Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En este gráfico se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.

OBJETIVO: Hacer una estimación poblacional de microorganismos utilizando conteo en cámara y turbidimetría. Relacionar estas lecturas con respecto al tiempo.

RESULTADOS:

MUESTRA TIEMPO (hr) D.O.DILUCION (1:Xmm) 1:10 x * 10¨8

1 2 0,75 1 0,075 0,2965

2 3 0,906 1 0,0906 0,5615

3 4 0,548 6 0,3288 0,8101

4 5 0,348 10 0,348 0,8575

5 6 0,418 10 0,418 1,03

6 6 0,597 8 0,477 1,184

7 7 0,532 10 0,532 1,365

8 8 0,884 5 0,442 1,097

9 9 0,432 11 0,3927 0,9747

10 10 0,363 10 0,363 0,785

TABLA 1. Muestra las muestras experimentales, tomadas cada hora, incluye su D.O. experimental a diferentes diluciones, se calculó dicha densidad a dilusión 1:10, se elaboró un conteo en cámara para relacionarse con la absorbancia.

VELOCIDAD DE PRODUCCION

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

2 3 4 5 6 6 7 8 9 10

TIEMPO (hr)

DE

NS

IDA

D P

OB

LA

CIO

NA

L (

* 10

¨4/m

l)

La gráfica de velocidad de crecimiento de la población nos indica la cant. De M.O. en la muestra a diferentes horas, nos da un indicio de cómo se comporta la población en estudio.

DISCUSION DE RESULTADOS:Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. Además, no esta de menos mencionar el hecho de que la absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración y de la distancia recorrida como nos dice la ley de Lambert y la ley de Beer. Si fusionáramos estas leyes, podríamos establecer que al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, hay una perdida que se expresa con la ecuación:It/Io=T-kdc''Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación intensidad incidente) y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiente decrece a medida que el recorrido aumenta. Donde k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuación simplificada de la ley de Beer-LambertA = ε.d.cComprende a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.

La absorción (o absorbancia) es igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la transmitancia:(1)A= log 1/TCon lo anterior podemos deducir que al obtener valores de absorbancia o transmitancia podemos calcular la concentración, aunque todavía nos faltaría una incognita que seria el factor de calibración, al no tener una curva patrón, o mediciones de soluciones estándar nos vemos obligados a utilizar factores ya calculados los cuales se representan en las ecuaciones utilizadas, llamadas dicromáticas, las cuales restan valores de absorbancia multiplicados por valores establecidos y por una relación volumen/peso que nos daría el campo dimensional de la concentración. Los factores por los que se multiplican las absorbancias son relativos a la longitud de onda (Jeffrey 1975)

También es recomendable que las absorbancias obtenidas se les reste una medición de la muestra a una longitud de onda más alta para evitar lectura de impurezas.Para las pruebas en espectro las absorbancias se miden de 0-1 en casi de absorbancia mayor, se realiza una dilución que al final se toma en cuenta para saber la concentración exacta de analito en la muestra, al no tener en cuanta A<1 los resultados pueden variar debido a la saturación de la muestra y las interacciones moleculares llevadas cabo en ella. Para construir la curva patrón se utilizó el conteo en cámara, esta técnica bien utilizada nos puede dar valores muy cercanos a las concentraciones reales. Pero igualmente que en la medición de Abs. Necesitamos hacer diluciones para realizar conteos más fácilmente, ya que una mezcla saturada nos provocaría igualmente errores.El experimento debería repetirse varias veces para tener una curva patrón fiable, y así estimar una mezcla problema o una estimación poblacional con más exactitud.

Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la concentración de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formación de producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato.

CONCLUSION:

El conteo en cámara es efectivo, siempre y cuando se realice con una muestra, para no realizar este conteo con muchas muestras de concentración desconocida podemos valernos de una curva patrón, leyendo muestras ya contabilizadas en un espectrofotómetro, así al leer Abs. De una mezcla podemos determinar la concentración por interpolación en la curva patrón.

Al obtener diferentes muestras en relación al tiempo con las que construimos la curva patrón también calcular la velocidad de reproducción y así utilizar los M.O. en procesos estandarizados.

La velocidad de producción de M.O. dependerá siempre del sustrato, pero siempre llegará a una velocidad máxima como explica el modelo de Michaelis-Menten

Bibliografía:1- Robert L. Pecsok y L. Donal Shields, Métodos modernos de análisis

químicos, Editorial Limusa2- Jeffrey S. W., New spectrophotometric equations for determining

chlorophills , Biochem, Physiol, 1975. 167-194pp