Sóc fill biològic dels meus pares? Estudi de 16 marcadors genètics en 4 membres d'una família
Control biològic del xancre del castanyer al Parc Natural...
Transcript of Control biològic del xancre del castanyer al Parc Natural...
Control biològic del xancre del
castanyer al Parc Natural del
Montseny i Montnegre-Corredor.
Fase 2006
Amb el finançament de:
Desembre 2006
Control Biològic del Xancre del Castanyer a Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
1
Índex ÍNDEX...............................................................................................................................................................1
1. INTRODUCCIÓ .........................................................................................................................................3
1.1. ESTAT DEL PROBLEMA...........................................................................................................................3 1.2. ANTECEDENTS I JUSTIFICACIÓ ..............................................................................................................3
2. OBJETIUS ...................................................................................................................................................6
3. ACTIVITATS 2006.....................................................................................................................................7
3.1. SELECCIÓ DE PLANTACIONS DE CASTANYER ........................................................................................7 3.2. DETERMINACIÓ DELS GCV ...................................................................................................................8 3.3. DETECCIO D’AÏLLAMENTS HIPOVIRULENTS........................................................................................15 3.4. INCIDÈNCIA DE LA MALALTIA .............................................................................................................18
3.4.1. Can Tarrer...................................................................................................................................21 3.4.2. Polell............................................................................................................................................22 3.4.3. Trauna .........................................................................................................................................22 3.4.4. Can Preses...................................................................................................................................22 3.4.5. Fontmartina.................................................................................................................................22
3.5. PRODUCCIÓ DE INÒCUL .......................................................................................................................23 3.6. INOCULACIÓ A CAMP ...........................................................................................................................26
3.6.1. El Samon (Sant Pere de Vilamajor)...........................................................................................29 3.6.2. Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor) .......................................................................................34 3.6.3. Fontmartina (Fontmartina)........................................................................................................36
4. BIBLIOGRAFIA.......................................................................................................................................40
ANNEX I. PARCEL·LES VISITADES .....................................................................................................44
CAN TARRER ...............................................................................................................................................44 Trauna....................................................................................................................................................49 Fontmartina ...........................................................................................................................................57 El Samon ................................................................................................................................................63 Can Preses .............................................................................................................................................70
ANNEX II. TAULES DE CREUAMENTS...............................................................................................73
CAN TARRER ...............................................................................................................................................73 FONTMARTINA ............................................................................................................................................74 EL SAMON ...................................................................................................................................................75 CAN PRESES ................................................................................................................................................76
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
2
ANNEX III. PROVA MORFOLOGICA DELS CULTIUS ...................................................................77
CAN TARRER ...............................................................................................................................................77 FONTMARTINA ............................................................................................................................................77 EL SAMON ...................................................................................................................................................78 CAN PRESES ................................................................................................................................................78
ANNEX IV. INVENTARIS D’ESTAT SANITARI.................................................................................79
PLANTILLA D’INVENTARI ...........................................................................................................................79 CAN TARRER ...............................................................................................................................................80 FONTMARTINA ............................................................................................................................................90 CAN PRESES ................................................................................................................................................95 POLELL ......................................................................................................................................................103 TRAUNA.....................................................................................................................................................108 RESUM INVENTARI ....................................................................................................................................111
ANNEX V. CULTIUS CONVERTITS ....................................................................................................112
EL SAMON .................................................................................................................................................112 FONTMARTINA ..........................................................................................................................................112 CAN TARRER .............................................................................................................................................112
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
3
1. Introducció
1.1. Estat del problema
El xancre del castanyer ha devastat les castanyedes de Catalunya durant els
últims 20 anys. A les comarques del nord-est, els propietaris frustrats per la
reducció dels beneficis de les seves perxades imposada pel xancre,
substitueixen els castanyers per Pinus radiata, assumint un elevat cost, i
potser sense donar suficient importància al risc que Sphaeropsis sapinea i
Fusarium circinatum, dos patògens molt virulents, comprometin la viabililtat
d’aquest pi en el futur. El mètode de control més eficient contra el xancre del
castanyer actualment és la lluita biològica mitjançant el virus CHV1. Aquest
mètode ha estat i és utilitzat amb èxit a diversos països d’Europa.
1.2. Antecedents i justificació
La malaltia del xancre del castanyer, causada pel fong ascomicet
Cryphonectria parasitica (Murril) Barr, originari d’Àsia, porta afectant les
castanyedes europees des de mitjans del segle XX (Milgroom et al., 1996;
Heiniger i Rigling, 1994; Griffin 1986).
