alberto Aguilar PadillaSubsecretario de Agricultura

Prof. Arturo Osorio SnchezSubsecretario de Desarrollo Rural

Lic. Ricardo Aguilar CastilloSubsecretario de Alimentacin y Competitividad

Lic. Marcos Augusto Bucio MjicaOficial Mayor

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRCOLAS Y PECUARIAS

Dr. Pedro Brajcich GallegosDirector General

Dr. Salvador Fernndez RiveraCoordinador de Investigacin, Innovacin y Vinculacin

M. Sc. Arturo Cruz VzquezCoordinador de Planeacin y Desarrollo

Lic. Marcial A. Garca MorteoCoordinador de Administracin y Sistemas

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIN DISCIPLINARIA EN CONSERVACIN Y MEJORAMIENTO DE ECOSISTEMAS FORESTALES

Dr. Fabin Islas GutirrezDirector

1Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba (Swietenia macrophylla King)

a partir de explantes vegetativos

2CRDITOS EDITORIALES

Edicin Tcnica:Dr. Alejandro Ponce MendozaM.C. Claudia Mndez Espinoza

Edicin:Dra. Mara Cecilia del Carmen Nieto de Pascual Pola

Cuidado de la Edicin: M. C. Marisela C. Zamora-Martnez

DiseoSilvia Onodera Hamano

Fotografa:Pas. Bil. Luis Barba-EscotoMVZ. Jess Prez SantacruzDra. Ana Wegier Briuolo

La cita correcta es:

Wegier, A., L. Barba-Escoto, F. Garca-Campusano, J. Prez S. y A. Flores G. 2013. Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba (Swietenia macrophylla King) a partir de explantes vegetativos. Manual Tcnico Nm. 10 . CENID-COMEF, INIFAP. Mxico, D.F. Mxico. 84 p.

No se permitir la reproduccin total o parcial de esta obra, ni la transmisin de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, fotocopia, por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito a la Institucin.

Derechos Reservados 2013Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y PecuariasProgreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, delegacin Coyoacn. 04010. Mxico D.F. Telfono (55) 3626 8700 ext. 608Primera edicin 20131 000 ejemplares

Impreso en: Graphx, S.A. de C.V. Tacuba 40, Desp. 205. colonia Centro, Mxico, D.F. 06010 La edicin se termin de imprimir en julio de 2013

ISBN 978-607-37-0052-8

3Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba(Swietenia macrophylla King)

a partir de explantes vegetativos

Dra. Ana Laura Wegier BriuoloInvestigadora Titular. Programa de Biotecnologa. CENID-COMEF, INIFAP

Pas. Bil. Luis Barba EscotoTcnico externo del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del

CENID-COMEF, INIFAP

Dra. Florencia Tiberia Aucn Garca CampusanoInvestigadora Titular. Programa de Biotecnologa

CENID COMEF, INIFAP

M.V.Z. Jess Prez SantacruzAuxiliar del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del CENID COMEF, INIFAP

M. C. Andrs Flores GarcaInvestigador Titular Programa de Plantaciones y Sistemas Agroforestales,

CENID-COMEF, INIFAP

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias

Centro Nacional de Investigacin Disciplinaria

en Conservacin y Mejoramiento de Ecosistemas Forestales

Distrito Federal, Mxico julio 2013.

4AGRADECIMIENTOS

Los autores desean hacer patente su agradecimiento al Fondo CONAFOR-CONACYT por el financiamiento otorgado mediante el Proyecto Generacin de lneas celulares de Swietenia macrophylla King resistentes al barrenador de las meliceas (Hypsipyla grandella Zeller) mediante la integracin del gen Bt (Nm. 148409) para llevar a cabo este manual, as como a la comunidad del CENID COMEF por las facilidades otorgadas.

Igualmente, a diversas personas que con su importantes aportaciones, contribuyeron a lograr este objetivo.

Al M. en C. Xavier Garca Cuevas, Investigador Titular del Programa de Plantaciones Forestales y Sistemas Agroforestales del Campo Experimental Chetumal. CIR-Sureste y al personal del Vivero Forestal La Unidad (Localidad Tolom, Km 1 Col. Los Amigos, Municipio Paso de Ovejas, Veracruz) por haber proporcionado el material vegetal para la realizacin del proyecto.

Al personal del rea de Adquisiciones del CENID-COMEF y en particular a Nancy Corona y a Abigail Coln lvarez por su ayuda en diversas gestiones.

Al Sr. Joel Reyna Flores, Tcnico adscrito al Laboratorio de Biotecnologa Forestal del CENID COMEF, por su apoyo en la operacin de varios procedimientos y a la Pas. de Bil. Alejandra Cervantes por haber desempeado distintas actividades para efectos de su Servicio Social.

Al Dr. Alejandro Ponce Mendoza y a la M. en C. Claudia Mndez Espinoza, investigadores del CENID-COMEF, por sus comentarios para enriquecer el contenido del manual.

Este manual fue validado por personas con diferente experiencia en el cultivo de tejidos, desde los que trabajan en laboratorio con la tcnica en otras especies, los que trabajan en laboratorio en otras reas y los que an no haban trabajado en un laboratorio. A todos ellos queremos expresar nuestro agradecimiento para que esta obra resulte beneficiosa para el usuario.

5CONTENIDO

Pgina

INTRODUCCIN 71. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE 9Clasificacin taxonmica 9Nombre comn 9Descripcin botnica 9Aspectos fenolgicos, fisiolgicos y genticos 10Distribucin natural y datos ecolgicos 12Usos 14Datos de vivero, cultivo y produccin 142. EL CULTIVO in vitro COMO UNA ALTERNATIVA PARA LA SILVICULTURA

16

Generalidades del cultivo in vitro 16Cultivo in vitro de la caoba 213. MATERIAL Y MTODOS 23rea de cultivo 24Desinfeccin del rea de siembra 29Desinfeccin del material para sembrar 33Tres vas para el establecimiento in vitro de caoba 33- Germinacin in vitro 34- Proliferacin de yemas axilares 37- Formacin de callo 62CONSIDERACIONES FINALES 66BIBLIOGRAFA 67ANEXOS 71

6

7INTRODUCCIN

La caoba (Swietenia macrophylla King) es una de las especies maderables de las zonas tropicales con mayor importancia econmica. Sin embargo, el aumento de la tasa de deforestacin, el sobre aprovechamiento de sus poblaciones naturales y la tala de los mejores individuos para uso comercial han afectado la diversidad gentica de las poblaciones (Gillies, 1999; Novick et al., 2003; Lemes, 2000; Lemes et al., 2003; Basil, 2007). Con el propsito de regular el comercio ilegal de la especie, fue incluida en el listado del Apndice II del CITES (Convencin sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres, por sus siglas en Ingls) en 2002; esta medida contribuye a mantener un comercio legal y sostenible de sus existencias (CITES, 2003). Para restaurar las poblaciones silvestres es necesario disear estrategias para promover su conservacin y regeneracin en toda la distribucin de la especie in situ (Patio, 1998), aunado a sistemas de propagacin y manejo ex situ, como lo son las plantaciones artificiales y los bancos de germoplasma.

Una alternativa para la regeneracin de la caoba es el cultivo in vitro, ya sea para fines de conservacin, o como parte de los planes de aprovechamiento. El cultivo in vitro es una herramienta biotecnolgica orientada a la propagacin clonal de plantas (Bonga y von Aderkas, 1992; George, 1993) y que se ha explorado ampliamente durante las dos ltimas dcadas. Es un recurso socorrido en los bancos de germoplasma que requieren resguardar especies con semillas recalcitrantes; asimismo, es indispensable para realizar mejoramiento gentico, ya que permite probar el potencial de un mismo individuo en diferentes condiciones y con validez estadstica porque se pueden producir muchos clones de un rbol seleccionado (Thorpe et al., 1991).Con base en todo lo anterior, el objetivo

8de este manual consisti en presentar de una manera clara y sencilla tres protocolos para el cultivo in vitro de la caoba (Swietenia macrophylla), a partir de diferentes tejidos, con el fin de obtener la formacin de brotes adventicios y callos.

Aqu se describe el uso de tcnicas de cultivo in vitro encaminadas al establecimiento masivo de la caoba (Swietenia macrophylla). Se destacan aspectos fundamentales sobre cmo organizar un laboratorio; se hacen recomendaciones para tener un rea de trabajo asptico; para seleccionar y desinfectar el material vegetal que se utilizar como explante, as como las especificaciones nutrimentales (medios de cultivo) y ambientales necesarias. Se ofrece adems, una gua rpida para llevar a cabo distintos protocolos de regeneracin, lo que supone la secuencia temporal de pasos necesarios para lograr con xito el establecimiento in vitro.

91. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE

Clasificacin taxonmica

La especie Swietenia macrophylla fue descrita por George King en 1886 (King, 1886). Con base en los registros del Missouri Botanical Garden (tropicos.org; theplantlist.org), la clasificacin taxonmica aceptada ms reciente es:

clase: Equisetopsida

subclase: Magnoliidae

superorden:Rosanae

orden: Sapindales

familia: Meliaceae

gnero: Swietenia

especie: Swietenia macrophylla King

Nombre comn

Conocida comnmente como caoba en pases de habla hispana, tanto en Amrica como en Europa (Pennington y Sarukhn, 2005).

Descripcin botnica

La caoba es una especie caducifolia, que mide de 35 a 50 m de altura (en ocasiones hasta 70 m), con floracin anual y con dimetro a la altura de pecho que vara entre 1 y 1.8 m (pero puede incluso llegar hasta 3.5 m). Los rboles tienen un fuste recto de hasta 25 m, aunque es ligeramente acanalado, con contrafuertes en la parte basal de hasta 2 a 3 m de altura.

10

La copa del rbol es abierta y redondeada con forma de sombrilla. Presenta pocas ramas gruesas en la parte baja (ascendentes) y torcidas que se localizan por arriba de los 25 m. Las hojas alternas son grandes y paripinnadas o a veces imparipinadas, de 12 a 40 cm de largo; sus foliolos, lanceolados u ovados, son de 3 a 5 pares, muy asimtricos. La corteza externa es profunda y ampliamente fisurada con costillas escamosas (piezas alargadas), de color pardo griscea a moreno griscea; el color interno de la corteza es de rosa a rojo, de consistencia fibrosa; su sabor es amargo y astringente. El grosor de ambas cortezas es de 10 a 25 mm. Las flores son pequeas, actinomorfas, de 6 a 8 mm de dimetro, verde- amarillentas, agrupadas en panculas axilares y subterminales, de hasta 15 cm de largo. La especie rene flores de ambos sexos en un mismo individuo, generalmente las flores masculinas son ms abundantes que las femeninas, y ambas son dulcemente perfumadas; el cliz tiene forma de copa, la corola tiene 5 ptalos ovales y cncavos. El fruto es una cpsula leosa, ovoide u oblonga con forma de cabeza de zopilote, comnmente de 6 a 25 cm de largo y 2 a 12 cm de dimetro, de color pardo grisceo; es liso, con 4 y 5 valvas leosas de 6 a 8 mm de grosor; cada cpsula contiene de 45 a 70 semillas aladas y livianas, de 7.5 a 10.0 mm de largo por 2.0 a 3.0 mm de ancho, de color canela o caf-rojizo; su sabor es amargo y estn provistas de una prolongacin en forma de ala de 6 a 7 cm de largo (Pennington y Sarukhn, 2005).

