Programa PREPA 2007 - 2008 Curso de microscopia moderna Jean-Pierre GALAUP Laboratoire Aim Cotton Bt. 505, Centre dOrsay 91405 ORSAY cedex (France) http://www.lac.u-psud.fr e-mail : jean-pierre.galaup@lac.u-psud.fr Universidad de Antioquia Medelln (Colombia) 3-14 de Diciembre 2007 2 3Plan del curso 1 Introduccin 1.1- Historia de la microscopa 1.2- Principio de la formacin de las imgenes 1.2.1 La ptica geomtrica1.2.2 Difraccin de Fraunhofer 1.2.3 Teora de Abbe1.3- Lmite de resolucin de un microscopio 1.3.1 Criterio de Rayleigh1.3.2 Apertura numrica1.3.3 Aberraciones geomtricas y cromticas 1.3.4 Papel del condensador1.4- Resultados comparados de las microscopas pticas 2 Microscopas fotnicas clsicas 2.1- Microscopa a fondo claro2.1.1 Condiciones de una buena observacinLa contribucin del condensadorAlumbrado de Khler Cual aumento? 2.2- Microscopa a fondo oscuro - Ultramicroscopa2.2.1 Microscopa a fondo oscuro2.2.2 Ultramicroscopa2.3- Microscopa a contraste de fase 2.4- Microscopa en luz polarizada2.5- Microscopa a contraste interferencial diferencial "Nomarski" 3 Microscopas pticas confocales3.1- Principio3.2- Formacin de la imagen confocal 3.2.1 Mejoramiento de la resolucin en microscopa confocalResolucin axial en x,yResolucin radial en z3.2.2 Tratamiento y desconvolucin de la imagen confocal3.3- Realizacin de un microscopio confocal 3.3.1 Microscopio confocal a barrido lser3.3.2 Microscopio confocal a disco de Nipkow3.3.3 Descripcin de un microscopio confocal invertido comercial3.4- Ejemplos de aplicaciones 4 Microscopas pticas en campo cercano 4.1- Ondas evanescentes4.1.1 Introduccin4.1.2 Las ondas evanescentes de FresnelEl vector de onda de la onda evanescente4 La polarizacin de la onda evanescente4.1.3 Algunas consecuencias de estas propiedades inusualesVuelta sobre el problema de la resolucin de un instrumento ptico Los lmites de la onda evanescente de Fresnel4.1.4 La difraccin evanescenteLa difraccin de una onda llana La microscopa ptica en campo cercano4.2- Principales configuraciones4.2.1 Microscopios en transmisin4.2.2 Microscopios en reflexin4.2.3 Microscopios a efecto tnel fotnico Microscopios a efecto tnel ptico a barrido STOM o PSTM Microscopios STOM/PSTM invertidos: el i-PSTM o TNOM4.2.4 Microscopios en campo cercano a plasmones de superficie4.2.5 Microscopios hbridosMicroscopios con control de la fuerza de cizallamiento ("shear-force control")Microscopios en campo cercano con contacto4.3- Estructura bsica de un microscopio SNOM4.3.1 Parte mecnica El mdulo de translacin Los tubos piezoelctricos4.4- Nanocolectores y nanoemisoras4.4.1 Distintos conceptos de nanocolectores4.4.2 Fabricacin de las puntas4.4.3 Control de la distancia a la superficie Control ptico Tcnica "shear-force" 4.5- Tratamiento de las imgenes4.5.1 Filtrado por transformacin de Fourier 5 evolucin actual5.1- Microscopa de fluorescencia fotnica multifotnica 5.2- Microscopa de objetos individuales5.3- Microscopa Raman 5.3.1 Raman de resonancia5.3.2 Raman exacerbado por efecto de superficie (SERS "Suface Enhanced Raman Scattering") 6 Anexo: Glosario de microscopa fotnica 7 Bibliografa 51- Introduccin DesdesuinvencinenelsigloXVII,elmicroscopiopticosehaconvertidoenun instrumento de uso corriente indispensable en muchos mbitos de la metalurgia a la biologa y a la medicina. Es un