La hipovirulència és una malaltia d’aquest fong que dóna lloc a l’atenuació de
la seva virulència, provocada per un virus de RNA de doble cadena (dsRNA)
(Milgroom et al., 1991; MacDonald i Fulbright, 1991; Choi i Nuss, 1992;
Heiniger, 1994). L’hipovrius disminueix la capacitat del fong de matar l’arbre,
doncs els xancres queden reduïts a la part externa de l’excorça i no
destrueixen el càmbium del castanyer (Griffin, 2000; Robin et al., 2000; Homs
et al., 2001). L’agent víric dsRNA es transmet horitzontalment via anastomosis
hifal (Kuhlman et al., 1984; Anagnostakis, 1987; MacDonald i Fulbright, 1991;
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
4
Heiniger, 1994; Griffin, 2000; Baidyaroy et al., 2000), o verticalment mitjançant
els conidis, tot i que no mitjançant les ascospores (Robin et al., 2000; Homs et
al., 2001). La incompatibilitat vegetativa limita l’anastomosis, pel que
restringeix la transmissió de l’hipovirus (Anagnostakis et al., 1986; Choi i Nuss,
1992; Bissegger et al., 1997; Cortesi et al., 2001). La disseminació de
l’hipovirus estaria directament relacionada amb la composició de grups de
compatibilitat vegetativa (GCV) de la població. Així, una de les causes de l’èxit
de la hipovirulència a Europa és la baixa diversitat de GCV (Bissegger et al.
1997).
A Catalunya, s’han detectat 11 GCV, essent domintant un d’ells, EU-2, amb un
55,3% dels 380 aïllaments analitzats, estant present en totes les
subpoblacions mostrejades. La diversitat de GCV, en termes de relació entre
el nombre de GCV i el nombre d’aïllaments analitzats, és baixa (0,03),
comparada amb d’altres poblacions europees on el control biològic (CB) està
funcionant, com és el cas de França (0,20) i Itàlia (entre 0,04 i 0,18, segons la
subpoblació), on la hipovirulència es va expandir de manera natural
(Anagnostakis i Hillman, 1992; Cortesi i Milgroom, 1998; Anziani i Robin, 1999;
Robin et al., 2000; Trestic et al., 2001). L’índex de Shannon (1,37) és
comparable amb el valor donat per Cortesi et al. (1996) per Itàlia (1,23), i
inferior al d’altres regions europees com França (2,71), Bòsnia-Herzegovina
(2,26) (Trestic et al., 2001). Aquesta situació mostra unes bones condicions
per l’èxit del CB a Catalunya.
El CB es basa en l’exposició d’un xancre virulent a inòcul hipovirulent que deu
no només causar la conversió de la soca virulenta, sino també reduir la
quantitat d’inòcul virulent i inciar la producció d’inòcul hipovirulent (MacDonald
i Fulbright, 1991). D’aquesta manera, el fong infectat produeix conidis que són
portadors del virus, i són dispersats per insectes o esquitxades d’aigua que
porten aquests conidis fins un altre xancre. Quan aquests conidis infectats
germinen, transfereixen el virus a les soques sobre les que han caigut
dispersant el virus per la massa de castanyers. Un cop que el virus està
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
5
instal·lat dins d’una massa, els xancres virulents no arriben a donar-se, o
creixen uns centímetres fins a ser infectats pel virus i perden la seva
virulència.
Els factors més importants que influeixen en l’èxit del CB són la virulència, la
diversitat de GCV a la població, la capacitat de conversió, la transmissió del
fenotip hipovirulent als conidis, i la quantitat d’inòcul produït pels aïllaments
hipovirulent (Liu i Milgroom, 1996; Melzer et al., 1997; Robin et al., 2000).
L’aplicació del CB consisteix en la selecció d’un d’aïllament hipovirulent
corresponent al GCV predominant a la població a tractar. L’aïllament
s’introdueix als forats practicats als marges del xancre, de manera que el virus
pot transmetre’s amb èxit, afavorint la seva cicatrització (Anagnostakis, 1995;
Robin et al., 2000; Anziani i Robin, 1999).
A la selecció de soques a aplicar al CB, deu tenir-se en compte la prioritat
d’utilitzar aquells aïllaments amb una producció elevada de conidis
hipovirulents, de manera que s’afavoreix una expansió secundària del virus,
convertint en hipovirulents també els xancres no inoculats (Melzer et al.,
1997).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
6
2. Objetius
Els objectius específics de l’any 2005-2006 han estat els següents:
• Caracteritzar l’estat sanitari de les finques de castanyer situades al Parc
Natural del Montseny i del Montnegre-Corredor, proposades per la
Diputació de Barcelona per a rebre el tractament i la seva adequació
per aquest tipus de tractament.
• Definir la composició en Grups de Compatibilitat Vegetativa (GCV) de
les finques a tractar.
• Avaluar a camp la presència d’hipovirulència natural a les finques a
tractar.
• Inocular les finques seleccionades amb una soca hipovirulenta del GCV
majoritari a la parcel·la, amb diferents intensitats de tractament.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
7
3. Activitats 2006
3.1. Selecció de plantacions de castanyer
Aquesta fase ha consistit en la presa de contacte amb propietaris i gestors
interessats en la recuperació del cultiu del castanyer, preferentment distribuïts
de manera homogènia per la zona de distribució del castanyer, al Parc.
Aquest any, s’ha centrat la selecció de castanyedes en aquelles platacions
destinades a la producció de fusta. S’ha intentat identificar les perxades que
no arribessin al seu torn els propers deu anys, prioritzant aquelles en què
s’havia de fer la selecció de tanys a l’any següent per tal de seguir la
seqüència lògica d’aplicació del control biològic: inoculació i aclarida.
D’aquesta manera, les ferides produïdes durant l’aprofitament, seran punts
d’entrada pel fong hipovirulent introduït prèviament.