Aspectos fenolgicos, fisiolgicos y genticos

En Mxico, la caoba florece de julio a agosto y fructifica de noviembre a enero. La fructificacin ocurre a los 15 aos y algunas veces antes; es entonces cuando un rbol puede llegar a producir 250 frutos, aunque esta cantidad aumenta a medida que los individuos maduran. Los aos de fructificacin son frecuentes y la polinizacin es entomfila. Los rboles son

11

caducifolios en las zonas ms secas de su rea de distribucin; toleran suelos con deficiencias nutrimentales, pero el crecimiento es lento en suelos intensamente cultivados y con materia orgnica degradada (CONABIO, 2012).

La semilla de la caoba tiene un comportamiento recalcitrante cuando es almacenada (Gmez et al., 2006). Es decir, que a diferencia de las semillas ortodoxas, que desarrollan altos niveles de desecacin y alguna forma de latencia, este tipo de semillas no experimentan deshidratacin en la planta madre, por lo que conservan una importante actividad metablica al ser liberadas, y pasan directamente a la germinacin (Navarro et al., 1996; Magnitskiy y Plaza, 2007). Debido a que la viabilidad de estas semillas decae pronto si no entran en contacto con las condiciones adecuadas para germinar, su preservacin a largo plazo (por ejemplo en bancos de germoplasma) es prcticamente imposible, e implica la necesidad de contar con un ambiente muy especial para su mantenimiento.

El gnero Swietenia incluye a tres especies: S. macrophylla King, S. mahagoni Jacq. y S. humilis Zucc. Los nmeros cromosmicos para las tres especies son 2N = 48 (S. mahagoni), 2N = 54 (S. macrophylla) y 2N = 56 (S. humilis). Aparentemente existe suficiente variabilidad en la caoba para poder efectuar programas de mejoramiento con base en seleccin de individuos y cruzamientos. Se ha determinado que hay variacin fenotpica en el peso especfico de la madera entre rboles de una misma plantacin y diferencia significativa entre fuentes geogrficas y ecolgicas (Bauer y Francis, 1998).

Swietenia macrophylla muestra una gran diferenciacin gentica entre las poblaciones Mesoamericanas en contraste con la evidente similitud de las del Amazonas. Esto indica que ha tenido una historia muy compleja y guardan cierto grado de aislamiento entre ellas (Novick et al., 2003).

12

La tala de esta especie en Mesoamrica ha tenido un efecto negativo sobre su diversidad. En sus zonas de distribucin natural se ha sealado una reduccin significativa de diversidad gentica en poblaciones que han sido constantemente aprovechadas, en contraste con poblaciones que han sufrido poco disturbio. Los trabajos en general sobre diversidad gentica de la especie describen una alta estructuracin, con mayor diversidad intrapoblacional que interpoblacional (Gillies, 1999, Novick et al., 2003; Lemes, 2000; Lemes et al., 2003 y Basil, 2007), al parecer ocasionado por la baja dispersin de los polinizadores y la fragmentacin de las poblaciones (Gillies, 1999).

Un estudio realizado en Centroamrica (Navarro et al., 1996) determin que los patrones de variacin estn asociados fuertemente con las condiciones ecolgicas en las cuales las poblaciones evolucionaron; se encontr gran variacin morfolgica entre poblaciones de reas inundables y de zonas de laderas. Estas diferencias entre procedencias requieren de mayor estudio as como otros aspectos de inters: diferencias en crecimiento y rendimiento y resistencia al ataque del barrenador de las meliceas (Hypsipyla grandella Zeller).

Distribucin natural y datos ecolgicos

Swietenia macrophylla es una especie originaria de Amrica. Se distribuye desde el sur de Mxico y la vertiente del Atlntico en Amrica Central, desde Belice, Honduras, Guatemala, Nicaragua, Costa Rica y Panam. En Amrica del Sur, es nativa de Venezuela, Colombia, Ecuador y hasta el Valle del Amazonas de Brasil, Per y Bolivia (Pennington y Sarukhn, 2005; Aguilar et al., 1992). En Mxico, en los estados de Oaxaca, Veracruz, Tabasco y en la Pennsula de Yucatn.

13

Forma parte del bosque tropical y subtropical y se desarrolla en altitudes de 50-500 m pero puede llegar hasta los 1,400; las temperaturas varan de 22-28C (con extremas de 11 a 37C); en climas secos, hmedos o muy hmedos; precipitaciones entre 1,000 y 2,500 mm. Tolera estaciones secas. Se establece en una gran variedad de suelos, de arcillosos a arenosos, pero prefiere suelos aluviales profundos, bien drenados y frtiles, de alcalinos a neutros, aunque tambin puede crecer en suelos cidos con pH de hasta 4.5. La especie es medianamente helifila y se regenera en campos abandonados an bajo sombra. Se presenta aislada o en grupos, pero rara vez se les encuentra en densidades mayores de 4 a 8 rboles/ha (Barrance et al., 2003; CONABIO, 2012).

Swietenia macrophylla se asocia con otras especies arbreas de gneros como Quercus sp., Manilkara sp., Vitex sp., Swietenia sp., Metopium sp., Bursera sp., Pseudobombax sp., Calophyllum sp., Licania sp., Aspidosperma sp., Lysiloma sp., Guettarda sp., Alseis sp., Esenbeckia sp., Lonchocarpus sp., Terminalia sp. y Dialium sp. (CONABIO, 2012).

Uno de los grandes problemas a los que se enfrentan las plantaciones de caoba es al ataque de Hypsipyla grandella (Zeller, 1848), el Barrenador de las Meliceas; es un lepidptero que se ha convertido en una plaga que ocasiona graves problemas en el trpico. En la caoba, la larva causa daos severos porque destruye el meristemo apical, barrena las puntas y hace tneles en los tallos jvenes (Griffiths, 2001). Las plantaciones afectadas por este insecto producen numerosas ramas laterales y rboles mal formados, lo que propicia baja produccin de madera y prdidas econmicas. No obstante, a pesar de que se han realizado investigaciones con el objetivo de mejorar mtodos que disminuyan el efecto de los ataques (Briceo-Vergara, 1997; Snchez-Soto et al., 2009), no se han obtenido resultados alentadores. Algunos autores han sugerido que una solucin

14

es la bsqueda y seleccin de individuos resistentes al barrenador para la proliferacin de estos por medios como la domesticacin (Wightman et al., 2005). Sin embargo, es necesario desarrollar estudios sobre mejoramiento gentico de las poblaciones, as como mtodos para propagar dichos individuos por medios vegetativos (Newton et al., 1994), como los que se describen en este manual.

Usos

En la actualidad, la caoba se cultiva en plantaciones con fines maderables, ya que se utiliza para la elaboracin de muebles y ebanistera fina de interior y exterior as como molduras, ventanas y puertas adems de chapas decorativas. Debido a la facilidad para trabajarla y su alta resistencia a la flexin esttica y a la compresin, es apta para otros usos tales como: construccin ligera, embarcaciones, instrumentos musicales y cientficos y maquetas. Con menor frecuencia se le incorpora como ingrediente en la elaboracin de medicinas, tintes y para cosmticos; as como rbol en huertos familiares (Yucatn) o para dar sombra en cafetales (CONAFOR, 2012; CONABIO, 2012).

Datos de vivero, cultivo y produccin

Es una especie de crecimiento moderadamente rpido (en el primer ao alcanza 1.8 m de altura) con caractersticas favorables para plantaciones, que puede producir madera de aserro en turnos de rotacin de 30 a 40 aos (Cordero, 2003). Se estima que en esta forma de cultivo, los intervalos de crecimiento en dimetro y altura son de 1.2-1.4 cm y 1-2 m por ao, respectivamente. En bosques naturales los rboles requieren de 60 a 100 aos para alcanzar un tamao comercial, mientras que en plantaciones entre 30 y 50 aos (Barrance, 2003).

15

La propagacin se hace por semilla, la cual se recolecta durante enero y febrero. Un kilogramo puede contener de 1,800 a 1,950 unidades, con un 87% de germinacin aproximadamente, aunque se deben sembrar dentro de los primeros cinco das despus de haberla obtenido, ya que su viabilidad se pierde con rapidez (Santiago et al., 2007). Como tratamiento pregerminativo, se corta la mitad del ala y se remoja en agua durante 24 horas; despus se coloca directamente en el sustrato (2 a 5 cm de profundidad) con el ala hacia arriba. El sustrato puede estar compuesto de una mezcla en proporcin 3:7 de cachaza de caa composteada y el cascabillo producto del despulpado en seco del caf. Se debe proporcionar sombreado durante los 25 das posteriores a la siembra. Se recomienda llevar un programa de control de plagas y enfermedades, aunque el control de la humedad y la sombra pueden prevenir la incidencia de las ltimas. El tiempo de produccin en vivero es de cuatro meses y medio (Santiago et al., 2007).

Para su conservacin, se han establecido plantaciones para recuperar el nivel de produccin que la industria forestal tena hace algunas dcadas y disminuir la presin sobre las reas naturales. La caoba se transplanta al campo cuando el ejemplar cultivado ha alcanzado una altura de 20 a 25 cm (6 a 8 meses). La distancia de plantacin es de 3 x 3 m; cuando se siembra con cultivos agrcolas perenes o anuales se recomiendan distancias de 15 x 15 m. Es conveniente que cada individuo est bajo sombra lateral de otros rboles durante los primeros tres aos para no recibir radiacin solar directa. Se pueden aplicar podas sanitarios ante el ataque del barrenador de las meliceas que consiste en eliminar el brote daado y tres meses despus, cuando ya haya un brote dominante, remover los otros brotes para evitar bifurcaciones. Los primeros aclareos se deben realizar entre los 6 y los 10 aos, hasta llegar a una densidad de 120-150 rboles/ha (Barrance et al., 2003).

16

Como la caoba es helifila, es decir que necesita de grandes cantidades de luz para desarrollarse en estado natural, es una especie pionera de claros que se producen por la cada de rboles o incendios en el piso de las selvas. Dicha caracterstica ha sido aprovechada como la principal tcnica silvcola por los productores ya que as pueden obtener mayor cantidad de individuos por hectrea. Sin embargo, el uso excesivo de sta tcnica puede actuar en detrimento del ecosistema y por lo tanto de la produccin misma (Snook et al., 2003 y Snook et al., 2005).

En cuanto a su comercializacin, la caoba est considerada dentro del grupo de especies tropicales preciosas de mayor aprovechamiento en Mxico. La SEMARNAT (2010) reporta que este grupo aporta 51,460 m3 de madera aprovechable con un valor total de $136,455,006.00. Los estados que contribuyen ms a este respecto son Veracruz (36.67 %), Quintana Roo (23.08 %) y Chiapas (16.38 %).

2. EL CULTIVO IN VITRO COMO UNA ALTERNATIVA PARA LA SILVICULTURA

Generalidades del cultivo in vitro

En este manual se describen tres protocolos que permiten el establecimiento de un sistema in vitro (en vidrio) para establecer y mantener explantes libres de contaminacin. Estos mtodos representan sistemas de cultivo artificiales, que se realizan en condiciones de asepsia, en los cuales se busca controlar la mayor cantidad de variables, tanto del ambiente fsico (luz, temperatura, fotoperiodo), qumico (nutrientes minerales y orgnicos, hormonas), como biolgico (presencia de patgenos o simbiontes), a las que estarn expuestas las plantas para optimizar su desarrollo.

