CRECIMIENTO MICROBIANO

TECNICAS DE MEDICION DEL CRECIMEINTO MICROBIANO

La cuantificación de la concentración celular en un medio de cultivo es de suma importancia en la determinación de le estequiometria y de la cinética dl crecimiento microbiano, por lo que es necesario contar con medios precisos para su medición. Existen diversos métodos usados en la cuantificación de la concentración celular, pero todos ellos pueden ser agrupados en dos grandes categoría, los métodos directos y los métodos indirectos. En general los métodos directos obtienen una medida directa de la masa celular por diversos mecanismos, en cambio los métodos indirectos miden más bien la concentración de algún componente celular (ADN proteínas, etc.) y luego establecen una relación entre tal compuesto y las células.

Entre los métodos directos están los que miden la densidad numérica de las células, entre los cuales se consideran las diversas técnicas de conteo, y otros que miden la conc3entracion de masa celular como; peso celular, y la absorbancia de luz.

a) Conteo celular: Es un método de determinación de la densidad numérica y se basan en contar directamente en un microscopio las células, determinando la masa celular por unidad de volumen, con ese fin se colocan muestras del cultivo adecuadamente diluidas en porta-objetos y se procede a contar las células en un microscopio. Par facilitar esta labor existen diversos accesorios que hacen menos tedioso el conteo, entre ellos se tienen; las cámaras de Neubauer, de Petrff-Hausser, el hemacitómetro y los microscopios graduados como de Helber. En ellos se cuenta con rejillas calibradas, de modo que se pueda contar el número de células por cada uno de los cuadrantes de la rejilla, que luego se puede multiplicar por el total de cuadrantes, y por las veces que se diluyó la muestra para obtener la densidad celular. Para tener una gran seguridad estadísticamente razonable es conveniente contar unos veinte cuadrantes.Existen hoy en día nuevos instrumentos en desarrollo, con contadores automáticos que por ejemplo usan la alta resistencia eléctrica de las células para contarlas por pulsos de resistencia, para su uso se convierte el medio en una solución electrolítica, se toma una muestra y se la coloca en un tubo porta muestras, luego el contador cuenta con un sistema que aplica al tubo un vacio y succiona la solución electrolítica con las células electro-aislantes, el contador posee dos electrodos, a través de los cuales se aplica un potencial eléctrico en el orificio de succión, a medida que las células pasan por el orificio se produce un incremento en la resistencia eléctrica, los cual provoca la formación de pulsos en un medidor de voltaje. El número de pulsos es una medida del número de células y como quiera que el tubo tenga un volumen conocido se tiene una medida del tamaño celular. Esta técnica es muy buena pero solo para células discretas por lo que no puede usarse con organismos miceliales. El mayor inconveniente de estas técnicas es que no diferencian entre células totales y células viables.

b) Conteo en placas: También se puede hacer el conteo usando Placas Petri con u medio gelificado en agar-agar, para ello se diluye varias veces la muestra liquida y luego se esparce sobre la superficie sólida 0.1 ml. De la muestra, incubando hasta que transcurran unas 25 generaciones, luego d lo cual cada célula dará lugar a colonias, las cuales pueden ser observadas a simple vista y contadas como tales. El resultado es expresado en unidades de conformación de colonias. Este método tiene la desventaja de ser muy largo, pues suele r5equerir unas 24 horas de incubación, y exigir muy buenas técnicas de esterilización, además puede dar errores cuando se trata de células agregadas en cuyo caso una colonia no será necesariamente producida por una célula individual.

c) Peso seco: Este es el metodo mas comúnmente usado para la determinación de la concentración celular, y consiste en secar volúmenes conocidos de medio de cultivo con las células en crecimiento, hasta obtener un peso constante, expresando la concentración en g/l. Cuando se trata de células de levadura que pueden fácilmente centrifugadas se puede usar una centrifuga con velocidades de 4-6*103 rpm con lo cual se logra obtener una masa húmeda d células, luego esta masa se la va y seca a 80º C por 24 horas, para proceder a pesar en un portaobjetos debidamente destarado.Cuando se trata de células bacterianas difíciles de centrifugar se usan filtros de membranas (ultrafinos) para obtener la masa celular húmeda, y luego se procede a secar, como en el caso anterior.Esta técnica solo puede ser u8sada cuando el medio no contiene sólidos en suspensión como es el caso de: melazas, celulosa, o licor de maíz. Sin embargo, en estos casos se puede intentar corregir el peso final para considerar la fracción que corresponde a los sólidos del medio. Adicionalmente el método presenta la desventaja de requerir muestras muy grande4s y de ser sumamente lentos.

d) Absorción de luz: En esta técnica s aprovecha la particularidad de las células para desviar la luz de una celda espectrofotométrica. En efecto, se puede usar un turbidímetro o un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (OD) a 600-700 nm de longitud de onda. En este caso las células se comportan como simples partículas en suspensión con capacidad para desviar y absorber la luz será proporcional a la concentración de células viables, el color afectara los resultados. Valores altos de OD (mayores a 0.3) afectaran la linealidad en la respuesta.Este método es apropiado para medios libres de partículas en suspensión.

e) Masa de un componente celular: Cuando es difícil usar alguno de los métodos anteriores se puede usar la medida d algún componente celular que sea parte constante del peso total de las células, entonces se cuantifica por algún método analítico, el componente escogido, con lo cual se tendrá una estimación indirecta de la biomasa presente. Tales componentes suelen ser: proteínas, nitrógeno, ADN, RNA, y ATP celulares, los cuales están presentes en cantidades más o menos constantes por especie.

f) Efectos físicos: Se puede también medir la variación de algún factor externo por efecto del crecimiento celular, tales como; el calor generado por el crecimient0o,

o el oxigeno captado por el medio, y que deja un vacío medible. Estas técnicas son rápidas y efectivas pero solo son útiles para grandes volúmenes.