instrumento simple que aumenta considerablemente las capacidades de percepcin del mundo a escala micromtrica por el ojo humano. Losresultadosdeunmicroscopiodependendelascalidadesdesuptica(Fig.1.1),delas condiciones de observaciones utilizadas (Fig. 1.2), pero hasta actualmente, no se comparan no obstantealasobservacionesrealizadasenmicroscopaelectrnica,solatcnicapermitiendo alcanzar resoluciones sub nanomtricas (Fig. 1.3) Figura 1.1: Resultados comparados de un microscopio modelo juguete (a la izquierda) con un microscopio de laboratorio (a la derecha). Figura 1.2: Comparacin entre dos observaciones hechas con un mismo microscopio pero con un alumbrado incorrecto (a la izquierda) y un alumbrado correcto (a la derecha). 6 Figura 1.3: Observacin comparada de Gyrosigma sinense en microscopa ptica (a la izquierda) y en microscopa electrnica (a la derecha). La barra representa una distancia de 1 m. El problema de la finura de los detalles observables y de su resolucin constituye el problema principaldelamicroscopa.Acausadeladifraccindelaluzporlaaperturalimitadadel objetivo, una fuente de luz perfectamente puntual no puede dar una imagen tambin puntual, perosolamenteaunamanchadedifraccinconuntamaotantomayorquelaaperturaser limitada y el aumento buscado elevado. La reciente evolucin condujo a buscar otros medios para superar este lmite impuesto por la difraccin de la luz y mejorar las condiciones de observaciones de objetos particulares, de ah laevolucindelamicroscopasobrefondonegrooultramicroscopia,delasmicroscopasa contrastedefaseointerferenciales.Elprogresomsnotableenelmbitodelamicroscopa fotnicaencampolejanoeseldelamicroscopadichaconfocalque,sinoaumenta considerablemente la resolucin instrumental, permite una calidad de imagen inigualaday la posibilidad de reconstituir en 3 dimensiones la imagen de un objeto. Larevolucinenestembitovinodeldesarrollodelastcnicasdemicroscopaencampo cercanodondelautilizacindelasondasevanescentesquesoloexistenmuycercadela superficie de un objeto. Al "recoger" estas ondas evanescentes por una sonda ptica colocada aalgunosnanmetrosdelobjeto,sepuedereconstituirunaimagendelobjetoconuna resolucin ampliamente sub longitud de onda y solamente dependiente de la dimensin de la sonda. 1.1- Historia de la microscopa Algunas fechas... II siglo ante JC: Nron utilizaba al gatito de su anillo como lupa.1608: Z. Jansen construye un microscopio a dos lentejas convergentes. 1633: Ren Descartes (1596-1650) escribe las leyes de la ptica. 1665:RobertHooke(Freshwater-Londres16351703)publicaMicrographia,laprimer recopilacindemicrografasdescribiendocuchillasfinasdemaderaydndeapareceel trminoclula(Fig.1.4).Siendoalmismotiempobilogo,paleontlogo,meteorlogo, mecnicoy astrnomo,Hooke fue uno de los ms brillantes experimentadores de su tiempo. 7Su nombre permaneci tambin asociado a las leyes de deformaciones elsticas de los cuerpos (ley de Hooke). Figura 1.4: Microscopio de Hooke y micrografa de una cuchilla de corcho tomada por Hooke. 1669: Isaac Newton (1642-1727) descubre la descomposicin de la luz blanca por el prisma.1695: Antonie Van Leeuwenhoek (1632 - Delft 1723) construy cerca de 500 microscopios que le permitieron observar y describir por primera vez los microorganismos como: bacterias, espermatozoides, protozoos, clulas sanguneas... (Fig. 1.5).

