Cursos de Formación de la UAT (2012)

Plataforma de Genómica / Plataforma de Diagnóstico Molecular

“Tecnologías de alto rendimiento en genómica”

2ª Parte: Tecnologías de ultrasecuenciación y de enriquecimiento de secuencia.

Programa del curso

De Sanger hacia NGS

454 de Roche Cómo funciona Flujo de trabajo de la tecnología

Comparación con otros Sistemas NGS

Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación. Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones. Secuenciación de genomas “de novo”. Metagenómica RNAseq Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:

Análisis de exomas Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de

captura de secuencia.

Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)

Cualquier DNA puede ser secuenciado

M Tuberculosis

H5N1

C. elegansBarley

Arabidopsis

Maccaca

NeanderthalHIV

Tomato

Potato

HoneybeeMammut

S. cervisiae

James WatsonGrape wine

Genomas Secuenciados

Nature Reviews Genetics 9, 303-313, 2008

Figure 2. Vertebrate genomic sequence data. Phylogenetic tree representing species for which genomic sequence data are currently available Green indicates that BAC (bacterial artificial chromosome)-based sequence is available in targeted regions of the genome11, 15. Yellow represents 2X whole-genome shotgun assemblies17, and blue represents full-shotgun or near-complete genomic sequence assemblies.

Over the past years the genomes of some of the most impotant model organisms have been sequenced:

1953

1977

70´s

1987

1990

2003

2005

2010

2012

Francis Crick and James Watson

describen el modelo de la

doble hélice del DNA.

“ DNA sequencing by

chemical degradation ”

Maxam y Gilbert

ABI comercializa

el 1ª secuenciador automático,

ABI 370.

El NIH empieza

secuenciación

a gran escala de diversos

microorgs.

phi X 174 Primer genoma de

DNA completo secuenciado

11 genes en 5386 bases (cadena

sencilla)

FinalizaciónProyecto Genoma Humano (13 años)

Lanzamiento de SOLEXA (Illumina)

Secuenciación Genoma

Watson mediante

454/ROCHENature 452, 872-876 (17 April 2008).

Lanzamiento de SOLID

(ABI)

1000 Genomes Project

“Chain-terminator method”

Sanger et al. Método usado

durante los proximos 30 años

Lanzamiento de

GS20 (454 Life

Science)

GS FLX(ROCHE)

2008

2009

Helicos BioSciences

2006

2007

Cronología de la Secuenciación

GS FLX-Titanium(ROCHE)

GS FLX+ROCHE)

ddTTPddATPddGTP ddCTP

dTTP

dATPdGTP

dCTP

5´

3´ CGGTCAGCCTACGTATACAGACTCAGCGGTCAGCCTACGTATACAGACTCACGGTCAGCCTACGTATACAGACTCCGGTCAGCCTACGTATACAGACTCGGTCAGCCTACGTATACAGACCGGTCAGCCTACGTATACAGACGGTCAGCCTACGTATACAGCGGTCAGCCTACGTATACACGGTCAGCCTACGTATACCGGTCAGCCTACGTATACGGTCAGCCTACGTATCGGTCAGCCTACGTACGGTCAGCCTACGTCGGTCAGCCTACGCGGTCAGCCTACCGGTCAGCCTACGGTCAGCCTCGGTCAGCCCGGTCAGCCGGTCAGCGGTCACGGTCCGGTCGGCGC

1ª Generación Secuenciación

Método manual de Secuenciación SangerNucleótidos Modificados

Método automático de Secuenciación Sanger

Nucleótidos Modificados Marcados

3´…GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC…5´5´…CGGT

PolimerasaSecuencia molde:Primer:+

Electroforesis(1 Secuencia/Capilar)

ddGTP ddATP ddTTP ddCTP

3´..GCCAGTCGGATGCATATGTCTGAGTC..5´5´…CGGT

PolimerasaSecuencia molde:Primer:

+dTTP

dATPdGTP

dCTP

CGGTCAGCCTACCGGTCAGCCTACGGTCAGCCTCGGTCAGCCCGGTCAGCCGGTCAG

GCCTAC

(Marcaje radioactivo en el Primer o en uno de los 4 dNTPs en cada tubo)

Grupo fosfato

Base

H

Estrategia de Secuenciación a gran escala

Secuenciación de fragmentos largos de DNA.

