CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOSDEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD IRAPUATODEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Identificación y caracterización funcional de genes letalesmasculinos en el polen de Arabidopsis thaliana: bases para el

establecimiento de una tecnología que impida el flujo detransgenes.

Tesis que presenta

Q.F.B Ana Elena Dorantes Acosta

Para obtener el grado deDOCTORA EN CIENCIAS

en la especialidad enBIOTECNOLOGIA DE PLANTAS

Director de TesisDr. Jean Philippe Vielle Calzada

Irapuato, Guanajuato. Marzo 2006

ESTE TRABAJO FUE REALIZADO EN EL LABORATORIO DE DESARROLLO REPRODUCTIVO Y

APOMIXIS DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA GENÉTICA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE

ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPN CAMPUS GUANAJUATO BAJO LA ASESORÍA

DEL DOCTOR JEAN PHILIPPE VIELLE CALZADA

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Jean Philippe Vielle Calzada por la oportunidad de formar parte de su laboratorio,por su asesoría y su amistad.

A mi comité de asesores: Dra. Alba Estela Jofre y Garfias, Dr. Alfredo Herrera Estrella,Dr. Ariel Alvarez Morales, Dra. Gladys Cassab y al Dr. Juan Gabriel Ramírez Pimientelpor su disponibilidad y sugerencias que enriquecieron mi trabajo doctoral.

A todos los miembros del Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis, pasados ypresentes, en especial a Mario, Gerardo, Wilson, Nidia, Vianey, Andrés, César, Victor,Santos, Vicenta, Jaime, Javier, Daphnè, Marcelina… por su apoyo y amistad.

A Lety Chong, Dora Anguiano, Laura Camacho, Martha Corona y Lalo por sudisponibilidad y amabilidad en la realización de los trámites administrativos.

A mis compañeros de generación.

A la comunidad del CINVESTAV que de una u otra manera ayudó a la realización deeste trabajo.

Al CINVESTAV-IPN Campus Guanajuato donde llevé a cabo mis estudios de doctorado.

Al CONACYT por el financiamiento que me otorgó durante el doctorado, lo que mepermitió realizar la mayor parte de mi trabajo doctoral.

ÍNDICE páginaRESUMENABSTRACT

I. INTRODUCCIÓNA. Desarrollo del polen.

a. Microsporogénesis.b. Microgametogénesis.

c. Síntesis y deposición de pared celular.

d. Germinación y crecimiento del tubo polínico.B. Fases de expresión génica y genes polen-específicos.

C. Identificación de mutantes letales gametofíticas masculinas.D. Dispersión del polen y sus implicaciones.

a. El polen como vector de información genética y evidencia del

flujo de transgenes a través del polen.b. Estrategias para lograr la contenció del flujo de polen.

E. Empleo de genes gametofíticos letales para impedir el flujo detransgenes a través del polen.

II. OBJETIVOSA. Objetivo general.

B. Objetivos específicos

III. MATERIALES Y METODOS

A. Material biológico y condiciones de crecimiento.B. Escrutinio para identificar mutantes gametofíticas letales masculinas.

C. Identificación del gen etiquetado y determinación del número de

inserciones.D. Análisis de segregación y cruzas reciprocas.

E. Análisis histológicos.a. Clareos.

12

3456891214

1516

19

20

2121

22232323

b. Tinciones DAPI.

c. Cortes semifinos.d. Detección de calosa.

e. ESEMF. Germinación de polen in vitro e in vivo.

G. RT-PCR.

H. Hibridación in situ en cortes semifinos y tejido completo.

24242425252626

IV. RESULTADOSA. Rastreo de segregación en la colección de mutantes insercionales.

a. Clasificación de las familias de segregación.

b. Segregación distorcionada 1:1.B. Identificación de mutantes gametofíticas letales masculinas, MGT76,

tepitzin1(tpz1 ) y MET350.

a. Discriminación del origen de la mutación.C. Análisis de las mutantes gametofíticas letales masculinas. MGT76 y

MET350. Determinación del número de inserciones. D. MGT76 , tepitzin1.

a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea

MGT76.b. El gen etiquetado en MGT76 es WOX5 y pertenece a la familia

WOX, caracterizadas por un homeodominio tipo WUSCHEL.c. Una segunda inserción a 6 pares de bases de MGT76 también

segrega 1:1.

d. Segregación de las inserciones de MGT76.e. Patrón de expresión de WOX5.

f. El desarrollo del polen en línea MGT76, tepitzin1(tpz1) es

idéntico al silvestre.

g. El tubo polínico en tpz1 muestran un retraso en el crecimiento del

45% en comparación con el silvestre.

h. Seguimiento genético de los cuatro productos de la meiosis en

tpz1.

282829

303131

33

33

33

373738

39

40

tpz1.

i. La elongación del tubo polínico de tpz1 in vivo también es

deficiente.

E. MET350a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea

MET350.

b. El gen etiquetado en MET350 (AtCAD6) pertenece a la familia delas enzimas cinamil alcohol deshidrogenasa.

c. La familia CAD está involucrada en la síntesis de componentes dela pared celular.

d. Patrón de expresión de AtCAD6 .

e. AtCAD6 se transcribe en sentido y en antisentido.f. El polen en la línea MET350 tiene defectos en la integridad y

mantenimiento de la pared celular.g. Confirmación de la mutación gametofítica.

V. DISCUSIÓNA. Los escrutinios de segregación son una herramienta poderosa para

identificar genes gametofíticos.B. Mutantes gametofíticas letales masculinas.

C. Genes que se expresan durante el desarrollo del polen y el desarrollo

progámico.D. El factor transcripcional W O X 5 se expresa durante la

microgametogénesis.

E. WOX5 se expresa en el centro quiescente y en el tubo polínico yposiblemente su expresión está regulada por auxinas.

F. En la mutante tpz1 los tubos polínicos detienen su crecimiento, peroen la doble mutante tpz1/+; qrt1/qrt1 el tubo polínico de tpz1 se

recupera parcialmente.

G. La eficiencia de transmisión de tpz1 a través del polen es del 47%, sinembargo no es posible recuperar plantas homocigotas

42

44

45

45

464749

5052

5354

54

55

56

56

57

H. AtCAD6 es una enzima reductora y está involucrada en síntesis de

pared celular.I. Transcripción sentido y antisentido asociada a AtCAD6.

J. A qué nivel de pared celular se encuentra el defecto?.

K. Uso de AtCAD6 e implicaciones para el establecimiento de

tecnologías que impidan el flujo de transgenes a través del polen

VI. CONCLUSIONES

VII. PERSPECTIVAS

VIII. REFERENCIAS

IX. ANEXOS

585859

60

63

65

68

77

1

RESUMEN

El constante incremento mundial en la superficie cultivada con plantas transgénicas ha

desembocado en problemas prácticos asociados con el flujo de rasgos transgénicos a través del

polen. La implementación de nuevas estrategias biotecnológicas para evitar o reducir

significativamente el flujo del polen transgénico es particularmente importante en países que

constituyen centros de origen de especies cultivables (ej. el maíz). El desarrollo del polen ocurre en

las anteras, donde múltiples células arqueosporiales se diferencían a partir del tapetum y se dividen

meioticamente para producir cuatro productos haploides, denominados microsporocitos. Posterior a

la meiosis, los microsporocitos experimentan dos divisiones mitóticas para producir un grano de

polen tricelular maduro. Estudios de expresión globlal a nivel genómico realizados en Arabidopsis

thaliana han mostrado que cerca del 10% de los genes expresados en el polen, son específicos a

este gametofito. Generamos una colección de líneas insercionales con transposones que actúan

como trampas génicas o detectores de potenciadores en Arabidopsis y realizamos un escrutinio

genético basado en la identificación de distorsión de la segregación clásica mendeliana 3:1 del

caracter que confiere resitencia al antibiótico Kanamicina (KanR) presente en el transposón de

plantas heterocigotas. Analizamos la segregación de 1000 líneas y encontramos que 7 de ellas

segregaban 1:1 (KanR:KanS) y mostraban una reducción en la transmisión del transposón a través

del polen. Caracterizamos dos de estas líneas a nivel genético y molecular. La inserción en la línea

que denominamos tepitzin1 (tpz1) se encuentra en la región reguladora del gen WOX5, un presunto

factor transcripcional que contiene un dominio del tipo hélice-asa-hélice característico de la familia

WOX y que es similar al factor transcripcional WUSCHEL. Ensayos de germinación de polen in

vitro e in vivo de plantas heterocigotas tpz1/+ mostraron que el crecimiento del tubo polínico se

encuentra reducido hasta en un 45% en longitud con respecto al polen tipo silvestre. En la línea

MET350 la transmisión a través del polen fue del 0.2%. La transmisión del transposón a través del

gametofito femenino en ambas líneas no se encuentra afectada. La inserción en MET350 está en el

3’ UTR del gen AtCAD6 que codifica para una enzima alcohol deshidrogenasa involucrada en la

biosíntesis de pared celular. El el 50% del polen maduro en esta línea muestra surcos de

geminación anormales y extensiones protrusivas de exina. Mientras que la función de WOX5 define

una nueva ruta genética que integra la señalización por auxinas durante la fase progámica de la

reproducción de las plantas, AtCAD6 consituye la primer enzima de la ruta biosintética de ligninas

involucrada en la microgametogénesis. Nosotros proponemos una nueva estrategia biotecnológica

para impedir el flujo de transgenes a través del polen a menos del 0.2% en condiciones de cultivo

en campo, que se basa en la alteración de la actividad de AtCAD6

2

ABSTRACT

The constant world increase in transgenic cultivated areas has lead to practical problems associated

with the flow of transgenic traits through pollen. Implementing new biotechnological strategies to

avoid or significantly reduce transgenic pollen flow is particularly important in countries that are

centers of origin of crop species(v. gr. corn). Pollen development takes place in the anther where

multiple archeosporial cells differentiate from the tapetum and divide meiotically to produce four

haploid products, the microsporocytes. Following meiosis, the microsporocytes undergo two

mitotic divisions to produce a tricellular mature pollen grain. Global expression studies at the

genomic level have shown that close to 10% of the genes expressed in pollen are specific to the

male gametophyte in Arabidopsis thaliana. After generating a collection of transposon-based

enhancer detector and gene trap lines in Arabidopsis, we performed a genetic screen based on the

distorted segregation of the classical 3:1 mendelian ratio of a molecular marker (kanamycin

resistance; KanR) carried by a mutagenic transposon element in a heterozygous individual. We

analyzed 1000 lines and found that 7 lines that segregate 1:1 (KanR:KanS) and showed reduced

transposon transmission through pollen. We characterized 2 of these lines. The insertion in the line

that we named tepitzin1 (tpz1) is located in a regulatory region of WOX5, a putative transcription

factor WUSCHEL like containing a helix-loop-helix domain that belongs to the WOX family. In

vitro and in vivo pollen germination of tpz1 heterozygous individuals produced pollen tubes

showing delayed germination and reduced 45% in length. MET 350 shows 0.2% transmission

through the male gametophyte but normal transmission through the female. The insertion is in the

3’UTR of a gene encoding an alcohol dehydrogenase AtCAD6, involved in cell wall biosynthesis.

In MET350 50% of the mutant tricellular pollen had abnormal furrows and protrusive extensions of

exine. We suspect that these types of defects are detrimental for pollen viability by provoking

excessive dehydration during pollen maturation and germination. Whereas the function of WOX5

defines a new genetic pathway integrating auxin-mediated signals with the progamic phase of plant

reproduction, AtCAD6 encodes the first lignin biosynthetic enzyme involved in

microgametogenesis. We propose a new biotechnological strategy that relies on altering the

molecular activity of AtCAD6 to impede transgenic flow through pollen less than 0.2% in filed

conditions.

3

I. INTRODUCCIÓN

La reproducción sexual en las plantas requiere de la formación exitosa de

gametofitos femeninos y masculinos que son producidos durante la generación

gametofítica. Esta generación alterna con la esporofítica, representada por tejido

vegetativo como tallos, hojas, raíces y la mayor parte de los órganos florales de carácter

diploide. En las plantas con flores (angiospermas) el desarrollo de los gametofitos se

encuentra restringido a estructuras especializadas de naturaleza diploide. El gametofito

femenino se desarrolla al interior de los óvulos, y se compone comúnmente de 7 células;

tres antípodas, dos sinérgidas, una célula huevo (ovocélula) y una célula central. El

gametofito masculino o polen se desarrolla en las anteras de las flores y en plantas como

Arabidopsis thaliana, es una estructura tricelular, con dos células espermáticas contenidas

dentro de una célula vegetativa.

Cuando el polen maduro entra en contacto con estigmas receptivos, se inicia el proceso de

la doble fecundación; mientras que una célula espermática fecunda a la ovocélula dando

lugar al embrión, la otra célula espermática fecunda a la célula central originando el

endospermo, dando lugar a la formación de una semilla.

A. DESARROLLO DEL POLEN

El polen se desarrolla en las anteras. En Arabidopsis thaliana, las flores poseen 6

anteras localizadas en el extremo de cada uno de los estambres, dos cortos y 4 largos que

se ubican en la tercera corola floral (Figura 1).

Figura 1. Estructuras reproductivas masculinas.(A) Las flores de Arabidopsis poseen 4 corolas 1 corresponde a los sépalos, 2 a lospétalos, 3 a los estambres y 4 al carpelo. (B) En el extremo de cada estambre seencuentran las anteras, que son las estructuras dentro de las cuales se desarrolla el polen.(C) Cuando el polen ha completado su desarrollo, las anteras liberan el polen (antesis).Tomado y modificado de mips.gsf.de/proj/thal/ens; www.uarl.edu; www.jic.ac.uk

4

Cuando cada antera ha desarrollado los 4 lóculos (Figura 1B), alrededor del día 10

después del inicio de la formación del primordio floral comienza la formación del grano de

polen. (Smyth et. al., 1990; Sanders et. al.,1999; Regan y Mofat 1990). El desarrollo

sincrónico entre la flor, las anteras y el polen se describe en la Tabla 1.

a. Microsporogénesis

El polen inicia su desarrollo en la capa interna de la antera, en el tapetum, que funciona

como soporte metabólico y tiene un papel fundamental en el desarrollo de la pared celular

(Bedinger 1992; Blackmore y Crane 1988). Las células del tapetum o células

arquesporiales, se diferencian en microsporas madre tras una serie de divisiones mitóticas.

Cada microspora madre sufre una división meiótica y da origen a 4 productos haploides.

Tabla 1. Clasificación y descripción de los estadios de desarrollo de la flor, antera y polen, tomado de Smyth et. al.,

1990; Sanders et. al.,1999; Regan y Mofat 1990.

Etapa

floral

Edad de la flor

al fin de la

etapa (días)

Etapa de

desarrollo de

la antera

Etapa de

desarrollo

del polen

Principales marcadores morfológicos

1 1

2 2.25 Se forma el primordio floral.

3 3 Se presenta primordio de los sépalos.

4 3.75 Sépalos cubren el meristemo floral.

5 41

2

Primordios de pétalos y estambre aparecen.

Las células arquesporiales se distribuyen en 4 esquinas de la cala L2. El primordio se hace oval.

6 5.25 Sépalos rodean el botón floral.

7 6.25 3Primordio de estambres largos anclados a la base.

Cuatro regiones de actividad mitótica.

8 7.25 4Aparecen los lóculos en estambres largos. Aparece el patrón de los cuatro lóculos de la antera. Se

inicia la zona vascular.

9* 9.75

5

6

7

3

4

Primordio de pétalos anclados a la base. Se establecen claramente los cuatro lóculos de las

anteras. Aparecen las microsporaas madre y ya se encuentran presentes todos los tipos celulares.

Las microsporas madre entran en meiosis. La pared media inicia su degradación, el tapetum se

llena de vacuolas y la antera aumenta su tamaño. La meiosis se completa y las tétradas se

encuentran libres en los lóculos.

10 10.258

9

5

6

7

Pétalos y estambres cortos al mismo nivel. Se degrada la pared de calosa que rodea las tétradas y

se liberan las microsporas uninucleadas. Continúa el crecimeinto de la antera. Las microsporas

generan una pared de exina y se vacuolizan.

11 11.5

10

11

12

8

9Aparecen papilas estigmáticas. Se inicia la degeneración del tapetum

12* 13.25

10

11

12

8

9

10

Pétalos y estambres largos al mismo nivel. Las divisiones mitóticas proceden, termina la

degeneración del tapetum. Las anteras contienen polen tricelular, la antera se vuelve bilocular

13 0.5 13Botones abren, los pétalos son visibles, antesis o dehiscencia. Ruptura del estonio y se libera el

polen.

14 1 13 Anteras largas se extienden sobre los estigmas.

15 2 14 Estigmas se extienden sobre anteras largas. Senescencia de los estambres

5

Estas 4 nuevas células denominadas microsporas permanecen unidas por un polímero de

calosa (b1-3 glucano) formando una estructura que se conoce como tétrada. Las tétradas se

mantienen disgregadas dentro de cada lóculo de la antera.

b. Microgametogénesis

El desarrollo del polen implica complejos rearreglos celulares y una síntesis activa de

nuevos compuestos. Una vez que se ha formado la tétrada y tan pronto como la meiosis

concluye, se inicia la síntesis de la pared celular del grano de polen. El polen maduro

contiene una capa de intina que se encuentra en contacto con la membrana citoplásmica y

está compuesta principalmente por pectocelulosa y por una capa externa compuesta

mayoritariamente por esporopolenina esculpida en distintos patrones que contribuyen a

darle la especificidad al reconocimiento estigma-polen denominada exina (Xu et.al, 1999).

La tétrada se separa por la acción de una enzima hidrolítica llamada calasa, dejando así

las microsporas libres. Cada una de estas microsporas dará lugar a un grano de polen

después de pasar por dos divisiones mitóticas. Las microsporas libres se vacuolizan,

aumentan de tamaño y se preparan para una división mitótica, la formación de la vacuola

central se acompaña de la migración del núcleo a la periferia. La primera división, llamada

mitosis polínica I (PMI), es una división asimétrica que produce 2 células; la célula

vegetativa que es una célula de gran tamaño con un núcleo disperso y la mayoría del

citoplasma de la microspora y la célula generativa, que es una célula pequeña con

cromatina altamente condensada y muy poco citoplasma. Esta célula está contenida dentro

del citoplasma de la célula vegetativa (Figura 2). En Arabidopsis thaliana y en algunas

gramíneas como Zea mays la segunda división mitótica (PMII) ocurre mientras la

microspora está en la antera, pero en la mayoría de las especies de la familia de las

Solanáceas esto ocurre después del inicio de la germinación del tubo polínico (Twell et.

al., 1998).

La etapa de mayores rearreglos celulares es la división mitótica I, etapa durante la cual

inicia la fusión de las vacuolas y la migración nuclear a la periferia celular. De esta primera

6

división se producen dos células de diferente tamaño; la asimetría de este proceso es

crucial para la determinación del destino celular. La célula de mayor tamaño (la vegetativa)

detiene su desarrollo en la etapa G2 del ciclo celular, mientras que la generativa se libera

de intina y queda incluída en el citoplasma de la célula vegetativa. En Arabidopsis, tras una

segunda división mitótica se producirán dos células espermáticas de igual tamaño, una

encargada de fecundar la célula central para la formación del endospermo en las semillas y

la otra encargada de fecundar a la ovocélula (Lady et. al.,1995; McCormick,1993). El

evento de doble fecundación marca el final de la fase haploide.

En la literatura se muestra que las diferencias estructurales y funcionales entre la célula

vegetativa y la generativa están altamente reguladas por la actividad génica (Mascarenhas

1989; Blomstedt et. al., 1996; Ma 2005), sin embargo los procesos moleculares y genéticos

que controlan estos eventos han sido pobremente elucidados.

c. Síntesis y deposición de pared celular

Uno de los procesos más dinámicos en el desarrollo del grano de polen es la

síntesis y deposición de pared celular. La división meiótica que da lugar a las microsporas

y la síntesis de pared celular inician sincrónicamente. En el momento en que la microspora

FIGURA 2. Formación del grano de polen de Arabidopsis thaliana.Los cuatro productos de la meiosis quedan unidos formando una tétrada. Tras su separación por acción de lacalasa, cada microspora aumenta de tamaño y forma una gran vacuola. La microspora se dividemitóticamente y da origen a dos células; la célula vegetativa y la generativa, ésta última se dividirá una vezmás para formar las dos células generativas. El polen maduro es una estructura tricelular; dos célulasgenerativas o espermáticas pequeñas contenidas dentro del citoplasmas de la célula vegetativaModificado de Twell 2002.

7

queda libre, se torna más redonda debido a la presencia de pequeñas vacuolas. En este

momento el polen ya formó una cubierta delgada y flexible de exina (Figura 3).