17

El cultivo in vitro aprovecha el principio de la totipotencialidad celular, el cual plantea que todas las clulas tienen la capacidad de regenerar a un individuo completo (o a partes de l), si se les proporcionan las condiciones apropiadas, ya que contienen toda la informacin gentica necesaria para ello (Bonga y von Aderkas, 1992). La propagacin de plantas por este sistema se conoce tambin como propagacin clonal, ya que se obtiene la regeneracin de un nmero indeterminado de plantas genticamente idnticas a partir de una porcin muy pequea de la planta madre o individuo (embrin). A cualquier parte de la planta (hoja, tallo, pice, raz, etc.) que se tome para este tipo cultivos se le conoce como explante (George, 1993).

Esta alternativa biotecnolgica para la propagacin de plantas es ampliamente utilizada a nivel mundial, para especies de inters agrcola, ornamental y silvcola. De acuerdo a Thorpe et al. (1991), ofrece ventajas importantes sobre los mtodos tradicionales (Cuadro1), tales como:

(1) Propagar especies que por su edad no pueden reproducirse o no responden a las tcnicas tradicionales;

(2) La multiplicacin de genotipos seleccionados, as como de plantas exticas o en peligro de extincin, en un perodo relativamente corto;

(3) Se puede utilizar como base del mejoramiento gentico de las especies, ya que permite seleccionar y propagar individuos resistentes a patgenos o a condiciones ambientales adversas;

(4) Es posible obtener, mantener y propagar masivamente plantas libres de patgenos;

(5) La produccin ocurre independientemente de la estacin del ao y del ciclo de vida de la planta, adems de que acorta los ciclos

18

productivos, lo cual es muy deseable para especies de vida larga, como muchas especies forestales.

La aplicacin del cultivo in vitro como herramienta es muy poderosa para la propagacin de especies con genotipos selectos o para su conservacin, y constituye la base de la mayora de los estudios actuales acerca del mejoramiento gentico. Sin embargo, hay varios aspectos que merecen consideracin antes de plantear su uso para una planta en particular, principalmente debido a que el costo durante las fases iniciales de estandarizacin es ms alto que a travs del uso de tcnicas convencionales; por ello, antes de empezar, siempre es conveniente hacer una evaluacin costo-beneficio para establecer la viabilidad y rentabilidad de su implementacin (Bonga y von Aderkas, 1992) (Cuadro 1).

Cuadro 1.Ventajas y desventajas del cultivo in vitro.

Ventajas Desventajas

Propagacin de individuos que no han alcanzado la madurez sexual.

Tcnica sensible a contaminacin por hongos y bacterias.

Propagacin clonal de genotipos seleccionados.

Necesidad de acceso a instrumental e infraestructura especializada

Propagacin de especies exticas o en peligro de extincin, en tiempos relativamente cortos

Capacitacin para aprender las tcnicas in vitro.

contina Cuadro 1...

19

Constituye la base del mejoramiento gentico, a travs de propagar individuos resistentes a patgenos o condiciones adversas.

Necesidad del desarrollo emprico de las tcnicas y protocolos que se van a utilizar para cada especie o tejido.

Obtencin y propagacin de individuos libres de patgenos.

Propensin del tejido a oxidacin y crecimiento anmalo.

Reduce el tiempo de generacin lo que es posible aplicar a especies forestales.

Existencia de prdidas durante los trasplantes.

Debido a las condiciones controladas de laboratorio la produccin no depende de la poca del ao.

Necesidad de hacer una evaluacin del costo beneficio de las tcnicas que se van a utilizar.

Se han descrito cuatro aplicaciones de estas tcnicas para la propagacin de plantas (Kirakayosan et al., 2011):

1. La micropropagacin, en la que se promueve la elongacin de brotes axilares preexistentes que estn asociados a una yema apical, los cuales deben ser enraizados posteriormente;

2. La organognesis, que se refiere a la formacin de novo de yemas o de races a partir de un tejido, que es directa si se forma sobre el explante o indirecta si los rganos se forman a partir del cultivo de masas de clulas indiferenciadas conocidas como callo;

continuacin Cuadro 1...

20

3. La embriognesis, que implica la formacin de embriones a partir de tejido somtico, es decir, sin que haya ocurrido un proceso de fertilizacin y

4. El cultivo y fusin de protoplastos, en el que se usan clulas a las que se les ha eliminado la pared celular, lo cual facilita la produccin de hbridos y la manipulacin gentica (Loyola-Vargas y Vzquez-Flota, 2006).

Existen varios aspectos que deben ser considerados para el establecimiento de cualquier tipo de cultivo:

(a) caractersticas del explante;

(b) medio nutritivo y

(c) condiciones ambientales.

(a) Los explantes que se utilizan para el cultivo in vitro pueden ser de tejido vegetativo como hojas jvenes, pices de tallos, etc., o a travs del cultivo de estructuras reproductivas como las anteras, polen, vulos o embriones, segn los objetivos que se persigan. El comportamiento de los explantes puede estar influenciado por diferentes factores, tales como por el rgano que servir como fuente del explante; la edad fisiolgica u ontognica del mismo; la estacin del ao durante la cual es recolectado; el tamao del explante y la calidad general de la planta madre (Thorpe y Patel, 1984).

(b) El medio de cultivo proporciona los nutrimentos bsicos para el crecimiento continuo de los explantes aislados y de los propgulos que se obtengan, y dirige su crecimiento y desarrollo por medio del control que ejercen sustancias reguladoras del crecimiento (hormonas vegetales) (George, 1993). En la literatura se pueden encontrar una

21

gran variedad de medios propuestos para el desarrollo de plantas leosas; sin embargo, todos presentan los mismos constituyentes bsicos (Slater et al., 2008; Lloyd y McCown, 1980) : (a) Nutrimentos inorgnicos o elementos minerales, tanto macronutrimentos como micronutrimentos; (b) compuestos nitrogenados orgnicos como vitaminas y aminocidos; (c) una fuente de carbono, generalmente sacarosa; (d) reguladores de crecimiento, los cuales son sustancias que a bajas concentraciones estimulan, inhiben o modifican de alguna manera los procesos fisiolgicos (los que se usan con mayor frecuencia son las auxinas y las citocininas); y (e) un sustrato o soporte fsico para el explante, que puede ser un agente gelificante para el medio como el agar o Phytagel (de Sigma-Aldrich), por ejemplo.

(c) Otros factores relevantes son el pH, la iluminacin (tanto la intensidad, la calidad y tiempo de luz) y la temperatura. El primero afecta la disponibilidad de los nutrimentos minerales y las propiedades de los geles como solidificantes (Slater et al., 2008). La luz es indispensable para el crecimiento y desarrollo de las plantas y se recomienda una fuente luminosa de amplio espectro, como por ejemplo la luz blanca fluorescente y fra (Ellis y Webb, 1993). La temperatura influye sobre las reacciones qumicas que ocurren en las plantas y es comn que se ajuste a un intervalo de las plantas en su ambiente natural.

Cultivo in vitro de la caoba

Los primeros ensayos de propagacin in vitro de Swietenia macrophylla comenzaron a finales de la dcada de los aos ochenta y durante mucho

22

tiempo se alcanz cierto xito utilizando como tejido original el que se obtiene a partir de la germinacin de semillas en condiciones aspticas y una combinacin de hormonas (Lee y Rao, 1988; Maruyama et al., 1989; Sotolongo y Medina, 1998).

Posteriormente han habido esfuerzos por propagar individuos de 3, 10 u 11 aos de edad mediante la proliferacin de callo, o a partir de brotes obtenidos de estacas (Medina y Sotolongo, 2004). Con una combinacin de hipoclorito de sodio (NaClO) y un biocida (PPM) aplicados externa y directamente en el medio se han alcanzado altos porcentajes de establecimiento sin contaminacin y, en conjunto con el uso de N6-bencilaminopurina (BAP), se obtuvieron porcentajes altos de generacin de brotes, a pesar de que la defoliacin no ha podido ser superada (Prez et al., 2012).

El mantenimiento de los explantes mediante cualquiera de las tcnicas mencionadas y a partir de cualquier tejido como se ha intentado previamente, ha probado ser bastante difcil, ya que se presentan altos grados de senescencia de los tejidos, absicin de las hojas y marchitamiento por oxidacin fenlica (Prez et al., 2012; Lee y Rao 1988).

Para superar estos problemas se ha intentado el uso de embriognesis somtica directa e indirecta a partir de cigotos y clulas de los cotiledones, respectivamente (Collado et al., 2006; Collado et al., 2010). Tambin se ha logrado la formacin de callo a partir de inflorescencias de rboles de 40 aos de edad de caoba hbrida (Daquinta et al., 2004).

Otro problema que dificulta el establecimiento in vitro consiste en la contaminacin por agentes endfitos (Maruyama, 2006). Existe evidencia contrastante de intentos anteriores a partir de individuos que crecen en condiciones de campo y de invernadero. Maruyama (2006) describe que el tratamiento de explantes de plantas de 3 aos de edad, con

23

agentes desinfectantes como alcohol etlico, perxido de hidrgeno, cloruro de mercurio, hipoclorito de sodio o calcio, fungicidas y antibiticos utilizados solos o en sucesin, en diferentes concentraciones en diferentes tiempos de aplicacin, resultaron intiles para generar cultivos totalmente limpios. Incluso en algunos cultivos, estos organismos parecan estar ausentes en los establecimientos iniciales, pero aparecan en los trasplantes subsecuentes. Ni siquiera el uso de ramas colocadas en agua para producir brotes permiti obtener cultivos libres de patgenos, lo que sugiere que la contaminacin se debe a la presencia de agentes internos.

En contraste, Medina y Sotolongo (2004), con ejemplares de 11 aos y Prez et al. (2012) con otros de 10 aos en condiciones de campo logran establecimientos exitosos libres de patgenos, a partir de brotes de estacas y ramas colocadas en agua. Collado et al. (2004) obtienen altos porcentajes de establecimiento de individuos de campo con solo el manejo de concentraciones de hipoclorito de sodio y variando tiempos de exposicin.

La tcnica propuesta en este manual enfatiza la importancia de utilizar tejido no lignificado para el establecimiento in vitro de caoba. Durante el desarrollo de los experimentos realizados en este sentido para los protocolos que se incluyen aqu, se identific un hongo endfito del gnero Xylaria como el principal agente contaminante de los cultivos. Es por esto que se propone a la edad del tejido como el principal factor que determina el xito de un protocolo, ya que si el tejido es muy joven, escapa a la infestacin del hongo por contacto vertical (Bayman et al., 1998).

3. MATERIAL Y MTODOS

El cultivo in vitro requiere medidas especiales para establecer un sistema asptico y condiciones de crecimiento controladas, los cuales se detallan en esta seccin.