Figura 1.5: Leeuwenhoek y su famoso microscopio a una nica lenteja. Leeuwenhoekerapaeroycomenzapulir"lentejas"despusdelalecturadel Micrographia de Hooke. Amigo ntimo del pintor Vermeer cuyos no tena las subvenciones, l ha debido buscar la ayuda de un ilustrador para sus tableros. 1746: J. Adams adapta un barrilete porta objetivos.1828: W. Nicol desarrolla la microscopa en luz polarizada.1849: J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio.1890: Ernst Abbe (Eisenach 1840 -Ina 1905), fsico, plantea las bases de la formacin de las imgenesen el microscopioyelabora la teora de la resolucin de los instrumentos (Fig. 1.6). En 1866 l se une al mecnico Carl Zeiss con quien concibe lentejas a las aberraciones muyescasas(objetivoapocromticoyainmersin).En1896,reformaalasociedadCarl Zeiss,cuyosbeneficiosporlotantosedistribuyenentreladireccin,lostrabajadoresyla Universidad de Ina. 8 Figura 1.6: Retrato de Ernst Abbe. 1903: R. Zsigmondy inventa el ultramicroscopio (perfeccionado por A. Cotton). Recibir el Premio Nobel de Qumica en 1925 para su trabajo sobre los coloideos. 1908: Khler y Siedentopf realizan el microscopio a fluorescencia 1928: E. Synge sugiere un nuevo concepto para superar el lmite de difraccin e introduce el concepto de super resolucin. 1942:F.Zernike(1888-1966)obtieneelPremioNobelen1953paralamicroscopaa contraste de fase.1952: G. Nomarski se imagina el microscopio interferencial diferencial. 1982:G.BinningyH.Rohrerdescribenelprimermicroscopioapuntaqueutilizala corriente tnel electrnico, el "Scanning Tunneling Microscope" (STM). 1984: Los primeros equivalentes pticos del STM aparecen que abren la va a la microscopa ptica en campo cercano1985: Puesta a punto de la microscopa confocal a barrido lser.1990: M. Orrit y J. Bernard detectan molculas nicas por fluorescencia. 1.2- Principio de la formacin de las imgenes 1.2.1 La ptica geomtrica Segn las leyes de la ptica geomtrica, por un objetivo asimilado a una lenteja fina, se tiene la relacin: f1' p1p1= +(1.1) dnde p y p' son las distancias relativas respectivamente del objeto y la imagen al centro de la lenteja y f es la distancia focal de la lenteja. Se tiene en cuenta que la imagen se invierte con relacin al objeto. 9objectifobjetaxe optiqueimage agrandieFoFip p Figura 1.7: Ampliacin por un objetivo de microscopio. Fo es el foco objeto, Fi es el foco imagen del objetivo. El aumento es la consecuencia directa de la focal corta del objetivo. El crecimiento lineal es evaluado por: p' p = (1.2) Segn el Eq. 1.1, si p f, entonces p' , lo que significa que si el objeto est en el foco de la lenteja, la imagen se enva al infinito. Tomando en cuenta el Eq. 1.2 del aumento, se deduce quelaimagensertantomayorqueelobjetoestarcercadelfocoFoyquelafocaldela lenteja ser corta. Sin embargo, no es posible aumentar infinitamente un objeto reduciendo la distancia al foco y la focal del objetivo. Adems,lapticageomtricanotieneencuentaelcarcterondulatoriodelaluzylos fenmenosdedifraccinvanalimitarelcrecimientolinealdeunobjetivoavaloresque sobrepasarnapenasl00x.Enunmicroscopiocompuesto,laimagenformadaenelplano imagen del objetivo es reanudada por el ocular y el crecimiento total se obtiene multiplicando el del objetivo por el del ocular. 1.2.2 Difraccin de Fraunhofer Los fenmenos de difraccin se estudian normalmente en un curso de ptica ondulatoria.La teora la difraccin se basa en el principio de Huygens-Fresnel que indica que la perturbacin luminosaenunpuntoPresultadelasuperposicindelasondassecundariasemitidaspor todoslospuntosdeunasuperficiesituadaentreestepuntoylafuentedeluz.Latraduccin matemtica de este principio es la integral de Fresnel-Kirchhoff que se escribe: [ ]dS ) s , n cos( ) r , n cos(rse2A) P ( U) s r ( k =+Aii(1.3) cuando se considera el paso de la luz a travs de una apertura de forma cualquiera A taladrada enunapantalla(Fig.1.8).keselvectordeonda=2/.Si(x0,y0,z0)y(x,y,z)sonlas 10 coordenadas de los puntos P0y P respectivamentey (,) las coordenadas del punto Q en la apertura, se puede poner de manifiesto que el Eq. 1.3 puede escribirse: = +Ad d e' s ' rAe A cos) P ( U) , ( kf) ' s ' r ( kiii(1.4) dnde: ...' s 2) y x (' r 2) y x (' s 2 ' r 2 ' sy x' ry x) , ( f32320 02 2 2 20 0 + + + + + + + + = (1.5) Laevaluacindelaintegral1.4esmssimplecuandolostrminoscuadrticosylosde caracteres ms elevados en y pueden descuidarse. En este caso, se habla de la difraccin de Fraunhofer. Cuando los trminos cuadrticos no pueden descuidarse, se habla entonces de la difraccin de Fresnel. Afortunadamente, el caso ms simple de la difraccin de Fraunhofer es el de mayor importancia en la ptica. xy zP0POQrrss Figura 1.8: Difraccin por una apertura de forma cualquiera en una pantalla plana. Estrictamentehablando,lostrminoscuadrticosylosdecaracteresmselevados desaparecensolamentecuandor'ys'tiendenhaciaelinfinito,esdecir,cuandoalavezel puntofuenteyelpuntodeobservacinsonalinfinito.Esporqu,sehablatambinde difraccinalinfinito(oencampolejano)enelcasodeladifraccindeFraunhofer.La difraccin deFresnel seobservacuando la fuentey la pantalla son muy cercanas. Del punto devistadelateora,ladifraccindeFresnelesmsgeneraleincluyeladifraccinde Fraunhofer como un caso particular. Utilizando las coordenadas polares (,) para el punto Q en la apertura circular: cos = etsin = y las coordenadas (,) para el punto P en el plano de difraccin: 11wcos = petwsin = q De esta definicin de p y q, se siga que w = 2 2q p +es el seno del ngulo que la direccin (p,q)haceconladireccincentralp=q=0.LaintegraldeFresnel-Kirchhoffsepone entonces bajo la forma: = d d e C ) P ( Ua020) cos( w k i -(1.6) Esta forma evidencia la representacin integral de las funciones de Bessel Jn(x): = d e e2) x ( J20n cos xni i-ni(1.7) La integral 1.6 se escribe entonces: =d ) w k ( J C 2 ) P ( Ua00(1.8) Utilizando la relacin de recurrencia: { } ) x ( J x ) x ( J xdxdn1 n1 n1 n +++=quin da por integracin para n=0:=x01 0) x ( xJ ' dx ) ' x ( J ' xse obtiene: ((