La capa que está en contacto con la membrana citoplásmica es la intina, cuyos

componentes principales son pectina, celulosa y algunas proteínas. La exina es la capa

externa, y varía entre especies pero se reconocen de manera general dos subcapas

principales: la exterior (sexina) que está complejamente esculpida y la interior (nexina). La

exina está compuesta por esporopolenina; polímero alifático con cadenas laterales

conjugadas o con anillos aromáticos, responsable de la mayoría de las propiedades de la

pared del grano de polen, incluyendo la resistencia física, la resistencia al ataque de hongos

y bacterias y el reconocimiento célula-célula (Twell, 2002). La deposición se lleva a cabo

en pasos sucesivos. El primero de ellos es la ondulación de la membrana citoplásmica de la

microspora (Figura 4). Existen proteínas membranales como DEX1 (Paxson-Sowders et.

al., 2001), involucradas en el ondulamiento de la membrana citoplásmica; mutantes en

DEX1 no forman el patrón característico reticulado y son estériles masculinas. Una vez

formado el patrón de la membrana citoplásmica, se depositan gradual y sincrónicamente

los compuestos que integran la pared celular entre pectina, celulosa, ceras y lípidos

(Preuss et. al., 1996; Millard et. al., 1999).

FIGURA 3 . Estructura y composición de la pared celular del polen(A)La pared celular del polen está encargada de establecer el patrón superficial especie-específico (enArabidopsis se denomina reticulado) y de protección. (B)La pared del grano de polen se compone de 2capas: la intina (líneas horizontales), que se encuentra en contacto con la membrana citoplásmica,compuesta por proteínas, pectinas y celulosa , la exina (líneas inclinadas) compuesta por esporopoleninaque integra 3 capas, nexina1, nexina2 y la primexina que es la encargada del patrón especie-específico.Modificado de Twell 2002.

A B

8

d. Germinación y crecimiento del tubo polínico

Una vez que el grano de polen terminó su desarrollo dentro de la antera, contiene

proteínas, RNA mensajero y otras moléculas que provienen de las células de tapetum y de

los núcleos vegetativo y generativos. La fase progámica inicia con la deshidratación del

grano de polen, manteniendo de un 6-60% de agua según la especie (Taylor y Hepler

1997). Cuando el polen llega a un estigma receptivo inicia la germinación del tubo polínico

con ayuda del RNA, proteínas y otras moléculas almacenadas. Después del reconocimiento

célula-célula entre la superficie del polen y las papilas estigmáticas, se produce un flujo de

agua hacia el interior del polen, esto activa la síntesis de nuevas moléculas necesarias para

la germinación y se establecen gradientes iónicos especialmente de calcio, catión que

determina en gran parte la orientación de la germinación. La elongación de la punta del

tubo polínico representa el crecimiento celular vegetal más rápido reportado (Taylor y

Hepler 1997; Lord 2003); crece polarizadamente y presenta un fenómeno de periodicidad

(Parton et. al., 2003; Prado et. al., 2004). La región apical de los tubos polínicos en

crecimiento tiene más densidad de organelos que se mueven en la corriente citoplásmica

describiendo una forma de “fuente invertida”. Otra característica es la acumulación de

vesículas secretorias que contienen el material para la expansión de la pared celular,

agregadas en forma de cono invertido en la punta del tubo polínico (Figura 5) (Derksen et.

al., 2002).

FIGURA 4. Deposición de la pared celular del grano de polenDespués de la meiosis se inicia la síntesis de la pared celular (1). El ondulamiento de lamembrana citoplásmica es necesario para establecer el patrón de deposición (2). Este patrónpermite que los compuestos pectínicos y otros polímeros que constituyen la intina sedepositen en la cresta de cada onda (3); así se establece el patrón característico de lasuperficie del grano de polen. Los componentes de la exina se ensamblan con la capa inicialde intina (4 y 5). Modificado de Paxon-Sowders et. al.,2001.

1 2 3 4 5

9

Una vez que ha iniciado la germinación, el tubo polínico crece rápidamente, algunos de

los factores que participan en este proceso son: los filamentos de actina que mueven

activamente las vesículas generadas en el complejo de Golgi (Cheung et. al., 2002), la

pectina que mantiene el turgor del tubo polínico (Bosch y Hepler 2005; Bosch et.

al.,2005), la celulosa y las arabinogalacto-proteínas que pueden ser señal para dirigir el

crecimiento o fuente de carbohidratos para el consumo energético (Taylor y Hepler 1997;

Jonson y Preuss 2002; Lord y Russell 2002).

B. FASES DE EXPRESIÓN GÉNICA y GENES POLEN-ESPECÍFICOS

La división meiótica en la que se originan las cuatro microsporas, es una división

reductiva y es esencial para producir células reproductivas haploides. Depués de que las

células del tapetum se han diferenciado a microsporas madre, experimentan una ronda de

replicación de DNA y dos divisiones nucleares, meiosis I y meiosis II. En la meiosis I se

da la segregación de cromosomas homólogos. El estudio genético de la meiosis masculina

ha permitido identificar mutantes en genes esenciales para varias de sus etapas. La

FIGURA 5. Progresión de eventos antes y después de la germinación del tubo polínico.(A)La germinación del tubo polínico inicia cuando un grano de polen alcanza una papilaestigmática receptiva. Posterior al reconocimiento celular se activa el metabolismo del polenpor la hidratación, germina el tubo polínico y penetra el tejido materno hacia el interior delcarpelo para fecundar un óvulo. (B)La punta del tubo polínico es una zona de muchamovilidad de vesículas; este movimiento depende de fibras de actina. En esta zona hay unaactiva síntesis de compuestos de pared celular. Modificado de Gu et. al., 2003;www.cepceb.ucr.edu/members/yang.htm

A B

10

mutante syn1 de Arabidopsis thaliana, se encuentra afectada en la cohesión de las

cromátidas hermanas y tiene defectos en la condensación y apareamiento de las

cromátidas (Bai et. al.,1999). Otro gen que afecta este proceso es SWI1/DYAD que

codifica una proteína novedosa relacionada con la meiosis, esencial para la cohesión de

cromátidas hermanas durante meiosis femenina y masculina (Agashe et. al., 2002).

Posteriormente ocurre una unión estable, denominada sinapsis. En este proceso se han

reportado dos mutantes asy1 (asynaptic) y ahp2, que produce la formación de dos o tres

pares bivalentes en lugar de 5 por célula en la meiosis femenina y masculina de

Arabidopsis (Caryl et. al., 2000). AtRAD51 y AtDMC1 son genes importantes para la

división meiótica, son homólogos de la recombinasa A de levadura, codifican proteínas

de unión a DNA de cadena sencilla dependientes de ATP; mutantes en estos genes son

estériles femeninas y masculinas ya que presentan fragmentación de cromosomas tras la

meiosis (Couteau et. al., 1999). Posteriormente a la recombinación y separación de

cromosomas procede la separación celular (citocinesis). MMD1/DUET1 codifica una

proteína con un dominio PHD que le confiere la capacidad de interactuar con DNA,

proteínas y RNA. Mutantes en este gen son estériles masculinas. Para el desarrollo y

maduración exitosa del grano de polen también participan genes de naturaleza esporofítica

y productos del tapetum. Algunas de las mutantes que han proporcionado evidencia de la

importante contribución esporofítica son: male sterile2(ms2) y male sterile33(ms33)

deficientes en la formación de la pared celular del grano de polen. MS2 es un gen que se

expresa postmeióticamente en el tapetum y codifica para una proteína que promueve la

síntesis de moléculas alifáticas de cadena larga (Aarts et. al., 1997).

Mascarenhas (1990) propuso que hay dos fases principales de actividad génica posmeiótica

en el desarrollo del gametofito masculino que corresponden a dos poblaciones distintas de

transcritos. La primera población incluye transcritos que se sintetizan durante la mitosis I

y disminuyen durante la maduración. Estos transcritos representan genes tempranos. La

segunda población está representada por transcritos que se acumulan después de la mitosis

I y se traducen al tiempo que se acerca la germinación del tubo polínico. Estos transcritos

representan genes tardíos (Roberts et. al., 1993); genes que se expresan durante esta última

etapa han sido reportados y algunos estudios de regulación génica se realizaron usando los

11

promotores de genes como LAT52 y LAT59 de tomate (Twell et. al., 1989; 1990; 1991) y

Zmc13 de maíz (Hanson et. al., 1989). Elementos reguladores en cis de estos genes se han

caracterizado y reportado (Okada et. al., 2000). Sin embargo el control post-meiótico del

polen no solo está regulado por genes gametofíticos tardíos, sino también por esporofíticos

que son los que se han caracterizado más extensamente (Taylor y Hepler, 1997). Una de

las mutantes en desarrollo del polen que se ha descrito es: gemini pollen (gem1) que está

afectada en la división asimétrica producto de la mitosis polínica I y en lugar de obtener

una célula vegetativa y una generativa se obtienen dos con identidad de célula vegetativa

(Park et,al.,1998; Park y Twell 2001). Chen y McCormick(1996) reportaron otra mutante,

side car pollen, afectada también en la polaridad celular. Del grupo de McCormick han

surgido otras mutantes gametofíticas afectadas en procesos de germinación como raring to

go en la que el tubo polínico germina en las anteras antes de la antesis (Johnson y

McCormick, 2001).

El análisis genético de mutantes gametofíticas es todo un reto; el aislamiento sistemático

de genes gametofíticos es difícil debido a que no todas las mutaciones gametofíticas

pueden ser distinguidas fenotípicamente ya que son semi-estériles y generalmente si se

produce la progenie correspondiente. También es difícil propagar líneas con mutaciones

gametofíticas sin emplear sistemas de restauración de fertilidad, como en la andro-

esterilidad citoplásmica que requiere que uno de los progenitores contenga un gen

“restaurador” que al heredarse revierta la esterilidad masculina en la progenie, o en caso

de otras mutantes debe mantenerse en estado heterocigoto (Grini, et. al., 1999).

El desarrollo de estrategias que permiten el análisis de la expresión global de genes han

sido empleadas en el gametofito masculino. Los resultados reportados (Honys y Twell

2004) corroboran lo encontrado 15 años atrás por Mascarenhas mediante análisis de

isoenzimas (Mascarenhas, 1990).

12

C. IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES LETALES GAMETOFÍTICAS

MASCULINAS

En la sección anterior describimos algunas de las mutantes y genes encontrados

mediante rastreos de esterilidad. Otro enfoque para tratar de identificar genes asociados a

los procesos de formación de gametos son los escrutinios o rastreos de segregación. Estos

se basan en la posibilidad de asociar un gen marcador de selección o un marcador

molecular a la mutación. Las mutantes se rastrean buscando líneas que no transmitan el

gen de selección, como por ejemplo el de resistencia al antibiótico kanamicina (Feldmann

et. al., 1997; Bonhomme et. al., 1998; Howden et. al., 1998; Grini et. al., 1999; Procissi

et. al., 2001; Pagnussat et. al., 2005). Los genes introducidos a plantas vía transformación

ya sea mediante Agrobacteruium tumefaciens u otro método se heredan de forma

mendeliana; es decir, la progenie de la autopolinización de una planta heterocigota para un

carácter introducido segregará normalmente 3:1 para dicho carácter. Pero existen casos en

que la segregación no corresponde a la forma esperada. Esta segregación no mendeliana o

excepcional del carácter introducido puede ser el resultado de mecanismos muy

interesantes en los que la inserción haya inactivado un gen endógeno necesario para el

desarrollo de alguno de los gametos o del desarrollo embriogénico (Feldman et.al., 1997;

Dubreucq et. al., 1996).

Proporciones de segregación:

1:3(Sensible:Resistente). Es la forma mendeliana de segregación de un carácter

heterocigoto dominante como se espera que la mayoría de los transgenes se comporten

cuando se integran en el genoma de una planta, es decir, en el caso de que la inserción

contuviera un gen de selección (nptII) que le confiere resistencia al antibiótico kanamicina

(kan), la progenie que resulte de la autopolinización incluirá 75% de plántulas resistentes y

25% de sensibles. Feldman et.al., (1997) reporta que en un escrutinio realizado en una

colección de mutantes insercionales con T-DNA un 54% segregaron de forma mendeliana

3:1.

1:2(Sensible:Resistente). Este tipo de segregación no mendeliana está relacionada con

13

mutaciones en genes relacionados con la embriogénesis ya que si la inserción está

inactivando un gen necesario para este proceso, la descendencia que posea el alelo paterno

y materno mutado será inviable y no completará el desarrollo embriogénico, recuperando

solo dos plántulas resistentes por una sensible.

1:1(Sensible:Resistente). Esta forma de segregación ocurre cuando la inserción

interrumpe un gen indispensable para el desarrollo de alguno de los gametos, haciéndolos

inviables por lo que la progenie segregará de forma no mendeliana. Si la inserción inactiva

un gen que es necesario solo para la megagametogénesis o solo para la

microgametogénesis, se observarán proporciones 1:1 de segregación, pero si el gen es

indispensable para el desarrollo de ambos gametos, no habrá descendencia que porte el

transgén o gen marcador. Plantas mutantes gametofíticas femeninas heterocigotas serán

semi estériles ya que la mitad de los óvulos tendrán sacos embrionarios que no formen

semillas. Sin embargo si se afecta el proceso de gametogénesis masculina, las plantas

podrán ser completamente fértiles, ya que a pesar de que el 50% del polen muere el otro

50% es suficiente en cantidad para fecundar los óvulos que produzca la planta.

En los escrutinios realizados anteriormente, Feldmann y colaboradores reportaron que

aproximadamente el 9% de las líneas de mutantes insercionales con T-DNA analizadas (el

T-DNA contiene un gen que proporciona resistencia al antibiótico kanamicina) producía

progenie con un número reducido de individuos que portaban la inserción. Otro análisis de

una colección insercional reportó 8 de 1000 líneas con una proporción de segregación 1:1.

De este segundo escrutinio surge la mutante limpet pollen, que es una mutante estéril

masculina en la que la célula generativa no migra adecuadamente después de la PMI y

queda contra la pared celular (Howden et. al., 1998). Además fueron identificadas dos

mutantes más tistrya y andarta, ambas afectadas en el desarrollo del gametofito femenino.

En un análisis en la colección de Versailles se encontró que el 0.2% de las líneas estaban

afectadas en algún proceso de microgametogénesis (Procissi et. al., 2001). Lalanne et. al.,

(2004b), en un escrutinio de 3616 líneas transposantes identificó 19 líneas (0.5%)

gametofíticas letales independientes. De este escrutinio se desprenden las mutantes seth1 y

seth 2, ambas afectadas en genes que codifican componentes de la ruta biosintética de

14

glicosil fosfatidil inositol y son requeridos para la germinación y crecimiento del tubo

polínico (Lalanne et. al., 2004). En todos estos reportes se confirmó que el número

reducido de individuos resistentes al agente de selección correlacionaba con la ausencia del

T-DNA o transposón en la progenie.

Números variables (Sensible:Resistente). Además de las proporciones mendelianas y las

excepcionales se han encontrado proporciones variadas que no se ajustan a las antes

mencionadas. Esto probablemente se debe al número de inserciones y/o a la penetrancia de

la mutación. En este grupo de segregación se pueden encontrar combinaciones de las

mutantes descritas anteriormente o líneas que están afectadas en procesos gametofíticos y

embriogénicos cuyos efectos sumados de dos tipos de mutaciones genera proporciones

variables.

Debido a que la segregación no mendeliana puede seguirse mediante escrutinios con

medios selectivos se ha empleado esta estrategia para tratar de identificar genes

involucrados en el desarrollo gametofítico ya sea femenino (megagametogénesis) o

masculino (microgametogénesis) (Feldman et. al.,1997; Howden et. al.,1998; Procisi et.

al., 2001). Esta estrategia se ha basado en colecciones de mutantes insercionales, ya sea

mediante T-DNA o transposones que contienen un gen que confiera resistencia a un agente

selectivo, como la resistencia a los antibióticos.

D. DISPERSIÓN DEL POLEN Y SUS IMPLICACIONES

El polen es una de las estructuras biológicamente diseñadas para distribuir lainformación genética de las plantas. Debido a sus características morfológicas, los granos

de polen pueden ser dispersados grandes distancias por vectores como el viento y los

insectos. Actualmente con el incremento en el uso de los cultivos modificadosgenéticamente y el manejo de la bioseguridad nacional, la dispersión de polen transgénico

se ha convertido en un tema controversial, ya que el flujo de transgenes puede ocurrir através del polen.

15

a. El polen como vector de información genética y evidencia del flujo detransgenes a través del polen

La ingeniería genética ha sido empleada para mejorar plantas de interés agrícola. Aquellas

plantas que han sido modificadas manipulando su material genético se les denomina

plantas transgénicas, organismos genéticamente modificados (OGM) u organismos vivos

modificados (OVM). Este último término fue establecido en el Protocolo de Cartagena

(2000), documento que establece importantes lineamientos y criterios para la protección

de la biodiversidad y el manejo de organismos vivos modificado por métodos

biotecnológicos. Se han generado modificaciones a variedades cultivables de gran valor

agrícola tales como maíz y algodón resistentes a insectos, canola resistente a herbicidas y

otros que han aumentado el rendimiento además de mejorar productos con fines

alimenticios y de salud. Son numerosos los estudios que han evaluado la importancia del

flujo genético en cultivos anuales para estimar el riesgo asociado con la transferencia de

rasgos transgénicos (Ellstrand et. al., 1989; Eber et. al., 1994; Luby y Mcnicol, 1995;

Chevre et al., 1997; Saeglitz et. al.,2000; Metz et al., 1997; Rognli et. al., 2000; Rieger et.

al., 2002; Ritala et. al., 2002; Warwick et. al., 2003; Wilkinson et. al., 2003; Legere 2005).

En el caso de la papa (Solanum tuberosum L.), cuya polinización cruzada depende

predominantemente del transporte del polen por insectos, pruebas de campo demostraron la

alta frecuencia con la cual el polen de plantas transgénicas puede fecundar plantas

silvestres de la misma especie. Cuando plantas de papa que no habían sido genéticamente

manipuladas fueron plantadas a distancias de hasta 1,100 metros fuera del radio de una

parcela de papa transgénica, se comprobó que más del 35% de las semillas producidas por

dichas plantas eran portadoras del transgén (Skogsmyr 1994). En el caso de cultivos como

la canola, se ha demostrado que el rasgo transgénico puede ser transferido a través del

polen a plantas silvestres localizadas a 2.5 kilometros de distancia (Timmons et al., 1994).

Los problemas asociados con este tipo de flujo transgénico aumentan para cultivos en los

cuales el polen puede ser transportado por el viento a grandes distancias, como es el caso

de las gramineas y en particular del maíz.

16

En México, la mayor controversia se ha generado en torno al maíz porque nuestro

país es el centro de origen y diversificación de este importante cultivo, además de otros

como la papa y el jitomate. Las plantas de maíz producen enormes cantidades de polen,

entre 2,000 y 7,500 granos de polen por antera, hay 3 anteras por flor y miles de flores por

inflorescencia, estos nos da como resultado entre 14 y 50 millones de granos de polen por

planta de maíz (Emberlin, 1999). También se ha reportado que alrededor de 187,500

granos de polen permanecen a 500 m de la planta fuente (McCartney, 1990). Las

autoridades mexicanas respondieron a esta creciente preocupación por parte de la opinión

pública con una moratoria de facto a la importación de maíz transgénico para su cultivo,

incluso para propósitos de investigación (García et.al, 1998), pero se requiere realizar un

trabajo mayor con el fin de encontrar mejores alternativas para prevenir el flujo génico no

deseado y poder manejar nuestros propios recursos de manera segura.

b. Estrategias de contención del flujo de polen

El flujo de transgenes a través del polen es una realidad, por lo que ha habido líneas de

investigación que se han enfocado al estudio de la contención del polen para e

vitar la transferencia de genes (Chamberlain y Stewart, 1999; Kuvshinov et. al., 2001).

En numerosas especies, la transferencia horizontal de un rasgo transgénico a plantas no-

transgénicas de la misma especie puede causar graves confusiones entre plantas destinadas

a la producción industrial y plantas destinadas al consumo humano. En el caso del maíz,

por ejemplo, existen programas de ingeniería genética que contemplan mejorar la calidad y

cantidad del almidón endospérmico para reducir los costos asociados con la fabricación de

plásticos biodegradables (Rhoades, 1993). Este tipo de modificaciones dará lugar a

cultivos transgénicos cuyas propiedades agro-industriales pueden representar millones de

dólares en beneficios. Sin embargo, las modificaciones a los procesos metabólicos en el

grano resultarán en una importante disminución en el contenido de aminoacidos esenciales

presentes en las proteinas de reserva. La transferencia horizontal del rasgo transgénico

tendría en estos casos consecuencias nefastas para los productores y consumidores de maíz

17

destinado a la alimentación humana y animal. Numerosos ejemplos como el anterior

ilustran la dificultad creciente que generará la liberación de cultivos transgénicos en un

sistema agrícola para la cual la demanda de productos alimenticios o agro-industriales

especializados dependerá cada vez más de la ingeniería genética.

Algunas de las estrategias ensayadas para contener el flujo, principalmente de

transgenes a través del polen son:

MÉTODOS FÍSICOSEmasculación, desespigamientoAislamiento espacial y temporal

PRÁCTICAS AGRONÓMICASTrampas de polenUso de plantas no transgénicas como padre

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Androesterilidad

Los métodos físicos se basan principalmente en eliminar la fuente de polen. En el caso del

maíz que es uno de los cultivos más estudiados con respecto a la contención de polen, la

emasculación o desespigamiento se refiere a la eliminación de la flor masculina o espiga,

que debe cortarse antes de que el polen maduro se libere. Este tipo de estrategia es la más

empleada en el mejoramiento tradicional del maíz. En nuestro país se tienen grandes

extensiones cultivadas de maíz híbrido mejorado de forma tradicional en el que se ha

aplicado la técnica de emasculación o desespigamiento, pero cabe mencionar que este tipo

de práctica es laboriosa y costosa, se necesita de un gran número de personas que trabajen

en él, el proceso puede llevar de una a cinco semanas y requiere el empleo de 21 a 34

jornales por hectárea. El desespigamiento mecánico es mucho más costoso y en muchas

ocasiones no se puede realizar debido a la orografía del terreno (Tadeo et. al., 2001).