S’han realitzat diverses visites a camp, per tal d’evaluar les finques i de
seleccionar les parcel·les idònies pel tractament, d’aquelles que la Diputació
de Barcelona havia proposat com a candidates. A l’annex I es poden observar
les caracterísitiques de les parcel·les.
A continuació es fa una relació de les parcel·les propostes per la Diputació de
Barcelona (Taula 1).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
8
Taula 1. Parcel·les proposades per la Diputació de Barcelona per a fer tractament.
Comarca Municipi Nom Coor X Coor Y
Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor Polell 449113 4621136
Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor Can Tarrer 449241 4619862
Vallès Oriental Fontmartina Fontmartina 449165 4619916
Vallès Oriental Sant Pere de Vilamajor El Samon 449678 4622466
Vallès Oriental Fogars de Montclús Trauna 451388 4624747
Vallès Oriental Sant Celoni Can Preses 466314 4612400
El resultat d’aquesta fase ha estat la priorització per a la inoculació, segons les
condicions de les parcel·les visitades a camp, de les parcel·les d’El Samon
(Sant Pere de Vilamajor), Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor) i Fontmartina
(Fontmartina).
3.2. Determinació dels GCV
Aquesta fase va consistir en la determinació dels GCV de les parcel·les a
tractar, per tal de triar el grup majoritari de la zona i l’aïllament que seria el
portador de l’inòcul.
Per tal de decidir a quines parcel·les s’havia de fer el mostreig de GCV, es van
cartografiar el punts amb GCV coneguts i les noves parcel·les on s’havia
d’inocular. Els punts amb GCV coneguts van ser aquells d’estudis previs
realitzats al Laboratori de Patologia Forestal de la Universitat de Lleida.
El mostreig a camp va consistir en agafar mostres d’escorça de 10 xancres de
10 arbres diferents: dos xancres dels dos castanyers afectats més propers al
punt central; i altres dos dels dos arbres malalts més propers a cadascun dels
quatre punts situats a 10 m dels punt central en direcció nord, sud, est i oest
(Homs et al., 2001). De cadascun d’aquests xancres, es van prendre dues
mostres d’escorça (Il·lustració 1, Il·lustració 2 i Il·lustració 3).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
9
Il·lustració 1. Instrument per extraure les mostres.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
10
Il·lustració 2. Gradeta on es guarden les mostres d’escorça.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
11
Il·lustració 3. Xancre mostrejat a la finca d’El Samon, es pot apreciar
l’extracció de dos mostres d’escorça.
A més amb l’objectiu de detectar totes les possibles soques hipovirulentes de
la zona, es van prendre mostres addicionals de l’escorça d’arbres cicatritzats o
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
12
en procés de cicatrització, tan si estaven als punts de mostreig com si estaven
al voltant o al camí d’accés.
A la fase de laboratori, les mostres d’escorça es van aïllar segons la
metodologia desenvolupada per Anagnostakis et al. (1986). A la Il·lustració 4
pot veure el procés d’aïllament del fong en agar al 2%, segons la metodologia
abans esmentada. El procés va consistir en passar les mostres d’escorça per
aigua oxigenada 10 segons, aigua destil·lada autoclavada 10 segons més, i un
segons, per eliminar l’excés d’aigua, en paper dessecant.
Il·lustració 4. Procés d’aïllament del fong Cryphonectria parasitica, a partir de les mostres d’escorça.
La determinació de GCV es va portar a terme segons la metodologia descrita
per Anagnostakis (1988). Es van transferir a PDA (Potato Dextrose Agar)
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
13
petites porcions (menys de 3 mm per costat) de miceli del front d’avanç de
cultius que portaven en creixement menys de 7 dies (Anagnostakis et al.,
1986). Es van col·locar les peces de miceli a examinar separades a una
distància no superior a 5 mm i es van incubar a 25-27ºC a les fosques
(Anagnostakis et al., 1986) durant 7 dies, seguits d’una incubació a la llum del
dia al laboratori durant 7 dies més (Robin et al., 2000). Aquest procés es pot
veure a la Il·lustració 5. Es van realitzar vuit creuaments (parells de peces de
miceli) per cada placa de petri de 9 cm de diàmetre.
Il·lustració 5. Prova de compatibilitat vegetativa a la campana de flux laminar.
Es va evaluar la compatibilitat vegetativa segons la resposta de barreja-
barrera dels micelis (Anagnostakis, 1988) (Il·lustració 6 i Il·lustració 7). La
barreja de les dues soques indicava que aquestes eren compatibles (Bisseger
et al., 1997). En aquest cas, les hifes s’anastomosen (Anagnostakis, 1987). La
formació d’una línia de barrera entre les dues soques indicava la
inocompatibilitat vegetativa entre aquestes (Bisseger et al., 1997). A la zona
de barrera, es trobaven les cèl·lules mortes on l’anastomosis havia tingut lloc,
sense miceli aeri que la cobrís (Anagnostakis et al., 1986), i els picnidis aliniats
a ambdós costats de la barrera.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
14
Il·lustració 6. Placa amb creuaments.