=kaw) kaw ( J 2a C ) P ( U1 2 (1.9) de ah se deduce la intensidad de la mancha de difraccin: 0212Ikaw) kaw ( J 2) P ( U ) P ( I((

= = (1.10) Es la famosa frmula de Airy, establecida para una apertura circular. Se dice tambin que I(P) eslafuncindedespliegodeunpunto,"PointSpreadFunction"eninglsoPSF.I0esla intensidad en el centro de la mancha: I0 = a2E/2, E siendo la energa total incidente. Los mnimos de la funcin de Bessel J1(x) con x = kaw = 2aw/ se obtienen para x = 1.22, 2.233, 3.238... de ah se deduce que los rayos de los anillos oscuros son: a610 , 0 q p w2 2= + = a116 , 1

a619 , 1(1.11) 12 Enelcasodeunarajadeanchura2a,laecuacincorrespondientehaceintervenirelseno cardinal x) x sin(sinc = y se escribe: ) x ( sin I Ikpa) kpa sin() P ( U ) P ( I2c 0 022=((

= = (1.12) 1.2.3 Teora de Abbe Ernst Abbe formul la teora de la formacin de la imagen en un microscopio al final del siglo XIX.Abbetratelobjetocomounafinaestructuradedifraccinyaunquenoseauna descripcin exacta de la seccin de plantas, es una muy buena aproximacin de la estructura regular de las diatomeas por ejemplo. Laluzsedifractaatravesandounared.Alrayonodesviadodeorden0seaadenlosrayos difractados,porunayotrapartedelrayodeorden0ysegnlosrdenesdedifraccin sucesivos:-1y+1,-2y+2,-3y+3...Todosestosrdenescontienenunapartedela informacin sobre el objeto estudiado. La apertura del objetivo limita el nmero de rdenes de difraccin susceptibles de estar recogidos a travs de l (Fig. 1.9). Las estructuras que difractarn mucho la luz, es decir, correspondiendo a elevadas frecuencias espacialesequivalentesaunaestructuradedifraccinconunenormenmeroderendijasal milmetro, darn rayos con elevados ngulos de difraccin que no podrn ser recogidos por el objetivo. Su ausencia no permitir la formacin de una imagen, reconstruccin fiel del objeto.