El DNA se fragmenta en trozos al azar y se clonan en una biblioteca bacteriana.

El ADN de los clones bacterianos individuales se secuencian mediante Secuenciación Sanger automática.

La secuencia se ensamblan observando las regiones solapantes.

Los Gaps se pueden rellenar mediante paseos de cebadores.

1ª Generación Secuenciación

Sanger sequencing:- Long reads (500-1000 bp)- Low throughput (192 reactions/run)

1ª Generación Secuenciación

3.000 millones de dólares para secuenciar

3.000 nts (1$/nt)

Primer borrador Genoma Humano

2ª Generación Secuenciación

Los Instrumentos de secuenciación de 2ª generación son capaces de generar cientos de miles de reacciones de

secuencias en paralelo en un día como los generados por varios cientos de secuenciadores con capilares tipo

Sanger, a un coste por base leída más barato.

2004 2006-2009

Coste 0.01$/bp 0.0001$/bp

Capacidad/Instrumento/día 1.000.000 5.000.000.000˃

2ª Generación Secuenciación

Illumina

Life Technology

ROCHE

GS FLX 454

SOLiD™ 4 System 5500 System

5500xl System

SOLiD™ 3System Ion Torrent System

GS Junior 454GS FLX+ 454

HiSeq 2000 HiSeq 1000 HiScanSQ Genome Analyzer

IIx

MiSeqSolexa

Sanger vs 2ª Generación Secuenciación

1. Fragmentación de DNA 1. Fragmentación de DNA

2.Clonaje en Vectores; Transformación Bacterias; crecimiento y aislamiento vector DNA

2. Ligación de adaptadores in vitro y amplificación clonal

3. Ciclo Secuenciación

CTATGCTCG

Secuencia:Primer:

PolimerasadNTPsddNTPs marcados

Electroforesis(1 Secuencia/Capilar)

3. Secuenciación masiva en paralelo

4. Procesamiento imagen 4. Procesamiento imagen

Programa del curso

De Sanger hacia NGS

454 de Roche Cómo funciona Flujo de trabajo de la tecnología

Comparación con otros Sistemas NGS

Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación. Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones. Secuenciación de genomas “de novo”. Metagenómica RNAseq Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:

Análisis de exomas Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de

captura de secuencia.

Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)

GS 454 de ROCHE

GS FLX + GS Junior

PicoTiterPlateFLX+ (70x70mm)

1ª Generación3100 ABI

2ª Generación GS ROCHE

384p-Plates PicoTiterPlateJunior

GS 454 de ROCHE: Como funciona

96p-Plates

Formato de Placa

Multiplexar (MIDS; Tamaño amplicón; Primer)

N= num de muestras que puedo secuenciar en un run G= tamaño de lo que quiero secuenciar C= Coverage (C= N * L / G)

N= (GxC)/Mbp por región PTP

GasketsGS FLX+ Junior 454

¿Cúantas muestras se pueden secuenciar por run?

GS 454 de ROCHE: Como funciona

Multiplexar (MIDS; Tamaño amplicón; Primer)

70.000-100.000

2. Construcción Librería

3. Amplificación mediante emPCR

4. Secuenciación

GS FLX/Junior 454 Workflow

1.Calidad & CantidadMaterial de partida

gDNA, DNA plasmídico, RNA

Datos Obtenidos

1. Calidad & Cantidad Material de partida

gDNA, DNA plasmídico, RNA

1.1 Calidad mediante Chips Bioanalyzer; gel agarosa

1.2 Cuantificación mediante Picogreen (gDNA, amplicones) o Ribogreen (RNA)

y = 34,577x - 61,596R2 = 0,9994

0

5000

10000

15000

20000

0 200 400 600Lambda DNA (ng/mL)

Flu

ore

scen

ce

.