Il·lustració 7. Soques compatibles (esquerra) i incompatibles (dreta).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
15
Es van creuar tots els aïllaments d’una mateixa parcel·la de mostreig entre
ells, en totes les combinacions possibles, i es va guardar un aïllament de cada
GCV per a creuar amb cadascun dels GCV trobats a Catalunya fins a la data
(EU-1, EU-2, EU-5, EU-12, EU-65, EU-66, EU-67, EU-72, CAT-B, CAT-H,
CAT-X). Si els aïllaments d’una parcel·la eren incompatibles amb aquests
aïllaments-tipus, es van creuar amb la resta dels 74 aïllaments-tipus europeus.
El mostreig de GCV es va dur a terme a les següents parcel·les: Can Tarrer
(Sant Pere de Vilamajor), Fontmartina (Fontmartina), El Samon (Sant Pere de
Vilamajor) i Can Preses (Sant Celoni).
A les taules de l’annex II, es poden veure les proves de creuaments entre els
aïllaments de les parcel·les i els tipus. Les proves de compatibilitat vegetativa
de la parcel·la Can Preses s’han inclòs només els resultats dels GCV
existents, però no estan determinats encara a quin grup es corresponen
(nodet). A les taules, es poden veure GCV que no han estat compatibles amb
cap dels onze GCV trobats a Catalunya fins a la data (noCat) i, actualment
s’estan creuant amb la resta de testers presenta a Europa, esperant resultats.
3.3. Detecció d’aïllaments hipovirulents
Per detectar els possibles aïllaments hipovirulents ja presents a les parcel·les
visitades, es va fer la prova morfològica descrita per Bisseger et al. (1997).
Aquest mètode es va aplicar a tots els aïllaments recollits als mostreigs. La
prova morfològica va consistir en la classificació de l’aparença dels cultius de
C. parasitica, que està correlacionada amb la infecció del fong per l’hipovirus
europeu (Choi et al. 1992; Day et al., 1977; Rigling et al., 1989).
L’aparença típica blanca en PDA s’ha utilitzat àmpliament per a distingir les
soques hipovirulentes de les virulentes, tot i que s’ha observat una expressió
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
16
variable dels fenotips associats a les soques que contenen dsRNA (Heiniger et
al., 1994; Uscuplic et al., 1999).
La morfologia del cultiu no deu ser l’únic criteri per a determinar la
hipovirulència d’aïllaments desconeguts (MacDonald i Fulbright, 1991), per
això, es va fer aquesta prova com a primera aproximació i, dels possibles
aïllaments hipovirulents, se’n va fer l’extracció de dsRNA. L’extracció es va dur
a terme segons la metodologia descrita per Allemann et al. (1999).
En cultiu, els aïllaments hipovirulents (Il·lustració 8) mostren una velocitat de
creixement menor que els virulents (Il·lustració 9), un miceli de color blanc o
lleugerament ataronjat (MacDonald i Fulbright, 1991; Anagnostakis, 1987;
Anagnostakis, 1995), i una escassa producció de picnidis (Kuhlman et al.,
1984; Heiniger, 1994; Heiniger i Rigling, 1994; Anziani i Robin, 1999; Uscuplic
et al., 1999; Dawe i Nuss, 2001). Al contrari, els aïllaments virulents
normalment presenten un ràpid creixement, un miceli dens i taronja, i una
producció abundant de picnidis (Kuhlman et al., 1984; MacDonald i Fulbright,
1991; Heiniger, 1994; Uscuplic et al., 1999).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
17
Il·lustració 8. Aparença del miceli hipovirulent de Cryphonectria parasitica.
Il·lustració 9. Aïllament virulent de Cryphonectria parasitica.
D’aquesta manera es va utilitzar la següent classificació per a determinar la
infecció per l’hipovirus dels aïllaments analitzats: B, quan el cultiu era
totalment blanc i presentava una producció de picnidis poc freqüent; Po, quan
l’aïllament presentava una morfologia anormal, era ataronjat clar sense ser
totalment blanc; R, quan el creixement era escà o irregular; i Pi, quan
l’aïllament presentava una abundant i freqüent producció de picnidis i una
aparença taronja brillant.
Per evaluar les característiques morfològiques del cultiu, es van cultivar tots
els aïllaments de C. parasitica en plaques de petri amb PDA incubant-los a
25ºC a les fosques durant 7 dies, seguits d’una incubació a la llum del dia al
laboratori durant 5 dies (Bissegger et al., 1997). Sota aquestes condicions, els
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
18
aïllaments virulents i hipovirulents van desenvolupar una morfologia en cultiu
clarament diferent.
A l’annex III es pot veure la morfologia dels cultius analitzats.
L’extracció de dsRNA es va realitzar d’aquells aïllaments que van donar a la
prova d’hipovirulència B, Po, o R, d’aquelles parcel·les que s’havien d’inocular,
per saber si els aïllaments s’havien de convertir, en cas de no tenir el virus,
amb l’aïllament hipovirulent catalá, LL0559. La extracció de dsRNA podia
donar positiva (+), confirmant-se la presència de l’hipovirus, o negativa (-),
aïllament sense hipovirus.
