Efecto de Determinacin de la curva de crecimientoen organismos unicelulares

Programa Ingeniera de Alimentos

18 Mayo 2014.

Practica N. 1 Determinacin de la curva de crecimiento en organismos unicelulares.1. Resumen

El crecimiento microbiano se define como el incremento ordenado e irreversible de masa y estructura de todos los elementos componentes de este sistema, lo que implica un aumento en la masa celular, que puede conducir a un aumento de la poblacin. El organismo empleado en la determinacin de la curva de crecimiento fue Leuconostoc Mesenteroides, bacteria Gram-positiva, que tiene una amplia distribucin en la naturaleza encontrndose en vegetales verdes y races, el cual fue escogido por su rpido crecimiento y su carcter no patgeno. A lo largo de este artculo se explica el procedimiento llevado a cabo con dicha cepa, la cual estuvo cropreservada a -70C, y activada en medio estndar de sacarosa, incubada en distintos medios de cultivo con distintas concentraciones de sacarosa y fructosa; Con el fin de comparar la curva de crecimiento de este microorganismo en cada uno de los medios de cultivo y de esta manera lograr determinar cul es el medio ms adecuado para su crecimiento. La concentracin de la biomasa es determina mediante la ecuacin de la curva de calibracin. Segn los resultados se determina que el Leuconostoc presento un mayor crecimiento en el medio G compuesto por 20g/L Sacarosa + 5g/L fructosa, superando la concentracin de biomasa que se present en los otros medios y con tendencia a continuar aumentando es decir a seguir en su fase exponencial.2. Introduccin

Cuando se habla de crecimiento microbiano se deben entender los dos tipos de crecimiento microbiano, crecimiento individual de clulas el cual es un incremento en el tamao y peso y crecimiento poblacional, el incremento en el nmero de clulas como consecuencia de la divisin celular. Existen diversos factores que influyen en el crecimiento bacteriano, externos e internos, son las condiciones ambientales y nutricionales del medio en el que se encuentra la clula, pH, temperatura, actividad de agua, agitacin, humedad relativa, disponibilidad de oxgeno, dixido de carbono, relacin entre contenido de carbono y nitrgeno. Los factores internos se consideran como la capacidad metablica del microorganismo.

Es importante comprender el crecimiento microbiano, significa predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se van a ir acumulando sus productos en el medio, son elementos que al ser controlados pueden ser reproducidas aliniciar este tipo de cultivo, u otros cultivos a mayores escalas, para produccin industrial.El crecimiento microbiano se determina mediante la medida del cambio sucesivo en el nmero de clulas o por la variacin en la masa de las clulas. Esta prctica de laboratorio se bas en la determinacin de la curva de crecimiento en organismos unicelulares por la variacin en la masa de las clulas por turbidimetra a travs del uso del espectrofotmetro, midiendo el cambio en la turbidez en unidades de absorbancia, transformando estas unidades en unidades de concentracin mediante una curva de calibracin especfica para el organismo estudiado. El organismo estudiado en la determinacin de la curva de crecimiento fue Leuconostoc Mesenteroides, bacteria Gram-positiva, que tiene una amplia distribucin en la naturaleza encontrndose en vegetales verdes y races, es comercialmente usada en la produccin de vinos, lcteos, azucares, con un rol esencial en la mezcla de aromas y texturas. Es quimiorganotrfica y aerobia facultativa y su morfologa es principalmente esfrica y se encuentran en pares o cadenas cocos. Se trabaja con ella en la prctica principalmente por no ser patgena, y por presentar un rpido crecimiento en poco tiempo.

3. Mtodos y materiales utilizados

El mtodo utilizado fue anlisis cuantitativo, determinando la concentracin de biomasa, por turbidimetra, que consiste en la medida de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs del cultivo microbiano, y se emplean para su ejecucin, los siguientes materiales:

Agua destilada.

Bao de termostato.

Celdas para espectrofotmetro.

Cinta para rotular. Espectrofotmetro.

Gradilla para tubos de ensayo.

Reactivo DNS.

Medio Estndar Sacarosa 60g/L. (activacin)

Medios de cultivo en frascos de tapa rosca azul.