Con el aislamiento temporal y espacial se trata de sembrar las variedades modificadas en

épocas o zonas geográficas diferentes en las que florecen las plantas silvestres sexualmente

compatibles y así evitar la polinización cruzada y por tanto la contaminación a través del

polen. Hay algunos reportes que indican que el aislamiento por distancia es mas que

suficiente para evitar la introgresión de un rasgo transgénico a plantas silvestres. Luna et.

18

al., (2001) realizaron varios ensayos en un campo experimental en el estado de Nayarit,

con maíz transgénico y determinaron experimentalmente que la polinización cruzada

ocurría a una distancia máxima de 200 m, aunque el cálculo teórico indica que el polen

pudiera viajar hasta 32 Km. de forma lineal cuando el viento alcanza la máxima velocidad

bajo esas condiciones experimentales. A pesar de este tipo de estudios, aún no se tiene la

certeza de cuál es la forma más adecuada de manejar de manera eficiente y segura los

cultivos genéticamente modificados.

Una alternativa, dentro de las prácticas agronómicas es el empleo de plantas que funcionen

como trampas de polen que se siembran alrededor de la parcela que deba mantenerse

aislada. Las plantas “trampa” retienen todo aquel polen que pudiera salir de la parcela

por acción del viento o insectos, pero no garantiza la contención completa de transgenes.

Otra forma para evitar el flujo del polen de plantas transgénicas es el empleo de plantas

padre no transgénicas, es decir, la fuente de polen no es transgénica. Este método, en caso

del maíz, combina el desespigamiento de las plantas transgénicas que servirán como

hembra o el empleo de variedades estériles masculinas.

En el mejoramiento tradicional de cultivos se ha empleado la esterilidad masculina

(androesterilidad) como otra forma de contener al polen. En México existen pocos trabajos

al respecto porque este método se dejó de usar en los años 70 ya que las plantas andro-

estériles mostraban mayor susceptibilidad a la enfermedad del tizón foliar

(Helmintosporium maydis, raza T). El uso de plantas andro-estériles implica un trabajo

considerable en la realización de retro-cruzas para producir semillas que den origen a

plantas no fértiles (Tadeo et.al., 2001 ).

A nivel experimental, una de las propuestas que no pretende eliminar el polen, pero si la

herencia de transgenes a través de éste, es la transformación de cloroplastos. La mayoría de

los organelos se heredan maternamente y al estar el transgén en el cloroplasto se evita que

el polen sea un vector de flujo de transgenes (Daniell et. al., 1998; Gray y Raybould 1998),

pero existen especies en que los cloroplastos también se heredan del lado paterno (Wang

et.al., 2004).

19

E. EMPLEO DE GENES GAMETOFÍTICOS LETALES PARA IMPEDIR ELFLUJO DE TRANSGENES A TRAVÉS DEL POLEN

La capacidad del polen para funcionar como vector de flujo de genes es una realidad, poresto es imperante cubrir la necesidad de contar con un sistema adecuado de manejo de

cultivos genéticamente modificados y que no ponga en riesgo cultivos en parcelas de

cultivos vecinos de la misma especie o plantas silvestres sexualmente compatibles. Laesterilidad masculina completa no es la mejor alternativa cuando se trata de cultivos que

requieran la formación de semillas y frutos ya que necesitan necesariamente de lafecundación para su formación y, los métodos convencionales implican grandes

inversiones en tiempo y dinero.

Mediante el empleo de genes gametofíticos letales masculinos se pueden establecer las

bases de una nueva tecnología que reduzca dramáticamente el impacto de uno de los

problemas reales asociados con el establecimiento de plantas modificadas por técnicas deingeniería genética: la transferencia horizontal – a través del polen - de rasgos transgénicos

a plantas en las cuales dicho rasgo constituye una característica indeseable. Esta es unaestrategia que no causa esterilidad masculina ya que se mantiene la producción del polen

que no porte la características transgénicas (silvestre), asegurando así la polinización

natural y la formación de semillas y frutos necesarios para la cosecha.

20

II. OBJETIVOS

A. OBJETIVO GENERAL

Descubrir y caracterizar genes esenciales para el desarrollo o función del polen de

Arabidopsis thaliana como primer paso para la implementación de una estrategia

que permita limitar la transferencia de rasgos transgénicos a través del polen.

A. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Identificar mutantes gametofíticas letales masculinas.

2. Caracterizar genética, fenotípica y molecularmente al menos una mutante

gametofítica letal masculina.

3. Delinear las implicaciones del empleo de algunos de estos genes gametofíticos

letales masculinos para habilitar una tecnología que impida la transferencia de

transgenes a través del polen.

21

III. MATERIALES Y METODOS

A. MATERIAL BIOLÓGICO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO

En nuestro laboratorio se ha generado una colección de líneas transposantes usando

Arabidopsis thaliana (L.) Heyn. var. Landsberg erecta para implementar un sistema de

trampas génicas. Las líneas transposantes fueron generadas mediante el sistema Ac/Ds

implementado por Sundaresan et.al.(1995). El transposón modificado contiene como gen

reportero el gen uidA (GUS) y el gen marcador de selección, nptII, que confiere resistencia

al antibiótico kanamicina. Funcionan como trampas génicas (MGT, por “Mexican GeneTrap”) o como detectores de potenciadores (MET, por “Mexican Enhancer Trap”).

B. ESCRUTINIO PARA IDENTIFICAR MUTANTES GAMETOFÍTICAS

LETALES MASCULINAS

Para identificar genes que actúen durante del desarrollo gametofítico masculino,

rastreamos 1000 líneas de la colección de mutantes insercionales generada en el

Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis.

Los genes que actúan a nivel haploide en el desarrollo de los gametofitos pueden ser

identificados mediante escrutinios de segregación de una forma relativamente sencilla. Se

realizó un escrutinio de 1000 líneas transposantes MGT y MET. De cada una de las líneas

se esterilizaron superficialmente entre 100 y 200 semillas en tubos de microcentrífuga con

etanol 96% por 5 minutos e hipoclorito de sodio 20% 5 por minutos y tres lavados finales

de agua destilada estéril. Posteriormente se sembraron en medio selectivo de Murashige y

Skoog (1962) MS con kanamicina 50µg/ml. Las placas sembradas se vernalizaron (4º C

por 4 días en oscuridad) y se colocaron en una cámara de crecimiento (fotoperíodo 12/8 a

23ºC) por 7-10 días hasta la etapa cotiledonaria o de dos hojas verdaderas.

El escrutinio se basó en el conteo de plántulas sensibles a kanamicina (cotiledones

amarillos) contra las resistentes (cotiledones y hojas verdes y vigorosas) bajo un

estereomicroscopio. Si la proporción era cercana a 1:1 KanR:KanS, esta segregación

22

distorsionada nos indicaba el efecto de una posible mutante gametofítica letal. Todas

aquellas líneas que mostraron una proporción 1:1 de segregación se seleccionaron para

confirmar esta proporción con un número mayor de semillas.

C. IDENTIFICACIÓN DEL GEN ETIQUETADO Y DETERMINACIÓN

DEL NÚMERO DE INSERCIONES

La identificación del sitio de inserción se realizó mediante la técnica de reacción en

cadena de la polimerasa térmica entrelazada (TAIL-PCR, thermal asymmetric interlaced

PCR) descrita por Liu et. al., (1995). Esta técnica permite la amplificación de las

secuencias del genoma aledañas al sitio de inserción del transposón mediante el empleo de

iniciadores específicos a los bordes del transposón e iniciadores degenerados en tres

rondas de reacción de PCR. Los fragmentos obtenidos son secuenciados y nos permiten

saber la identidad de las regiones aledañas a sitio donde se localiza el transposón.

Los iniciadores específicos al borde 3´son: Ds3´-1 ( 5´CGATTACCGTATTTATCCCGT

TCG 3´), Ds Ds3´-2 ( 5´ CCGGTATATCCCGTTTTCG3´) y Ds3´-3 (5´GTTACCGACCGTTTT

CATCC3´), para el extremo 5´ DS5´-1 (5´CCGTTTACCGTTTTGTATATCCCG3´), Ds5´-2

(5´CGTTCCGTTTTCGTTTTTTACC3´) y Ds5´-3 (5´GGTCGGTACGGAATTCTCCTCCC3´).

Los iniciadores degenerados empleados fueron: AD1 (5´NTCA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT3´),

A D 2 ( 5 ´ N G T C G A ( G / C ) ( A / T ) G A N A ( A / T ) G A A 3 ´ ) , A D 3

(5´(A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA3´). La técnica de TAIL-PCR consiste en tres rondas de

PCR en donde se hacen combinaciones de cada uno de los iniciadores específicos con cada

uno de los degenerados. En cada ronda se hace una dilución 1:50 de la anterior; como los

iniciadores específicos están separados a una distancia conocida, esto nos permite obtener

un patrón escalonado de bandas. El producto de amplificación final se clona en el vector

pCRII TOPO (Invitrogen). Para las líneas seleccionadas se obtuvo una sola banda que se

clonó, purificó y mandó a secuenciar. Se obtuvieron las secuencias aledañas al borde 3´ del

transposón y estas secuencias se compararon contra las bases de datos de un banco del

dominio público.

23

Para determinar el número de inserciones en cada línea se realizó un ensayo tipo Southern

blot (Sambrook et. al., 1989). La sonda empleada corresponde a un fragmento (SstI/XbaI)

homóloga al borde 5´ del transposón y abarca el borde Ds 5´ y el gen nptII y posee un sitio

de restricción interno EcoRI.

D. ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN Y CRUZAS RECÍPROCAS

Para las líneas seleccionadas MGT76 y MET350, se sembraron alrededor de 500 semillas

más y se analizó la segregación de al menos dos generaciones sucesivas. Se hicieron cruzas

recíprocas con Arabidopsis thaliana tipo silvestre. Para esto se emascularon de 3 a 5

botones maduros por inflorescencia y se colocaron en la cámara de crecimiento, al tercer

día se polinizó con polen de las líneas a analizar. La semilla resultante de estas cruzas se

colectó y esterilizó como se describió anteriormente y se sembraron en medio selectivo

MS con kanamicina 50µg/ml. Para determinar la eficiencia de la transmisión del

transposón por ambos gametos se contaron las plántulas resistentes contra las sensibles de

cada cruza.

E. ANÁLISIS HISTOLÓGICOS

Para analizar los diversos estadios de desarrollo del gametofito masculino se tomó como

base la clasificación morfológica realizada por Smyth, et.al., (1990), Regan y Moffatt

(1990) y Sanders (1999). Se cubrieron las etapas 3, 4, 8, 9 y 10 del desarrollo del polen, en

las cuales proceden las divisiones meióticas y mitóticas (Tabla 1).

a. Clareos

Se colectaron anteras completas con polen en los estadios de desarrollo señalados en laTabla 1 tanto de plantas silvestres como de las líneas MGT 76 y MET 350 (con ayuda de

pinzas de disección)y se fijaron con FAA (etanol 50%, ácido acético 5%, formaldehído10%) en tubos de microcentrífuga durante un periodo de 4 a 6 horas. Posteriormente se

colocaron en etanol 70% y se clarearon. En los estadios desde tétrada a polen maduro se

clarearon con solución de Herr´s (fenol: hidrato de cloral: ácido láctico 85%:xileno:aceitede clavo (1:1:1:0.5:1)). Los estadios de polen tricelular maduro en anteras dehiscentes se

24

clarearon con ácido láctico 20%, glicerol 20%. Las observaciones se hicieron bajo óptica

de Normarski en un microscopio Leica DMR.

b. Tinciones DAPI

Para determinar si la formación, migración y disposición de núcleos presentan algún

defecto, una de las técnicas más usuales es visualizar el DNA con el fluoróforo DAPI

(diclorohidrato de 4´,6-diamidino-2-fenilindol). El DAPI forma un complejo fluorescente

con DNA de doble cadena, mostrando fluorescencia específica para regiones ricas en

adenina y timina (Larsen et. al., 1989). De esta manera es posible visualizar el DNA en

diferentes momentos del ciclo celular y determinar si las divisiones meióticas y mitóticas

proceden correctamente. Para las observaciones del polen en desarrollo y estados meióticos

y mitóticos se fijó tejido en solución de Carnoy (Etanol 60%, cloroformo 10%, ácido

acético 1%) por 8 horas a temperatura ambiente, se lavó el tejido con agua y después con

solución reguladora de citrato de sodio. Se realizó una digestión con pectoliasa 0.3% y

celulasa 1% y se realizó un lavado más con citrato de sodio frío, se disectaron las anteras y

sin dejar secar el tejido se retiró el exceso de tejido y líquido y se adicionó la solución de

DAPI (DAPI 1ug/mL, glicerol 50%, Tris pH 9.2 0.1 M) (Ross et. al.1996). Se muestrearon los

mismos estadios que para el análisis por clareo. Se empleó microscopía de fluorescencia en

un microscopio OLYMPUS BX60, a una longitud de excitación de 330-385 nm y de

emisión 420 nm.

c. Cortes semifinos

Tejido de la línea MET350 fue fijado e incluido en resina epóxica para realizar cortes

semifinos y tener la posibilidad de visualizar defectos en la estructura del grano de polen

en diferentes estadios de desarrollo. Muestras con botones florales que cubrían todas las

etapas del desarrollo del polen fueron colectadas y fijadas en una solución de

glutaraldehido 25% - cacodilato 0.2 M por dos horas a temperatura ambiente, después de

aplicar vacío suave para garantizar la adecuada fijación. Se eliminó el fijador mediante tres

lavados con solución reguladora de cacodilato 50 mM. Se trató con tetra óxido de osmio

(OsO4), se deshidrataron las muestras con una serie de diluciones de acetona (30, 40, 50,

60, 70, 80, 90 y 100%) y se infiltró el tejido en resina Spurr’s. Las muestras junto con

25

resina se colocaron en moldes plásticos para su polimerización a 60oC toda la noche o

hasta 24 horas. Los cortes de 2 micras se realizaron en un ultramicrotomo Leica Uktracut R

y se colocaron en portaobjetos tratados con poli-L-lisina. Los cortes se tiñen con azul de

toluidina 1%, borax1%. Se hicieron las observaciones bajo microscopía de campo claro.

d. Detección de calosa

Esta técnica se emplea para ver el crecimiento de los tubos polínicos in vivo. Para esta

técnica se colectaron carpelos después de fecundación, fueron fijados con FAA durante 2 -

4 horas y macerados en KOH 8N por 2 horas. Transcurrido este tiempo se lavó el tejido

con buffer de fosfatos y se les colocó en una solución de azul de anilina 0.1% en buffer de

fosfatos pH 7. Se empleó micoscopía de fluorescencia en un microscopio OLYMPUS

BX60, a una longitud de excitación 330-385 nm y de emisión 420 nm (Martin, 1959).

e. ESEM

El microscopio electrónico de barrido ambiental tiene capacidad para analizar muestras no

conductoras permitiendo la conservación de las condiciones naturales de muestras.

Se retiraron los estambres con anteras dehiscentes de flores silvestres y de MET350 con

unas pinzas de disección, suavemente se esparció el polen sobre un portamuestras

recubierto con cinta de grafito. El polen no requirió de tratamiento previo a la observación.

Las observaciones de polen maduro fueron realizadas en un microscopio de barrido

ambiental Fei (Philips) a 30.0 KV, GSE 10.5 y 4.8 Torr. Este equipo pertenece la Instituto

Mexicano del Petróleo.

F. GERMINACIÓN DE POLEN IN VITRO e IN VIVO

Se utilizó el medio de germinación reportado por Derksen et. al., (2002) que consta de:

cloruro de calcio 0.07%, ácido bórico 0.01%, polietilénglicol (PEG 4000) 3%, sacarosa

20% y 0.7 % de agar. Gotas de 20 - 50 microlitos del medio semi-sólido se colocaron

sobre un cubreobjetos que se depositó dentro de una caja petri para generar un ambiente

húmedo. El polen de una flor se colocó en cada gota de medio, las cajas se cerraron y las

observaciones se hicieron a las 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas de incubación en cámara de

crecimiento a 22oC, 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Para realizar las observaciones, se

26

tomó cada cubreobjetos con polen germinado, se colocó sobre un portaobjetos, se selló y

se observó bajo óptica de Normarski, se cubrió el mayor número de campos y se

archivaron las micrografías que serían usadas para hacer las mediciones de longitudes de

tubos polínicos con el software ImageJ 10.2. Para evaluar la polinización in vivo, se

emascularon carpelos de plantas silvestres o mutantes y se esperó a que los estigmas

estuvieran listos para colocar una cantidad controlada de polen. A las 12-24 horas después

de polinización se colectaron los carpelos y se fijaron. Se les trató como se indica en la

sección de detección de calosa.

G. RT- PCR

Se realizó extracción de RNA total con el método de Trizol (Invitrogen, Carlslab, CA) a

partir de plantas tipo silvestre (Wt) y la línea MET350. Los tejidos seleccionados fueron

inflorescencias completas, flores maduras, botones jóvenes, plántulas, hojas de roseta,

hojas caulinas y tallo. Se partió de 2 µg de RNA para la síntesis de la primera cadena con

la transcriptasa reversa SuperscriptII (Invitrogen, Carlslab, CA) .

Los iniciadores para detectar el mensajero del gen afectado en MET350 fueron, sentido

MET350S-2 5 ´ G A T A A A C A T G T C G G A A T C G T G 3 ´ y MET350AS-2

5´CTGCCGCAAAGTCAATCATCT3´ antisentido.

H. HIBRIDACIÓN IN SITU EN CORTES SEMIFINOS Y EN TEJIDOS

COMPLETOS

Para localizar el RNA mensajero de los dos genes, At3g11260 (MGT76) y At4g37970

(MET350), se empleó el protocolo descrito por Vielle-Calzada et. al., (1999). Los tejidos

empleados fueron botones, flores abiertas y silicuas jóvenes tanto de las líneas mutantes

como de silvestres. Las muestras se fijaron 12 horas en una solución de paraformaldehido

4% pH 7.0 y se deshidrató el tejido en una serie de diluciones etanólicas (60, 70, 80, 90, 95

y 100%), media hora cada una. Una vez deshidratado el tejido se infiltró con xileno en una

serie de mezclas etanol:xileno 3:1 por media hora, 1:1 y 1:3 hasta dejar el tejido 1 hora en

xileno 100%. El xileno fue remplazado lentamente por parafina (Fisher Scientific) a 58oC.

El tejido embebido junto con la parafina se colocó en moldes plásticos para que la parafina

27

se solidifique. Los bloques de parafina con el tejido se cortaron en un microtomo

(BROMA) y se obtuvieron cortes de 12 micras que se montaron en porta objetos cargados

positivamente (ProbeOn Plus).

La sonda que se usó para detectar At3g11260 fué de 128 pb y abarca la primera parte del

s e g u n d o e x ó n , e l i n i c i a d o r s e n t i d o e s M G T 7 6 S 3

5 ´ A A G C T T G C G A A G A A G A T T G T C A A G A G G 3 ´ y el antisentido MGT76AS3

5´GATATCCGTGGTGGTCTCTCGAATATA3´. Para At4g37970 la sonda usada fue de 182 pb

y cubre todo el último exón, se empleó el siguiente juego de iniciadores, sentido

MET350S3 5´AAGCTTGAAAATCGATAGCGGGAAGT3´ y antisentido MET350AS3

5´GATATCGATCGAGTAGCAGCCAATGTA3´. Cuando se obtuvieron las regiones amplificadas

se clonaron en el vector pCRII TOPO, se determinó la orientación de los insertos y se

sintetizaron las sondas sentido con el promotor T7 y antisentido con el SP6. Para la línea

MGT76 también se hizo la técnica de hibridación in situ en tejido completo siguiendo el

protocolo de García-Aguilar et. al., (2005); Anexo I.

28

IV. RESULTADOS

A. RASTREO DE SEGREGACIÓN EN LA COLECCIÓN DE MUTANTESINSERCIONALES

Se realizó un rastreo de segregación en 992 líneas en la colección de mutantes

insercionales generadas en el Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis. Seemplearon 553 líneas MGT y 439 líneas MET. Se registraron todas las plántulas

germinadas, sin germinar y sus características fenotípicas. Se cuantificó el número de

plántulas sensibles (cotilidones amarillos) y resistentes (cotiledones u hojas verdes) paracada línea (Figura 6). De las líneas analizadas destacan los grupos de la Tabla 2, (verresultados completos en Anexo II).

a. Clasificación de las familas de segregación

Para clasificar los tipos de segregación nos basamos en los análisis realizados en otras

colecciones de mutantes insercionales, ya sea por T-DNA o por transposición. El grupo I

incluye líneas cuya proporción KanS:KanR es menor a 1 indicando que la transmisión del

carácter de resistencia a kanamicina probablemente está afectada en ambos gametofitos.