3.4. Incidència de la malaltia
Es va dissenyar una plantilla per fer l’inventari de la incidència de la malaltia
(annex IV). L’inventari va consistir en l’establiment d’una parcel·la de 6 m de
radi, de tal manera que entressin 15 arbres o més. Si amb un radi de 6 m no
entraven 15 arbres com a mínim, es va augmentar el radi, fins a arribar a
aquest mínim d’arbres. El radi es va fer amb l’ajut d’un distanciòmetre, que es
pot veure a la Il·lustració 10.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
19
Il·lustració 10. Centre d’una de les parcel·les inventariades, amb el distanciòmetre com a referència del punt central.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
20
Es va contabilitzar cada soca i els arbres de cada soca. Si les soques només
tenien un tanys per soca, no es van contabilitzar les soques, sino els tanys
com a arbres individuals. En el cas de parcel·les de castanyers de fruit, es van
contabilitzar els arbres i el nombre de rebrots o branques (N rebrots) per arbre.
A cada arbre (tany, rebrot o branca) es van numerar els xancres presents,
classificant-los en xancres hipovirulents, virulents o intermitjos segons les
següents característiques:
- Xancres hipovirulents: xancres atípics que havien estat frenats per les
defenses de l’arbre. Havien cicatritzat. No presentaven coloració
vermellenca, ni una abundant producció de conidis.
- Xancres intermitjos: xancres que tenien una aparença entre virulenta i
hipovirulenta. Tenien característiques de xancres virulents i
hipovirulents. Podien estar parcialment cicatritzats o presentar un
creixement retingut o escàs, però tenir una producció de conidis
considerable.
- Xancres virulents: xancres en fase de creixement actiu, coloració
vermellenca i abundant producció de conidis.
La classificació de l’aparença dels xancres a camp no determina
definitivament la virulència del fong. En el cas dels xancres d’aparença
hipovirulenta, s’hauria de demostrar per tècniques moleculars la presència de
l’agent víric causant de la hipovirulència, per tal de determinar la seva condició
hipovirulenta.
Es va mesurar també la severitat de la malaltia per a cada arbre en termes de
percentatge de capçada morta. Es va estimar a partir de la quantitat de
branques mortes o sense rebrots i aquelles que encara produien. Les classes
establertes per a definir la severitat van ser aquestes:
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
21
- 0: 0% de capçada morta, arbre sa.
- 1: 1-25% de capçada morta.
- 2: 26-50% de capçada morta.
- 3: 51-75% de capçada morta.
- 4: 76-99% de capçada morta.
- 5: 100% de capçada morta, arbre mort.
Es van contabilitzar tots els xancres que podien veure, marcant-se amb esprai.
Aquells que eren inaccessibles i no es podien marcar, es van registrar a la
plantilla amb un asterisc. De la mateixa manera, es van marcar el nombre de
mostres agafades dels xancres, en cas de ser atípics; i el nombre de fotos
fetes als xancres, en el cas que se n’haguessin fet.
A l’annex IV, es poden observar els inventaris fets a les següents finques
(entre parèntesis, el nombre de parcel·les d’inventari realitzades a cadascuna
de les finques): de Sant Pere de Vilamajor, Can Tarrer (6), Polell (3); de
Fogars de Montclús, Trauna (3); de Sant Celoni, Can Preses (4); de
Fontmartina, Fontmartina (5).
3.4.1. Can Tarrer
Can Tarrer va constituir el paratge amb un percentatge més gran de xancres
d’aparença hipovirulenta (3%), trobats a tres de les sis parcel·les mostrejades,
essent el percentatge en una d’elles força elevat (13%). Aquestes xifres van
quedar reflectides en la severitat mitjana de la parcel·la, de grau 1.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
22
3.4.2. Polell
El paratge Polell tenia un elevat percentatge de xancres virulents, 88% del
total de xancres, i només un 9% i un 2% de xancres intermitjos i hipovirulents,
respectivament. Els xancres hipovirulents trobats estaven concentrats en una
de les tres parcel·les mostrejades, en una proporció del 4%. La severitat
mitjana de la parcel·la va ser de grau 2.
3.4.3. Trauna
En aquest paratge van ser mostrejades tres parcel·les. D’aquestes, dos van
presentar el 100% dels xancres amb aparença virulenta. A l’altra parcel·la, hi
va haver un 11% de xancres intermitjos, i un 89% de xancres virulents. Calia
destacar la inexistència de xancres d’aparença hipovirulenta, i una severitat
mitjana de grau 2.
3.4.4. Can Preses
Aquest paratge va destacar per no presentar cap xancre d’aparença
hipovirulenta, en cap de les quatre parcel·les mostrejades. Tot i així, el
percentatge mitjà de xancres virulents va ser el més baix de tots els paratges,
amb un 75%. El 25% restant dels xancres tenien característiques intermitges
entre xancres virulents i hipovirulents.
La severitat mitjana de les quatre parcel·les va ser de grau 2.
3.4.5. Fontmartina
De les cinc parcel·les mostrejades a Fontmartina, es van trobar només dos
xancres hipovirulents en una d’elles (FMT2), la qual cosa representava un 4%
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
23
del total de xancres d’aquesta parcel·la, i 1% del total de xancres d’aquest
paratge.
La severitat va ser de grau 2.
3.5. Producció de inòcul
Després de la decisió de les parcel·les a inocular, es va procedir a la
preparació de l’inòcul.