C. Sacarosa + 10g/L fructosa.

D. Sacarosa + 5g/L fructosa.

E. Sacarosa + 2g/L fructosa.

F. 20g/L Sacarosa.

G. 20g/L Sacarosa + 5g/L fructosa.

H. 40g/L Sacarosa.

Microorganismo cropreservado de Leuconostoc mesenteroides. Nevera.

Pipetas.

Pipeteadores.

Plancha de calentamiento.

Reloj.

Tubos de Ensayo.

La experimentacin se realiza con Leuconostoc Mesenteroides, el cual fue inoculado en 100mL de medio estndar de sacarosa con una concentracin de 60g/L, y activado durante un periodo de 12 horas a 30C en incubadora. A continuacin se describe cronolgicamente cada uno de los pasos realizados:

Adecuacin de medios, a temperatura de 30C en bao de termostato. Enumeracin de cada tubo de ensayo con la letra correspondiente al medio de cultivo empleado y la hora de toma de cada muestra (La Toma de muestra se realiza con intervalos de 0,5 horas iniciando desde tiempo 0 hasta tiempo 5.5).Nota: Para cada medio de cultivo se marca un tubo como blanco.

Para cada medio de cultivo se toma el blanco el cual corresponde a 5mL de medio estril sin inocular con el microorganismo.

Posteriormente se realiza la incubacin con el Leuconostoc Mesenteroides en los seis medios de cultivo compuestos de sacarosa y fructosa en distintas concentraciones.

Inmediatamente se toman 2mL de cada medio inoculado y se llevan a cada uno de los tubos marcado como tiempo cero, y se dejan en refrigeracin a 6C. Los cultivos se introducen nuevamente en bao de termostato a 30C., y trascurridos sesenta minutos se toman nuevamente 2mL de cada medio, se llevan al los tubos de ensayo rotulados con tiempo de 1 hora y se dejan en refrigeracin. Este paso se repite cada treinta minutos hasta completar 5.5 horas.

Terminado el proceso, se toman los tubos de ensayo del refrigerador y tras buena agitacin se llevan para lectura espectrofotomtrica a 600nm.

Grupo de Imgenes N. 01 Resumen del Procedimiento.4. Resultados

Tablas de recoleccin de datos obtenidos.

Imagen N. 01 Incubacin de Leuconostoc mesenteroides en medio de cultivo F.

Tiempo (Horas)Medio de cultivo

CDEFGH

Blanco000000

00,2560,2720,2780,2950,3260,313

10,270,2840,2910,30,30,29

1.50,2810,2970,3050,30,340,279

20,3270,2960,310,30,3350,348

2.50,2990,30,2930,2830,330,313

30,3080,3070,30,2790,3510,305

3.50,3080,3140,3040,3030,3570,305

40,2990,3120,3040,3110,3520,307

4.50,3130,3140,3070,3070,3550,319

50,3030,330,3220,3280,3650,324

5.50,3150,3570,3410,3520,3880,341

Tabla N. 01 Absorbancias para cada de medio de cultivo en los tiempos establecidos.

Calculo de concentracin de biomasa mg/mL.

Se utiliza la ecuacin de la curva de calibracin especfica para este microorganismo, como se muestra a continuacin:y = 0,191x + 0,005 Donde:

y = Absorbancia (a 600nm).x = Concentracin de la biomasa en mg/mL.Despejando x en la ecuacin se tiene que x = (y 0,005) / 0,191.Obteniendo los siguientes resultados, para cada medio de cultivo:Tiempo (Horas)Medio de cultivo

CDEFGH

Blanco000000

01,3141,3981,4291,5181,6811,613

11,3871,4611,4971,5451,5451,492

1,51,4451,5291,5711,5451,7541,435

21,6861,5241,5971,5451,7281,796

2,51,5391,5451,5081,4551,7021,613

31,5861,5811,5451,4351,8121,571

3,51,5861,6181,5651,561,8431,571

41,5391,6071,5651,6021,8171,581

4,51,6131,6181,5811,5811,8321,644

51,561,7021,661,6911,8851,67

5,51,6231,8431,7591,8172,0051,759

Tabla N. 02 Concentracin de Biomasa para cada medio de cultivo en los tiempos establecidos.Transcurrido el periodo de tiempo establecido para las distintas muestras, y realizando los clculos respectivos, se relaciona absorbancia y concentracin, donde podemos observar:

Grafica N. 01 Concentracin de Biomasa vs. Absorbancia para cada medio de cultivo.Ya con el fin de comparar la curva de crecimiento para cada uno de los medios, se toma tiempo y concentracin de biomasa donde se obtiene:

Grafica N. 02 Curva de crecimiento Leuconostoc Mesenteroides en diferentes medios de cultivo.5. Discusin de los resultados

En los ltimos aos se ha prestado atencin particular a mtodos y modelos que describen el comportamiento y crecimiento de microorganismos como funcin de distintos factores de control, usados para predecir los cambios en la calidad de los alimentos, para estimar la vida til de los mismos, y otros para ser aprovechados en la obtencin de enzimas y otros compuestos de inters industrial. Encontrar expresiones matemticas que describan el crecimiento, la supervivencia, inactivacin o actividad metablica son fundamentales en el estudio de microorganismos sea cual sea el estudio o investigacin sobre los mismos.Para determinar la curva de crecimiento del Leuconostoc Mesenteroides se procedi a inocular en diferentes medios de cultivo que variaban en las concentraciones de sacarosa y fructosa, para luego incubar en un periodo de tiempo establecido, posteriormente se emple la determinacin de turbidez mediante espectrofotmetro como mtodo para medir la cantidad de luz absorbida por la solucin (absorbancia). Segn los resultados obtenidos y tabulados, se tiene en la Tabla N. 01 Concentracin de Biomasa para medio de cultivo en los tiempos establecidos, con las distintas absorbancias obtenidas a 600nm de longitud de onda, las cuales son de gran inters y fundamentales, pero como dicha turbidez no es una medida directa del nmero de clulas o poblacin, su incremento es simplemente una indicacin del crecimiento, prima mas, conocer algn tipo de concentracin que contemple cantidades con unidades de medida, como lo es la concentracin de biomasa.

Para ello se toma la ecuacin de la curva de calibracin del microorganismo en estudio que corresponde a y = 0,191x + 0,005, remplazando despejando x en la ecuacin y remplazando valores de y, con las absorbancias obtenidas, se determina la concentracin, concentracin de biomasa mg/mL, datos relacionados en la Tabla N. 02 Concentracin de Biomasa para medio de cultivo en los tiempos establecidos.Por otra parte, si se relaciona absorbancia y concentracin grficamente podemos observar que a mayor absorbancia mayor concentracin como se muestra en la Grafica N. 01 Concentracin de Biomasa vs. Absorbancia para cada medio de cultivo.De los resultados expresados se centran los anlisis principalmente en la biomasa obtenida para cada medio de cultivo a travs del tiempo, (remitirse a la Grafica N. 2 Curva de crecimiento Leuconostoc Mesenteroides en diferentes medios de cultivo) comparndolos y determinando en cual medio el Leuconostoc se acopla mejor, aprovecha el substrato y se genera un mayor crecimiento del microorganismo expresado en trminos de concentracin de biomasa por mililitro de medio. Este conocimiento es de gran importancia ya que tener en cuenta todos estos factores bajo control puede permitir aprovechar este y otros microorganismos al mximo a mayores escalas, para una produccin de sustancias importantes a nivel industrial.