24

rea de cultivo

Para el cultivo in vitro es necesario habilitar varias reas para controlar las condiciones de asepsia, as como el ambiente donde se desarrollarn las plantas: (a) rea de lavado, (b) rea de preparacin de medios, (c) cuarto de siembra y (d) cuarto de incubacin (o cultivo).

rea de lavado. Es el espacio donde se lava la cristalera e instrumental antes y despus de las actividades de cultivo. Aqu tambin se procesan en un inicio los tejidos vegetales para eliminar agentes contaminantes, restos de la planta madre o del sustrato del que proceden. Consiste de una tarja con agua potable para lavar el material, as como un rea de secado (Figura 1).

rea de preparacin de medios. Aqu se preparan y esterilizan los medios de cultivo, as como el resto de los reactivos o materiales para el manejo de los tejidos. Incluye espacios para el almacenamiento de reactivos (anaqueles y refrigeradores), mesa de trabajo e instrumentos necesarios para la elaboracin de los medios: balanzas, potencimetro, agitadores magnticos calentadores, horno de microondas, etc. Se debe contar con una autoclave para la esterilizacin (Figura 2).

Cuarto de siembra. Es el sitio en el que se llevar a cabo la transferencia y manipulacin del tejido para el cultivo (Figura 3). Es un rea que debe adaptarse para trabajar en condiciones aspticas. Es de acceso restringido, libre de polvo, con corrientes de aire limitadas. En este se ingresa solo material que ha sido previamente esterilizado. En general, cuenta con una campana de flujo laminar horizontal (vertical si se trabaja con bacterias u

a)

b)

c)

25

hongos) (Figura 4), mesa de trabajo de acero inoxidable o vidrio, mecheros de alcohol o de gas (tipo Bunsen), iluminacin para trabajar, y focos de luz ultravioleta para desinfectar el rea.

En este espacio, el personal debe limitar al mximo el ingreso de contaminantes, por lo cual se recomienda el uso de bata, cubre bocas y (de preferencia) cofia para cubrir el cabello (Figura 5). No deben de usarse relojes, pulseras ni anillos, ya que las manos deben lavarse bien con agua y jabn antes de comenzar a trabajar y frecuentemente desinfectarse con etanol al 70 % durante el proceso.

Si no es posible contar con un cuarto de siembra, es importante adaptar las condiciones que permitan minimizar el riesgo de contaminacin; se sugiere:

Buscar un sitio para colocar una mesa, que quede fuera del paso de corrientes de aire.

De preferencia, colocar sobre la mesa un vidrio, u otro material de superficie lisa que se pueda limpiar y desinfectar con facilidad.

Antes de comenzar a trabajar, lavar bien la superficie antes mencionada con agua y detergente, luego con alcohol al 70 % al menos 3 veces.

Crear una zona estril. Para ello, se encienden dos mecheros y se colocan a una distancia de 20 a 30 cm entre ellos (Figuras 6 y 7).

26

Figura 1. rea de lavado. (a)Tarja y rea de secado. (b) El rea puede ser utilizada para los tratamientos de desinfeccin ya que muchas veces se puede derramar las soluciones.

Figura 2. (a) rea de preparacin de medios de cultivo y (b) autoclaves.

27

Figura 3. Cuarto de siembra e incubacin. Se muestran las instalaciones del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del INIFAP CENID-COMEF. La entrada principal posee dos puertas, lo que evita la entrada de corrientes de aire y adems cuenta con un sistema de extraccin de aire para todo el cuarto. Al interior estn las campanas de flujo laminar y los cuartos de incubacin.

Figura 4. Campanas de cultivo con flujo laminar. Se recomienda el uso de mesas a los lados para colocar material mientras se trabaja en la campana ya que esto evita entorpecer el trabajo y disminuye la probabilidad de contaminacin.

28

Figura 5. Vestimenta adecuada para el uso del cuarto de cultivo e incubacin.

29

Cuarto de incubacin. Este se puede obtener comercialmente o se puede acondicionar. Es una rea con iluminacin, fotoperiodo (horas luz), temperatura y humedad relativa controlada, donde se depositan los explantes y plntulas para su desarrollo. Debe contar con anaqueles para acomodar los frascos de cultivo, adems de incluir sistemas de aire acondicionado y calefaccin para regular la temperatura, focos fluorescentes para la iluminacin (que no emiten demasiado calor) y un temporizador para fijar las horas de luz y oscuridad (Figura 8). Una vez que las plntulas hayan adquirido el tamao esperado y el vigor suficiente para sobrevivir fuera del frasco, se recomienda transplantarlos e ingresarlos a cuartos adaptados para este fin. Para ello se utilizan mbitos cerrados que excluyan insectos y cualquier otra fauna nociva y que a su vez, mantengan una humedad, luz y temperatura sin cambios a lo largo del da, lo que protege a las plantas de cambios ambientales bruscos, de una manera similar a los cuartos de cultivo. Esto permite sostener una poblacin constante para obtener explantes con regularidad.

En el Laboratorio de Biotecnologa del CENID COMEF, el cuarto contiene iluminacin natural suplementada con tubos fluorescentes Phillips Alto de 32 watts a razn de 8 tubos en un rea de 14 m2 (por el cuarto mide 4 x 3.5 m) (Figura 9). Sin embargo, un vivero expuesto a la luz natural, aunque completamente cerrado, es una buena opcin.

Desinfeccin del rea de siembra

Este procedimiento se debe aplicar siempre antes y cada vez que se utilice el rea, independientemente de la actividad que se lleve a cabo. Consiste en lo siguiente:

1. Limpiar todas las paredes del interior de la campana de flujo laminar y la mesa, con alcohol al 70 % y algodn estril, comenzar

a)

30

con las partes ms internas y terminar con las orillas exteriores. Esta operacin debe hacerse al menos 2 veces (la mesa no debe de tener ningn instrumento en su superficie al momento de la desinfeccin).

2. Encender el motor de la campana de flujo laminar al menos 15 minutos antes de empezar a trabajar.

3. Encender una lmpara de luz ultravioleta durante 15 minutos para eliminar microorganismos.

Figura 6. Organizacin del campo estril. El campo estril se establece en el espacio entre dos mecheros Bunsen o lmparas de alcohol de 96. Los mecheros sirven a su vez para esterilizar las puntas de pinzas y bistures. La superficie de la mesa y las paredes de la campana deben de limpiarse con algodn y alcohol al 70%.

31

Figura 7. Forma de trabajar en un campo estril. Se aprovecha el calor generado por las flamas de los mecheros para producir el campo estril. Por este motivo, los mecheros se deben ubicar a una distancia tal que permita el trabajo entre ellos, evitando quemarse. Todo el material debe mantenerse cerca de los mecheros y flamearse antes de su uso.

Figura 8. Cuarto de incubacin. Dispone de tubos fluorescentes en las cuatro paredes, aire acondicionado, termmetros y un higrmetro para monitoreo de temperatura y humedad. Para la caoba se recomienda una temperatura de 28-30 C y 30% de humedad.

32

Figura 9. Plntulas de caoba en cuartos cerrados. Se puede habilitar un cuarto con luz natural y con lmparas para as controlar las horas luz con ayuda de un temporizador y la humedad con un calentador de aceite. Esto asegura un mejor control de plagas y de variables ambientales.

No se debe entrar al cuarto de cultivo mientras la lmpara de luz ultravioleta est encendida, pues la luz ultravioleta es el factor principal que desencadena el cncer de piel.

Ninguna persona o muestra de tejido debe permanecer al interior del cuarto al momento de encender la lmpara ni durante los 15 minutos de exposicin. Se sugiere cerrar el cuarto con llave mientras la luz ultravioleta est encendida.

33

Desinfeccin del material para sembrar

Todo el material que se va a utilizar para el cultivo debi ser esterilizado previamente en una autoclave; esto incluye al instrumental metlico (pinzas, bistur, etc.) as como la cristalera.

Antes de introducir a la campana de flujo laminar los frascos y el resto del material con el cual se va a trabajar es decir, bistures y pinzas se rocan con etanol al 70 % , que se deja evaporar antes de ser utilizado.

Para desinfectar las pinzas y bistur mientras se trabaja, se introducen en un esterilizador de perlitas de vidrio (Germinator 500). Una vez que se han calentado, se dejan enfriar dentro del rea estril antes de usarse. Es conveniente tener varios juegos de pinzas, de modo que mientras unos se esterilizan o se enfran, se puede seguir operando con otro juego. Si no se cuenta con un esterilizador de perlitas, se pueden sumergir las pinzas y el bistur en etanol al 70 % y luego flamear con el mechero.

Vas para el establecimiento in vitro de caoba

En este manual se describen protocolos para la germinacin in vitro, as como para la proliferacin de yemas axilares y la obtencin de callo. Para cada uno se detallan los criterios para la seleccin de explantes as como las condiciones de cultivo.

En los anexos de este manual se incluye un resumen que puede servir como gua rpida para el cultivo de yemas axilares.

En el anexo 1 se describe la lista de material y equipo necesario, as como la composicin de los medios y la preparacin de soluciones.

34

Germinacin in vitro

Es una alternativa para la propagacin cuando se tienen lotes de semillas viables. Permite reducir y eliminar la presencia de la mayora de los organismos contaminantes (bacterias y hongos), para la produccin de plntulas de alta calidad que incluso pueden ser transportadas a otras zonas del pas. Por lo mismo, pueden tambin ser utilizadas como fuente de explantes para el cultivo.

A) Preparacin de medio de cultivo

1) Se requiere medio de cultivo PDA (papa-dextrosa-agar) 6 g/l, que ya se vende comercialmente.

2) Verter 30 ml por frasco, tapar y esterilizar durante 15 minutos, a 15 lb y 121C.

3) Si el medio no se va a usar inmediatamente, se puede guardar en refrigeracin a 4C, hasta por 1 mes.

B) Limpieza de la semilla y desinfeccin

1. Remover la cubierta de la semilla (smara) que comprende el ala (recubrimiento caf o testa). En este paso la semilla descubierta muestra una apariencia de color blanco la cual debe eliminarse (Figura 10).

2. Lavar las semillas con agua y jabn tallando ligeramente con un escobilln o cepillo pequeo hasta que la semilla muestre un color caf.

3. Sumergir las semillas en alcohol al 70 % durante un minuto en agitacin, a razn de 5 semillas por cada 30 ml de alcohol y desechar el alcohol; esto se puede realizar en frascos Gerber estriles.

35

4. En el mismo frasco enjuagar con agua destilada y estril agitando durante un minuto, desechar el agua y repetir el enjuague tres veces.

5. Sumergir las semillas en cloro al 10 % en agitacin durante 5 minutos.

6. Enjuagar con solucin de antioxidante para evitar exceso de oxidacin (1g cido ascrbico + 1 g cido ctrico por cada litro de solucin).

Figura 10. Semilla de caoba. (a) Smaras. (b) Aspecto de la semilla y la cubierta blanca que presenta. (c) Remocin de cubierta blanca con escobilln y agua.

a) b)

c)

36

Figura 11. (a) Colocacin de semilla en medio PDA. (b) germinacin de semilla (15 das de incubacin).

a)

b)

37

C) Condiciones de cultivo

1. En condiciones de esterilidad, se colocan las semillas sobre el medio.

2. El frasco se tapa y se sella con pelcula plstica autoadherible (EgaPac) o Parafilm.

3. Los cultivos se mantienen en oscuridad a una temperatura de 30C durante al menos 7 das. Sin embargo, esto depender de la edad de las semillas y de las condiciones en las que fueron almacenadas, pues entre ms tiempo permanezcan as, requerirn mayor tiempo en oscuridad. Se debe monitorear a los 7 das y posteriormente cada dos das. En el momento en que se observe el crecimiento de hojas se inicia la incubacin con luz (Figura 11).

