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CURSO DE MICROBIOLOGÍA Alta especialidad en implantología Cuarta parte Dra. Laurie Ann Ximénez-Fyvie Mtra. Adriana Patricia Rodríguez-Hernández Laboratorio de Genética Molecular División de Estudios de Posgrado e Investigación Facultad de Odontología, UNAM
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CURSO DE MICROBIOLOGÍA Alta especialidad en implantología
Cuarta parte
Dra. Laurie Ann Ximénez-Fyvie Mtra. Adriana Patricia Rodríguez-Hernández
Laboratorio de Genética Molecular División de Estudios de Posgrado e Investigación
Facultad de Odontología, UNAM
Métodos para el estudio de microorganismos
Identificación fenotípica
•Tinción de Gram •Morfología celular •Motilidad •Tolerancia al oxígeno •Morfología de colonia •Tipificación bioquímica •Perfiles de proteínas celulares
Identificación genética
•Hibridaciones DNA-DNA •PCR •Secuenciación 16S rRNA
Identificación fenotípica
Definición
Secuencia consecutiva de métodos de “microbiología tradicional” que en conjunto llevan a la identificación de especies bacterianas en cultivo; mediante la determinación y posterior seguimiento de sus características fenotípicas y metabólicas a través de diagramas de flujo de identificación aceptados
Aplicación • Identificación y cuantificación de especie cultivable previamente caracterizadas o
de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
• Permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana posteriores o en paralelo a la identificación
• Es posible realizar la cuantificación de las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación genética:
• Más laborioso
• Mayor tiempo y costo
• Difícil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas
• Subestimación de especies fastidiosas
• No permite la identificación de especies no-cultivables
Identificación fenotípica- Diagrama de flujo
Tinción de Gram
Morfología celular
Motilidad
Tolerancia al O2
Morfología de colonia
Tipificación bioquímica
Perfiles de proteínas celulares
Identificación fenotípica- Morfología celular
Coco
Bacilo
Pleomórfico Espirilo
•Sin motilidad •De nado (Swimming) •De deslizamiento (Glidding) •En espasmos (Twitching)
En Agar
Tubo de Punción
Identificación fenotípica- Motilidad
Contraste de Fases
Campo Obscuro
•Anaerobio estricto (en ausencia de O2)
•Microaerofílico (en conc. bajas de O2)
•Capnofílico (en presencia de CO2)
•Anaerobio facultativo (en presencia/ausencia de O2)
•Aerobio estricto (en presencia de O2)
Identificación fenotípica (Tolerancia al oxígeno)
•Color •Tamaño •Forma •Textura •Consistencia
•Periferia •Adherencia al agar •Formación de fosas •Propiedades hemolíticas •Fluorescencia con luz UV
Identificación fenotípica- Morfología de colonia
Identificación fenotípica- Tipificación bioquímica
•Fermentación de carbohidratos •Productos terminales •Catalasa •Oxidasa •Coagulasa •Reacciones de aglutinación
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis)
Identificación fenotípica- Perfiles de proteínas celulares
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
Definición Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la detección de fragmentos cortos de DNA marcados (sondas) tras su enlace a moléculas de DNA complementarias en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación y cuantificación de microorganismos predeterminados a partir de
muestras clínicas o cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:
• Capacidad para evaluar mayor número de especies y muestras
En comparación a la identificación fenotípica:
• Menor tiempo y costo
• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas
• Permite la identificación de especies no-cultivables
En comparación a otras pruebas genéticas:
• Es posible cuantificación las especies evaluadas
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:
• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación
En comparación a otras pruebas genéticas:
• Menor sensibilidad y especificidad
•Sonda: fragmento de DNA marcado con una molécula reportadora que permite su detección después de la hibridación
