debido a su complejidad no pueden ser completamente caracterizados mediante técnicas analíticas...
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debido a su complejidad no pueden ser completamente caracterizados mediante técnicas analíticas solamentecalidad determinada por la combinación de análisis físico-químicos y biológicos, además del proceso de producción y su control (controles en proceso)
la actividad biológica e inmunogenicidad dependen de todas las “características estructurales”
DIRECTIVA 2003/63/CE DE LA COMISIÓN de 25 de junio de 2003
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proteínas y glicoproteínas
moléculas grandes y complejas
microheterogeneidad inherente debido a modificaciones post-traduccionales
Productos biotecnológicos
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i) Idénticas a la molécula natural
ii) Moléculas modificadas/nuevas
Hormona de crecimientoInsulina*
Proteínas de fusión (TNFR:Fc)Anticuerpos monoclonales “humanizados”
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'Pharmed' goats seek drug license
Imagine you could get life-saving medicines from milking a common farmyard animal.
That idea moves a step closer to becoming a reality this week, as the European Medicines Agency (EMEA) considers the final stages of an application to license a natural human protein extracted from the milk of goats.
22 February 2006
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EU funding for GM plant vaccines European scientists have launched a project to make pharmaceutically useful products in genetically modified crops. The consortium, called Pharma-Planta, wants to produce vaccines and other treatments for major diseases, such as HIV/Aids, rabies and TB.
The EU has put 12 million euros (£8m) into the project, which hopes to start clinical trials by 2009.
The first product, possibly grown in maize, is likely to be an antibody that can be used to block HIV transmission.
It would be incorporated into a microbicidal cream that could be used in the vagina.
12 July 2004
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Calidad, eficacia:Caracterización compleja
Control de bancos celularesControl durante el proceso de producciónControl de reactivos (e.g. suero bovino, enzimas)Estudios de inactivación viral
Impurezas (del proceso de producción y relacionadas con el producto)
Seguridad:
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PROCESO DE PRODUCCION
CONSISTENCIA DE PRODUCCIÓNESTABILIDAD
CARACTERIZACIÓN
MATERIAL DE PARTIDA
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caracterización del vector de expresión
su estabilidad durante todo el proceso
establecimiento y control de los bancos celulares
controles durante la fermentación y la purificación del producto
requisitos mínimos para la caracterización del producto
determinación de la consistencia de producción
ensayos de liberación del producto
Aspectos generales a controlar durante el proceso de producción:
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Working Cell Bank (WCB)
End Of Production Cells (EOPC)
Master Cell Bank (MCB)
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BACTERIASLEVADURAS
- Fácil producción a gran escala
- Producción rápida, costo bajo
- No modificaciones secundarias o
Líneas celulares de
mamífero
- Menor antigenicidad- Producción compleja, costo elevado
- Riesgo de contaminación
Animales
TRANSGÉNICOS
- Menor antigenicidad (?)- Mantenimiento de animales, GMP
- Riesgo de contaminación
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Cloned Cells
MCB Cells
WCB Cells
Production Cells
Production Harvest
Clarified Supernatant
Ultradiafiltration
Anion Exchange Chromatography
Ammonium Sulphate Precipitation
Hydrophobic Interaction Chromatography
Reverse Phase Chromatography
Anion Exchange Chromatography
Gel Filtration for Buffer Exchange
Nanofiltration for Virus Removal
Sterile Filtrate – Batch Purified Product (Drug Substance)
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Operating Parameters Process Step In‑process Controls
Load rate: 5 to 10 g/L resinPool dilution factor: 4.5 to 5.5 foldElution flow rate: 0.15 to 0.20 CV/minPool hold temperature: 2.0- 8.0C
Column: Cation exchange
chromatographySP Sepharose HP resin, bed volume
~21.5 L
RP‑HPLC purity, main peak: 86.8%CEX‑HPLC purity, main peak: 81.8%SE‑HPLC purity, main peak: 99.0%E coli protein: 2.5 ng/mgBacterial endotoxin: < 0.24 EU/mLAerobic bioburden: < 30 CFU/mLStep yield: 32.2% to 63.3%Pool volume: 40.9 to 77.4 LPosition of start collect: 46.6 to 95.1 minPeak shape: Pass
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Impurity
Residual level
Host cell DNA < 2.5 ng/max. dose
CHO Proteins < 0.375 µg/max. dose
Insulin < 17 ng/mL (below the LOQ)
Gentamicin < 2.5 ng/mL (below the LOQ)
Anti-foam agent
< 12.5 µg/mL
Protein A < 0.4 ng/mL
TRIS < 83 µM (10 g/mL)
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VALIDACION del PROCESO de PRODUCCION
• Numero de lotes de producción requerido depende de la complejidad del proceso de producción
•Al menos tres lotes consecutivos obtenidos a la escala de producción comercial propuesta
Requerimientos mínimos para productos biológicos/biotecnológicos:
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Caracterización Físico-Química
Otras propiedades• Carga: CE, IEC, IEF• Tamaño: AUC, SDS-PAGE,
SE-HPLC, MALDI-TOF MS• Inmuno-reactividad: IP, WB
Estructura secundaria y terciaria• Dicroísmo circular• Resonancia Magnética Nuclear• Cristalografía de rayos-X• Inmuno-reactividad• Ensayos biológicosComposición(cualitativa y cuantitativa)
Estructura primaria• Análisis de la composición de aminoácidos• Secuenciación N/C-terminal• Mapa peptídico y secuenciación/MS
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Actividad Biológica
Ensayos biológicosen animalesERITROPOYETINA
Ensayos biológicosen cultivos celularesINTERFERON
Ensayos bioquímicosFACTOR VIII
potencia consistencia de producción
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Oxidación Desamidación Agregación Clipping Plegamiento inadecuado Glicosilación alterada Modificación química Puentes disulfuro inadecuados
Modificación de proteínas(product-related impurities)
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SEGURIDAD & EFICACIA
Especificaciones
Caracterización extensiva durante el
desarrollo del producto
cumplimiento de GMPs
Validación de la producción
Control de los materiales de partida
Controles en-proceso
Estudios de estabilidad
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No se recomiendan métodos ni límites específicos (propios del fabricante en función de su propia experiencia)
Describe los principios que deben guiar el establecimiento de especificaciones a diferentes niveles del proceso de producción:
caracterización del producto controles en proceso materiales de partida liberación del producto validación de los métodos de análisis uso de estándares de referencia, etc.
e.g. formas desamido
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• rDNA products• EPO• insulin• somatropin• IFN alfa• IFN gamma• glucagon
• rhuFVIII• alteplase (rtPA)• calcitonin• HBsAg• molgramostim (GM-CSF)• MoAbs
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Las especificaciones de una monografía de Ph. Eur. se consideran requisitos mínimos pero no son suficientes para definir cada producto en particular.
Las especificaciones son propias de cada producto y asociadas a cada proceso de producción (ej. EPO)
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Estudios de estabilidad que han de presentarse al solicitar la autorización comercial
Incluye aspectos tales como
• frecuencia a la que se debe medir la estabilidad• condiciones de almacenamiento• parámetros que deben ser medidos• criterios de selección de los lotes que se incluyen en
los estudios, etc.
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Final product
•at least 3 batches, representative of the scale of production and the material used in preclinical and clinical studies
•Final container, from different batches of bulk material where possible
•Minimum of 6 months stability data at the time of submission
•Expiry date based upon the actual data submitted
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