Se dice que en las curvas de crecimiento, expresan el ciclo normal del crecimiento microbiano, por ende a partir de esta curva de ordenadas logartmicas puede deducirse que la fase de latencia en la cual las clulas se adaptan al nuevo ambiente. Segn los resultados se determina que la fase de latencia en todos los medios de cultivo fue de aproximadamente 1 h, exceptuando el medio F cuya fase de latencia fue de 2 h.La fase exponencial se torna un poco compleja, se observan picos y descensos que podran significar un comportamiento diauxico este se explica por que hay diferentes sustratos como fuente de carbono (sacarosa y fructosa) presentes en el medio, claro esta, exceptuando medio F y H cuya fase exponencial tuvo una duracin de aproximadamente 0,5 h a 1 h, mas bien corta.Luego de este tiempo, Leuconostoc entra en un estado estacionario la velocidad de crecimiento disminuye y deja de reproducirse de igual forma, es decir el nmero de microorganismos es aproximadamente constante, el tiempo en dicha fase es de aproximadamente 2 horas, en este apartado es importante considerar que cada uno de los tubos de medio de cultivo fue sometido a refrigeracin a 6C de manera intermitente posiblemente quizs al encontrarse cerca del mechero se pudo presentar mnimo crecimiento, esto a nivel de incubacin de muestras, a nivel de medicin espectrofotomtrica muchas veces las muestras de organismos forman agregaciones o biofilms y es necesario realizar agitacin antes de pasar a leer la absorbancia en el equipo, por alguno de estos motivos en la grafica se evidencian algunos picos y descensos.Por ltimo, generalmente en las curvas de crecimiento los cultivos entra en la fase de muerte, en la que el nmero de clulas que mueren se va haciendo mayor, para Leuconostoc en las condiciones dadas, no ocurre este hecho, pues a las 5,5 horas posiblemente el microorganismo no haba consumido todo el sustrato, y las condiciones de incubacin seguan siendo optimas para su crecimiento, simplemente se determino un periodo de tiempo para esta experiencia dados los trminos de las dems experiencias a desarrollar. Sin embargo segn los resultados obtenidos es posible determinar que el Leuconostoc presento un mayor crecimiento en el medio G compuesto por 20g/L Sacarosa + 5g/L fructosa, ya que la concentracin de biomasa supero a los otros medios y al finalizar la recoleccin de muestras (5,5 h) se evidencia que an segua en su fase exponencial. Finalizando, y en vista de que la informacin recolectada, es acorde a los objetivos de la gua de trabajo, se puede afirmar, que el procedimiento en el manejo de muestras y disoluciones, fue el adecuado.

En opinin personal, al hablar de crecimiento microbiano son muchas las variables que deben tenerse en cuenta, si bien es en esta oportunidad analizado solo el medio de cultivo, hubiese sido interesante enfocar adems comportamientos a otras temperaturas con los mismos medios de cultivo obteniendo a su vez resultados de gran debate que al ser estudiados tambin, permitiran aun mas la apropiacin de conceptos sobre este tema.6. Conclusiones

El crecimiento microbiano se determina mediante la medida del cambio sucesivo en el nmero de clulas o por la variacin en la masa mediante turbidez de las clulas en cada uno de los tubos llevados a espectrofotometra. El organismo estudiado en la determinacin de la curva de crecimiento fue Leuconostoc mesenteroides, la prctica arroja unidades de absorbancia, las cuales se transforman en unidades de concentracin mg/mL de biomasa mediante una ecuacin de la curva de calibracin especfica para el organismo estudiado.

En el presente artculo se ha podido constatar, los efectos que causan distintas concentraciones de sacarosa y fructosa, teniendo como objetivo, observar y determinar cuantitativamente su evolucin en el tiempo sealado.Tomando como base la experimentacin realizada, clculos, resultados, discusin y anlisis, y al ser comparados con la teora existente en varias fuentes, se determina que:

-La tasa de crecimiento de una poblacin a analizar indica un aumento en la masa celular, con un consecuente aumento de poblacin microbiana.-Los factores que influyen en el crecimiento bacteriano, estn determinados por condiciones ambientales y nutricionales del medio.-Comprender el crecimiento microbiano, significa predecir cmo va a evolucionar un cultivo en determinadas condiciones.-Comparar la curva de crecimiento para cada uno de los medios de cultivo permite identificar cul de los medios es ms apto para su crecimiento.-Las expresiones matemticas que permiten comprender el crecimiento, activacin o actividad metablica son fundamentales en el estudio de microorganismos.- La turbidimetra, consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs del cultivo microbiano, en valores de absorbancia.-Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio, por ende mayor absorbancia.

-Las curvas de crecimiento, expresan el ciclo normal del crecimiento microbiano, de las cuales de deducen, las fases de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte.-A mayor tiempo de incubacin, mayor concentracin de Biomasa ser encontrada en el medio de cultivo, la cual a su vez variara de acuerdo al sustrato presente.

7. Referencias

Informacin sobre Leuconostoc Mesenteroides, microorganismos en general, crecimiento, variables y factores de crecimiento, y dems compendios del tema desde:

(i) Manual del laboratorio

Ortiz, F., (2014). Gua componente prctico: 305689 Biotecnologa. Pasto: UNAD.

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