Proliferacin de yemas axilares

Es una alternativa para la propagacin clonal de especies forestales, ya que permite la regeneracin de individuos de caractersticas ya probadas o de genotipos selectos. Consiste en cultivar lo pices de los tallos y promover el desarrollo y alargamiento de las yemas axilares, mismas que posteriormente son separadas del tallo y enraizadas, para dar lugar a plntulas individuales. Es la va ms deseable cuando no se tiene acceso a semillas, o cuando se cuenta con muy pocos individuos (Figura 12).

En general, la regeneracin in vitro de especies forestales a partir de tejidos maduros ha resultado ms complicada que a partir de tejidos jvenes debido a que su capacidad de respuesta disminuye con la edad. Se recomienda utilizar los tejidos ms jvenes que se puedan encontrar en la planta adulta: yemas apicales y axilares, hojas muy jvenes, etc. (Figura 12). Para usar explantes a partir de plantas maduras es conveniente que: (1) provengan de rboles vigorosos y con buena hidratacin aparente

38

del follaje; (2) no muestren sntomas de contaminacin por patgenos como bacterias, hongos o ataque de insectos; o (3) no se obtenga el tejido a partir de brotes de tallos jvenes (un mes de desarrollo), en los que sea evidente la dominancia apical.

Por otra parte, la utilizacin de tejido ya lignificado tiene una mayor probabilidad que el tejido joven de contener asociaciones con organismos saprobios que en la planta completa pueden no afectar el desarrollo de la misma pero que in vitro resultan dainos para el tejido vegetal, como es el caso de hongos endfitos del gnero Xylaria.

A) Seleccin del material vegetal

La caoba tiene tallos principales con hojas paripinnadas o imparipinnadas (Figura 13). Las hojas son compuestas, es decir se componen de varios foliolos que crecen en pares opuestos (paripinnadas) o a veces alternos (imparipinnadas) sobre un mismo raquis, el cual a su vez, se inserta en el tallo principal. Una de las ventajas de la caoba es su capacidad de generar una nueva yema apical despus de cortar el pice, lo cual puede ser aprovechado en el cultivo in vitro ya que permite obtener mltiples explantes a partir de un solo individuo o plntula, a razn de dos explantes por mes, con tres yemas al menos, cada uno.

Para la propagacin in vitro de la caoba se han probado el cultivo de yemas apicales de los tallos, yemas de los foliolos y foliolos. Los extremos terminales de los tallos, es decir las yemas axilares terminales que con un color verde o verde rojizo, sin lignificacin (Figura 14), son las estructuras que se considera ofrecen los mejores resultados en cuanto a la supervivencia, as como por la ausencia de agentes contaminantes. Tambin se ha observado que si se utilizan las yemas axilares (las cuales se encuentran inmediatamente por debajo de la yema apical) sobreviven

39

mejor a los tratamientos qumicos de desinfeccin que el pice; sin embargo, se corre el riesgo de que estn contaminados por su proximidad de la yema axilar a la rama principal de la planta. La obtencin de brotes a partir de los foliolos no ha resultado fcil; no obstante, han sido empleados con xito en otras especies y en particular en caoba para la generacin de callo (Tacoronte et al., 2004).

Figura 12. Procedimiento para la proliferacin de yemas auxiliares y su propagacin masiva.

40

Figura 13. Estructura de las hojas de Swietenia macrophylla.

41

Figura 14. Caractersticas del tejido ideal para la propagacin in vitro de caoba. (a) Plntula de caoba a partir de la cual se pueden obtener explantes .( b) pice de una plntula de caoba, el tejido joven originado en estas yemas es el ideal para cultivo in vitro.

B) Preparacin de medios

El medio ideal para la proliferacin de yemas axilares en la caoba es el de Murashigue-Skoog (MS), as como el medio WPM (Lloyd & McCown, Woody Plant Medium). Consultar el Anexo 1 para detalles acerca de su composicin y preparacin.

42

Procedimiento para generar un litro de medio para cultivo in vitro.

1. En un vaso de precipitado de 1 litro agregar 500 ml de agua destilada. En agitacin adicionar el peso o volumen correspondiente de macronutrimentos, micronutrimentos, vitaminas, aminocidos y sacarosa (ver Anexos 1 y 2). Si se usa medio nutritivo comercial, agregar el peso en gramos correspondiente, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Por ejemplo, el medio MS puede ser de la marca de Phytotechnology Laboratories, y se agregan 4.33 g por litro; si es WPM se agregan 2.3 g por litro.

2. Mezclar y disolver 30 g de D-Sacarosa (Figuras 15 y 16).

3. Ajustar el pH a 5.7 (Recuadro 1 y Figura 17 para indicaciones)

4. Agregar el resto de agua hasta completar un litro de volumen final, usando una probeta.

5. Adicionar el agar y calentar hasta la ebullicin (Recuadro 2). Mezclar bien.

6. Una vez que el medio alcance la ebullicin, se deja enfriar hasta que sea tolerable su manipulacin pero evitando que se enfre al punto de comenzar a solidificarse. Se vierte en los tubos o frascos con tapa con una pipeta o con ayuda de un dispensador (Figura 18). Se necesitan 7 ml de medio de cultivo por cada tubo de cultivo y 30 ml para frascos tipo Gerber. Aunque se realice el clculo del volumen requerido de medio de cultivo, se sugiere preparar un 10 % adicional a la cantidad calculada ya que siempre se pierde un poco durante este proceso.

43

RECUADRO 1Ajuste de pH

El pH es una medida del nmero de iones de hidrgeno que existen libres en una solucin. Esta medida es una escala que va del 0 al 14, siendo 0, lo ms cido, 7 lo neutro y 14 lo bsico. El mediode cultivo necesita un pH de 5.7, en el cual se asegura una asimilacin ptima de los nutrientes por el tejido vegetal.

El ajuste de pH se hace una vez que se han agregado todos los reactivos al medio excepto el agar.

Con ayuda de un agitador magntico se mantiene en circulacin todo el lquido en el vaso de precipitado y al mismo tiempo se sumerge el electrodo del potencimetro a una altura suficiente que cubra por completo al electrodo. Se debe esperar a que la lectura del pH se estabilice en la pantalla de aparato y se ajusta al valor deseado de una solucin de hidrxido de sodio 1N (para subir), o de cido clorhdrico 1N (para bajar). Por ejemplo, si en pantalla se observa un pH de 6, se agrega cido, si al contrario se observa un pH de 4, se adiciona hidrxido de sodio.

La cantidad de cido o hidrxido que se ha de agregar depende mucho de que tan alejado este el pH inicial del pH de 5.7 que se busca. Se sugiere agregar por goteo, de una en una a la solucin, siempre en agitacin, y esperando el tiempo suficiente para que se estabilice la lectura en la pantalla del potencimetro.

NOTAS:Asegrese que el potencimetro est calibrado, existen sustancias buffer que son soluciones con un PH conocido y con el cual se ajusta el aparato.

Tome en cuenta que el magneto del agitador debe estar a una distancia suficiente para no entrar en contacto con el electrodo del potencimetro ya que por el movimiento puede averiarlo. El electrodo debe ser manejado con sumo cuidado y permanecer en todo momento hidratado.

44

C) Esterilizacin

Una vez terminada la preparacin del medio, se debe esterilizar para destruir cualquier organismo (hongos y bacterias) contaminante.

Los tubos con el medio de cultivo se colocan en una gradilla o bien se pueden hacer paquetes de peridico y cinta adhesiva de tal manera que no se volteen y as evitar escurrimientos (Figura 19).

Si utiliza una autoclave, debe someter el material a:

Temperatura: 120 C

Presin: 15 lb

Tiempo: 15 minutos

MUY IMPORTANTE:

Siempre cuidar que los tubos permanezcan en posicin vertical antes y despus de introducirlos a la autoclave.

Una vez pasados los 20 minutos, es recomendable dejar enfriar la autoclave con todos sus contenidos por al menos 2 horas lo que permite que los medios solidifiquen, evitando que se derramen.

Una prueba de la correcta preparacin del medio consiste en que una vez que los tubos se han enfriado, debe ser posible ponerlos de cabeza y agitarlos sin que el medio de cultivo se deslice. El medio una vez en los frascos o tubos debe de cambiar de translcido a opaco (Figura 20).

45

RECUADRO 2Disolucin del Agar.El agar es una sustancia que permite que el medio de cultivo se solidifique con una consistencia gelatinosa, generando as un soporte para el tejido, adems de mantener una presin de agua favorable para la asimilacin de nutrientes.

Para que el agar solidifique de forma homognea, debe calentarse hasta la ebullicin.

La manera ms eficiente de disolver el agar es calentar la solucin a la que y se ha ajustado el pH, y agregar el agar, despus se contina con la agitacin y el calentamiento hasta alcanzar su completa disolucin que se obtiene con la ebullicin.

NOTA: la formacin de burbujas por la ebullicin al interior del contenedor donde se prepare el medio de cultivo puede ser repentina e incotrolable al momento de calentarla, lo que puede provocar accidentes por el derrame del lquido. Por esto se recomienda manipular los recipientes siempre con guantes de tela y, de ser posible, utilizar un vaso de mayor capacidad, es

decir, de un litro si se preparan 500 ml.

Figura 15. (a) Balanza analtica. Se hacen recipientes de papel o papel aluminio para pesar por separado las sustancias. Asegrese que una vez colocado el papel y antes de agregar sustancias, haya presionado el botn de tara (tare), el cual ajusta el peso a cero.(b) Se extraen las sustancias con ayuda de una esptula o cuchara seca.

46

Figura 16. Agitador magntico y vaso de precipitados de 1 litro. Antes de agregar el agar, se ajusta el pH y se disuelve por completo el medio de cultivo y la sacarosa.

47

Figura 17. Ajuste de pH. (a) Potencimetro. Se muestra el buffer con el cual se calibra el aparato para un pH de 7 y frascos con HCl y NaOH 1 N. (b) Se ajusta el pH a 5.7 agregando gotas de HCl o NaOH y posteriormente se lleva al volumen deseado.

48

Figura 18. Llenado de tubos de cultivo. (a) Se utiliza un dispensador que facilita el trabajo y lo hace ms preciso ya que vaca una cantidad fija de medio por cada tubo. (b) Por un extremo se absorbe el medio y (c) se descarga por completo en un tubo presionando hacia abajo el mbolo.

Figura 19. Esterilizacin. (a) Se utiliza una autoclave en la cual se colocan los tubos de forma vertical, para facilitar su manejo y evitar que se derrame su contenido durante la esterilizacin; se pueden hacer paquetes con ligas o peridico. (b) Hay que asegurarse que la autoclave quede bien cerrada para evitar una mala esterilizacin e, incluso, accidentes. Las condiciones de esterilizacin son 120 C, 20 min, 15 lb de presin.

49

Figura 20. Caja y tubos de cultivo in vitro con medio de cultivo.

D) Obtencin del explante a partir de plntulas

Con tijeras estriles se hace un slo corte en la base de la rama seleccionada (Figura 21a).

Se eliminan los peciolos de las hojas (Figura 21 b).