Figura 1.9: Ilustracin de la teora de Abbe. A la izquierda, el objeto es una red a escaso nmero de rendijas, todos los rdenes de difraccin pasan por el objetivo y la imagen reconstituye el objeto. A la derecha, el objeto difracta mucho y no todo los ordenes de difraccin son recogidos por el objetivo. En consecuencia, la imagen es solamente parcialmente reconstituida, o incluso no aparecen las estructuras finas del objeto. Vamosadescribiresteprocesodeformacindelaimagenconmsdetalle.Enesta presentacindelateoradelaformacindelasimgenesenunmicroscopio,limitaremos nuestra atencin a los dos casos extremos de una iluminacin completamente incoherente de una partey de una iluminacin perfectamente coherente de otra parte. No se trata elcaso de una iluminacin sino parcialmente coherente. Iluminacin incoherente Consideremosunobjetoluminosoporsmismocomo,porejemplo,elfilamento incandescente de una lmpara elctrica. Sea P el punto del objeto situado sobre el eje ptico y Q un punto vecino a una distancia y de P en el plano objeto . Llamemos P' y Q' las imgenes 13deestospuntosseparadasdeladistanciay'enelplanoimagen'(Fig.1.10).y'son planesconjugados.Llamemosy'losngulosquehacenlosrayosmarginalesquepasan por el diafragma con el eje ptico. F DaPQPQ yyYY Figura 1.10: Esquema que ilustra la teora del poder de resolucin del microscopio. Sea a' el rayo de la zona supuesta circular en la cual el haz de luz convergente hacia P' corta el plan focal posterior F' y llamemos D' la distancia entre el pupilo de salida y el plano imagen, entonces, puesto que ' es pequeo: ' D' a' = (1.13) Si w = 2 2q p +es la separacin entre Q' y P', es decir, el seno del ngulo bajo el cual los dos puntos se ven del centro de la apertura, entonces tenemos con una buena aproximacin: Y = wD(1.14) Seannyn'losndicesderefraccin,y'laslongitudesdeondarespectivamenteenlos espacios objeto e imagen y 0 la longitud de onda en el vaco, entonces, puesto que segn el resultado1.11,elprimermnimodelafiguradedifraccindePesdadoporw=0,61'/a', habemos al lmite de resolucin: ' ' n61 , 0''61 , 0' a' D61 , 0 ' Y0== = (1.15) Utilizando la relacin de los senos: nYsin = - n'Y' sin', se substituye Y' por Y en el Eq. 1.15 y al asimilar sin' a ', se deduce: sin n61 , 0 Y0(1.16) 14 Laecuacin1.16daladistanciaentredospuntosobjetosqueunmicroscopiopuede exactamente separar cuando la iluminacin es incoherente y que la apertura es circular. La cantidad nsin que se produce en esta ecuacin es la apertura numrica. Debe ser grande para un mejor poder de resolucin. Iluminacin coherente (teora de Abbe) Consideramoselotrocasoextremodondelaluzquesurgedelobjetopuedetratarsecomo estrictamente coherente. Esta situacin se realiza aproximadamente cuando un objeto fino con unaestructurarelativamentesimpleesiluminadoporlaluzresultantedeunafuente suficientementepequeaatravsdeuncondensadoraescasaapertura.Laprimerateora satisfactoriadelaresolucindeunmicroscopiobajoiluminacincoherentefueformuladay tambin ilustrada con bonitas experiencias por E. Abbe en 1873. Segn Abbe, el objeto acta a la manera de una estructura de difraccin, aunque no slo cada elementodelaaperturadelobjetivo,sinotambincadaelementodelobjetodebetenerseen cuentaenladeterminacindelaperturbacincomplejaqueseproduceencualquierpunto particulardelplanoimagen.Bajoformamatemtica,latransicindelplanoobjetoalplano imagenimplicadosintegraciones:unaseextiendesobreelplanoobjeto,laotraseextiende sobre laapertura. En la teora de Abbe, la difraccin por el objeto se considera primerayse tiene el efecto de la apertura en cuenta en un segundo tiempo. Para ilustrar la teora de Abbe, se considera la formacin de la imagen de un objeto con forma deestructuradedifracciniluminadaporunaondaplanaincidentenormalmentesobreel plano objeto segn el principio de la iluminacin central de Khler. La onda es difractada por el objeto y da nacimiento a una figura de difraccin de Fraunhofer de la red en el plano focal posteriorF'delobjetivo(Fig.1.11),poresollamadoplanodeFourier.Losmximosque correspondenalosespectrosdecarctersucesivodeestafiguradedifraccinsetienenen cuentaS-3, S-2, S-1, S0, S1, S2, S3 F D f(,)(x,y)(x,y)S0S1S2S3S-1S-2S-3(p,q)(p,q) Figura 1.11: Esquema que ilustra la teora de Abbe de la formacin de la imagen en un microscopio bajo iluminacin coherente. 15 Cadapuntoenelplanofocalpuedeentoncesconsiderarsecomoelcentrodeunaemisin coherentesecundariacuyacontribucinserproporcionalalaamplitudencadapunto.Las ondas luminosas resultantes de cada uno de estos puntos fuentes secundarias interferirn entre ellasydarnnacimientoalaimagendelobjetoenelplanoimagen'delobjetivo.Para obtener una imagen fiel, es necesario que todos los espectros (todos los ordenes de difraccin) contribuyen a la formacin de la imagen. Esto no es nunca posible estrictamente a causa de la apertura limitada del objetivo. De un punto de vista prctico sin embargo, es suficiente que la aperturaseasuficientementegrandeparaadmitirtodoslosrdenesquetransportanuna cantidad apreciable de energa. Seobservarquesielobjetoposeeestructurasdegranfinura,equivalentespuesaunared grabadamuyfina,losngulosdedifraccindebidosaestasestructurassernmuygrandey solamenteunnmeromuylimitadoderdenesdedifraccin,oinclusoallmiteunoslo, podr pasar a travs del objetivo. Por consiguiente, el objeto no podr reconstituirse con toda la finura necesaria y se habr alcanzado el lmite de resolucin del instrumento. Estasconsideracionespuedenexpresarsedeunamaneraprecisasinlimitarsealcasode objetos asimilados a estructuras de difraccin. Sean (x,y) las coordenadas de un punto tpico del plano objetoy f la distancia del planofocalF' a la lenteja objetivo, la perturbacin en el punto (=pf, =qf) del plano F' es dada por la frmula de Fraunhofer: ((