TECNICAS DE MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

El termino fermentación, que antiguamente se aplicaba solo a los procesos de producción de alcohol por acción de levadura ha ido ampliando su significado hasta nuestros días, de modo que actualmente se usa para designar a todos los procesos de transformación microbianos. Tales bioprocesos o fermentaciones ya sean que conduzcan a nivel de laboratorio o a nivel industrial, pueden ser clasificados desde distintos puntos de vista. Así, según la distribución del m.o. en el medio de cultivo la fermentación puede ser superficial o sumergida, y según la periodicidad del proceso la fermentación puede ser continua, semicontinua o intermitente.

1. Fermentación en superficie: Llamado también procesos de fermentación en medio solido (FMS), como su nombre indica, este tipo de fermentación se refiere a los procesos en los cuales los microorganismos se desarrollan solo en la superficie del medio, y es más común en el desarrollo de m.o. aerobios. Generalmente la fermentación en superficie se aplica a los procesos de fermentación de sustratos en estado sólido, tal como en la producción de Koji, y se caracterizan por que en él, los niveles de humedad pueden variar entre 12% y 80%. A una humedad inferior a 12% cesa toda actividad biológica, en la práctica estos procesos transcurren a humedades entre 40% y 80%. En la tabla se indican algunas aplicaciones de tales tipos de fermentación.

Los principales parámetros de operación en este tipo de cultivos son:

La cantidad de agua disponible o actividad del agua (Aw). Los microorganismos se desarrollan en el rango d 0.6< Aw <0.99, lo cual equivale a humedades mayores a 50%.

Intercambio de gases, el lecho sólido debe ser lo suficientemente permeable para permitir el ingreso y difusión del oxigeno, así como la salida del CO2.

Control de la temperatura. Debido a la consistencia sólida del medio, es posible la acumulación de calor, lo cual puede crear los siguientes efectos negativos: desaceleración de la actividad microbiana, deshidratación del medio, y desvío del metabolismo hacia algún mecanismo de defensa ante el calor.

2. Fermentación sumergida: En estos tipos de fermentación el m.o. crece sumergido en el interior del medio de cultivo. Este proceso a su vez puede ser de dos tipos; aerobio si recibe suministro de oxígeno, y anaerobio si no reci8be suministro de oxigeno. La mayor parte de los bioprocesos conocidos son procesos de fermentación sumergidos, tales como la producción de cerveza, vino y demás tipos de fermentación alcohólica por acción de sacharomyces cerevisiae, o a la producción del yogurt a partir de la leche por acción simbiótica de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus termophilus.

MICROORGANISMOS SUSTRATO PRODUCTOS

Aspergillus NigerPulpa de café y

BCPerctinasas

Aspergillus NigerGlucosa, pectina y

BCpectinasa

Aspergillus NigerResiduos de

melazaAcido cítrico

Aspergillus NigerYuca, plátano y

amberlitaBiomasa

Aspergillus Niger Yuca AmilasasAspergillus therreus Bc y melazas Biomasa

Giberella fujikuroiCenteno y almidón

solubleAcido giberélico

Neurospora crassa Paja de trigo Β-glucisidasaPenicillium chrysogenum BC y sacarosa Penicilina G

Penicillium roqueforti Cuajada de leche AromasRhizopus arrhizus Yuca biomasa

Trichoderma harzianum BC y glucosa Celulasa, esporas

Cándida utilisBc, salvado de trigo, amberlita

Biomasa

Schwanniomyces Castelli BC y almidon Biomasa, etanolBacilus lichenformis centeno α-amilasa

3. Fermentación intermitente sumergidaConocida también como fermentación por lotes o fermentaciones Batch, se refiere al crecimiento de células en un sistema cerrado, en el cual una vez cargada la masa inicial del medio, esta no es alterada por adiciones o retiros posteriores de nutrientes hasta que culmina la fermentación. Una consecuencia lógica de este proceso es que en él varían el pH, la temperatura y la concentración de nutrientes con el tiempo, lo cual da lugar a una conducta cíclica en el crecimiento celular, conocido como ciclo de crecimiento.

1. Ciclo de crecimiento microbiano: Cuando un medio de cultivo es inocuo con un cultivo semilla (inóculo), los microorganismos toman selectivamente los nutrientes del medio y los convierten en biomasa y productos metabólicos, produciéndose el crecimiento celular. Sin embargo, ese crecimiento no es lineal y en los cultivos batch sigue un patrón conocido como ciclo de crecimiento microbiano, el cual puede ser dividido en 6 etapas.

CRECIMIENTO EN CULTIVO INTERMITENTEEl cultivo por lotes o intermitente representa el crecimiento en un sistema cerrado puesto que no se añade medio nuevo al cultivo.Cuando un medio de crecimiento adecuado se inocula con células, tiene lugar una secuencia de eventos característica llamada ciclo de crecimiento, el cual se puede describir por medio de una gráfica del peso seco molecular, (X), (g1-1) contra el período de incubación en horas (h).