Si el tallo es muy largo y la distancia internodal impide colocarlo entero en el frasco para su desinfeccin, se recomienda hacer cortes transversales cuidando que conserven las estructuras (Figura 22).

E) Lavado y desinfeccin del explante

El material vegetal debe ser sometido a un tratamiento de desinfeccin para evitar el crecimiento de bacterias y hongos que pudieran interferir con el crecimiento del tejido. El procedimiento implica el uso

1)

2)

3)

50

de distintos desinfectantes de manera secuencial, para lo cual todas las soluciones deben ser preparadas con agua estril y realizarse en condiciones de asepsia. Debido a que los tejidos deben sumergirse totalmente en las soluciones, se recomienda medir la cantidad necesaria que se va a utilizar para preparar suficiente solucin desinfectante y no interrumpir el procedimiento. El uso de un agitador mecnico tambin puede ser til en esta fase.

F) Lavado del material vegetal

Se sugiere lavar con jabn abundante los segmentos de tallo con movimientos suaves del escobilln o cepillo y repetir al menos 3 veces para cada trozo. Finalmente, se debe enjuagar con agua corriente entre cada lavado (Figura 23).

Figura 21. (a) Obtencin de tallo de plntulas de caoba, no se utiliza n estructuras lignificadas. (b) Explantes. Se indican los cortes pertinentes de los peciolos para poder procesar el material en la desinfeccin.

51

Figura 22. Tallo principal indicando la posicin de las yemas favorables para cultivo in vitro.

52

G) Tratamiento con antioxidante

Despus del lavado, el tejido se sumerge en una solucin de antioxidante en un frasco nuevo, ya que el tejido debe permanecer hidratado todo el tiempo (Figura 23).

H) Desinfeccin

Consiste en una serie de pasos secuenciales, los cuales se realizan en condiciones de esterilidad (Figura 24) (Ver anexos para preparacin de soluciones).

I) Desinfeccin con etanol al 70 %.

1. Desechar el antioxidante.

2. Agregar etanol al 70 %

3. Agitar durante 1 minuto

4. Desechar el etanol

5. Agregar antioxidante cubriendo bien el tejido

J) Desinfeccin con hipoclorito de sodio comercial (cloro) al 15%.

1. Desechar el antioxidante

2. Agregar el cloro al 15%

3. Agitar durante 10 minutos

4. Desechar el cloro

5. Agregar antioxidante hasta cubrir por completo el tejido

53

K) Tratamiento con fungicida (Captn)

1.Desechar el antioxidante

2.Agregar Captn (2g/l)

3.Agitar durante una hora

Figura 23. (a) y (b) Lavado de explantes. Se utiliza agua corriente para enjuagar el jabn; (c) los explantes deben sumergirse en una cantidad suficiente de lquido para asegurar un efecto uniforme de las soluciones.

54

Figura 24. Desinfeccin. (a) Se vierte el desinfectante (cloro alcohol o Captn) y comienza a tomarse el tiempo de agitacin una vez que se ha llenado el ltimo frasco. (b) Se muestra como se puede agitar varios frascos a la vez con ayuda de una charola. (c) Un agitador mecnico, que puede ser til para periodos prolongados de agitacin.

Una vez terminado el tiempo de agitacin se mantienen los tallos en esta solucin mientras se procede a la siembra.

De ser posible no procesar ms de 5 plantas simultneamente por persona, ya que los tiempos de agitacin pueden prolongarse demasiado lo que expone en exceso al tejido a la accin de los desinfectantes, pudiendo daarlo significativamente.

55

El alcohol ya utilizado puede conservarse para otros usos (por ejemplo para llenar las lmparas de alcohol), excepto como desinfectante.

L) Siembra de los explantes

Precauciones previas al momento de sembrar:

1. Una vez que se tienen los tallos ya limpios se llevan todos los frascos al cuarto de cultivo para evitar salir durante la siembra y se asegura de tener todo el material dispuesto dentro de la campana de cultivo (Figura 25).

2. Se identifica cada frasco o tubo que se utilizar para la siembra con fecha y origen del tejido. Debe indicar el nombre de la planta de donde se extrajo el tejido, as como la parte de la planta, ya sea pice, yema 1, yema 2 o yema 3 (Figura 31 y 22). Los frascos se pueden marcar con plumn indeleble, las leyendas deben de ocupar el menor espacio posible y colocarse en un solo lado del frasco para poder revisar los tejidos con facilidad.

M) Procesamiento de los explantes

Dentro de un rea estril, y una vez desinfectado el material vegetal, se disectan las yemas. Se sugiere cortarlas en orden descendente y sembrarlas inmediatamente cada una para no perder el origen de cada tejido, es decir primero el pice y sucesivamente las yemas 1, 2, y 3 (Figura 22). Para cada explante se sigue la siguiente secuencia:

1. Se extrae el tallo desinfectado del frasco con Captn y se coloca en una caja de Petri (Figura 26).

56

2. Se cortan las bases de las hojas que permanecen unidas al tallo principal sin afectar a ste con los cortes (Figura 27).

3. Se corta la yema apical y subsecuentemente trozos de tallo de 2 cm, que incluyan al nudo y las yemas axilares (Figura 28).

4. Se procede a sembrar.

N) Siembra

1. Se toma el explante con las pinzas estriles y se coloca en forma vertical cuidando siempre colocar la porcin apical del tallo por encima del nivel del medio de cultivo (Figura 29).

2. El explante se coloca sobre el medio de cultivo, ejerciendo una ligera presin y procurando no tocar el medio con las pinzas.

3. El explante debe de penetrar en el medio al menos la mitad de su extensin (Figura 30).

4. Se sellan los frascos con Egapac o Parafilm y se llevan al cuarto de cultivo (Figura 31).

O) Condiciones de incubacin

La temperatura recomendada es de 30C, con una humedad relativa de 30% y un fotoperodo de 12 horas luz. El desarrollo de yemas axilares que se pueden obtener por esta tcnica tarda entre 3 y 4 semanas.

P) Resiembras, individualizacin de brotes y enraizamiento

Los medios de cultivo con el tiempo se van deshidratando y los explantes consumen los nutrimentos. Por ello, es importante realizar resiembras

57

peridicas de los explantes en medio nuevo. Asimismo, a medida que se alarguen las yemas axilares, estas deben ser individualizadas y sembradas en el medio para promover su enraizamiento. Es comn que el medio de resiembras tenga un contenido nutrimental y hormonal diferente al medio inicial. Para caoba, el medio que se utiliza para las resiembras es el mismo que para la fase anterior (MS+ sacarosa 30g/l) y se realiza cada 30 das. Algunas veces las yemas enrazan espontneamente bajo estas condiciones (Figura 32).

Figura 25. Sugerencia de la disposicin de material al interior de la campana de cultivo.

58

Figura 26. Obtencin de explantes. Los fragmentos de tallo se sacan del Captn y se colocan en una caja Petri estril para su procesamiento.

Figura 27. Obtencin de yemas. Remocin de restos de bases de hojas sin llegar a cortar el tallo principal. El tallo debe insertarse en los tubos de cultivo sin tocar las paredes.

59

Figura 28. Se ajusta la altura del tallo, por encima y por debajo de la yema debe de mantenerse al menos un centmetro de tallo principal para conservar las propiedades de proliferacin de la yema.

Figura 29. Se toma el tallo ya preparado, se destapa el tubo y se inserta el tejido en el medio. El tubo solamente debe de ser abierto en este momento y cerrarse inmediatamente despus de haber introducido el tejido. Se muestra un pice a punto de introducirse al medio.

yema

60

Figura 30. Se introduce la mitad del explante en el medio de cultivo. Se debe de considerar la posicin vertical de la yema para no introducir de cabeza el tejido.

Figura 31. Tejidos ya sembrados en sus tubos debidamente identificados con: fecha de siembra, tipo de medio, nombre del individuo del que se extrajo el tejido, origen y tipo de tejido (pice o yemas axilares). Se muestra de izquierda a derecha: el pice, yema1, yema 2 y yema 3 (ver Figura 22).

61

Figura 32. Desarrollo de una plntula completa de S. macrophylla en medio de cultivo MS. Esta planta se obtuvo a partir del trasplante de tejido generado in vitro con la tecnologa aqu propuesta.

Q) Monitoreo

Se recomienda llevar una bitcora con las anotaciones de seguimiento del desarrollo in vitro. Durante la primera semana despus de iniciado el cultivo se debe tener cuidado en revisarlos diariamente para detectar de forma oportuna la presencia de agentes contaminantes. Ms adelante, se pueden

62

realizar revisiones quincenales o mensuales para evaluar supervivencia y contaminacin, as como para detectar los individuos y tratamientos con los mejores resultados. Se anexa una tabla sugerida para llevar el control de estos parmetros donde se puede registrar la fecha, el tratamiento, el desempeo de cada individuo y de cada yema (Anexo 2).

Es conveniente identificar cada una de las partes del explante, con el fin de establecer el origen de cada tejido a la hora de sembrar, para su seguimiento durante la incubacin (Figura 31).

La Figura 32 muestra un individuo con races obtenido mediante la tcnica descrita.

Formacin de callo

El callo se refiere a la proliferacin desorganizada de clulas de parnquima. Se origina en zonas en las que han ocurrido lesiones, y evita la entrada de agentes patgenos. Sin embargo, tambin se genera como consecuencia del cultivo in vitro y su desarrollo tiene importantes aplicaciones biotecnolgicas (George, 1993).

Los callos varan considerablemente en su apariencia y textura, desde masas de clulas nodulares compactas o muy suaves. Suelen ser blancos o de color crema, anaranjados o verdes, dependiendo si contienen o no cloroplastos, e incluso algunos callos tienen clulas con distintas coloraciones como distinta forma y diferente estado de diferenciacin (Robledo-Paz et al., 2006).

La formacin de callo in vitro a partir de un explante se divide en tres etapas: (1) la induccin de divisiones celulares, por lo general inicia en los sitios donde ocurri la lesin al producir el explante; (2) perodo de divisin muy activa, en el que las clulas del explante pierden las

63

caractersticas que tenan antes del cultivo (se desdiferencan) como consecuencia de la influencia de hormonas vegetales (auxinas y citocininas); y (3) perodo en el que disminuyen e incluso cesan las divisiones celulares e inicia la diferenciacin.

Con el callo es factible producir yemas, races o embriones somticos (se forman a partir de tejido vegetativo, sin que haya habido fecundacin). Asimismo, funciona para obtener cultivos de clulas en suspensin y protoplastos, o para la sntesis in vitro de compuestos qumicos vegetales (metabolitos secundarios). Finalmente, se les puede almacenar a largo plazo en bancos de germoplasma.

Los callos se producen a partir del cultivo de casi cualquier tipo de explante. A continuacin se describe un protocolo para la obtencin de callos a partir del cultivo de hojas jvenes de caoba.

A) Preparacin de medios

1. El medio ideal para la proliferacin de callo de caoba es el MS. (Consultar el Anexo 1 para detalles acerca de su composicin).

2. Para 1 litro de medio, se agregan 500 ml de agua destilada a un vaso de precipitado. En agitacin, se adicionan los macronutrimentos, micronutrimentos, vitaminas, aminocidos y sacarosa en las cantidades correspondientes (Anexo 1). Si se usa medio nutritivo comercial, agregar el peso en gramos indicado por el proveedor (stos ya contienen todos los nutrimentos necesarios). Agitar hasta disolverlo todo.