El grupo II es el de mayor interés para este trabajo, ya que representa candidatos a

Tabla. 2 Grupos de segregación obtenidosdel rastreo de 1000 líneas transposantesGRUPO/KanS:KanR

NO. DELÍNEAS

%

I) x<1 7 0.70 II) 1:1 7 0.70 III) 1:2 277 27.9 IV) 1:3 188 18.9 V )3:1<x<15:1 171 17.2 VI) 1:15 6 0.60 VII) 1:63 1 0.10 VIII) otros 78 7.8 IX) 100% R 255 25.7 X) 100% S 3 0.30

992KanS, sensible a kanamicina; KanR, resistente akanamicina

Figura 6. Fenotipo de plántulas resistentes ysensibles a kanamicinaEl conteo de plántulas resistentes/sensibles serealizó en cajas Petri para cada una de las líneas,7 días después de germinación.

R

S

29

mutantes gametofíticas letales en uno solo de los gametos, es decir, que solo los

gametofitos femeninos o masculinos se encuentran afectados por la inserción. El grupo III

representa candidatos a mutaciones recesivas embrionarias. Las líneas de los grupos

IV,V,VI y VII segregan de forma mendeliana. Para una sola inserción se espera que la

progenie herede el carácter de resistencia a kanamicina en una proporción KanR:KanS 3:1,

para dos inserciones ligadas variará entre 3:1 a 15:1 y para dos inserciones no ligadas

15:1. La proporción 63:1 es indicativo de tres inserciones. 7.8% de las líneas analizadastienen patrones de segregación que van de KanS:KanR 1:10 a 1:50 y puede deberse a la

presencia de múltiples inserciones o a efectos combinados entre éstas. El 25% de las líneas

analizadas fueron homocigotas.

b. Segregación distorcionada 1:1

Después de realizar la clasificación de los grupos de segregación, cada una de las líneas del

grupo II (KanR KanS 1:1) se volvió a sembrar aumentando el número de semillas por línea.

Se volvió a aplicar el análisis estadístico de c2 que nos permitió identificar 3 líneas (Tabla

3).

La segregación del carácter de resistecia a kanamicina de la progenie de un proceso de

autopolinización de las líneas MET41, MET350 y MGT76 se ajusta con un 95% de

confianza a la segregación KanS:KanR 1:1. Este patrón de segregación indica que se trata

Tabla 3. Segregación KanR:KanS de líneas seleccionadas

LÍNEANUMERO DE PLANTAS

SENSIBLES

NÚMERO DE PLANTAS

RESISTENTES

PROPORCIÓN

KanS:KanR

c2

c2<3.841(1) 0.05

MET 41 113 141 1.25 3.09

MET 350 288 250 0.87 2.68

MGT 76 169 173 1.02 0.05

30

de mutantes gametofíticas en las que se encuentra afectado uno solo de los gametofitos. Se

decidió sólo caracterizar dos líneas, MGT76 y MET350 cuya segregación fue más estricta.

B. IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALES MASCULINAS, MGT 76 Y MET 350

Para determinar cuál de los procesos de gametogénesis se encuentra afectados, serealizaron cruzas recíprocas con plantas de Arabidopsis thaliana tipo silvestre. De esta

forma se evaluó la eficiencia de transmisión (ET) del carácter de resistencia a kanamicina

tanto por el polen como por los óvulos de las líneas seleccionadas. Los resultados seresumen en la Tabla 4.

Cuando ya se ha comprobado que la segregación de la línea en estudio es de 1:1, (es decir,el 50% de la progenie es resistente a kanamicina), se procede a realizar las cruzas

recíprocas. En una mutante gametofítica letal masculina se espera que al usar la línea

como padre o donadora de polen, no se obtengan plántulas resistentes. Esto se debe a queel polen de esta línea se encuentra afectado por la inserción y muere o no es capaz de

participar en la dobe fecundación, por lo que no se espera obtener plantas resistentes deesta cruza. La eficiencia de transmisión es baja o nula. En cambio si la línea fue usada

como madre se generarán el 50% de platas resistentes ya que los óvulos son normales y

Tabla 4. Resultados esperados de cruzas recíprocas entre una línea mutante y plantas silvestres paradeterminar el origen femenino o masculino de la mutación

Autopolinizaciónlínea heterocigota

Línea como padresilvestre X línea

Línea como madrelínea X silvestre

RESULTADO

KanR:KanS KanR:KanS KanR:KanS

Líneainsercional

1:150%:50%

0:10:100%

1:150%:50%

Mutante gametofíticaletal masculina

Líneainsercional

1:150%:50%

1:150%:50%

0:10:100%

Mutante gametofíticaletal femenina

31

provienen de una planta heterocigota para la inserción. En caso contrario podemos definir

la mutante como gametofítica letal femenina.

a. Discriminación del origen de la mutación

Al realizar las cruzas recíprocas entre las líneas seleccionadas y plantas silvestres, se

observó que las dos líneas seleccionadas tienen baja eficiencia de transmisión del carácterde resistencia a kanamicina cuando son usadas como padre, pero transmiten eficientemente

el transposón cuando son usadas como madre (Tabla 5). Esto indica que se trata demutantes gametofíticas letales masculinas.

MET 350 tiene una ET a través del polen que comprende una de las más bajas reportadas

en la literatura y su ET a través del gametofito femenino es normal. MGT76 tiene una ET

a través del polen cercana al 50% y transmite normalmente el transposón a través delgametofito femenino. La ET masculina para el caso de MGT76 puede explicarse como una

mutación cuya penetrancia es parcial.

C. ANÁLISIS DE LAS MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALESMASCULINAS MGT76 y MET350

Se identificó el sitio de inserción del transposón en MGT76 y MET350 por medio deTAIL-PCR. Para MGT 76 se obtuvo un fragmento de 500 pb, se clonó y secuenció.

Analizando la secuencia obtenida mediante el programa BLAST se identificaron los sitios

del borde Ds 3´ del transposón y se determinó que la inserción se encuentra en el brazo

Tabla 5. Resultados de las cruzas recíprocas y eficiencia detransmisión de MET350 y MGT76

Wt x LíneaKanR:KanS

ET%

Línea x WtKanR:KanS

ET%

MET 350 1: 198 0.2 130: 125 100MGT 76 46: 91 46 70: 42 100

32

largo del cromosoma III, 300 pares de bases (pb) río arriba del inicio de transcripción del

gen At3g11260 (Figura 8).

Para la línea MET350 el fragmento obtenido fue de 300 pb. Al analizar la secuenciaidentificamos que la inserción se encuentra en el brazo largo del cromosoma IV en laregión 3´ sin traducir del locus At4g37970, a 11 pares de bases antes del final del

transcrito (Figura 17).

A partir de un ensayo Southern blot, se determinó que la línea MGT76 tenía 2 inserciones

y MET350 tiene 1 inserción (Figura 7). Para ello se digirió el DNA obtenido de cada una

de las líneas con dos enzimas de restricción: EcoRI para el que se espera una señal detamaño constante (2000 pb) y una de tamaño variable por cada inserción y HindIII con la

que se espera una sola señal variable por cada inserción.

Figura 7. Determinación del número de insercionesDeterminamos el número de inserciones de MGT 76 y MET 350 por análisis Southern blot, conDNA total digerido EcoRI para la que se esperan 2 bandas por inserto y HindIII con la que seespera una banda por inserto. Se muestra la región del plásmido pWS31 (SstI-XbaI) que seempleó como sonda.

5’Ds nptII GUS int 3’Ds 3’Ds

SstI XbaI

4 kb

EcoRI

33

D. MGT76 , tepitzin1

a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea MGT 76

El transposón se encuentra en el brazo largo del cromosoma III, en la región intergénica

entre los genes At3g11250 y At3g11260, que codifican para una proteína acídica 60Sribosomal PO y WOX5 respectivamente. La región intergénica que separa a estos dos

genes es de 4575 pares de bases. La inserción se encuentra a 300 pb del sitio de inicio de

la transcripcion de WOX5 (Figura 8), un factor transcripcional del tipo WUSCHEL. El genreportero uidA del transposón está en dirección opuesta al del sentido de la transcripción

del gen. Al analizar colecciones insercionales disponibles para la comunidad científica, seidentificó una segunda inserción, 6 pb río abajo de la inserción presente en MGT76.

b. El gen etiquetado en MGT76 es WOX5 y pertenece a la familia WOX ,caracterizadas por un homeodominio tipo WUSCHEL

El gen afectado en la línea MGT 76, WOX5, pertenece a una familia previamente descrita,

caracterizada por un homeodomio, llamada WOX por WUSCHEL HOMEOBOX. Esta

familia está constituida por 15 miembros incluyendo al gen modelo WUSCHEL (Tabla 6).El homeodominio está caracterizado por una región de aproximadamente 60 amino ácidos

(aa) capaz de adquirir una conformación hélice-asa-hélice que une DNA. WOX5 posee66% de identidad y 78% de similitud al dominio WOX (Haecker, et al, 2004).

uidA

5’ 3’uidA

GT6264 3’5’

18 motivo WOX 84

+1

-327 -322

MGT76

5’UTR 3’UTRWOX5

Figura 8. Esquema de la estructura del gen WOX5. Localización de la inserción de la línea MGT76 (-327), seubicó otra línea insercional, GT6264 a 6 pb en el sitio -322. El homeodominio se codifica en el primer exón, seidican los aminoácidos de inicio y fin de éste.

34

En el siguiente alineamiento se resaltan los motivos característicos y distintivos de los

miembros de la familia WOX (Figura 9).

Tabla 6. La familia WOX de Arabidospis thalianaNOMBRE DELGEN / Locus Chr Gen/mRNA a.a. Semejanza Patrón de expresión

WUSAt2g17950 2 1919/879 292

WOX1At3g18010 3 2020/1101 349 67(87) Primordio de iniciación vascular durante la etapa de

torpedo y corazónWOX2At5g59340 5 1220/696 260 66(81) Ovocélula y célula central. En el dominio apical del

cigoto en etapa 8 celular.PRSAt2g28610 2 /735 244 68(82) Primordios cotiledonares de la etapa de corazón

WOX4At1g46480 1 1051/756 251 66(78)

WOX5At3g11260 3 858/549 182 66(78) Célula quiescente en meristemo de raíz.

PFSAt2g01500 2 2037/816 295 64(81)

WOX7At5g05770 5 369/369 122 63(77)

WOX8At5g45980 5 911/762 325 45(69) Ovocélula y célula central, depués de fecundación,

su expresión es complementaria a WOX2STIPAt2g33880 2 2327/1137 378 44(71) Célula basal de cigoto, después se restringe a la

hipófisis y se expande al dominio central del embriónWOX10At1g20710 1 783/594 197 43(69)

WOX11At3g03660 3 909/600 268 63(64)

WOX12At5g17810 5 2216/807 268 40(62)

WOX13At4g35550 4 1589/807 268 40(67)

WOX14At1g20700 1 1452/636 195 38(64)

Chr, cromosoma; gen/mRNA indica la relación entre número de nucleótidos del gen con relación al tamaño final del mRNAdespués de la remoción de intrones; a.a. señala el número de aminoácidos . Semejanza con el dominio WOX en % e identidadentre paréntesis.

35

Figura 9. Alineamiento de la familia WOXSe muestra el reporte del alineamiento de la familia WOX; el motivo conservado seencuentra resaltado en amarillo. Los histogramas superiores; rojo, naranja, verde, yazul indican la conservación de los aminoácidos entre los miembros de la familia(en orden descendente). Las líneas indican que no hay conservación entre losaminoácidos. El alinemiento se realizó por el método ClustalW con ayuda delprograma Megalign 3.15 de Lasergene.

36

Un análisis detallado de la región reguladora 5´ de WOX5 reveló un elemento de 5

nucleótidos (nt) (TGTGG) a 647 pb río arriba del sitio de inserción que anteriormente sehabía demostrado esencial para la expresión específica del polen (Zabaleta et. al., 1998).

Dos elementos adicionales de respuesta a auxinas también se encontraron presentes(Figura 10).

A la fecha se ha reportado la caracterización de cuatro miembros de la familia WOX.

WUSCHEL, es un factor transcripcional que controla el destino celular del meristemo

apical por represión directa de reguladores de crecimiento inducibles por citocininas

(Haecker y Laux, 2001; Leibfried et. al., 2005). Los otros tres miembros son importantes

para el desarrollo floral y del meristemo. STIMPY (WOX9) es requerido para el crecimiento

y mantenimiento del meristemo apical y activa directamente a WUSCHEL (Wu et. al.,

2005). En contraste PRETTY FEW SEEDS (PFS2 o WOX6) provoca anormalidades en los

integumentos, lo que compromete seriamente la fertilidad femenina (Park et. al., 2005). La

Figura 10. Región 5´reguladora del gen WOX5Las cajas específicas de polen que se encuentran bien conservadas en la región 5´reguladora están subrayadas. Provienen de 3 genes que codifican para subunidadesdel complejo respiratorio I en Arabidopsis thaliana. En recuadros se resaltan cajasde respuesta a auxinas. (Prestridge, 1991; Higo et. al., 1999)

aatggctttt tacaaatatt ttggtgtagg acttatatta tacatgtgtg tggcgaaccttctggttcta tctattaaat gccttttctt tttgtagttt tttatgattc agaattcagatatttgattt tgtaatatta tattttctta taaaagagaa taaaatttca aatttcctgtctacacttgc cgaccaacgt tcctcaagtg tcacatcttc tgtgcaagag agacaaaactacaatctgtt cacacaatgt catgatgttt ataattaatc ttatcatctt cattcatatcaaactaatat cggccatcca tccgtctcaa taatgtaatt gcatacaatc tttgtttaggacttgctagc tatttcaact tattattgat tacagattag atctacaatt tgtaaagaacttctaacttc aaaacaaata caaaaaaaag aaagtgaatg taaaatttct agtgtcataatttggaatag ttgaagcatt gaagttacaa tatcgaacgt taaaatattg acactagatagtacattacc accaaggctt tctgattatt cttatcatgt tatatgaata gtaagaaattacgtagaacg caatttaagt gtgtgcgagt caccacaaat taaaggagaa caaattcaatgtttcaatcg ctggttccga tatacaactt atgca*tgcca tggcatgaat gcgagatccaattatatact aatatataca cacaaaaaca tatgtaaata tagatggaac agaagcctagataggttagg ataaagaaaa cgatcaaatc tgcaaagatc agtctctccc aaatccccaaaaaaaacaaa gcatgcattt cgtaataaac aactcatcat aaaacgacac ataactcgaaaacctctcct cccgacattt catcaattca tttctctttt tattttcgaa aagatgaaaacttaataaat tattatgaac aatcttacta tatatatgga tatatacaca ggccctaaaacgtaaaacag ttgaggactt tacatctgaa cATGtctttc

37

mutante en WOX3, pressed flower, muestra reducción del crecimiento lateral de los sépalos

(Matsumoto y Okada 2001).

c. Una segunda inserción a 6 pb de MGT76 también segrega 1:1

Para determinar si la inserción del transposón Ds era la causante del efecto gametofítico

masculino, cotejamos la existencia de inserciones de otras colecciones que se encuentrenen el mismo locus. Encontramos una inserción de la colección de Cold Spring Harbor

Laboratory, GT6264, que se encuentra a 6 pb de la inserción identificada en MGT76(Figura 8). En ambas líneas insercionales, la orientación del gen reportero contenido en el

transposón se encuentra en orientación opuesta respecto al sentido de la transcripción del

gen, lo que impide la identificación de patrones de expresión. El análisis de la progenie deplantas heterocigotas GT6264 reveló que también segrega de manera distorsionada 1:1

(Tabla 7), sugiriendo fuertemente que la interrupción de WOX5 causa la mutacióngametofítica en MGT 76.

d. Segregación de las inserciones en la línea MGT 76

La generación F3 de la línea MGT76, producto de la autopolinización segrega 1:1 con un

95% de confianza. Cuando evaluamos por medio de cruzas recíprocas la transmisión del

carácter de resistencia a kanamicina a través de los dos gametos resultó ser normal a través

Tabla 7 Segregación distorsionada y eficiencia de transmisión de MGT76 y GT6264

AutopolinizaciónMutante como

padreMutante como

madre

Mutant KanS:KanRaProporción

c2b

KanS:KanR ET%c KanS:KanR ET%

MGT 76 F3 173:200 1.5 1.95

MGT 76F4 319:352 1.1 1.62 168:80 47.6 121:140 115.7

GT6264F3 56:57 1.05 0.01

a KanS Sensible a kanamicina, KanR resistente a kanamicina . bc2<3.841(1) 0.05.cET, eficiencia detransmisión.

38

del gametofito femenino y parcialmente reducida en el masculino, lo que puede explicarse

por la presencia de una segunda inserción en esta línea. Con el fin de segregar las

inserciones y poder analizar el fenotipo causado por la inserción previamente descrita,

(confimada con inserciones de otras colecciones) procedimos a sembrar varias plantas

progenie de la T3 para evaluar en cada una de ellas la segregación y poder segregar las

inserciones (Anexo III). Se identificó una planta que mantuvo la segregación 1:1.

e. Patrón de expresión de WOX5

En reportes anteriores se ha mostrado que el mRNA del gen WOX5 se expresa en la

hipófisis de embriones en etapa globular temprana, en el centro quiescente del meristemo

de la raíz en etapa de corazón y en células asociadas al primodio vascular de los

cotiledones en desarrollo; sin embargo no se realizaron estudios de expresión en tejido

reproductivo masculino (Haecker, et. al., 2004). Para determinar el patrón de expresión de

WOX5 durante la microgametogénesis y durante el desarrollo progámico, localizamos la

expresión de WOX5 mediante hibridaciones in situ en cortes semifinos y en tejido

completo. Se empleó una sonda sentido y antisentido que corresponde a una porción del

segundo exón del gen y que no muestra homología con otros miembros de la familia WOX.

Para establecer el patrón de expresión durante el desarrollo del polen se colectaron anteras

en los estadios de desarrollo 5-7 y 10-12 y carpelos después de polinización. Encontramos

que la expresión de WOX5 inicia tras la primera división mitótica durante la

microgametogénesis (Figura 11A), se detecta la presencia del mensajero en el estadio

tricelular maduro del polen y en el tapetum de antera maduras (Figuras 11B y 11C). La

expresión aumenta durante el inicio de la germinación del tubo polínico y la señal se

detecta en el citoplasma cuando abandona la pared celular del grano de polen (Figuras

11F, 11G). En los tubos polínicos germinados in vivo y que ya han crecido a través del

tejido de transmisión del carpelo también detectamos la expresión de WOX5 (Figura 11H).

39

f. El desarrollo del polen en línea MGT76 tepitzin1(tpz1 )es idéntico al silvestre

La línea MGT76 fue bautizada con el nombre de tepitzin1 (tpz1) que en náhuatl significa

“poco” o “pequeño”, debido al fenotipo asociado a la mutación.

Plantas heterocigotas tpz1 crecen y se desarrollan igual que las silvestres, no muestran

frecuencias anormales de óvulos abortados, indicando que no existen defectos post-

fecundación que expliquen la segregación distorsionada de tpz1. Analizamos los diferentes

FIGURA 11. Detección de la expresión del mRNA de WOX5 (A) La expresión de WOX5 inicia durante la microgametogénesis,después de la primera mitosis. (B) Es detectable en el tapetum y (C)polen trinucleado antes de la antesis. (F) El mayor nivel de expresiónse detecta cuando germinan los tubos polínicos sobre los estigmas. (G)La expresión acompaña se detecta en el citoplasma del tubo polínico.(H) La expresión se conserva durante la elongación del tubo polínico .(D y E) Se hibridó con sonda sentido; los controles con tubos polínicosy polen maduro no muestran señal detectable. N, núcleo; t, tapetum;mpg, polen maduro; pt, tubo polínico; sp, papila estigmatica. Barra deescala = 20µm

40

estadios de desarrollo del gametofito masculino de plantas silvestres y tpz1 mediante la

tinción con el fluoróforo DAPI (diclorohidrato de 4´-6 diamidino-2-fenolindol) y con

clareos. Desde la diferenciación de las microsporas madre, las microsporas unicelulares,

bicelulares y polen maduro, el tamaño, organización de los núcleos y la morfología del

polen tpz1 fue idéntico a la del polen silvestre (Figura 12).

g. El tubo polínico en tpz1 muestran un retraso en el crecimiento del 45% en

comparación con el silvestre

La germinación del tubo polínico es un proceso muy importante para garantizar la

reproducción y por lo tanto la producción de semillas. Para determinar si los individuos

heterocigotos tpz1 producían polen con defectos en la germinación, establecimos un

ensayo de germinación in vitro. Colectamos polen maduro de anteras dehiscentes de

plantas silvestres y tpz1 en laminillas con gotas de medio de germinación (Derksen et. al.,

2002) y lo incubamos a 24°C bajo condiciones de 16 horas luz y 8 de oscuridad en una

cámara húmeda. La observación de los tubos polínicos germinados in vitro se realizó bajo

óptica de Normaski cubriendo todos los campos de la preparación tomando de cada uno

una micrografía, de esta forma se evaluó la capacidad de germinación y se midió la

longitud de los tubos alcanzada (Image J) a diferentes tiempos después de la incubación en

el medio de germinación. Primero evaluamos la eficiencia de germinación de tpz1. A las 2

horas de incubación (hdi) el polen silvestre germinó con una eficiencia del 93%. En

contraste, la eficiencia de germinación de tpz1 fue del 43.2%. Para determinar si esta

diferencia se debía a una capacidad reducida de germinación o era reflejo de germinación

lenta, ensayamos la germinación in vitro a tiempos de incubación más prolongados. A las

Figura 12. Morfología y tamaño del polen de tpz1 y silvestre.(A) Grano de polen de plantas silvestres clareado, se observa el núcleovegetativo (B) Polen maduro de plantas silvestres donde se observan los tresnúcleos característicos. (C) Grano de polen de plantas tpz1 antes de la antesis.Se observa la integridad de la pared celular y la ubicación de los núcleos. (D)Polen de tpz1. Barra de escala= 10mm.