Fluorímetro FLx800

2. Construcción Librería

3. Amplificación mediante emPCR

4. Secuenciación

GS FLX/Junior 454 Workflow

1.Calidad & CantidadMaterial de partida

gDNA, DNA plasmídico, RNA

Datos Obtenidos

2. Construcción Librería

gDNA, DNA plasmídico RNA

PCR con Fusion Primers

FragmentaciónSelección Tamaño Ligación Adaptadores

Librería ShotgunLibrería Pair-EndLibrería cDNA

Librería Amplicones

Adaptador A (44 bases): Adaptador B (44 bases) Fusion Primers

Primer Amplificación Primer

Secuenciación4

nucleótidos“Key”

Primer Amplificación Primer

Secuenciación4

nucleótidos“Key”Biotina

Adaptador A Target

Adaptador B Target

Fuerzas de rotura hidrodinámicas

Orificio

gDNA

gDNA fragmentado

Librerías Shotgun

NEBULIZACIÓN

2.1 bar (30psi)

2. Construcción Librería: Fragmentación gDNA

Librerías Pair-End

HYDROSHEAR

DNA genómico Fragmentos de DNAde doble cadena

Rotura utilizando nitrógeno a alta presión

Nebulize

2. Construcción Librería: Fragmentación RNA

Librerías cDNA

RNA

Fragmentos de cDNAde doble cadena

Solución de Fragmentación de

RNA

First Strand Synthesis

Random

Primers

Second Strand Synthesis

2. Construcción Librería: Selección fragmentos

DNA 7500 Lab Chip

50pb-1000pb

gDNA Nebulizado:

gDNA fragmentado con Hydroshear:

300pb-1000pb

DNA 7500 LabChip

Tamaño medio de 500-600 nt (dep. del contenido en GC)Menos del 10% ≤ 300 nt, no adaptor dimers

Conc >0.2 ng/μl (Ribogreen ®)

RNA Pico 6000 LabChip

500pb-600 nt

AMPure beads SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization)

Electroelución

Inmobilización Fragmentos y aislamiento de la Librería:

2. Construcción Librería

Melt Solution

4 tipos de productos resultan de la ligación

Los productos con Biotina (AB, BA, BB) se unen a bolas magnéticas que llevan estreptavidina. Los products AA son lavados y eliminados.

Mediante Melt Solution (NaOH0.1N) las cadenas no biotiniladas de cada fragmento de dsDNA son aisladas. Ambas cadenas de los fragmentos BB quedarán unidas a las bolas.

Sólo se aislan cadenas de DNA sencilla AB constituyendo la librería.

AB

BA

BB

AA

Num de Avogadro es 6.022x1023 (moléculas/mole)

328.3x109 (gramos/mole) es peso molecular medio de nts.

Perfil típico de una librería ssDNA (Agilent 2100 RNA Pico 6000 LabChip): Tamaño medio de 500-800 bp

Cuantificación mediante Ribogreen

Dilución de trabajo para emPCR

Molecules/μl =

2. Construcción Librería: Q&Q Librería

2. Construcción Librería

3. Amplificación mediante emPCR

4. Secuenciación

GS FLX/Junior 454 Workflow

1.Calidad & CantidadMaterial de partida

Datos Obtenidos

gDNA, DNA plasmídico, RNA

3. Amplificación mediante emPCR

-1 starting effective fragment per microreactor- ~106 microreactors per ml- All processed in parallel (Amplificación clonal)

High-speed shaker

Reacción de emPCR:

Enrequecimiento de beads con DNA:

% Enrequecimiento=

3. Amplificación mediante emPCR

DNA-beads/ml

Input beadsx100

% Recuperación=DNA-beads/ml

Input beadsx100

Recuperación de beads después de la emPCR:

Rotura y Recuperación Contaje

Melt

dsDNAUnión de Primer

marcado con Biotina a bolas de captura con

ssDNA

Adición de bolas magnéticas con estreptavidina

Melt

5-20% óptimo

65%, 85% óptimo

Antes de la emPCR:

emPCR Titulación sólo para GS FLX

¿Cuántas copias de librería por Beads de captura son óptimas?