Es van triar quatre aïllaments del GCV majoritari de la parcel·la i es van
convertir amb l’aïllament LL0559, segons el següent procediment: es va posar
una porció de miceli de l’aïllament a convertir i una altra porció de miceli de
l’aïllament LL0559 separats 5 mm, en un extrem de la placa de petri amb PDA.
Es van fer tres plaques de conversió per aïllament. Un cop es va veure que
l’aïllament LL0559 havia convertit al virulent, es va transferir l’aïllament
convertit a una altra placa de petri amb PDA. La conversió es feia palesa pel
canvi en el patró de creixement de l’aïllament virulent i pel canvi de coloració,
de manera que l’aïllament virulent passa de tenir una presència abundant de
conidis i una coloració taronja, a tenir un miceli blanc (Il·lustració 11 i
Il·lustració 12). Després d’aïllar el cultiu convertit, es va repicar en vàries
plaques de petri, per tal de fer la prova morfològica d’hipovirulència.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
24
Il·lustració 11. Placa on es pot observar la conversió de l’aïllament virulent, degut a la compatibilitat vegetativa entre ambdues soques.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
25
Il·lustració 12. Placa on es veu que la conversió de l’aïllament virulent no s’ha produït, degut a la incompatibilitat vegetativa entre ambdues
soques.
Paralel·lament, es va fer l’extracció de dsRNA dels aïllaments convertits.
L’aïllament que va donar blanc a la prova morfològica i positiu a l’extracció de
dsRNA, es va utilitzar com a inòcul.
Un cop triat l’aïllament, es va repicar en grans quantitats en plaques de petri
amb poc PDA i es va fer crèixer durant 7 dies a la llum. Quan el miceli havia
cobert tota la placa, es va triturar el miceli de totes les plaques fent una pasta
uniforme que es va introduir en tubs de plàstic, per la seva posterior aplicació
en camp (Il·lustració 13).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
26
Il·lustració 13. Procés d’elaboració de l’inòcul a la campana de flux laminar.
A l’annex V, es poden veure els aïllaments convertits per a cada parcel·la
inoculada i els resultats de la prova d’hipovirulència. A les taules es poden
veure els aïllaments convertits, data de la prova d’hipovirulència, el resultat de
la prova (morfologia), i el resultat de les extraccions (-, negatiu; +, positiu,
infectat pel virus; buit, si no s’ha fet l’extracció).
3.6. Inoculació a camp
Aquesta fase va consisitir en la inoculació a camp dels xancres trobats sobre
els arbres seleccionats. Es va utilitzar la tècnica d’inoculació amb miceli,
preparat segons l’apartat anterior.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
27
Els arbres seleccionats pel tractament van ser prioritàriament aquells més
vigorosos amb xancres hipovirulents. Els arbres morts o amb un alt
percentatge de capçada morta, no van ser prioritzats, tot i que de vegades van
ser inoculats, degut a la manca d’altres castanyers en millor estat.
La inoculació amb miceli va consistir en practicar forats al voltant dels xancres
seleccionats, separats un centímetre del front d’avanç del fong (Il·lustració 14).
Es va introduir l’inòcul dins dels forats (Il·lustració 15), tapant-los posteriorment
amb cinta adhesiva, per evitar la dessecació del miceli (Il·lustració 16).
Il·lustració 14. Forats realitzats la perifèria del xancre.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
28
Il·lustració 15. Introducció del miceli als forats practicats al voltant del xancre.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
29
Il·lustració 16. Xancre inoculat amb la cinta adhesiva per evitar la dessecació.
Es va fer inoculacions a les parcel·les d’El Samon, Can Tarrer i Fontmartina.
3.6.1. El Samon (Sant Pere de Vilamajor)
La inoculació es va realitzar el dia 6/9/06.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
30
L’objectiu d’aquesta inoculació va ser doble: d’una banda, aconseguir la
disseminació de l’hipovirus a la finca El Samon; i de l’altra, avaluar la dispersió
de l’hipovirus a la zona tractada i al seu perímetre.
Per assolir aquest doble objectiu, es van establir tres àrees dins de la finca de
0,06 ha (20×20 m). A una d’elles, es van tractar el 50% dels xancres
accessibles trobats (un sí, un no); a una altra, es van tractar el 100% dels
xancres accessibles (tres de cada quatre); i a l’altra no es va tractar cap
xancre, constituint la parcel·la control.
Cada parcel·la es va inocular seguint transectes segons corbes de nivell, fins a
cobrir la totalitat de l’àrea seleccionada a tractar. Els xancres que es van
inocular van ser preferentment aquells que es trobaven en arbres joves i
vigorosos, essent marcats per a evitar que fossin tallats a les aclarides, i
utilitzar-los així com a punt de dispersió de la hipovirulència. Els xancres en un
estat molt avançat, que estaven a punt de matar l’arbre, en principi, no es van
inocular (Il·lustració 17).
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
31
Il·lustració 17. Arbre no inoculat, per l’estat avançat del xancre virulent.