41

22 hdi tpz1 tiene un porcentaje de germinación del 83% y el polen silvestre de 95%

indicando que los granos de polen de tpz1 no perdieron su capacidad de germinación, pero

inician después que los de las plantas silvestres (Tabla 8, Figura 13).

Para determinar si la deficiencia en WOX5 tenía un efecto en la elongación del tubo

polínico, medimos la longitud de los tubos polínicos de plantas silvestre y de tpz1 a

diferentes tiempos de incubación in vitro (2, 6, 8, 16 y 24 horas). A las 2 hdi, la longitud

media alcanzada por los tubos polínicos silvestres fue de 28.4 µm y 13.9 µm por los de

tpz1, lo que representa un 51% de retraso de crecimiento. Esta reducción se incrementó a

64% a las 6 hdi. La reducción máxima de tamaño (45%) se encontró a las 22 hdi. De

manera interesante, mientras que los tubos polínicos silvestres continuaron creciendo hasta

las 22-24 hdi, alcanzando una longitud promedio de 290±17 µm, los tubos polínicos de

individuos heterocigotos crecieron de forma discreta después de las 8 hdi, alcanzando una

longitud promedio de 104±11 µm (Tabla 8). Los datos en conjunto indican que los tubos

polínicos de tpz1 crecen más lento sino que detienen su crecimiento alrededor de las 8

Tabla 8 Porcentaje de germinación y longitud de tubos polínicos in vitroHoras después deincubación 2 8 24

Silvestre(wt)

tpz1 Silvestre(wt)

tpz1 Silvestre(wt)

tpz1

% de germinación 93.4 57 92.5 47.85 95 83.3Longitudpromedio micras 28.4 13.9 228.1 104 290 131.5

Figura 13.Granos de polen en medio de germinación in vitroMicrografías de campos aleatorios de polen silvestre (wt) y tpz1 a 2, 8 y 24 horasde incubación. Se observan granos de polen germinados y sin germinar. Lapoblación de polen tpz1 proviene de plantas heterocigotas, por lo que se observantubos polínicos largos y cortos. Barra de escala = 20µm.

2h 8h 24h

42

horas de incubación, ya que a partir de este momento no se observan un aumento

significativo de tamaño, aun dejando el cultivo de polen por 48 horas. Se graficaron las

longitudes promedio para cada tiempo (Figura 14).

h. Seguimiento genético de los cuatro productos de la meiosis en tpz1

Se empleó la mutante química qrt1 (Preuss et.al., 1994) para darle seguimiento genético al

fenotipo de tpz1. La mutante qrt1 deja los cuatro granos de polen unidos después de la

meiosis, éstos se desarrollan normalmente y son funcionales. Para introducir el alelo

mutante tpz1 en el fondo mutante qrt1 realizamos cruzas qrt1/qt1 con tpz1/+, se analizó la

generación F2 del producto de la cruza buscando plantas resistentes a kanamicina

(proporcionada por el transposón) y que tuvieran el fenotipo de los cuatro granos de polen

fusionados de qrt1. El polen de esta doble mutante nos permitió analizar mas

detalladamente el fenotipo de los tubos polínicos. En las tétradas de la doble mutante se

espera que dos de los granos de polen produzcan tubos polínicos tipo silvestre y dos sean

mas cortos. Se midió la longitud de los tubos polínicos de las tétradas conteniendo tres o

cuatro tubos polínicos pensando que al menos uno de los tubos polínicos producidos por

una tétrada porta el alelo mutante tpz1. A las 24 hdi la media de la longitud de los tubos

Tiempo después de incubación

FIGURA 14. Longitud promedio de tubos polínicos de tpz1 y silvestreSe midieron 100 tubos polínicos para cada tiempo de incubación y se obtuvo la media para cadatiempo, los tubos polínicos de tpz1 provienen de plantas heterocigotas, A las dos horas deincubación los tubos polínicos de las plantas silvestres alcanzaron 28µm a diferencia de los detpz1 con 13.9 µm. La longiud máxima a las 24 horas es de 290 µm para los tubos polínicos deplantas silvestres y para tpz1 de 131 µm , lo que representa un 45% de retraso de crecimiento.

50

100

150

200

250

300

350

Longituddel tubopolínico

µm

Wttpz1

2 h 6 h 8 h 24 h

28.4 13.9

173.7

228.1

290

62.2

104131.5

43

polínicos de las tétradas control qrt1/qrt1 es de 320±14 µm y de tpz1/+;qrt1/qrt1 de

227±11 µm. Esta diferencia representa el 29% de reducción en la longitud, indicando que

la ausencia de la actividad de QRT1 recupere parcialmente la habilidad de elongación de

los tubos polínicos en la mutante tpz1 (Figura 14 A). Analizamos las diferentes clases de

tubos polínicos (Fig 15 B) de tpz1/+;qrt1/qrt1 y de qrt1/qrt1. La clase de menos de 100

micras fue la mas abundante en la mutante tpz1/+;qrt1/qrt1 (21.95%) en contraste del

5.7% en tubos polínicos de las tétradas control, confirmando así el detenimiento temprano

en el crecimiento de los tubos polínicos tpz1.

FIG 15. Frecuencia de longitud de tubos polínicos de qrt1/qrt1 y tpz1/+;qrt1/qrt1 a las 24 hdi.(A) Promedio de la longitud alcanzada a las 24 hdi por los tubos polínicos silvestres, tpz1, tubosindividuales de las tétradas control qrt1/qrt1 y de las de tpz1/+;qrt1/qrt1, los tubos polínicos silvestresy de las tétradas control crecen de manera semejante, pero las media de los tubos polínicos de la doblemutante es mayor que los de los tubos de plantas heterocigotas tpz1. (B) Tétrada tpz1/+;qrt1/qrt1 condos tubos largos (naranja) y dos cortos (amarillo) Barra de escalas = 50 mm. (C) Frecuencia de lalongitud alcanzada por tubos individuales de las tétradas con tres o cuatro tubos polínicos detpz1/+;qrt1/qrt1 (193 tubos polínicos) y tétradas control qrt1/qrt1(190 tubos polínicos).

A B

C

44

i. La elongación del tubo polínico de tpz1 in vivo también es deficiente

Para evaluar la geminación in vivo se emascularon carpelos silvestres (wt) y tpz1. Cuando

los estigmas se encontroron receptivos se colocó una cantidada limitada de polen de

silvestre (wt), tpz1 o tpz1/+;qrt1/qrt1 para investigar si los tubos polínicos mostraban un

retraso en el crecimiento in vivo. Se colectaron los carpelos 24 horas después de

polinización, se fijaron en FAA, se ablandaron las paredes celulares en KOH 8N y después

de hacer lavados en solución de fosfatos se colocaron en portaobjetos con solución de

anilina 0.1% y se observaron con microscopía de fluorescencia. En los carpelos silvestresautopolinizados observamos tubos poínicos creciendo a lo largo del tejido de transmisiónde forma normal, pero en todos los casos cuando se empleó polen mutante, ya sea tpz1 o

tpz1/;qrt1/qrt1, se observó una población de tubos más cortos (Figura 16).

A B C

Figura 16. Crecimiento in vivo de tubos polínicos(A) Tubos polínicos silvestres sobre estigmas silvestres germinando in vivo. (B)Tubos polínicos tpz1 sobre carpelos tpz1 (C) Tubos polínicos tpz1/+; qrt1/qrt1sobe carpelos de plantas silvestres, mostrando diferencias de longitud entre los 4productos de una tétrada. Los asteriscos denotan tubos largos y las flechas tuboscortos. Barra de escala = 50mm.

45

E. MET350a. Características moleculares del gen etiquetado en la línea MET350

La inserción se encuentra en el brazo largo del cromosoma IV en la región 3´sin traducir

del gen At4g37970 que codifica para una enzima reductora cinamil alcohol deshidrogenasaAtCAD6, a 11 pares de bases antes del final del transcrito. Este gen se encuentra en una

región que contiene 3 loci que codifican para presuntas enzimas alcohol deshidrogenasas

(Figura 17).

b. El gen etiquetado en MET 350 (AtCAD6) pertenece a la familia de enzimascinamil alcohol deshidrogenasa AtCADs

El gen afectado en MET 350 pertenece a la familia AtCAD (Cinamil AlcoholDeshidrogenasa de Arabidopsis thaliana) . Esta familia se caracteriza por tener un dominio

de zinc reductor. La familia consta de 9 miembros, 5 de los cuales se encuentran en

cromosoma IV y tres (AtCAD6, ATCAD7 y AtCAD8) están en tandem (Figura 17). En laTabla 9 se describe la localización de cada miembro, su tamaño, la semejenza con la ezima

modelo funcional descrita en tabaco y el patrón de expresión que se ha detectado en otrosestudios (Raes et al., 2003; Kim et. al.,2004) .

Figura 17. Estructura genómica de la región aledaña a AtCAD6 La inserción se encuentra el la región 3´UTR del gen AtCAD6 (At4g37970) que constade 6 exones y se encuentra en un contexto genómico con 3 miembros de la mismafamilia en tandem; AtCAD6, AtCAD7 y AtCAD8. La orientación del gen reportero uidAdel transposón se encuentra en dirección opuesta a la orientación de transcripción delgen. Se indica el tamaño en nucleótidos de cada gen y la región intergénica.

uidA

3’5’

AtCAD6 AtCAD7 AtCAD8525 2464 486 1864 1506 2449

+15’UTR 3’UTR

MET350

1 2 3 4 5 6

46

Tabla 9. Miembros de la familia AtCAD en Arabidopsis thaliana. Raes et al.,2003; Kim et. al.,2004ANOTACIONDEL GEN /Locus

X Gen/mRNA a.a. SemejanzaNtCAD/id Patrón de expresión

AtCAD1At1g72680 1 1785/1068 355 57.1(46) Plántulas, hojas y silicuas verdes

AtCAD2At2g21730 2 1570/1131 376 62.4(51.7) Plántulas, hojas , tallo adulto

AtCAD3At2g21890 2 1558/1128 375 64(52.1) Plántulas, hojas , tallo adulto

AtCAD4At3g19450 3 2452/1098 365 81.5(75.1) Plántulas y hojas

AtCAD5At4g34230 4 1992/1074 357 82.9(76.5) Plántula. raíz, hoja y tallo en

desarrollo y maduroAtCAD6At4g37970 4 2568/1092 363 61.3(51) Plántula, raíz, hoja y tallo

maduro

AtCAD7At4g37980 4 1912/1074 357 61.4(50.1)

P l á n t u l a , r a í z , h o j a ,inflorescencia, silicuas verde ytallo

AtCAD8At4g37990 4 1748/1080 359 63.4(52.7) Hoja

AtCAD9At4g39330 4 1855/1083 360 60.2(50.7) Plántula, hoja, silicuas verdes y

tallo en desarrollo y maduro.X= cromosoma, gen/mRNA indica la relación entre número de nucleótidos del gen con relación altamaño final del mRNA después de la remoción de intrones; a.a. señala el número de aminoácidosNtCAD, la primer alcohol deshidrogenasa caracterizada en Nicotiana, enzima de referencia paraesta familia.

Las enzimas alcohol deshidrogenasas catalizan la reducción reversible de acetaldehído aetanol, con la correspondiente oxidación de NAD a NADH. Estas enzimas pertenecen al

grupo de las deshidrogenasas de cadena larga que contienen zinc. En AtCAD6 el dominio

deshidrogenasa abarca del aminoácido 20 al 354.

c. La familia CAD está ivolucrada en la síntesis de componentes de pared la

celular

Las enzimas de la familia CAD catalizan el último paso en la síntesis de monolignol que

son precursores de ligninas y lignanos, participando por ejemplo en reacciones de

reducción de cinamil-aldehidos a su correspondiente alcohol. Las CADs reducen algunos

aldehidos presentes en diversas células durante el desarrollo de la planta. La primera

enzima CAD bona fide fue reportada en 1992 en tabaco (Nicotiana tabacum), por lo que

47

constituye la enzima de referencia de esta familia (Knight et. al., 1992). Algunos de los

sustratos que puede emplear esta familia son los de la ruta biosintética de monolignoles y

lignina como: cumaril-aldehido, cafeil-aldehido, coniferil-aldehido, 5-hidroxiconiferil

aldehido y sinapil aldehido (Kim, et. al., 2004).

d. El patrón de expresión de AtCAD6

Reportes previos han mostrado que AtCAD6 se expresa en plántula, raíz, hojas y tallos

durante todo su desarrollo hasta la madurez, pero no fue posible detectar expresión en

flores por ensayo Northern blot (Raes et. al., 2003). Para determinar un patrón de

expresión potencial de AtCAD6 durante el desarrollo del polen, determinamos la

localización del mRNA por hibridación in situ en cortes semifinos de tejido floral de

plantas silvestres y de MET 350 (Figura 18). Se empleó una sonda homóloga al último y

penúltimo exón que no tiene homología con ningun otro miembro de la familia AtCAD.

Se analizó la expresión de AtCAD6 en anteras durante el desarrollo del polen.

Encontramos que la señal más fuerte en tejido reproductivo masculino era detectada con la

sonda sentido para el gen AtCAD6. En cambio cuando se hibridaron las muestras con la

Figura 18. Expresión de AtCAD6(A) Cortes semifinos de anteras con polen en estadio unicelular. (B) Polen bicelular(C) Polen maduro hibridados con la sonda antisentido. (D) Anteras con polenunicelular .(E) Anteras con granos de polen entrando a la primera mitosis y (F)Granos de polen mduro. Muestras hibridadas con la sonda sentido (200ng) donde semuestra una expresión fuerte en tapetum y en polen maduro.

48

sonda antisentido, la señal fue muy baja o casi indetectable para los mismos tejidos. El

experimento fue repetido y confirmamos la detección del mRNA con la sonda sentido en

tapetum y durante el desarrollo del polen en las microsporas.

Para corroborar el patrón de expresión de AtCAD6 en polen y en tejido esporofítico se

colectaron plántulas, tallos, inflorescencias completas y tejido enriquecido en anteras con

polen en etapa 6 -7 (microsporas), 8 (polen binucleado), 9 (trinucleado) y 10 (maduro,

anteras dehiscentes) (Tabla 1). Se extrajo RNA total y se realizó un ensayo de RT-PCR

(Figura 19) con iniciadores que amplifican una región de 395 nucleótidos entre los exones

4 y 6.

Los resultados del experimento de RT-PCR sugieren que la interrupción del gen AtCAD6

por el transposón en la región 3´UTR perturbó la expresión espacio-temporal del

mensajero, manteniéndose presente en el estadio de madurez del polen en MET 350,

momento en el cual no se detecta expresión de AtCAD6 en polen silvestre.

Figura 19. RT-PCR para el gen AtCAD6 en plantas silvestres y MET350.Se analizó la expresión del mRNA en plántula, tallo, inflorescencias y 4estadios de desarrollo del polen (tejido enriquecido en anteras); 1) microsporas,2) polen binucleado, 3) polen trinucleado y 4) polen maduro después deantesis. Detectamos expresión del mRNA en tejido silvestre en plántulas, tallo,inflorescencias y en anteras en desarrollo pro no en anteras con polen mauro(carril 4-Wt Col). En cambio en MET350 la expresión de AtCAD6 se mantieneen polen maduro.

396

1 2 3 4 1 2 3 4

49

e. AtCAD6 se transcribe en sentido y en antisentido

En la primer versión del genoma de Arabidopsis thaliana la estimación de genes que

codifican proteínas fue de 25,500. La estimación de unidades transcripcionales en la

versión más reciente (6.0) del genoma de Arabidopsis es de 31,407. El incremento en el

número de genes de una versión a la otra se debe principalmente al empleo de estrategias

experimentales que han permitido descubrir nuevos genes o reanotarlos. En términos

generales se puede decir que dichas estrategias se basan en el empleo del RNA para

descubrir y ordenar al DNA. Recientemente se llevó a cabo el análisis de la actividad

transcripcional en el genoma de Arabidopsis mediante la obtención de cDNAs de tamaño-

completo y el empleo de un grupo de 12 microarreglos diferentes con oligonucleótidos de

25 nt de longitud que fueron diseñados para cubrir el genoma completo de Arabidopsis

(cada arreglo contiene alrededor de 834,000 oligos de 25 nt) (Yamada et. al., 2003).

Dichos arreglos fueron hibridados con diversas muestras de RNA provenientes de

diferentes tejidos y diversas condiciones de crecimiento. Se descubrió que

aproximadamente el 30% (7,600) de los genes de Arabidopsis muestran expresión

antisentido. Los resultados de este análisis se encuentran disponibles públicamente

(http://signal.salk.edu/cgi_bin/atta) y se puede acceder a ellos mediante una interface

grafica que muestra la actividad transcripcional de cada gen de Arabidopsis en forma de

una gráfica de barras, donde cada barra representa un oligonucleótido del arreglo y la

altura de la barra representa el nivel de expresión de dicha región en cierto tejido o bajo

cierta condición experimental. Haciendo un análisis de AtCAD6 en dicha interfaz gráfica

encontramos que tiene asociados 2 transcritos: uno sentido, que incluye los 6 exones y el

otro antisentido (AV813799), que ocupa parte del quinto y todo el sexto exón (Figura 20).

50

f. El polen en la línea MET350 tiene defectos en la integridad y

mantenimiento de la pared celular

Cuando realizamos el análisis citológico del desarrollo del polen en la línea MET350

observamos que, con la mayoría de los tratamientos de fijación y clareo, el 50% de los

granos de polen maduro mostraban un desprendimiento de pared celular. Los estadios de

tétrada, microspora libre y microspora binucleada son equiparables al tipo silvestre, pero

después de la segunda mitosis encontramos que los granos de polen se desprenden de su

pared celular con mucha facilidad. Analizamos con el fluoróforo DAPI la progresión de

las divisiones celulares durante la meiosis, mitosis I y mitosis II en la línea MET350 y son

idénticas a las que ocurren en polen silvestre. En estadio maduro, una vez que concluyeron

las divisiones celulares, no fue posible observar los núcleos dentro del grano de polen, ya

que con el tratamiento de tinción, aproximadamente 50% de los granos de polen no

soportaron la presión osmótica y se encontraban vacíos. Confirmamos este defecto por

varias técnicas; una de ellas fue la infiltración de tejido en resina epóxica donde

encontramos paredes celulares deformes. Todas las técnicas probadas en el laboratorio

requirieron que en algún momento pusieramos a los granos de polen en contacto con una

solución acuosa y siempre observamos ruptura de la pared celular an aproximadamente el

50% del polen analizado. Para poder determinar cual era el defecto en la pared celular

Figura 20. Transcrito antisentido.Encontramos reportado un mRNA antisentido quecubre la región 3´ de AtCAD6 (At4g37970) , en losexones 5 y 6. El nivel de expresión en anteras deltranscrito sentido (azul) es mucho menor que eltranscrito antisentido (naranja).En líneas verdes y negro se resaltan los exones.Las barras verdes inferiores indican el nivel deexpresión del mensajero en las anteras. Se puedeobservar amplificada la región donde se encuentra eltranscrito antisentido.

51

antes de que se rompiera fue necesario recurrir a una técnica que no obligara a someter al

polen a algún tratamiento acuoso. Una tecnología que nos permite observar la superficie de

objetos sin tratamiento previo es la microscopía de barrido ambiental (ESEM). Al realizar

observaciones de polen mutante bajo ESEM, encontramos varios defectos en la pared

celular, desde acumulaciones anormales del material de la pared celular hasta poros de

germinación mas largos que los silvestres (Figura 21).

Figura 21. Fenotipo del polen la línea MET350.(A) Micrografías de polen clareado con solución deHerr´s de plantas silvestres. (B)Polen maduro de lalínea MET350; se marcan con flechas losdesprendimientos de la pared celular. (C) En cortessemifinos se observa la morfología del polen silvestre(D) Se observan protuberancias y desprendimientosentre el citoplasma y la pared celular en granos depolen de MET350. (E) Los tres núcleos característicosdel polen silvestre teñido con DAPI. (F) Ausencia delos núcleos en el 50% de los granos de polenMET350. (G) Superficie del grano de polen silvestre(H) En los granos de polen de MET350 se observandeformidades en la pared celular bajo microscopíaelectrónica de barrido ambiental.

Silvestre MET350

A B

C D A

E F E

G H

52

g. Confirmación de la mutación gametofíticaPara verificar que se trata de una mutante gametofítica, contamos con la mutante química

QRT1. Realizamos la cruza con la línea MET 350 y analizamos en la F2 los fenotipos

encontrados (Tabla10).