•Molécula Reportadora Radioactiva: Isótopos con emisiones (generalmente P32) No-Radioactiva: Digoxigenina, Fluorescina, Biotina, etc. •Especificidad: determinada por el diseño de la sonda •Sensibilidad: determinada por el tipo y concentración de la sonda
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
•Southern Blot Blanco = DNA Sonda = DNA
•Northern Blot Blanco = RNA Sonda = DNA
•Western Blot Blanco = Proteína Sonda = Anticuerpo
“MiniSlot”
Canales abiertos
Membrana de nylon
Filtros
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
“MiniBlotter”
Canales de hibridación
Membrana de nylon
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
Socransky et al. Biotechniques 1994
Métodos genéticos- Hibridaciones DNA-DNA
* Serotipos a: 43717 & b: 43718 † Subespecies nucleatum: 25586, polymorphum: 10953 & vincentii: 49256
Actinomyces georgiae 49285
Actinomyces israelii 12102
Actinomyces meyeri 35568
Actinomyces naeslundii stp. 1 12104
Actinomyces odontolyticus 17929
Actinomyces viscosus 43146
Aggregatibacter actinomycetemcomitans *
Campylobacter gracilis 33236
Campylobacter rectus 33238
Campylobacter showae 51146
Capnocytophaga gingivalis 33624
Capnocytophaga ochracea 27872
Capnocytophaga sputigena 33612
Dialister pneumosintes 33048
Eikenella corrodens 23834
Eubacterium nodatum 33099
Eubacterium saburreum 33271
Filifactor alocis 35896
Fusobacterium nucleatum †
Fusobacterium periodonticum 33693
Especie ATCC
Neisseria mucosa 19696
Parvimonas micra 33270
Porphyromonas asaccharolytica 25260
Porphyromonas gingivalis 33277
Prevotella intermedia 25611
Prevotella loescheii 15930
Prevotella melaninogenica 25845
Prevotella nigrescens 33563
Propionibacterium acnes 6919
Selenomonas noxia 43541
Streptococcus anginosus 33397
Streptococcus constellatus 27823
Streptococcus gordonii 10558
Streptococcus intermedius 27335
Streptococcus mitis 49456
Streptococcus oralis 35037
Streptococcus sanguinis 10556
Tannerella forsythia 43037
Treponema denticola 35405
Veillonella parvula 10790
Especie ATCC
Métodos genéticos- PCR
Definición Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la amplificación de porciones específicas de DNA en una muestra (templete)
Aplicación • Identificación de microorganismos predeterminados a partir de muestras clínicas o
cultivos puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:
• Mayor sensibilidad
En comparación a la identificación fenotípica:
• Menor tiempo y costo
• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas
• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:
• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación
En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies (excepto PCR en tiempo real)
En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
PCR
Métodos genéticos- PCR
•Ciclos repetitivos de desnaturalización, alineamiento de primers y extensión para producir múltiples copias de una secuencia determinada de DNA
•Especificidad: determinada por el diseño de los primers •Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
Definición Método no-dependiente del cultivo bacteriano para la identificación de especies; mediante la determinación de la secuencia en el DNA de la fracción 16S rRNA en una muestra (templete) y su posterior comparación con secuencias publicadas
Aplicación • Identificación de cualquier microorganismo a partir de muestras clínicas o cultivos
puros
Ventajas
En comparación al resto de las pruebas de identificación:
• Mayor especificidad
En comparación a la identificación fenotípica:
• Menor tiempo y costo
• Fácil manejo de muestras bucales y de otros sitios con proporciones elevadas de especies fastidiosas
• Permite la identificación de especies no-cultivables
Desventajas
En comparación a la identificación fenotípica:
• No permite la realización de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en paralelo a la identificación
En comparación a la identificación fenotípica e hibridaciones DNA-DNA:
• No permite la cuantificación de especies
En comparación a hibridaciones DNA-DNA:
• Bajo número de especies evaluadas
Secuenciación 16S rRNA
Métodos genéticos- Secuenciación de la fracción 16S rRNA
•Comparación con bancos de secuencias conocidas
•Especificidad: hipotéticamente “absoluta” •Sensibilidad: hipotéticamente 1 célula