3. Adicionar 10 mg/l de la auxina sinttica 2,4-D (cido 2,4-Diclorofenoxiactico).

4. Ajustar el pH a 5.7

64

5. Aforar a 1 litro y agregar el agar.

6. Calentar para disolver el agar y verter en frascos tipo Gerber (30 ml).

7. Esterilizar a 121C, 115 lb, durante 20 minutos.

8. Esterilizar tambin papel secante (envolver en papel aluminio antes de meter en la autoclave).

B) Lavado y desinfeccin del explante

1. Con una tijera, separar foliolos del peciolo de hojas jvenes de caoba (Figura 13) (las ms cercanas al pice o punta de crecimiento).

2. Sumergir y agitar durante 5 minutos en una solucin de detergente lquido. Posteriormente con la ayuda de un escobilln y abundante agua lavar los foliolos y enjuagar .

3. En la campana de flujo laminar, y en condiciones de esterilidad, colocar los foliolos en un vaso de precipitados y sumergirlos durante 1 minuto en alcohol al 70%. Se elimina el alcohol.

4. Agregar cloro al 15% durante 1 minuto, despus de lo cul se desecha y los foliolos se enjuagan 3 veces con agua destilada estril.

C) Siembra de los explantes

Una vez enjuagadas, los foliolos se procesan uno por uno como se describe a continuacin:

1. Se extraen los foliolos uno por uno y se elimina el exceso de humedad sobre una sanita (o toalla de papel) previamente esterilizada.

65

2. Se colocan en una caja Petri y con ayuda de un bistur y pinzas de diseccin estriles se cortan trozos de aproximadamente 1 cm2. El tamao es importante ya que se ha observado que los explantes mas pequeos no sobreviven.

3. Se colocan de 4 a 5 explantes en cada frasco con medio de cultivo, con el envs de la hoja en contacto con el medio. Se sellan los frascos con Parafilm o Egapack y se ponen a incubar.

D) Condiciones de incubacin y resiembras.

Los frascos con explantes se colocan a 28C, a la luz, con un fotoperodo de 16 horas luz, 8 de oscuridad. Los explantes se resiembran cada 30 das y se colocan sobre el mismo medio.

E) Monitoreo

Durante la primera semana despus de iniciado el cultivo es conveniente realizar revisiones diarias para detectar a tiempo la presencia de agentes contaminantes. Despus se pueden realizar monitoreos quincenales o mensuales para evaluar supervivencia, y contaminacin, para eventualmente evaluar que individuos nos han dado los mejores resultados. Se anexa una tabla sugerida para llevar las anotaciones (Anexo 2).

66

CONSIDERACIONES FINALES.

Los mtodos presentados en este manual constituyen la base para el desarrollo de ulteriores investigaciones en la fisiologa y gentica de la caoba. An existen profundas lagunas en el conocimiento de esta especie, desde la misma manutencin a largo plazo de cultivos in vitro, la regeneracin de plantas adultas a partir de estas tcnicas, hasta el desarrollo de investigacin sobre sus rutas bioqumicas y la produccin de metabolitos naturales con potencial de defensa en contra de plagas.

Las tcnicas que se han utilizado para el establecimiento de la caoba in vitro en el Laboratorio de Biotecnologa del INIFAP CENID-COMEF pueden ser transmitidos de manera personal y prctica a cualquier persona interesada ya sean silvicultores, estudiantes o investigadores de otras instituciones.

Toda correspondencia relacionada con esta publicacin o las tcnicas aqu descritas, favor de dirigirla a:

Dra. Ana Laura Wegier Briuolo

Laboratorio de Biotecnologa Forestal,

CENID COMEF, INIFAP.

Av. Progreso No. 5

Barrio de Santa Catarina

C.P. 04010 Mxico D.F.

Correo-e: wegier.ana@inifap.gob.mx

Telfono (01 55) 3626 8700 ext. 608

67

BIBLIOGRAFA

Aguilar C., J. M y M. A. Aguilar C. 1992. rboles de la Biosfera Maya Petn. Gua para las especies del Parque Nacional Tikal. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Escuela de Biologa. Centro de Estudios Conservacionistas(CECON).Guatemala. 272 p.

Barrance, A., J. Beer, D. H. Boshier, J. Chamberlain, J. Cordero, G. Detlefsen, B. Finegan, G. Galloway, M. Gmez, J. Gordon, M. Hands, J. Hellin, C. Hughes, M. Ibrahim, D. Kass, R. Leakey, F. Mesn, M. Montero, C. Rivas, E. Somarriba, J. Stewart y T. Pennington. 2003. rboles de Centroamrica. Oxford Forestry Institute-Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza. Turrialba, Costa Rica. pp. 901-906.

Basil, J. G. A. 2007. Diversidad gentica en poblaciones de Swietenia macrophylla King (Meliaceae) en Costa Rica y Bolivia. http://orton.catie.ac.cr/repdoc/A1313e/A1313e.pdf. (01 de octubre de 2012).

Bauer, G. P. y J. K. Francis. 1998. Swietenia macrophylla King. Honduras mahogany, caoba. SO-ITF-SM-81. US. Department of Agriculture, Forest Service, Southern Forest Experimental Station. New Orleans, LA USA. 7 p.

Bayman, P, P. Angulo-Sandoval, Z. Bez-Ortiz, D.J. Lodge 1998. Distribution and dispersal of Xylaria endophytes in two tree species in Puerto Rico. Mycol. Res. 102: 944 948.

Bonga, J. M. and P. von Aderkas. 1992. In vitro culture of trees. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. pp 72-125

Briceo-Vergara, A. J.. 1997. Aproximacin hacia un manejo integrado del Barrenador de las Meliceas, Hypsipyla grandella (Zeller). Revista Forestal Venezolana 41: 23-28.

Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F. Jimnez-Terry, M. Prez and O. Gutirrez. 2010. Indirect somatic embryogenesis of Swietenia macrophylla King in semisolid culture medium. Biotecnologa Vegetal. julio-septiembre Vol. 10 (3): 177 184.

Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F- Jimnez-Terry, M. Prez y O. Gutirrez. 2006. Embriognesis somtica directa en Swietenia macrophylla King. Biotecnologa Vegetal, abril-junio, Vol. 6 (2): 67-71.

Collado R., R. Barbn, D. Agramonte, F. Jimnez, M. Prez, O. Gutirrez y D. Ramrez. 2004. Establecimiento in vitro de pices y segmento nodales de Swietenia macrophylla King. Biotecnologa Vegetal, julio-septiembre Vol. 4 (3): 143-146.

Comisin Nacional Forestal (CONAFOR). 2012. Swietenia macrophylla King http://www.conafor.gob.mx:8080/documentos/docs/13/1005Swietenia%20macrophylla.pdf. (01 de octubre de 2012).

Comisin Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO). 2012. Swietenia macrophylla.http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/info_especies/arboles/doctos/37-melia5m.pdf. (19 de junio de 2012).

Convencin sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestre (CITES). 2003. Segunda reunin del grupo de trabajo sobre caoba (Swietenia macrophylla). http://www.cites.org/common/prog/mwg/MWG2/S-MWG2-09-02-MX.pdf. (01 de octubre de 2012).

68

Cordero, J. 2003. rboles de Centroamrica: un manual para extensionistas. http://herbaria.plants.ox.ac.uk/adc/downloads/capitulos_especies_y_anexos/swietenia_macrophylla.pdf. (31 de mayo de 2012).

Daquinta M., M. Cid, Y. Lezcano, D. Pina y R. Rodrguez. 2004. Formacin de callos a partir de inflorescencias inmaduras en Cedro y Caoba hbrida. Biotecnologa Vegetal, abril junio Vol. 4(2): 121 - 124.

Ellis, D. D. and D. T. Webb. 1993. Light regimes used in conifer tissue culture. In: M. R. Ahuja (ed), Micropropagation of woody plants. Kluwer Academic Publishers. Berlin, Germany. pp. 31-55.

Gamborg, O. L., G. C. Phillips. 1995. Plant cell, tissue and organ culture: fundamental methods. Springer-Verlag. Berlin, Germany. pp. 21-26.

George, E. F. 1993. Plant propagation by tissue culture, Part 1, The Technology. 2nd edition. Exegenetics Limited. Basingstock, UK. pp. 89-91

Gillies, A. C. M., C. Navarro, A. J. Lowe, A. C. Newton, M. Hernndez, J. Wilson and J. P. Cornelius. 1999. Genetic diversity in Mesoamerican populations of mahogany (Swietenia macrophylla), assessed using RAPDs. Heredity 83:722732.

Gmez, T. J., J. J. Jasso-Mata, J. J. Vargas-Hernndez y M. R. S. Hernndez. 2006. Deterioro de semilla de dos procedencias de Swietenia macrophylla King, bajo distintos mtodos de almacenamiento. Ra Ximhai 2: 223-239.

Griffiths, M. W., 2001. The biology and ecology of Hypsipyla shoot borers. In: Floyd, R. B. and C. Hauxwell (Eds.). Hypsipyla shoot borers in Meliaceae: Proceedings of an international workshop. Kandy, Sri Lanka, 1996. Australian Centre for International Agricultural Research. Canberra, Australia. pp. 7480.

King, George.1886. Hookers Icones Plantarum 16: t. 1550. Longman, Rees, Orme, Brown, Green & Longman. Vol. 16. London, UK.

Kirakayosan, A., E. M. Seymor and P. Kaufman. 2011. Plant biotechnology for the production of natural products. In: Trigiano R. N. and Grey D. J. Plant tissue culture, development and biotechnology. CRC. Press Boca Ratn, FL USA. pp. 515-530.

Lee, S. K. and A. N. Rao. 1988. Plantlet production of Swietenia macrophylla King through tissue culture. Gardening Bulletin Singapore 41: 11-18.

Lemes, M. R. 2000. Population genetic structure and mating system of Swietenia macrophylla King (Meliaceae) in the Brazilian Amazon: implications for conservations. Ph.D. Thesis. University of Stirling. Scotland, UK. 167 p.

Lemes, M. R., R. Gribel, J. Proctor and D. Grattapaglia. 2003. Population genetic structure of mahogany (Swietenia macrophylla King, Meliaceae) across the Brazilian Amazon, based on variation at microsatellite loci: implications for conservation. Molecular Ecology 12(11): 28752883.

Lloyd, G. and B. H. McCown. 1980. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. In: Combined Proceedings, International Plant Propagators Society. Carlisle, PA USA. Vol. 30: 421-427.

Loyola-Vargas V. M. and F. Vzquez-Flota. 2006. An introduction to plant cell culture. In: Loyola-Vargas V. M. and N. Ochoa Alejo (Eds,). Plant Cell Culture Protocols, Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Humana Press Inc. Totowa, NJ USA. Vol. 318, pp. 51-58.

69

Magnitskiy, S.V. G.A. Plaza. 2007 Fisiologa de semillas recalcitrantes de rboles tropicales. Agronoma Colombiana, Vol. 25. (1): 96-103.

Maruyama, E. 2006. Tissue culture of Swietenia macrophylla King (Big-Leaf Mahogany). In: Suzuki, K. K. Ishii, K. Sakurai and S. Sasa- ki (Eds). Plantation Technology in Tropical Forest Science. Springer-Verlag. Tokyo, Japan. p.p. 131-136.