Tubo Moléculas de Librería por Bead de Captura (cpb)

Vol Librería Diluida

1 2 1.2 µl

2 4 2.4 µl

3 8 4.8 µl

4 16 9.6 µl

1. Procesar 4 tubos emulsiones

2. Recuperación y enrequecimiento de cada tubo3. Contaje de las beads enriquecidas4. Escoger el ratio copia/bead con aproximadamente un 8% de enrequecimiento

2. Construcción Librería

3. Amplificación mediante emPCR

4. Secuenciación

GS FLX/Junior 454 Workflow

1.Calidad & CantidadMaterial de partida

Datos Obtenidos

gDNA, DNA plasmídico, RNA

4. Secuenciación

Metal coated PTP reduces crosstalk29 μm well diameter (20/bead)3,400,000 wells per PTP

Gaskets

Secuenciación mediante síntesisQuímica basada en la pirosecuenciación

Polimerasa añade nucleótidos (dATP)

Se libera pirofosfato (PPi)

Sulfurilasa crea ATP a partir del PPi

Luciferasa hidroliza ATP y usa luciferina para producir luz.

Light + oxyluciferin

Luciferina

Sulfurylase

Luciferase

4. Secuenciación

Nucleotides are flowed sequentially across the PTPone at a time (200 cycles à 4 bases)

Pyrophosphate signal generation upon complimentary nucleotide incorporation —dark otherwise

The CCD camera is generating a image after every flow

The signal strength is proportional to the number of nucleotides incorporated

Flujo de Reactivos

4. Secuenciación

4. Secuenciación

Flowgama y Base calling:

4. Secuenciación:Ejemplo

Especificaciones Sistemas GS FLX & GS Junior

GS FLX+ System GS Junior System

El futuro de la secuenciación 454

Programa del curso

De Sanger hacia NGS

454 de Roche Cómo funciona Flujo de trabajo de la tecnología

Comparación con otros Sistemas NGS

Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación. Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones. Secuenciación de genomas “de novo”. Metagenómica RNAseq Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:

Análisis de exomas Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de

captura de secuencia.

Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)

Comparación con otros Sistemas NGS

Cuadro resumen de las posibles combinaciones de estrategias en las diferentes plataformas de NGS

2ª NGS 3ª NGS

ABIROCHE

Illumina

3ª NGSRocheABIIllumina

Chemistry based onpirosequencing

Sample amplified byemulsion PCR

Read length 250-500 bp

>1 million reads per run

400-600 Mb of sequence

~10 hours run

GS FLX 454

Chemistry based onreversible terminators

Sample amplified by solidphase amplification

Read length 2x100 bp

3 billions reads per run

600 Gb of sequence

2-11 days run

HiSeq 2000-Illumina ABI SOLID 5500xl

Chemistry based onsequencing by ligation

Sample amplified byemulsion PCR

Read length 50-100 bp

100-500 million reads per run

50-100 Gb of sequence

4-8 days run

Comparación Plataformas NGS

EQUIPO ROCHE GS FLX 454

ILLUMINA HISEQ 2000

ABI 5500XL SOLID

Coste del equipo 450.000 $ 690.000 $ 251.000 $

Coste de los reactivos por run*

6.200 $ 23.470 $ 10.503 $

Coste por Mb 12 $ 0,07 $ 0,04 $

Fuente: http://www.molecularecologist.com/next-gen-fieldguide/

Comparación Plataformas secuenciación

Comparación Plataformas secuenciación

Comparación Plataformas secuenciación

Aplicaciones

Comparación Plataformas secuenciación

Next Generation Genomics: World Map of High-throughput Sequencers

Ejemplos de Genomas humanos secuenciados

Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010)