A l’àrea tractada cadascun dels xancres inoculats es van marcar amb esprai
vermell i un número al costat del xancre; es van marcar els arbres amb una
cinta, per a poder localitzar-los en futurs seguiments. Els xancres d’aparença
hipovirulenta que s’anaven trobant es van marcar i numerar amb esprai groc.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
32
A la parcel·la control es van marcar els xancres virulents i hipovirulents
existents, amb el mateix codi de colors (vermell, pels xancres virulents, i groc,
pels hipovirulents).
Es van establir transectes de seguiments de la disseminació de l’hipovirus de
la següent manera: tres transectes paral·lels, seguint la direcció de les corbes
de nivell, separats a una distància de 20, 40 i 60 m dels costats inferior i
superior de la parcel·la (Figura 1). Els transectes van tenir una longitud de 30
m i una amplada de 5 m. A la es pot observar la disposició dels transectes per
a les àrees tractades. Dins dels transectes es van marcar i numerar els
xancres virulents i hipovirulents existents amb esprai vermell i groc,
respectivament.
Figura 1. Esquema de l’àrea d’inoculació i dels tres transectes de seguiment a 20, 40 i 60 m de l’àrea tractada.
A la primera parcel·la on la intensitat del tractament va ser del 100%, es van
inocular 31 xancres. i a la segona parcel·la, amb una intensitat del 50%, es
van inocular 20 xancres. Alguns d’aquests xancres es poden observar a la
Il·lustració 18 i Il·lustració 19.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
33
Il·lustració 18. Xancre inoculat a la parcel·la d’El Samon. Es poden
observar els forats practicats a l’escorça i la pasta introduïda.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
34
Il·lustració 19. Xancre basal inoculat a la parcel·la d’El Samon.
3.6.2. Can Tarrer (Sant Pere de Vilamajor)
La inoculació es va fer el dia 10/10/06.
La metodologia que es va seguir per a la inoculació va ser la mateixa que la
utilitzada per a la finca d’El Samon. A la primera parcel·la es van inocular tots
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
35
els xancres accessibles i presents en arbres que no estaven morts, és a dir,
amb una intensitat de tractament del 100%. El total dels xancres inoculats en
aquesta parcel·la, va ser de 30 xancres.
A la segona parcel·la es van inocular 15 xancres, el 50% dels xancres
virulents accessibles. Es poden observar els treballs d’inoculació a la
Il·lustració 20 i Il·lustració 21.
Il·lustració 20. Treballs d’inoculació a la finca de Can Tarrer.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
36
Il·lustració 21. Marcatge dels límits de la parcel·la a inocular.
La tercera parcel·la, es va deixar com a control, marcant els xancres trobats.
3.6.3. Fontmartina (Fontmartina)
La inoculació es va fer el dia 11/10/06.
La inoculació d’aquesta parcel·la es va fer al voltant de l’àrea tallada arreu
d’aquesta finca (Il·lustració 22). Es va marcar un perímetre de 10 m d’amplada
i es va inocular cadascun dels xancres. Es poden observar els treballs
d’inoculació a la Il·lustració 23.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
37
Il·lustració 22. Estat del rebrot de les soques que havien estat tallades, el dia de la inoculació.
Il·lustració 23. Treballs d’inoculació a la finca Fontmartina.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
38
A una part del perímetre, el castanyer es trobava barrejat amb alzina
(Il·lustració 24). En total, es van inocular 45 xancres. Es van trobar dificultats
durant la inoculació, degut a l’elevada edat dels castanyers (Il·lustració 25).
Això dificultava la distinció dels xancres, doncs les esquedes naturals de
l’escorça confonien els xancres. D’altra banda, els rebrots, generalment, no
tenien el diàmetre suficient per a ésser inoculats.
Il·lustració 24. Castanyeda mixta amb alzinar.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
39
Il·lustració 25. Castanyers adults a la finca de Fontmartina.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
40
4. Bibliografia
Allemann, C.; Hoegger, P.; Heiniger, U.; Rigling, D.; (1999). Genetic variation
of Cryphonectria hypoviruses (CHV1) in Europe, assessed using
RFLP markers. Molecular Ecology 8: 843-854.
Anagnostakis, S.L. (1988). Cryphonectria parasitica, cause of chestnut blight.
Adv. Plant Pathol. 6: 123-136.
Anagnostakis, S.L.; (1987). Chestnut blight: the classical problem of an
introduced pathogen. Mycologia, 79: 23-37.
Anagnostakis, S.L.; (1995). The pathogens and pests of chestnuts. Advances
in Botanical Research, 21: 125-145.
Anagnostakis, S.L.; Hau, B.; Kranz, J.; (1986). Diversity of vegetative
compatibility groups of Cryphonectria parasitica in Connecticut and
Europe. Plant Disease, 70(6): 536-538.
Anagnostakis, S.L.; Hillman, B.; (1992). Evolution of the chestnut tree and its
blight. Arnoldia 52,2:3-10.
Anziani, C.; Robin, C.; (1999). Le chancre du châtaignier en France. Phytoma,
La Défense des Végétaux, 517: 44-47.
Baidyaroy, D.; Huber, D.H.; Fulbright, D.W.; Bertrand, H.; (2000). Transmisible
mitochondrial hypovirulence in a natural population of Cryphonectria
parasitica. Molecular plant-microbe interactions: MPMI. 13(1): 88-95.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
41
Bissegger, M.; Rigling, D.; Heiniger, U.; (1997). Population structure and
disease development of Cryphonectria parasitica in European
Chestnut forests in the presence of natural hypovirulence.