Confirmamos que la mayoría de las tétradas de la mutante MET350/+;qrt1/qrt1 tienen dosde los cuatro granos de polen colapsados, lo que indica que se trata de una mutación

gametofítica.

qrt1/qrt1 MET350/+;qrt1/qrt1 colapsados/normales 4/0 4.1% 1.9 % 3/1 5.5% 3.8 % 2/2 2.7% 82.7 % 1/3 2.7% 3.8 % 0/4 84.9% n=146 76 % n=104

Tabla 10 . Frecuencia de granos de polen colapsados en la doblemutante MET350/+;qrt1/qrt1

53

V. DISCUSIÓN

A. LOS ESCRUTINIOS DE SEGREGACIÓN SON UNA HERRAMIENTAPODEROSA PARA IDENTIFICAR GENES GAMETOFÍTICOS

En los últimos años se ha invertido gran esfuerzo por conocer cuántos y qué genes

participan en el desarrollo micro gametofítico (Honys y Twell, 2004; Becker et. al., 2004).Análisis a nivel global han confirmado que aproximadamente el 10% de los genes

expresados durante el desarrollo del polen son específicos a este gametofito. A pesar deque se conocen muchas secuencias que están expresadas en el gametofito masculino, aún

queda por investigar su función y el control de la expresión específica de estos genes.

Mediante análisis de mutantes se puede tener un mayor acercamiento a la función génica.Las mutaciones que afectan el desarrollo de los gametofitos femeninos o masculinos son

comunes y se han descrito para más de 100 especies (Howden, et.al.,1998). La mayoría de

estas mutaciones muestran un requerimiento esporofítico y son recesivas. Una forma deidentificar mutantes afectadas en desarrollo gametofítico en Arabidopsis son los rastreos de

reducción en fertilidad; mutaciones esporofíticas que afectan el desarrollo del polen o losóvulos producen auto-esterilidad cuando son homocigotas, pero heterocigotas son

completamente fértiles. Mutaciones gametofíticas letales completamente penetrantes solo

pueden mantenerse como heterocigotas. Cuando son femeninas, la planta es semi-estérilporque solo el 50 % de los óvulos es capaz de producir semillas. Pero cuando son

masculinas, a pesar de que solo el 50% del polen es viable, son completamente fértilesdebido el exceso de polen en relación con los óvulos a fecundar. Con las mutantes

insercionales tenemos la capacidad de asociar un marcador a la mutación y por lo tanto

seguir esta mutación en varias generaciones. Esto permite hacer rastreos de segregación deltransposón que confiere resistencia a kanamicina y cuya presencia es causante de la

mutación.

54

B. MUTANTES GAMETOFÍTICAS LETALES MASCULINAS

La distribución de las familias de segregación encontradas en nuestra colección escomparable con lo mostrado en otras colecciones insercionales. Se ha reportado que del 0.2

al 9% son mutantes gametofíticas (Feldmann et. al., 1997; Grinni et. al., 1998; Howden et.

al., 1998; Pagnusat et. al., 2004). Nosotros encontramos un 0.7% de mutantesgametofíticas. De manera interesante todas ellas muestran una eficiencia de transmisión

reducida a través del gametofito masculino y no del femenino. Se postula que el número degenes involucrados en el desarrollo del polen es mayor que los del saco embrionario o

gametofito femenino, y que la redundancia de funciones en el polen es menor, por lo que

se postula que son más numerosas las mutantes insercionales que afectan al polen.

C. GENES QUE SE EXPRESAN DURANTE EL DESARROLLO DEL POLEN YEL DESARROLLO PROGÁMICO

En años recientes se han hecho esfuerzos por determinar de forma global los genes que seexpresan durante el desarrollo del polen (Honys y Twell, 2004) y en las primeras etapas de

la germinación (Becker et. al., 2004). Estos trabajos han reportado alrededor de 400 genes

específicos de polen además de otros cientos cuya expresión se traslapa durante eldesarrollo esporofítico. El polen es una estructura transcripcional y traduccionalmente muy

activa. El mayor número de genes encontrados aún no tiene clasificación funcional. Losgenes involucrados en la actividad transcripcional están altamente representados y su perfil

de expresión aumenta después de la segunda mitosis (Honys y Twell, 2004). Los genes

involucrados en síntesis de pared celular también representan una cantidad alta (9.8%), yaque la actividad de deposición y síntesis de pared celular durante el desarrollo del polen así

como durante la elongación del tubo polínico es alta. Mediante rastreos de segregacióndistorsionada se han identificado genes necesarios para el desarrollo microgametofítico y

progámico, como SETH1 y SETH2 que son dos componentes de la ruta biosintética de

55

glicosil fosfatidil inositol requeridos para la germinación y crecimiento del tubo polínico

(Lalanne et. al.,2004).

D. EL FACTOR TRANSCRIPCIONAL WOX5 SE EXPRESA DURANTE LAMICROGAMETOGÉNESIS

Análisis funcionales han indicado que algunos de los genes de la familia WOX juegan un

papel importante en la determinación del destino celular en diferentes etapas del desarrollo

de las plantas. El gen WOX5 es el segundo miembro de la familia WOX más pequeño en

tamaño. La proteína tiene 182 resíduos aminoacídicos codificados en 2 exones. El motivo

conservado tiene 60 resíduos aminoacídicos (18-84 aa) y están codificados en el primer

exón, del nucleótido 99 al 279. En estudios anteriores se ha reportado que la expresión del

gen WOX5 se encuentra restringida al centro quiscente desde el estado de desarrollo

embrionario. Nosotros encontramos que durante el desarrollo del gametofito masculino

WOX5 se expresa después de la primera mitosis. En granos en estado bicelular, el nivel de

expresión aumenta a lo largo del desarrollo. Se expresa fuertemente en polen tricelular

antes de la dehiscencia de las anteras, así como en el tapetum. En otros estudios se hareportado la participación de algunos miembros de la familia WOX durante el desarrollo

del meristemo o de los órganos florales, generalmente controlando la diferenciación o la

identidad de grupos celulares. El polen es una estructura tricelular y el control de lacomunicación y coordinación entre estas tres células aún no es del todo conocido. Es

posible que el gen WOX5 sea un factor que controle o regule la expresión de genes enpolen después de la mitosis I, a partir del momento en que se forman las dos células: la

vegetativa y la generativa.

En este trabajo encontramos que la expresión más intensa de WOX5 se alcanza en el inicio

de la germinación del tubo polínico y la penetración del tubo en las papilas estigmáticas, se

mantiene durante la elongación de los tubos polínicos germinados in vivo. Se ha reportado

que durante la germinación y elongación del tubo polínico hay una actividad metabólica

elevada ya que se requiere síntesis de novo de los compuestos de la pared celular. Es

56

posible que un factor transcripcional como WOX5 sea una pieza esencial en el proceso de

expresión génica durante esta etapa del crecimiento celular.

E. WOX5 SE EXPRESA EN EL CENTRO QUIESCENTE Y EN EL TUBO

POLÍNICO Y POSIBLEMENTE SU EXPRESIÓN ESTÁ REGULADA POR

AUXINAS

Reportes anteriores han mostrado que WOX5 se expresa en la hipófisis del embrión en

estadio globular temprano y en el centro quiescente del embrión en estadio de corazón(Haecker, et.al 2004). Otros estudios señalaron que en plántulas, la expresión de WOX5 se

ve inducida por auxinas (Gonzali, et. al., 2005). Concentraciones altas de ácido indol

acético (AIA) que presuntamente se sintetiza en el tapetum han sido recientementeencontradas en polen maduro (Aloni et. al., 2006), sugiriendo que las auxinas pueden

promover la germinación del tubo polínico. Nosotros encontramos que WOX5 también seexpresa durante las etapas tempranas de la germinación del grano de polen y se mantiene

durante la elongación del mismo. La localización del mRNA colocaliza con las regiones de

mayor acumulación de auxinas libres reportadas (Aloni et. al., 2006), sugiriendofuertemente que este gen se expresa tanto en tejido esporofítico como gametofítico, y que

su regulación depende de las auxinas.

F. EN LA MUTANTE tpz1 LOS TUBOS POLÍNICOS DETIENEN SUCRECIMIENTO, PERO EN EN LA DOBLE MUTANTE tpz1/+; qrt1/qrt1 ELTUBO POLÍNICO SE RECUPERA PARCIALMENTE

La germinación de tubos polínicos de tpz1 inicia de forma retardada y detiene su

crecimiento. Esto se pone en evidencia entre las 6-8 hdi, cuando ya no hay un aumento

significativo del promedio de longitud de los tubos polínicos de individuos heterocigotostpz1. Los datos obtenidos del ensayo de germinación in vitro en los que se incubó el polen

a diferentes tiempos nos permitió estimar la velocidad de crecimiento de los tubos

polínicos. Durante las primeras 6 horas los tubos polínicos silvestres crecieron 37 µm/h, en

57

cambio, los de tpz1 12 µm/h, lo que sugiere que la competencia de los tubos polínicos se

encuentra seriamente comprometida en la mutante tpz1. Los análisis de crecimiento del

tubo polínico muestran que WOX5 es necesario para el crecimiento in vitro e in vivo.

La diferencia de longitud de los tubos polínicos silvestres y tpz1 es del 76%. Pero parapoder evaluar de forma más precisa la diferencia entre los tubos silvestres y mutantes

empleamos la doble mutante tpz1/+; qrt1/qrt1 que nos permite en una misma tétrada

evaluar la longitud de los 4 productos de la meiosis. Se esperaba observar 2 tubos cortos ydos largos. Obtuvimos el promedio de longitud máxima a las 24 horas de incubación y en

comparación con los tubos control de qrt1/qrt1 el crecimiento se redujo en un 30%. Lasdiscrepancias entre la diferencia de longitud de la mutante tpz1 contra tubos silvestres y la

diferencia entre tpz1/+; qrt1/qrt1 y qrt1/qrt1 aún queda por elucidarse, pero es probable

que se deba a que en la mutante qrt1 existe mayor cantidad de productos de pectina. Estepolímero es el que no se degrada y que permite la unión de los 4 productos de la meiosis,

así que aunque no hay evidencia de la fuente de pectina que emplea el tubo polínico paracrecer, surge la interesante posibilidad de que la ausencia de la actividad de QRT1

compense parcialmente el defecto de crecimiento de tpz1.

G. LA EFICIENCIA DE TRANSMISIÓN DE tpz1 A TRAVÉS DEL POLEN ES DEL47%, SIN EMBARGO NO ES POSIBLE RECUPERAR PLANTASHOMOCIGOTAS

La transmisión del carácter de resistencia a kanamicina en los individuos heterocigotostpz1 no está completamente bloqueada a través del polen (Tabla 7). Pues un número

limitado de tubos polínicos carentes de actividad de WOX5 son capaces de competir con

los tubos polínicos silvestres y fertilizar un número reducido de óvulos. Después deanalizar alrededor de 100 plantas heterocigotas tpz1, no fue posible encontrar plantas

homocigotas tpz1/tpz1. Aunque no pudimos detectar defectos en el desarrollo delgametofito femenino o en la germinación de las semillas, se sabe que WOX5 se expresa en

tejido embrionario, aunque su papel en el desarrollo de la semilla aún debe ser elucidado.

58

H. AtCAD6 ES UNA ENZIMA REDUCTORA Y ESTÁ INVOLUCRADA ENSÍNTESIS DE PARED CELULAR

Las enzimas cinamil alcohol deshidrogenasas (CADs) catalizan el último paso en la rutabiosintética de los monolignoles. Los miembros de esta familia tienen preferencia por

diferentes sustratos y se expresan de manera diferencial en los tejidos de la planta. Las

alcohol deshidrogenasas se han clasificado en función del sustrato que pueden reducir.AtCAD6 se agrupa con AtCAD7 , AtCAD8, la sinapil alcohol deshidrogenasa de álamo

SAP (Populus tremuloides), la manitol deshidrogenasa de apio (Apium graveolens) y otrasenzimas CAD-ELI3 de perejil (Raes et.al, 2003). En el álamo se ha estudiado la

localización de esta enzima y sus sustratos. Se encontró que se encuentra localizada junto

al parénquima del protofloema, lugar donde se sintetiza su sustrato preferente, el siringil-aldehido (Li et. al., 2001).

A pesar de conocer los sustratos metabolizables por la mayoría de las alcoholdeshidrogenasas, no se ha relacionado esta ruta metabólica de síntesis de lignanos y

ligninas con la síntesis de la compleja pared celular del polen. Se sabe que dentro de locomponentes de la pared celular del polen se encuentran algunos polímeros alifáticos con

cadenas laterales conjugadas o con anillos aromáticos. Estos últimos pueden ser los

compuestos que se comparten con la ruta metabólica de los monolignoles y ligninas dondelas CADs catalizan la última reacción de reducción de la ruta biosintética. El tipo de

enlaces químicos y las presencia de cadenas alifáticas determinan algunas de laspropiedades de la lignina como la flexibilidad y la dureza.

I. TRANSCRIPCIÓN SENTIDO Y ANTISENTIDO ASOCIADA A AtCAD6

El gen AtCAD6 se transcribe en sentido y antisentido. Ambos transcritos se han reportado

previemente en colecciones de cDNA (Seki et. al., 2002). En este trabajo, medianteensayos de hibridación in situ, fue posible detectar la expresión del mensajero antisentido

en tejido gametofítico masculino (Figura 18). La sonda fue diseñada en la región 3’, quees la región de menor homología entre los miembros de la familia AtCAD, sitio donde se

59

encuentra el transcrito antisentido. También fue posible encontrar la expresión del

transcrito sentido mediante un ensayo de RT-PCR. Los iniciadores abarcan los exones 4-6,sitio que incluye al mRNA sentido. Los transcritos antisentido son una clase de RNA,

codificantes o no codificantes cuyas secuencia es complementaria a otro transcrito. Estostranscritos antisentido pueden participar en una amplia gama de mecanismos de regulación

génica, ya sea en cis o trans (Dahary et. al.,2005). Los datos obtenidos sugieren que los

transcritos sentido largo y antisentido corto de AtCAD6 se expresan de maneracomplementaria. Mientras que la actividad transcripcional sentido ocurre en toda la planta

(excepto en polen maduro) la trascripción antisentido ocurre preferencialmente en elpolen en estadio maduro.

Los datos mostrados sugieren que el fenotipo causado por la inserción en la línea MET 350se debe a la persistencia del transcrito sentido en estadios de desarrollo en los que de

manera silvestre no se expresa, como en el caso de las flores maduras donde el polen se

encuentra en estadio tricelular, etapa en la cual la mutante hace evidente los defectos depared celular. La regulación del mRNA sentido pudiera estar a cargo del RNA antisentido

corto. La inserción en MET350 se encuentra justo al final del 3´UTR del gen, sitio dondese inicia la transcripción antisentido.

J. ¿A QUÉ NIVEL DE LA PARED CELULAR SE ENCUENTRA EL DEFECTO?

Se ha reportado que la síntesis y deposición de compuestos que integran la compleja paredcelular del polen está regulada a dos niveles; la formación de intina a nivel gametofítico,

por genes que se expresan en la microspora, y la exina a nivel esporofítico, por genesexpresados por el tapetum, tejido de origen materno. Los análisis del transcriptoma del

polen han sugerido que la formación de compuestos de la exina, sobre todo de la capa de

esporopolenina, también tiene una contribución gametofítica. Se reportó que un grupo defactores transcripcionales que se encuentra sobre-representado en los análisis de expresión

global de polen es el de la familia C3H, que juega un papel importante en la regulación de

la ruta de síntesis de lignina y compuestos fenil propanoides involucrados en esta misma

60

ruta biosintética (Honys y Twell, 2004). A partir de ello podemos postular que el problema

de la integridad y mantenimiento de la pared celular del polen en MET 350 se encuentra enla capa externa (exina). Normalmente la expresión de este gen debería terminar antes de la

antesis, pero en la línea mutante MET 350 la expresión de AtCAD6 se mantiene durante laantesis. La expresión temporal afectada puede ser la causante de las protrusiones que

observamos en el polen de MET350, como la acumulación de protuberancias en la pared

celular. La causa de que el polen se desprenda fácilmente de la pared puede deberse a larigidez de la pared, o al establecimiento inadecuado de anlaces químicos entre los

componentes de la exina. Este trabajo abre la posibilidad de asignarle una funcióngametofítica a las enzimas AtCADs.

K. USO DE AtCAD6 E IMPLICACIONES PARA EL ESTABLECIMIENTO DETECNOLOGÍAS QUE IMPIDAN EL FLUJO DE TRANSGENES A TRAVÉSDEL POLEN

La penetrancia está directamente relacionada a la ET que caracteriza a las líneas mutantesaquí descritas. En el caso de tepitzin1, la ET a través del gametofito masculino es de

46.7%, mientras que en MET350 es de 0.2%. Para mutantes gametofíticas letalesmasculinas, este valor de ET es de los más bajos reportados, solo comparable con aquellos

encontrados para seth1-2 (ET 1%) (Lalanne, et. al., 2004). Desde la perspectiva de

implantación de una tecnología que permita impedir la transferencia de rasgos transgénicosa través del polen, los valores de ET obtenidos a partir de cruzas manuales constituyen una

primera evaluación de la capacidad que podrían tener algunas mutaciones que alteren laactividad de AtCAD6 al ser usadas como herramientas esenciales para la aplicación de esta

tecnología. Esto se debe a que en términos estrictamente genéticos, el transposón que

confiere resistencia a kanamicina simula el comportamiento de un transgén. Desde estaperspectiva, el obtener tan solo 1 semilla “transgénica” por cada 1,000 convierte a AtCAD6

en una herramienta adecuada para implementar un sistema que impida el flujo detransgenes a través del polen. Esto no parece cierto para tepitzin1, cuya ET corresponde a

obtener más de 23 semillas transgénicas por cada 100 obtenidas por polinización cruzada

de una planta transgénica heterocigota con plantas silvestres no transgénicas.

61

Si bien estos datos nos permiten aproximar el problema bajo condiciones controladas enuna planta en la cual prevalece casi completamente la auto-polinización (se calcula que la

polinización cruzada en Arabidopsis no rebasa el 4% bajo condiciones de campo), larealidad puede ser muy diferente para una planta de polinización abierta como el maíz en

condiciones de cultivo. Dadas las condiciones de polinización cruzada en campo en las

cuales la esperanza de vida y de participación exitosa de un grano de polen son pobres, seconsidera la probabilidad de que un grano de polen viable que porta la característica

transgénica polinice exitosamente a un óvulo es menor a las obtenida en nuestrosexperimentos. Por lo tanto, consideramos que la transmisión de rasgos transgénicos en el

fondo genético MET350 se debería de ver reducida sustancialmente bajo condiciones de

campo en una planta como el maíz. Sin embargo, no es factible proponer que se utilice elfondo mutante MET350 como herramienta per se para implementar la tecnología, pues es

indispensable que la característica transgénica y el elemento que causa la letalidad

gametofítica masculina estén genéticamente ligados.

Para implementar esta tecnología en una planta de cultivo como el maíz, proponemos lassiguientes alternativas:

En el caso de que sea la inactivación del transcrito largo en orientación sentido del mRNAde AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:

a) La utilización de un vector que ligue 2 construcciones: 1) la característica transgénica

deseable y 2) el promotor LAT52 de tomate dirigiendo la expresión sentido y anti-sentido

del mRNA de AtCAD6 para causar silenciamiento post-transcripcional por RNAinterferente (RNAi). El promotor LAT52 ha sido exitosamente utilizado para expresar

genes de manera específica en el polen. Esta estrategia depende de que la función del genAtCAD6 de Arabidopsis esté conservada en el maíz. Estudios preliminares muestran que

tanto el genoma del maíz como el del arroz contienen un homólogo de AtCAD6, lo que

sugiere que la función de dicho gen puede estar conservada en polen.

62

b) La utilización de un vector que ligue 2 construcciones: 1) la característica transgénicadeseable y 2) el promotor de WOX5 dirigiendo la expresión sentido y anti-sentido del gen

AtCAD6 para causar silenciamiento post-transcripcional por RNA interferente (RNAi). Elpromotor WOX5 no ha sido utilizado para expresar genes de manera específica en el polen,

pero el patrón de localización del mRNA de WOX5 indica que su actividad está restringida

a estados tardíos de formación del polen, y la embriogénesis temprana. Esta estrategiadepende de que el silenciamiento de AtCAD6 en tejidos embrionarios no sea detrimental a

la planta. Las mismas consideraciones funcionales en maíz son ciertas para esta alternativa.

En caso de que sea la inactivación del transcrito corto en orientación antisentido en el

3’UTR de AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:

c) La utilización de un vector de sobre-expresión del gen AtCAD6 que permita su

persistencia transcripcional en estados maduros del polen. Un ejemplo podría ser unaconstrucción que ligue el promotor de ACTINA5 con el cDNA completo de AtCAD6. Esta

estrategia depende de que sea la persistencia del mRNA de AtCAD6 la que cause letalidad.Las mismas consideraciones funcionales en maíz son ciertas para esta alternativa.

Después de obtener estas construcciones, se deberá de evaluar su eficacia bajo condicionesexperimentales controladas que no causen riesgos de dispersión transgénica en condiciones

de campo.