Maruyama, E.; K. Ishii, A. Saito, and K. Migita. 1989. Screening of suitable sterilization of explants and proper media for tissue culture of eleven tree species of Per Amazon Forest. Journal of Agricultural Science 33: 252-260.

Medina, L.M. y S.R. Sotolongo. 2004. Avances en el cultivo de tejidos de Swietenia macrophylla King X Swietenia mahogani Jacq. (Hbrido de Caoba). Revista Forestal Baracoa. Diciembre, Vol. 23 (2): 19-26.

Navarro, C., J. Cornelius y A. Gillies. 1996. El muestreo de poblaciones y los estudios de diversidad como base para la conservacin y el mejoramiento gentico forestal. In: Salazar, R. (Ed.). Memorias del Simposio sobre Avances en la Produccin de Semillas Forestales en Amrica Latina (1995). CATIE. Turrialba, Costa Rica. pp. 51-55.

Newton, A. C., R. R. B Leakey, K. Powell, R. Chalmers, Z. Waugh, P. Tchoundjeu, J. Mathias, P. G. Alderson, J. F. Mesen, P. Baker and S. Ramnarine. 1994. Domestication of mahoganies. In: Leakey, R. R. B. and A. C. Newton (Eds.) Tropical trees: the potential for domestication and the rebuilding of forest resources. (ITE Symposium, 29). London, UK. pp. 256-266.

Novick, R. R., C.W. Dick, M.R. Lemes, C. Navarro, A. Caccone y E. Bermingham 2003. Genetic structure of Mesoamerican populations of big-leaf mahogany (Swietenia macrophylla) inferred from microsatellite analysis. Molecular Ecology 12: 2885-2893.

Patio V., F. 1998. Los recursos genticos de Swietenia macrophylla y Cedrela odorata en los Neotrpicos: Prioridades para una accin coordinada. http://www.greenstone.org/greenstone3/nzdl?a=d&book=off&c=fi1998&d=HASH2e05c8a14550905767b0ff&dt=simple&sib=1&p.a=b&p.sa=&p.s=ClassifierBrowse. (01 de octubre de 2012).

Pennington, T. D. y J. Saraukn. 2005. rboles tropicales de Mxico. Manual de identificacin de las principales especies. 3 edicin. Fondo de Cultura Econmica. Mxico, D. F. Mxico. 523 p.

Prez Flores, J., M. E., guilas Vega y R. Roca Tripepi. 2012. Assays for the in vitro establishment of Swietenia macrophylla and Cedrela odorata. Rev. Colomb. Biotecnol [online], vol.14, n.1 ISSN 0123-3475. http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-34752012000100003&lng=en&nrm=iso (05 de junio de 2013)

Robledo-Paz, A., M. N. Vzquez-Snchez, R. M. Adame-lvarez y A. E. Jofre-Garfias. 2006. Callus and suspension culture induction, maintenance and characterization. In: Loyola-Vargas V.M. and N. Ochoa Alejo (Eds). Plant Cell Culture Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol 318. Human Press, Heidelberg, Germany. pp 59-70.

Snchez-Soto, S., M. Domnguez-Domnguez y H. Corts-Madrigal. 2009. Efecto de la sombra en plantas de caoba sobre la incidencia de Hypsipyla grandella Zeller y otros insectos, en Tabasco, Mxico Universidad y Ciencia, Vol. 25(3): pp. 225-232.

70

Santiago T., O., V. Snchez M., C. R. Monroy R. y J. G. Salazar G. 2007. Manual de produccin de especies forestales tropicales en contenedor. INIFAP. CIRGOC. Campo Experimental El Palmar. Folleto Tcnico Nm. 44. Veracruz, Mxico. 73 p.

Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). 2010. Anuario estadstico de la produccin forestal 2010. http://www.semarnat.gob.mx/temas/gestionambiental/ forestalsuelos/Anuarios/ANUARIO_2010.pdf. (05 de octubre de 2012).

Slater, A., N. Scott and M. Fowler. 2008. Plant biotechnology, the genetic manipulation of plants (2nd ed.). Oxford University Press. Oxford, UK. pp. 37-53.

Snook, L. K., V. S. Jimenez, M. C. Mundo, C. C. Rivas, F. M. Ek, P.M. Kantn and C. E. Ruz. 2003. Managing natural forests for sustainable harvests of mahogany (Swietenia macrophylla): experiences in Mexicos community forests. Unasylva 214/215, Vol. 54:68-73.

Snook, L. K., L. Cmara-Cabrales, and M. J. Kelty. 2005. Six years of fruit production by mahogany trees (Swietenia macrophylla King): patterns of variation and implications for sustainability. Forest Ecol Manag 206(1): 221-235.

Sotolongo, R. y L. M. Medina. 1998. Callognesis in vitro del hbrido de caoba (S. macrophylla x S. mahogani), Resmenes del III Congreso Latinoamericano de Biotecnologa Vegetal REDBIO 98, La Habana, Cuba. s/p.

Tacoronte, M., M. Vielma, A. Mora & C. Valecillos. 2004. Propagacin in vitro de caoba (Swietenia macrophylla King) a partir de yemas axilares. Acta Cientfica Venezolana 55: 7-12.

Thorpe, T.A. e I.S. Harry. 1991. Clonal propagation of conifers. Plant tissue culture manual. C3. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. pp.1-16.

Thorpe, T. A., I.S. Harry and P. P. Kumar. 1991. Application of micropropagation to forestry. In: Debergh, P. C. and R. H. Zimmerman Eds. Micropropagation. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, The Netherlands. pp. 311-336.

Thorpe, T.A., and K. Patel. 1984. Clonal propagation: adventitious buds. In: Vasil, K. Ed. Cell culture and somatic cell genetics in plants, Vol. 1. Academic Press, Inc. New York, NY USA. pp. 49-60.

Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. http://www.tropicos.org 1(6 Jan 2013)Wightman, K., B. Rodrguez Santiago, S. Ward, and J. Cornelius. 2005. Domestication of Spanish

cedar and mahogany in the Yucatan Peninsula of Mexico: experiences in forest tree germplasm improvement. Recursos Naturales y Ambiente 44: 119-128.

71

ANEXOS

72

73

Resumen del protocolo para la proliferacin de yemas axilares de caoba

Preparacin de un litro de medio cultivo MS.

1. En un vaso de precipitados de 1 litro se vierten 500 ml de agua destilada.

2. Se agregan 30 g de D-sacarosa y los componentes del medio MS(4.33 g), se agita hasta que se disuelva.

3. Se ajusta el pH a 5.7.

4. Se afora a 1 litro.

5. Se agrega el agar y se calienta con agitacin hasta disolver, permitir la ebullicin al menos dos veces.

6. Se vierten 7 ml de medio cultivo por cada tubo, o 30 ml por cada frasco tipo Gerber.

7. Se esterilizan los tubos tapados durante 15 minutos, a 15 lb t 121C.

Obtencin de Explantes.

1. Con tijeras estriles se corta una rama desde la base, la rama debe de contar con un tallo principal no lignificado y dos yemas auxiliares y un pice.

2. Se separan las hojas sin eliminar la base del peciolo para no maltratar las yemas.

3. Se recortan los tallos de forma que no se afecten las yemas pero que se puedan sumergir en frascos con antioxidante.

4. Se sumergen en un frasco con antioxidante para proceder al lavado.

Lavado.

1. Se elimina el antioxidante.

2. Lavar con jabn lquido y con un cepillo o escobilln. Con movimientos suaves se talla toda la superficie del tallo. Repetir 3 veces.

3. Se coloca el tejido en un frasco estril para continuar con la desifeccin.

Desinfeccin.

1. Sumergir el tejido en alcohol al 70% durante 1 minuto con agitacin contnua. Eliminar el alcohol.

2. Se decanta el antioxidante y se sumerge en Captn con agitacin constante y durante una hora.

3. Se mantiene el tejido en captan hasta la siembra.

Siembra.

Se desinfecta la mesa o campana de cultivo tallando con algodn y alcohol al 70%. Se desinfecta el cuarto de siembra con luz UV durante 15 minutos.

El tejido se extrae del captan y se coloca en cajas de Petri estriles.

Se cortan secciones del tallo, de tal forma que cada una contenga un nudo con las yemas auxiliares en la parte media del explante.

74

1.-Material y equipo

CristaleraMatraces Erlenmeyer de 1000 mlProbetas de 1000 mlVasos de precipitado de 1000 mlMatraz aforado 100 mlFrascos tipo Gerber o ISO para cultivo in vitroTubos para cultivo in vitroTapas de plstico esterilizables para frascos o tubos

EquipoCampana de flujo laminarAutoclaveBalanza analticaAgitador magntico con plancha calefactora (o bien un microondas o mechero)pH-metro.Pipeta dispensadora de medio (o una pipeta normal)

MaterialGuantes de cocina de tela o para sujetar objetos calientes.Papel de AluminioPlstico Egapac o ParafilmServitoallas o sanitasTijeras estrilesReloj o cronmetroCepillo pequeo o escobilln de preferencia estril.Guantes de plstico

OtrosDetergente lquido

75

2.- Preparacin de medios y soluciones

Medio Murashigue y Skoog (MS) (Gamborg y Phillips, 1995)

mg/l Stock

(g/100 ml)

ml/l

Macronutimentos (100X)

NH4NO3 1650 165

10 ml

K NO3 1900 190

CaCl22H2O 440 44

MgSO47H2O 370 37

KH2PO4 170 17

Micronutrimentos (1000X)

H3BO3 6.2 6.2

1 ml

ZnSO4H2O 8.6 8.6

CuSO45H2O 0.025 0.025

KI 0.83 0.83

CoCl26H2O 0.025 0.025

MnSO44H2O 22.3 22.3

NaMoO42H2O 0.25 0.25

Fe/EDTA (100X)

FeSO47H2O 27.8 2.78 10 ml

Na2EDTA2H2O 37.3 3.73

Compuestos orgnicos

Myo-inositol 100 Se pesa y adiciona al momento

Niacina 0.5 0.05

10 mlPiridoxinaHCl 0.5 0.05

TiaminaHCl 0.1 0.01

Glicina 2 0.2

Sacarosa 30000 (30g/l) Se pesa y adiciona al momento

Agar 8000 (8g/l)

pH: 5.7-5. 8 se ajusta antes de agregar el agar. Componente: Frmula qumica del compuesto. mg/l: indica cuntos miligramos del compuesto debe tener el medio una vez preparado.Stock (g/100 ml): son soluciones concentradas de los compuestos. Se agrupan en Macronutrimentos, Micronutrimentos, Fe-EDTA, Compuestos orgnicos. Facilita el pesado y manejo. Una vez preparados almacenar en refrigeracin.ml/l: indica cuntos ml de las soluciones stock se usan para preparar 1 l de medio, para que tengan las concentraciones adecuadas de los nutrimentos.La sacarosa, el Myo-inositol y el agar se agregan al momento de usarse.

76

Medio Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd y McCown, 1980)

mg/l Stock (g/100ml) ml/l

Macronutimentos (100X)

NH4NO3 400 40

10 ml

Ca(NO3)2 386 38.6

CaCl22H2O 72.5 7.25

MgSO4, Anhidro 180.7 18.7

KH2PO4 170 17

Micronutrimentos (1000X)

H3BO3