Phytopathology, 87: 50-59.
Choi, G.H.; Nuss, D.L.; (1992). Hypovirulence of chestnut blight fungus
conferred by an infectious viral cDNA. Science, 257(5071): 800-803.
Cortesi, P.; McCulloch, C.E.; Song, H.; Lin, H.; Milgroom, M. G.; (2001).
Genetic control of horizontal virus transmission in the chestnut blight
fungus, Cryphonectria parasitica. Genetics 159: 107-118.
Cortesi, P.; Milgroom, M. G.; (1998). Genetics of vegetative incompatibility in
Cryphonectria parasitica. Applied and Environmental Microbiology,
64(8): 2988-2994.
Dawe, A. L.; Nuss, D. L.; (2001). Hypoviruses and chestnut blight: exploiting
viruses to understand and modulate fungal pathogenesis. Annual
Review of Genetics, 2001. 35: 1-29.
Day, P. R.; Dodds, J. A.; Elliston, J. E.; Jaynes, R. A.; Anagnostakis, S. L.
(1977). Double-stranded RNA in Endothia parasitica. Phytopathology
67: 1393-1396.
Griffin, G. J.; (1986). Chestnut blight and its control. Horticultural reviews, 8:
291-335. Griffin, G.J.; (2000). Blight control and restoration of the
American chestnut. Journal of forestry. 98(2): 22-27.
Griffin, G. J.; (2000). Blight control and restoration of the American chestnut.
Journal of Forestry 98(2), 22-27.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
42
Heiniger, U.; Rigling, D.; (1994). Biological control of chestnut blight in Europe.
Annu. Rev. Phytopathol., 32: 581-599.
Heiniger, U.; (1994). Le chancre de l'écorce du châtaignier (Cryphonectria
parasitica). Symptômes et biologie. Nierhaus-Wunderwald, Dagmar,
22: 1-7.
Homs, G.; Rodríguez, J.; Rigling, D.; Colinas, C.; (2001). Caracterización de la
población de Cryphonectria parasitica y detección de cepas
hipovirulentas en 3 subpoblaciones de Cataluña. Montes para la
sociedad del nuevo milenio. III Congreso Forestal Español. Ed.
Junta de Andalucía. Granada.
Kuhlman, E.G.; Bhattacharyya, H.; Nash, B.L.; Double, M.L.; MacDonald, W.L.;
(1984). Identifying hypovirulent isolates of Crypthonectria parasitica
with broad conversion capacity. Phytopathology, 74(6): 676-682.
Liu, Y.C.; Milgroom, M. G.; (1996). Correlation between hypovirus transmission
and the number of vegetative incompatibility (vic) genes different
among isolates from a natural population of Cryphonectria parasitica.
Phytopathology, 86 (1): 79-86.
Macdonald, W.L.; Fulbright, D.W.; (1991). Biological-Control of Chestnut Blight
- Use and Limitations of Transmissible Hypovirulence. Plant
Disease, 75: 656-661. (Del tercer párrafo de la página 657).
Melzer, M.S.; Dunn, M.; Zhou, T. y Boland, G. J.; (1997). Assessment Of
Hypovirulent Isolates Of Cryphonectria Parasitica For Potential In
Biological Control Of Chestnut Blight Canadian Journal Of Plant
Pathology_Revue Canadienne De Phytopathologie, 19(1): 69-77.
Control Biològic del Xancre del Castanyer al Montseny i Montnegre-Corredor. Fase 2006
43
Milgroom, M.G.; Macdonald, W.L.; Double, M.L.; (1991). Spatial Pattern-
Analysis of Vegetative Compatibility Groups in the Chestnut Blight
Fungus, Cryphonectria Parasitica. Canadian Journal of Botany, 69:
1407-1413.
Milgroom, M.G.; Wang, K.; Zhou, Y.; Lipari, S.E.; Kaneko, S.; (1996).
Intercontinental population structure of the chestnut blight fungus,
Cryphonectria parasitica. Mycologia, 88(2): 179-190.
Rigling, D.; Heiniger, U.; Hohl, H. R.; (1989). Reduction of Laccase activity in
dsRNA-containing hypovirulent strains of Cryphonectria (Endothia)
parasitica. Phytopathology 79, 219-223.
Robin, C.; Anziani, C.; Cortesi, P.; (2000). Relationship between biological
control, incidence of hypovirulence, and diversity of vegetative
compatibility types of Cryphonectria parasitica in France.
Phytopathology, 90: 730-737.
Trestic, T.; Uscuplic, M.; Colinas, C.; Rolland, G.; Giraud, A.; Robin, C.; (2001).
Vegetative compatibility type diversity of Cryphonectria parasitica
populations in Bosnia-Herzegovina, Spain and France. For. Snow
Lands. Res., 76(3): 391-396.
Uscuplic, M.; Trestic, M.; (1999). Chestnut blight in Bosnia-Herzegovina and its
control. Proceedings of the Second International Symposium on
Chestnut, Bordeaux, Frances, 19-23 October, 1998. Acta Horticulturae
1999, 494, 489-494.