63

VI. CONCLUSIONES

Este trabajo describe dos mutantes que se encuentran afectadas en genes del desarrollo del

polen y progámico. Uno de estos genes, AtCAD6, codifica para una enzima de la ruta de lalignina. El segundo codifica para un factor transcripcional tipo WUSCHEL, WOX5.

Ambos fueron identificados mediante un rastreo de distorsión de segregación.

Del análisis de la línea MGT76 podemos concluir que el factor transcripcional WOX5 se

expresa durante la microgametogénesis, a partir de la primera división mitótica y que es laseñal más fuerte detectada durante el inicio de la germinación del tubo polínico. Pudimos

confirmar que otra inserción (GT6264) muy cerca de la originalmente identificada produce

el mismo fenotipo de segregación distorsionada, ligando fuertemente la inserción con eldefecto de transmisión observado en esta línea. tpz1 sugiere que WOX5 es requerido para

crecimiento normal de los tubos polínicos tanto in vivo como in vitro, y que la mutante

qrt1 recupera parcialmente el fenotipo posiblemente haciendo accesible el suplemento de

productos pectínicos esterificados para la formación de la pared del tubo polínico. Este es

el primer miembro de la familia WOX que se reporta que participa en el desarrollo del

gametofito masculino. Los resultados de este trabajo sugieren que WOX5 integra una

nueva ruta génica, en la que incorpora la señalización por auxinas al desarrollo progámico

durante la reproducción sexual en las plantas.

MET350 es una mutante que tiene una de las eficiencias de transmisión más bajas

reportadas en la literatura. Se encuentra afectada la integridad y el mantenimiento de la

pared celular del grano de polen El gen etiquetado es AtCAD6, una enzima reductora que

participan en la ruta biosintética de lignanos y ligninas, componentes de paredes celulares

vegetales. AtCAD6 posee un complejo patrón de regulación, ya que existe un transcrito

sentido expresado en toda la planta excepto en flores maduras, pero también se encuentra

asociado a este gen un transcrito antisentido, cuya expresión está localizada

preferencialmente en tejido gametofítico. Estos datos sugieren que a lo largo del desarrollo

de la planta se requiere la expresión diferencial de este gen, y que la perturbación del

64

transcrito antisentido ocasionado por la inserción causa los defectos durante el desarrollo

de la pared celular del polen en el estado maduro.

Las características fenotípicas y de baja transmisión a través del polen causadas por la

inserción del transposón en la línea MET350 convierte al gen AtCAD6 en el candidato

más interesante para ser usado como herramienta en la implementación de una tecnología

que impida la transferencia de rasgos transgénicos a través del polen.

65

VII. PERSPECTIVAS

De este trabajo se desprende una lista de familias con segregación distorsionada (1:1 y 2:1)

cuyo análisis puede proporcionar información muy valiosa para el estudio de los

gametofitos y del desarrollo embrionario (Anexo I), temas centrales de estudio en el

Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis.

Para implementar una tecnología que impida la transferencia de transgenes a través delpolen con las herramientas generadas en este trabajo en Arabidopsis y en una planta de

cultivo como el maíz, se deberán responder algunas preguntas biológicas y tecnológicas

que aseguren el establecimiento exitoso de dicha estrategia.

En el caso de que sea la inactivación del transcrito largo en orientación sentido del mRNAde AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:

- Tratar de complementar la mutante MET350 con la porción del gen AtCAD6 afectada por

la inserción.

- Determinar la región del gen AtCAD6 que no presente homología con los demásmiembros de la familia AtCAD para poder ser usada en la construcción palindrómica que

cause silenciamiento post-transcripciona por RNAi.

- Para el caso de la implementación en maíz se deberá realizar un análisis computacional

para identificar secuencias con homología a AtCAD6 en la secuencia parcial disponible delgenoma de maíz y en bases de datos de ESTs. Se puede utilizar el genoma secuenciado de

arroz como un marco de referencia, ya que mediante estudios de genómica comparativa se

ha demostrado que extensas regiones del genoma de ambos cereales guardan una estrecharelación sinténica. Se deberá también determinar el patrón de expresión de las presuntas

66

secuencias homólogas y seleccionar aquellas que muestren un patrón de expresión similar

a AtCAD6 y clonar la o las presuntas secuencias homólogas a AtCAD6.

- Para emplear el promotor del gen WOX5 se deberán realizar ensayos de expresión con lafusión de distintas regiones reguladoras de WOX5 fusionadas a la proteína verde

fluorescente lo que nos ayudaría a determinar si existe una región que confiera expresión

específica al polen.

En caso de que sea la inactivación del transcrito corto en orientación antisentido en el3’UTR de AtCAD6 la que cause letalidad gametofítica del polen:

- Deteminar experimentalmente la presencia (RT-PCR) y longitud (5’ y 3’ RACE) deltranscrito antisentido corto y evaluar su patrón de expresión.

- Generar plantas transgénicas de Arabidopsis que porten una construcción que contenga algen reportero GFP fusionado al 3’ UTR de AtCAD6 y utilizar dicho transgén como un

sensor que delate el patrón de expresión de AtCAD6 y del transcrito antisentido,determinando la probable región reguladora responsable de la expresión del transcrito

antisentido y analizando su capacidad para dirigir la transcripción mediante fusiones con

un gen reportero.

- Expresar de manera ectópica el transcrito antisentido en la mutante MET350 para tratarde revertir el fenotipo observado.

- Evaluar si la transcripción sentido/antisentido conduce a la formación de un RNA dedoble cadena que pueda inducir un evento de RNAi buscando RNAs pequeños asociados

con dicha región, ya sea computacionalmente en la base de datos de firmas MPSS deArabidopsis o experimentalmente, deteminando si existen RNAs pequeños asociados a la

región empalmada en plantas silvestres y comparando el posible perfil obtenido de RNAs

pequeños con plantas MET350.

67

Después de obtener las construcciones propuestas, se deberá de evaluar su eficacia bajocondiciones experimentales controladas que no causen riesgos de dispersión transgénica en

condiciones de campo.

La búsqueda de genes que interactúen con el factor transcripcional WOX5 ayudará a

entender su función y establecer una ruta de señalización durante el inicio de la

germinación y crecimiento del tubo polínico, proceso en el que se desconocen la mayoría

de los componentes génicos involucrados.

Estudios de especificidad del promotor permitirán saber si existe regulación gametofítica y

esporofítica dirigida por sitios diferentes de la región reguladora para poder así estudiar la

funcionalidad de los sitios de respuesta a auxinas durante la microgametogénesis.

Un análisis de inmunolocalización para detectar diferentes compuestos de pectina nos

permitiría conocer con precisión el nivel del defecto en la pared celular del grano de polen

en la mutante MET350, y así esclarecer la relación entre la ruta biosintética de ligninas y

lignanos y su contribución al desarrollo del polen.

68

VIII. REFERENCIAS

Aarts MG, Hodge R, Kalantidis K, Florack D, Wilson ZA, Mulligan BJ, StiekemaWJ, Scott R, Pereira A (1997) The Arabidopsis MALE STERILITY 2 protein sharessimilarity with reductases in elongation/condensation complexes. Plant J 12:615-623.

Agashe B, Prasad CK, Siddiqi I (2002) Identification and analysis of DYAD: a generequired for meiotic chromosome organisation and female meiotic progression inArabidopsis. Development 129:3935-3943.

A loni R, Aloni E, Langhans M, Ullrich CI (2006) Role of auxin in regulatingArabidopsis flower development. Planta 223: 315-328.

Bai X, Peirson BN, Dong F, Xue C, Makaroff CA (1999) Isolation and characterizationof SYN1, a RAD21-like gene essential for meiosis in Arabidopsis. Plant Cell 11:417-430.

Becker JD, Boavida LC, Carneiro J, Haury M, Feijo JA (2004) Transcriptionalprofiling of Arabidopsis tissues reveals the unique characteristics of the pollentranscriptome. Plant Physiol 133:713-25.

Bedinger P (1992) The remarkable biology of pollen. Plant Cell 4: 879-887.

Blackmore S, Crane PR (1988) The systematic implications of pollen and sporeontogeny. In Ontogeny and Systematics (Humphries CJ, ed.) New Cork: ColumbiaUniversity Press, p. 83-115.

Blomstedt C, Kno RB, Singh M (1996) Generativ cells of Lilium longiflorm possesstranslatable mRNA ans functional synthesis machinery. Plant Mol Biol 31: 1083-1086.

Bonhomme S, Horlow C, Vezon D, de Laissardiere S, Guyon A, Ferault M,Marchand M, Bechtold N, Pelletier G (1998) T-DNA mediated disruption of essentialgametophytic genes in Arabidopsis is unexpectedly rare and cannot be inferred fromsegregation distortion alone. Mol Gen Genet 260:444-452.

Bosch M, Cheung AY, Hepler PK (2005) Pectin methylesterase, a regulator of pollentube growth. Plant Physiol 138: 1334-46.

Bosch M, Hepler PK (2005) Pectin methylesterases and pectin dynamics in pollen tubes.Plant Cell 17: 3219-26.

Caryl AP, Armstrong SJ, Jones GH, Franklin FC (2000). A homologue of the yeastHOP1 gene is inactivated in the Arabidopsis meiotic mutant asy1. Chromosoma 109 :62-71.

69

Chamberlain D y Stewart Jr. N (1999) Transgene escape and transplantomics. NatureBiotechnology 17: 330-331.

Chen YS, McCormick S (1996) sidecar pollen, an Arabidopsis thaliana malegametophytic mutant with aberrant cell divisions during pollen development. Development122: 3243-3253.

Cheung AY, Chen CY, Glaven RH, de Graaf BH, Vidali L, Hepler PK, Wu HM(2002) Rab2 GTPase regulates vesicle trafficking between the endoplasmic reticulum andthe Golgi bodies and is important to pollen tube growth. Plant Cell 14: 945-962.

Chèvre AM, Frèdèrique E, Baranger A, Renard M (1997) Gene flow from transgenicscrops. Nature 389:924.

Couteau F, Belzile F, Horlow C, Grandjean O, Vezon D, Doutriaux MP ( 1999)Random chromosome segregation without meiotic arrest in both male and femalemeiocytes of a dmc1 mutant of Arabidopsis. Plant Cell 11:1623-34.

Dahary D, Elroy-Stein O, Sorek R (2005) Naturally occurring antisense: transcriptionalleakage or real overlap? Genome Res 15:364-368.

Daniell H, Datta R, Narma S, Gray S, Lee SB (1998) Containment of herbicide resistantthrough genetic engineering of the chloroplast genome. Nature Biotechn 16: 345-348.

Derksen J, Knuiman B, Hoedemaekers K, Guyon A, Bonhomme S, Pierson ES (2002)Growth and cellular organization of Arabidopsis pollen tubes in vitro. Sex Plant Reprod15: 133-139.

Dubreucq B, Grappin P, Caboche M (1996) A new method for the identification andisolation of genes essential for Arabidopsis thaliana seed germination. Mol Gen Genet252: 42-50.

Eady C, Lindsey K, Twell D (1995) The significance of microspore division and divisionsymmetry for vegetative cell-specific transcription and generative cell differentiation. ThePlan Cell 7: 65-74.

Eber F, Chèvre AM, Baranger A, Vallèe P, Tanguy X, Renard M (1994) Spontaneushyridization between a male-sterile oilseed rape and two weeds. Theor App Genet 88:362-368.

Ellstrand N, Delvin B, Marshall D (1989) Gene flow by pollen into small populations:Data from experimental and natural strains of wild radish. Proc Natl Acad Scie USA 86:9044-9047.

Emberlin J (1999) A report on maize pollen dispsersal. University College

70

Feldmann K, Coury D, Christianson M (1997) Exceptional Segregation of a selectablemarker (Kan R) in Arabidopsis identifies genes important for gametophytic growth anddevelopment. Genetics 147:1411-1422.

García M, Figueroa J, Gomez R, Townsend R, Schoper J (1998) Pollen control duringtransgenic hybrid maize development in Mexico. Crop Science 38: 1597-1602.

García-Aguilar M, Dorantes-Acosta A, Pérez-España V, Vielle-Calzada JP (2005)Whole-mount in situ mRNA localization in developing ovules and seeds of Arabidopsis.Plant Mol. Biol. Reporter 23: 279-289.

Gonzali S, Novi G, Loreti E, Paolicchi F, Poggi A, Alpi A, Perata P (2005) Aturanoseinsensitive mutant suggests a role for WOX5 in auxin homeostasis in Arabidopsisthaliana. Plant J 44: 633-45.

Gray A y Raybould F (1998) Reducing transgene escape routes. Nature 392: 653-654.

Grini PE, Schnittger A, Schwarz H, Zimmermann I, Schwab B, Jurgens G,Hulskamp M (1999) Isolation of ethyl methanesulfonate-induced gametophytic mutants inArabidopsis thaliana by a segregation distortion assay using the multimarker chromosome1. Genetics 151:849-863.

Gu Y, Vernoud V, Fu Y, and Yang Z (2003) ROP GTPase regulation of pollen tubegrowth through the dynamics of tip-localized F-actin. J Exp Bot 54: 93-101.

Haecker A, Gross-Hardt R, Geiges B, Sarkar A, Breuninger H, Herrmann M, Laux T(2004) Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during earlyembryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development 131 :657-668.

Haecker A, Laux T (2001) Cell-cell signaling in the shoot meristem. Curr Opin Plant Biol4: 441-446.

Hanson DD, Hamilton DA, Travis JL, Bashe DM, Mascarenhas JP (1989)Characterization of a pollen-specific cDNA clone from Zea mays and its expression. PlantCell 1:173-179.

Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T (1999) Plant cis-acting regulatory DNAelements (PLACE) database:1999. Nucleic Acids Res 27: 297-300.

Honys D, Twell D (2004) Transcriptome analysis of haploid male gametophytedevelopment in Arabidopsis. Genome Biol 5:R85.

Howden R, Park SK, Moore JM, Orme J, Grossniklaus U, Twell D (1998) Selection ofT-DNA-tagged male and female gametophytic mutants by segregation distortion inArabidopsis. Genetics 149:621-631.

71

Johnson MA, D Preuss (2002) Plotting a course: multiple signals guide pollen tubes totheir targets. Dev Cell 2: 273–281.

Johnson S, McCormick S (2001) Pollen germinates precociously in the anthers ofraring-to-go, an Arabidopsis gametophytic mutant. Plant Physiol 126: 685-695.

Kim S, Kim M, Bedgar DL , Moinuddin SGA, Cardenas CL, Davin LB, Kang C,Lewis NG (2004) Functional reclassification of the putative cinnamyl alcoholdehydrogenase multigene family in Arabidopsis. Proc Acad Nat Sci USA 101 :1455–1460.BIOCHEMISTRYKnight ME, Halpin C, Schuch W (1992) Identification and characterization of cDNAclones encoding cinnamyl alcohol dehydrogenase from tobacco. Plant Mol Biol 19:793-801.

Kulikauskas R, McCormick S (1997) Identification of the tobacco and Arabidopsishomologues of the pollen-expressed LAT59 gene of tomato. Plant Mol Biol 34: 809-814.

Kuvshinov V, Koivu K, Kanerva A, Peh E (2001) Molecular control of transgene escapefrom gentically modified plants. Plant Science 160: 517-522.

Lago C, Clerici E, Dreni L, Horlow C, Caporali E, Colombo L, Kater M (2005) TheArabidopsis TFIID factor AtTAF6 controls pollen tube growth. Dev Biol 285: 91-100.

Lalanne E, Honys D, Johnson A, Borner GH, Lilley KS, Dupree P, Grossniklaus U,Twell D (2004) SETH1 and SETH2, two components of the glycosylphosphatidylinositolanchor biosynthetic pathway, are required for pollen germination and tube growth inArabidopsis. Plant Cell 16: 229-240.

Lalanne E, Michaelidis C, Moore JM, Gagliano W, Johnson A, Patel R, Howden R,Vielle-Calzada JP, Grossniklaus U, Twell D (2004b)Analysis of transposon insertionmutants highlights the diversity of mechanisms underlying male progamic development inArabidopsis. Genetics 167:1975-1986.

Lalanne E, Twell D (2002) Genetic control of male germ unit organization inArabidopsis. Plant Physiol 129: 865-875.

Larsen TA, Goodsell DS, Cascio D, Grzeskowiak K, Dickerson RE (1989) Thestructure of DAPI bound to DNA. J Biomol Struct Dyn 7:477-491.

Legere A (2005) Risks and consequences of gene flow from herbicide-resistant crops:canola (Brassica napus L) as a case study. Pest Manag Sci 61:292-300.

72

Leibfried A, To JP, Busch W, Stehling S, Kehle A, Demar M, Kieber JJ, LohmannJU (2005) WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible response regulators. Nature 438: 1172-1175.

Li L, Cheng XF, Leshkevich J, Umezawa T, Harding SA, Chiang VL (2001) Thelast step of syringyl monolignol biosynthesis in angiosperms is regulated by a novel geneencoding sinapyl alcohol dehydrogenase. Plant Cell 13: 1567–1585.

Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF (1995) Efficient isolation and mappingof Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.Plant J 8: 457-463.

Lord EM (2003) Adhesion and guidance in compatible pollination. J Exp Bot 54: 47–54.

Lord EM, Russell SD (2002) The mechanisms of pollination and fertilization in plants.Annu Rev Cell Dev Biol 18: 81-105.

Luby Jy McNicol R (1995) Gene flow from cultivated to wild raspberries in Scotland:developing a basis for risk assessment for testing and deployment of transgenic cultivars.Theoretical an Applied Genetics 90:1133-1137.

Luna S., Figueroa JM, Baltazar M, Gomez R, Townsend R, Schoper J (2001) Maizepollen longevity and distance isolation requirements for effective pollen control. CropScience 41:1551-1557.

Ma H (2005) Molecular Genetic Analyses of Microsporogenesis and microgametogenesisin Flowering Plants. Annu Rev Plant Biol 56:393-434.

Martin FW (1959) Staining and observing pollen tubes in the style by means offluorescence. Stain Tech 34:125–128.

Mascarenhas JP (1989) The male gametophyte of flowering plants. Plant Cell 1: 657-664.

Mascarenhas JP (1990) Gene activity during pollen development. Annu Rev of PlantPhysiol Plant Mol Biol 41: 317-338.

Matsumoto N, Okada K (2001) A homeobox gene, PRESSED FLOWER, regulates lateralaxis-dependent development of Arabidopsis flowers. Genes Dev 15: 3355-3364.

McCartney (1990) Dispersal mechanisms through air. In Dispersal of AgriculturalHabitats p. 133-158.

McCormick S (1993) Male gametophyte development. Plant Cell 5:1265– 1275.

73

Millar A, Clemens S, Zachgo S, Glibin E, Taylor D (1999) CUT1, an Arabidopsis generequired for cuticular- wax biosynthesis and pollen fertility, encodes a very-long-chainfatty acid condensing enzyme. Plant Cell 11:825-838.

Metz P, Jacobson E, Nap J, Pereira A, Stiekema W (1997) The impact on biosafety ofthe phosphinotricin-tolerance transgene in inter-specific B. rapa x B. napus hybrids antheir succesive backcroses. Theoretical an Applied Genetics 95: 442-450.

Muscietti J, Dircks L, Vancaney G, McCormick S (1994) LAT52 protein is essentialfor tomato pollen development: pollen expressing antisense LAT52 RNA hydrates andgerminates abnormally and cannot achieve fertilization. The Plant J 5:321-338.

Okada T, Sasak Y, Ohta R, Onozuka N, Toriyama K (2000) Expresión of Bra r 1gene in transgenic tobacco ans Bra r 1 promoter activiy in pollen of various plant species.Plant Cell Physiol 41:757-766.

Pagnussat G C1, Yu H, Ngo QA, Rajani S, Mayalagu S , Johnson CS, Capron A,Xie L , Ye D, Sundaresan V (2005) Genetic and molecular identification of genesrequired for female gametophyte development and function in Arabidopsis. Development132: 603-614.

Park SK, Howden R, Twell D (1998) The Arabidopsis thaliana gametophytic mutationgemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate.Development 125:3789-99.

Park SK, Twell D (2001) Nove patterns of ectopic cell plate growth and lipid bodydistribution in the Arabidopsis gemeni pollen1 mutant. Plant Physiology 126: 899-909.

Park SO, Zheng Z, Oppenheimer DG, Hauser BA (2005) The PRETTY FEW SEEDS2gene encodes an Arabidopsis homeodomain protein that regulates ovule development.Development 132: 841-849.

Parton RM, Fischer-Parton S, Trewavas AJ, Watahiki MK (2003) Pollen tubesexhibit regular periodic membrane trafficking events in the absence of apical extension.Journal Cell Sci 116: 2707-2719.

Paxson-Sowders D, Dodrill CH, Heather A, Owen HA, Makaroff CA (2001) DEX1, anovel plant protein, is required for exine pattern formation during pollen development inArabidopsis. Plant Physiol 127:1739–1749.

Prado AM, Porterfield DM, Feijo JA (2004) Nitric oxide is involved in growthregulation and re-orientation of pollen tubes. Development 131: 2707-2714.