||

\| + = Adxdy yfxfk exp ) y , x ( F C ) , ( U1i (1.17) dndeFeslafuncinquedescribelatransmisindelobjeto,C1esunaconstanteyla integracin se efecta sobre la superficie A del plano objeto cubierta por el objeto. Consideramos ahora la transicin del plano focal F' al plano imagen P'. D' siendo la distancia entre estos dos planes, en el punto tpico (x' =p'D', y' =q'D') del plano imagen, la perturbacin debida a la difraccin de Fraunhofer por una apertura B situada en el plano F' ser: ((

||

\| + =Bd d' D' y' D' xk exp ) , ( U C ) ' y , ' x ( V2i (1.18) La sustitucin del Eq. 1.17 en el Eq. 1.18 d: ((

|||

\|||

\|+ + ||

\|+ =B Ad dxdyd ' y' Dfy ' x' Dfxfkexp ) y , x ( F C C ) ' y , ' x ( V2 1i (1.19) SisesuponequeF(x,y)sedefinecomonulaparatodoslospuntosdelplanoobjetoquese encuentran a fuera del objeto el mismo, es decir, de A, entonces la integracin con relacin a xeypuedeformalmenteextendersede+.Delmismomodo,silaaperturaBes suficientementegrandeparaque) , ( U seadesdeableparalospuntosdelplanofocalF' que se encuentran fuera de B, entonces las integraciones con relacin a y pueden tambin extenderse de +. Llamemos M (