Comparación Plataformas secuenciación

1ª Generación 2ª Generación

SCIENCE Vol 323 2 JANUARY 2009

John Eid,John Eid,** Adrian Fehr, Adrian Fehr,** Jeremy Gray, Jeremy Gray,** Khai Luong, Khai Luong,** John Lyle, John Lyle,** Geoff Otto, Geoff Otto,** Paul Peluso,Paul Peluso,** David Rank, David Rank,** Primo Baybayan, Brad Bettman, Arkadiusz Bibillo, Primo Baybayan, Brad Bettman, Arkadiusz Bibillo, Keith Bjornson, Bidhan Chaudhuri, Frederick Christians, Ronald Cicero, Keith Bjornson, Bidhan Chaudhuri, Frederick Christians, Ronald Cicero, Sonya Clark, Ravindra Dalal, Alex deWinter, John Dixon, Mathieu Foquet, Sonya Clark, Ravindra Dalal, Alex deWinter, John Dixon, Mathieu Foquet, Alfred Gaertner, Paul Hardenbol, Cheryl Heiner, Kevin Hester, David Holden, Alfred Gaertner, Paul Hardenbol, Cheryl Heiner, Kevin Hester, David Holden, Gregory Kearns, Xiangxu Kong, Ronald Kuse, Yves Lacroix, Steven Lin, Paul Gregory Kearns, Xiangxu Kong, Ronald Kuse, Yves Lacroix, Steven Lin, Paul Lundquist, Congcong Ma, Patrick Marks, Mark Maxham, Devon Murphy, Insil Lundquist, Congcong Ma, Patrick Marks, Mark Maxham, Devon Murphy, Insil Park, Thang Pham, Michael Phillips, Joy Roy, Robert Sebra, Gene Shen, Jon Park, Thang Pham, Michael Phillips, Joy Roy, Robert Sebra, Gene Shen, Jon Sorenson, Austin Tomaney, Kevin Travers, Mark Trulson, John Vieceli, Jeffrey Sorenson, Austin Tomaney, Kevin Travers, Mark Trulson, John Vieceli, Jeffrey Wegener, Dawn Wu, Alicia Yang, Denis Zaccarin, Peter Zhao, Frank Zhong, Wegener, Dawn Wu, Alicia Yang, Denis Zaccarin, Peter Zhao, Frank Zhong, Jonas Korlach, Stephen Turner.Jonas Korlach, Stephen Turner.

Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules

MENLO PARK, Calif., Feb 23, 2010 Pacific Biosciences, a private company developing a disruptive technology platform for real-time detection of biological events at single molecule resolution, today announced the 10 institutions that have purchased its Single Molecule Real Time (SMRT(TM)) DNA sequencing system as part of the company's early access program in North America.

Eleven Leading Companies Support Launch of Third-generation DNA Sequencing

Press Release

Pacific Biosciences Announces Early Access Customers for Its Single Molecule Real Time System

http://www.pacificbiosciences.com

3ª Generación Secuenciación

Programa del curso

De Sanger hacia NGS

454 de Roche Cómo funciona Flujo de trabajo de la tecnología

Comparación con otros Sistemas NGS

Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación. Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones. Secuenciación de genomas “de novo”. Metagenómica RNAseq Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:

Análisis de exomas Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de

captura de secuencia.

Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)

PAUTAS PARA EL DISEÑO EXPERIMENTAL DE UN ESTUDIO DE ULTRASECUENCIACIÓN

Pautes para el Diseño experimental de un estudio de ultrasecuenciación

EXPERIMENTAL DESIGN QUALITY SAMPLES COLLECTION

SAMPLE PROCESSING

DATA ANALYSIS

RESULTS CHECKING

SEQUENCING

EXPERIMENTS

Statistics and Bioinformatics (UEB)

UCTS

Researcher

UCTS WORKFLOW

UEB UCTS

Others

Programa del curso

De Sanger hacia NGS

454 de Roche Cómo funciona Flujo de trabajo de la tecnología

Comparación con otros Sistemas NGS

Aplicaciones de las tecnologías de ultrasecuenciación. Estudio de quasiespecies virales mediante análisis de amplicones. Secuenciación de genomas “de novo”. Metagenómica RNAseq Aplicaciones de los arrays de captura de secuencia:

Análisis de exomas Estudio de mutaciones en leucemia mediante arrays de

captura de secuencia.

Análisis de datos de ultrasecuenciación (UEB)

Fin