Prestridge DS (1991) SIGNAL SCAN: A computer program that scans DNA sequencesfor eukaryotic transcriptional elements. Comut Appl Biosci 7: 203-206

74

Preuss D, Lemieux B, Yen G, Davis RW (1993) A conditional sterile mutation eliminatessurface components from Arabidopsis pollen and disrupts cell signaling duringfertilization. Genes Dev 7: 974-985.

Preuss D, Rhee SY, Davis RW (1994) Tetrad analysis possible in Arabidopsis withmutation of the QUARTET (QRT) genes. Science 264:1458-1460.

Procissi A, Laissardière S, Férault M, Vezon D, Pelletier G, Bonomme S (2001) Fivegametphytic mutations affecting pollen development and pollen tube growth inArabidopsis thaliana. Genetics 158: 1773-1783.

Raes J, Rohde A, Christensen JH, Van de Peer I, Boerjan W (2003) Genome-widecharacterization of the lignification toolbox in Arabidopsis. Plant Physiology 133:1051–1071.

Regan SM, Moffatt BA (1990) Cytochemical analysis of pollen development in wild-type Arabidopsis and a male-sterile mutant. The Plant Cell 2: 877-889.

Rhee SY, Somerville CR (1998) Tetrad pollen formation in quartet mutants ofArabidopsis thaliana is associated with persistence of pectic polysaccharides. Plant J 15:79-88.

Rieger MA, Lamond M, Preston C, Powles SB, Roush RT(2002) Pollen-mediatedmovement of herbicide resistance between commercial canola fields. Science 296: 2386-2388.

Ritala A, Nutila AM, Aikasalo R, Kauppinen V, Tammisola J (2002) Measuring geneflow in the cultivation of the transgenic baley. Crop Science 42:278-285.

Roberts M, Foster G, Blundell R, Robinson S, Kumas A, Draper J, Scott R (1993)Gametophytic and sporophyic expression of an anther specific Arabidopsis thaliana gene.The Plant Journal 3:111-120.

Rognli OA, Nilsson NO, Nurminiemi M (2000) Effects of distanace and pollencompetition on gene fow in the wind-pollinates grass Festuca pratensis Huds. Heredity85:550-560.

Ross KJ, Fransz P, Jones GH (1996) A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsisthaliana. Chromosome Research 4:507-516.

Saeglitz C, Pohl M, Bartsch D (2000) Monitoring gene flow from transgenic beeet usingcytoplasmic male-sterile bait plants. Molecular Ecology 9 :2035-2040.

75

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. A laboratory manual.Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 9.31-9.57.

Sanders PM, Bui AQ, Weterings K, McIntire MN, Hsu Y, Lee PY, Truong MT, VelasTP Goldberg RB (1999) Anther developmental defects in Arabidopsis thaliana male-sterile mutants. Sex Plant Reprod 11:297–322.

Seki M, Narusaka M, Kamiya A, Ishida J, Satou M, Sakurai T, Nakajima M, Enju A,Akiyama K, Oono Y, Muramatsu M, Hayashizaki Y, Kawai J, Carninci P, Itoh M,Ishii Y, Arakawa T, Shibata K, Shinagawa A, Shinozaki K (2002) Functionalannotation of a full-length Arabidopsis cDNA collection. Science 296:141-145.

Skogsmyr (1994) Gene dispersal from transgenic potatoes to conspecifics: a field trialTheoretical an Applied Genetics 88: 770-774.

Smyth DR, Bowman J , Meyerowitz EM (1990) Early flower development inArabidopsis. Cell 2: 755-767 .

Sundaresan V, Springer P, Volpe T, Haward S, Jones JD, Dean C, Ma H,Martienssen R (1995) Patterns of gene action in plant development revealed by enhancertrap and gene trap transposable elements. Genes Dev 9:1797-1810.

Tadeo M, Espinosa A, Solano AM, Martínez R (2001) Esterilidad masculina paraproducir semilla híbrida de maíz. Ciencia y Desarrollo 157:65-75.

Taylor L, Hepler P (1997) Pollen germination and tube growth. Annu Rev Plant PhysiolPlant Mol Biol 48:461–91.

Twell D (2002) Pollen developmental biology. In S.D. O'Neill and J.A. Roberts (eds.)Plant Reproduction. Annual Plant Reviews, Volume 6. Sheffield Academic Press,Sheffield . Pp. 86-153.

Twell D, Park SK, Lalanne E (1998) Asymmetric division and cell fate determination indeveloping pollen. Trends Plant Sci 3: 305–310.

Twell D, Yamaguchi J, McCormick S (1990) Pollen-specific expression in transgenicplants: coordinate regulation of two different promoters during microsporogenesis.Development 109: 705-713.

Twell D, Yamaguchi J, Wing RA, Ushiba J, McCormick S (1991) Promoter analysis ofthree genes that are coordinately expressed during pollen development reveals pollen-specific enhancer sequences and shared regulatory elements. Genes Dev 5: 496-507.

Twell D, Wing RA, Yamaguchi J, McCormick S (1989) Isolation and expression of ananther-specific gene from tomato. Mol Gen Genet 217: 240-245.

76

Vielle-Calzada JP, Thomas J, Spillane C, Coluccio A, Hoeppner MA, Grossniklaus U(1999) Maintenance of genomic imprinting at the Arabidopsis medea locus requireszygotic DDM1 activity. Genes Dev 13:971-982.

Wang T,Li Y, Shi Y, Reboud X, Darmency H, Gressel J (2004) Low frequencytransmission of a plastid-encoded trait in Setaria italica.Theor Appl Genet 108:315-320.

Warwick SI, Simard MJ, Legere A, Beckie HJ, Braun L, Zhu B, Mason P, Seguin-Swartz G, Stewart CN Jr. (2003) Hybridization between transgenic Brassica napus L.and its wild relatives: Brassica rapa L., Raphanus raphanistrum L., Sinapis arvensis L.,and Erucastrum gallicum (Willd.) O.E. Schulz. Theor Appl Genet 107:528-539.

Wilkinson MJ, Elliott LJ, Allainguillaume J, Shaw MW, Norris C, Welters R,Alexander M, Sweet J, Mason DC (2003) Hybridization between Brassica napus and B.rapa on a national scale in the United Kingdom. Science 302:457-459.

Wu X, Dabi T, Weigel D (2005) Requirement of homeobox gene STIMPY/WOX9 forArabidopsis meristem growth and maintenance. Curr Biol 15:436-40.

Xu H, Swoboda I, Bhalla P, Singh MB (1999) Male gametic cell-specific geneexpression in flowering plants. Proc Nat Acad Sci USA 96: 2554-2558.

Xu Z, Dooner HK (2005) The maize aberrant pollen transmission 1 (apt1) gene is aSABRE/KIP homologue required for pollen tube growth. Genetics November 19doi:10.1534/ genetics.105.050237.

Yamada K, Lim J, Dale JM, Chen H, Shinn P, Palm CJ, Southwick AM, Wu HC,Kim C, Nguyen M, Pham P, Cheuk R, Karlin-Newmann G, Liu SX, Lam B, SakanoH, Wu T, Yu G, Miranda M, Quach HL, Tripp M, Chang CH, Lee JM, Toriumi M,Chan MM, Tang CC, Onodera CS, Deng JM, Akiyama K, Ansari Y, Arakawa T,Banh J, Banno F, Bowser L, Brooks S, Carninci P, Chao Q, Choy N, Enju A,Goldsmith AD, Gurjal M, Hansen NF, Hayashizaki Y, Johnson-Hopson C, HsuanVW, Iida K, Karnes M, Khan S, Koesema E, Ishida J, Jiang PX, Jones T, Kawai J,Kamiya A, Meyers C, Nakajima M, Narusaka M, Seki M, Sakurai T, Satou M, TamseR, Vaysberg M, Wallender EK, Wong C, Yamamura Y, Yuan S, Shinozaki K, DavisRW, Theologis A, Ecker JR (2003) Empirical analysis of transcriptional activity in theArabidopsis genome. Science 302:842-846.

Zabaleta E, Heiser V, Grohmann L, Brennicke A (1998) Promoters of nuclear-encodedrespiratory chain complex I genes from Arabidopsis thaliana contain a region essential foranther/pollen-specific expression. Plant J 15: 49-59.

77

IX ANEXOS

ANEXO II 1Lista completa de las líneas analizadas en en rastreo de segregación

LINEAPlántulas sensibles

Plántulas resistentes

Ratio R:S Total de plántulasSensibles

(%)Chi2

MET 57 100 0 0.00 100 100.00

MET 202 100% 0 0.00 1 100.00

MGT 9 100 0 0.00 100 100.00

MENOR A 1 OS OR total

MGT 13 187 2 0.01 189 98.94

MET 61 135 7 0.05 142 95.07

MGT 60 130 31 0.24 161 80.75

MET 50 52 11 0.21 63 82.54

MET 179 29 3 0.10 32 90.63

MET 181 221 139 0.63 360 61.39

MGT 621 41 17 0.41 58 70.69

1:1

MGT 76 127 97 0.76 224 56.70 4.02

76,31 173 200 1.16 373 46.38 1.95

MET 350 288 250 0.87 538 53.53 2.68

MET 41 96 78 0.81 174 55.17 1.86

MET 215 105 114 1.09 219 47.95 0.37

MGT 783 17 22 1.29 39 43.59 0.64

MET 174 37 50 1.35 87 42.53 1.94

MET 92 36 49 1.36 85 42.35 1.99

2:1

*MET 99 48 96 2.00 144 33.33 0.00

MGT 370 48 96 2.00 144 33.33 0.00

MET 379 87 119 1.37 206 42.23 1.00

MET 277 11 21 1.91 32 34.38 2.00

MET 298 71 101 1.42 172 41.28 3.00

MET 344 118 176 1.49 294 40.14 4.00

MET 347 111 174 1.57 285 38.95 4.04

MGT 559 44 88 2.00 132 33.33 0.00

MET 317 88 175 1.99 263 33.46 0.00

MET 377 84 169 2.01 253 33.20 0.00

MGT 451 71 143 2.01 214 33.18 0.00

MGT 817 53 107 2.02 160 33.13 0.00

MGT 341 43 87 2.02 130 33.08 0.00

MGT 830 102 206 2.02 308 33.12 0.01

MGT 500 71 140 1.97 211 33.65 0.01

MGT 258 66 130 1.97 196 33.67 0.01

MET 134 51 104 2.04 155 32.90 0.01

MET 201 51 104 2.04 155 32.90 0.01

MET 512 47 96 2.04 143 32.87 0.01

MET 130 40 78 1.95 118 33.90 0.02

MGT 413 77 151 1.96 228 33.77 0.02

MGT 391 74 151 2.04 225 32.89 0.02

MGT 63 69 141 2.04 210 32.86 0.02

MET 351 7 15 2.14 22 31.82 0.02

MGT 233 62 121 1.95 183 33.88 0.02

MGT 454 61 119 1.95 180 33.89 0.03

*MET 96 53 103 1.94 156 33.97 0.03

MGT 815 89 182 2.04 271 32.84 0.03

MGT 265 45 87 1.93 132 34.09 0.03 2MGT 43 57 118 2.07 175 32.57 0.05

MGT 226 51 106 2.08 157 32.48 0.05

MGT 377 47 98 2.09 145 32.41 0.06

*MET 133 136 265 1.95 401 33.92 0.06

MET 154 43 82 1.91 125 34.40 0.06

MET 150 39 82 2.10 121 32.23 0.07

MGT 603 36 76 2.11 112 32.14 0.07

MGT 293 59 113 1.92 172 34.30 0.07

MET 168 51 107 2.10 158 32.28 0.08

MGT 578 71 148 2.08 219 32.42 0.08

MGT 203 73 140 1.92 213 34.27 0.08

MET 369 79 165 2.09 244 32.38 0.10

MET 358 73 153 2.10 226 32.30 0.11

MET 282 53 112 2.11 165 32.12 0.11

MGT 453 53 112 2.11 165 32.12 0.11

MGT 588 72 151 2.10 223 32.29 0.11

MGT 576 54 102 1.89 156 34.62 0.12

MET 287 52 98 1.88 150 34.67 0.12

MGT 718 65 137 2.11 202 32.18 0.12

MGT 507 47 100 2.13 147 31.97 0.12

MGT 119 50 94 1.88 144 34.72 0.13

MET 143 33 61 1.85 94 35.11 0.13

MET 59 41 88 2.15 129 31.78 0.14

MET 25 20 36 1.80 56 35.71 0.14

MET 137 27 59 2.19 86 31.40 0.15

MET 100 17 38 2.24 55 30.91 0.15

*MET 15 52 111 2.13 163 31.90 0.15

MET 97 16 36 2.25 52 30.77 0.15

MGT 330 36 78 2.17 114 31.58 0.16

MGT 439 49 105 2.14 154 31.82 0.16

MET 152 48 103 2.15 151 31.79 0.16

MGT 352 48 103 2.15 151 31.79 0.16

MGT 442 38 70 1.84 108 35.19 0.17

MGT 58 23 51 2.22 74 31.08 0.17

MGT 638 60 128 2.13 188 31.91 0.17

MGT 591 42 91 2.17 133 31.58 0.18

MGT 214 55 102 1.85 157 35.03 0.20

MET 566 27 60 2.22 87 31.03 0.21

MGT 706 62 133 2.15 195 31.79 0.21

MGT 365 48 104 2.17 152 31.58 0.21

MGT 465 79 148 1.87 227 34.80 0.22

MGT 534 84 179 2.13 263 31.94 0.23

MET 163 28 50 1.79 78 35.90 0.23

MGT 367 42 92 2.19 134 31.34 0.24

MET 148 34 61 1.79 95 35.79 0.26

MET 587 27 61 2.26 88 30.68 0.28

MET 348 76 164 2.16 240 31.67 0.30

MGT 301 63 137 2.17 200 31.50 0.30

MGT 610 50 110 2.20 160 31.25 0.31

MGT 786 60 131 2.18 191 31.41 0.32

MGT 136 57 125 2.19 182 31.32 0.33

MGT 622 68 148 2.18 216 31.48 0.33

MGT 623 68 148 2.18 216 31.48 0.33 3MET 151 37 83 2.24 120 30.83 0.34

MGT 107 73 159 2.18 232 31.47 0.36

MGT 491 72 157 2.18 229 31.44 0.37

MET 153 49 109 2.22 158 31.01 0.38

MGT 356 40 90 2.25 130 30.77 0.38

MET 24 29 50 1.72 79 36.71 0.41

MGT 707 75 164 2.19 239 31.38 0.41

MET 14 23 54 2.35 77 29.87 0.42

MET 575 73 160 2.19 233 31.33 0.42

MET 6 5 14 2.80 19 26.32 0.42

MET 161 35 80 2.29 115 30.43 0.43

MGT 207 59 106 1.80 165 35.76 0.44

MGT 392 51 114 2.24 165 30.91 0.44

MGT 662 11 28 2.55 39 28.21 0.46

MET 501 103 224 2.17 327 31.50 0.50

MGT 345 44 100 2.27 144 30.56 0.50

MET 167 36 83 2.31 119 30.25 0.51

MET 156 51 115 2.25 166 30.72 0.51

MET 309 50 113 2.26 163 30.67 0.52

MET 105 29 49 1.69 78 37.18 0.52

MGT 67 49 111 2.27 160 30.63 0.53

MET 279 34 79 2.32 113 30.09 0.54

MET 248 17 42 2.47 59 28.81 0.54

MGT 100 27 64 2.37 91 29.67 0.55

*MET 20 62 110 1.77 172 36.05 0.57

MGT 244 45 103 2.29 148 30.41 0.57

MGT 604 67 150 2.24 217 30.88 0.59

MGT 239 75 167 2.23 242 30.99 0.60

MGT 555 42 97 2.31 139 30.22 0.61

MET 353 80 178 2.23 258 31.01 0.63

MGT 526 71 159 2.24 230 30.87 0.63

MGT 118 34 80 2.35 114 29.82 0.63

*MET 145 62 140 2.26 202 30.69 0.63

MET 275 52 119 2.29 171 30.41 0.66

MET 9 10 27 2.70 37 27.03 0.66

MGT 213 43 100 2.33 143 30.07 0.69

MET 104 30 72 2.40 102 29.41 0.71

MGT 790 58 101 1.74 159 36.48 0.71

MET 63 62 141 2.27 203 30.54 0.71

MGT 607 12 32 2.67 44 27.27 0.73

MGT 372 40 94 2.35 134 29.85 0.73

MGT 463 45 105 2.33 150 30.00 0.75

MGT 529 38 90 2.37 128 29.69 0.77

MET 250 49 114 2.33 163 30.06 0.79

MET 132 22 55 2.50 77 28.57 0.79

MET 378 69 157 2.28 226 30.53 0.80

MGT 193 36 86 2.39 122 29.51 0.80

MGT 554 36 86 2.39 122 29.51 0.80

MET 524 106 236 2.23 342 30.99 0.84

MET 371 10 28 2.80 38 26.32 0.84

MGT 522 65 149 2.29 214 30.37 0.84

MGT 552 20 51 2.55 71 28.17 0.85

MGT 333 38 91 2.39 129 29.46 0.87 4MET 571 77 175 2.27 252 30.56 0.88

MET 522 19 49 2.58 68 27.94 0.89

MGT 311 37 89 2.41 126 29.37 0.89

MGT 28 52 122 2.35 174 29.89 0.93

MGT 254 56 131 2.34 187 29.95 0.97

MGT 292 108 242 2.24 350 30.86 0.97

MET 552 62 144 2.32 206 30.10 0.97

MGT 366 33 81 2.45 114 28.95 0.99

MET 423 85 194 2.28 279 30.47 1.03

MET 135 41 67 1.63 108 37.96 1.04

MET 565 19 50 2.63 69 27.54 1.04

MET 211 45 108 2.40 153 29.41 1.06

MET 107 30 75 2.50 105 28.57 1.07

MET 342 39 95 2.44 134 29.10 1.08

MGT 532 55 130 2.36 185 29.73 1.08

MGT 21 38 61 1.61 99 38.38 1.14

MET 582 27 69 2.56 96 28.13 1.17

MET 421 87 200 2.30 287 30.31 1.18

MGT 64 61 144 2.36 205 29.76 1.18

MGT 800 60 142 2.37 202 29.70 1.20

MGT 474 19 51 2.68 70 27.14 1.21

MGT 829 82 190 2.32 272 30.15 1.24

MGT 542 29 74 2.55 103 28.16 1.24

*MET 171 157 281 1.79 438 35.84 1.24

MGT 384 15 42 2.80 57 26.32 1.26

MET 225 45 110 2.44 155 29.03 1.29

MGT 709 45 110 2.44 155 29.03 1.29

MGT 23 75 127 1.69 202 37.13 1.31

MGT 340 34 86 2.53 120 28.33 1.35

MGT 469 47 115 2.45 162 29.01 1.36

MGT 490 26 68 2.62 94 27.66 1.36

MET 361 51 124 2.43 175 29.14 1.38

MET 359 56 135 2.41 191 29.32 1.38

MGT 492 50 122 2.44 172 29.07 1.41

MET 176 49 79 1.61 128 38.28 1.41

MGT 685 32 82 2.56 114 28.07 1.42

MGT 309 102 235 2.30 337 30.27 1.43

MET 128 39 98 2.51 137 28.47 1.46

MGT 329 39 98 2.51 137 28.47 1.46

MET 257 34 87 2.56 121 28.10 1.49

MGT 506 38 96 2.53 134 28.36 1.49

MET 118 30 78 2.60 108 27.78 1.50

MGT 481 37 94 2.54 131 28.24 1.53

MET 372 48 119 2.48 167 28.74 1.58

MGT 721 84 198 2.36 282 29.79 1.60

MET 415 39 99 2.54 138 28.26 1.60

MET 476 116 267 2.30 383 30.29 1.60

MGT 347 43 108 2.51 151 28.48 1.60

MGT 493 57 92 1.61 149 38.26 1.62

MET 356 51 126 2.47 177 28.81 1.63

MGT 556 18 51 2.83 69 26.09 1.63

MGT 383 42 106 2.52 148 28.38 1.64

MGT 676 42 106 2.52 148 28.38 1.64 5MGT 408 33 86 2.61 119 27.73 1.68

MGT 574 44 111 2.52 155 28.39 1.71

MGT 307 135 309 2.29 444 30.41 1.71

MGT 359 43 109 2.53 152 28.29 1.74

MGT 592 49 77 1.57 126 38.89 1.75

MGT 455 69 167 2.42 236 29.24 1.78

MGT 536 57 141 2.47 198 28.79 1.84

MET 436 114 266 2.33 380 30.00 1.90

MET 432 68 166 2.44 234 29.06 1.92

MGT 344 34 90 2.65 124 27.42 1.95

MGT 204 49 124 2.53 173 28.32 1.95

MGT 17 53 133 2.51 186 28.49 1.96

MGT 595 78 127 1.63 205 38.05 2.05

MGT 628 35 93 2.66 128 27.34 2.07

MET 228 42 109 2.60 151 27.81 2.07

MGT 719 75 183 2.44 258 29.07 2.11

MGT 608 34 91 2.68 125 27.20 2.12

MET 18 19 56 2.95 75 25.33 2.16

MET 285 36 96 2.67 132 27.27 2.18

MGT 446 39 103 2.64 142 27.46 2.20

*MET 164 58 146 2.52 204 28.43 2.21

MGT 691 61 153 2.51 214 28.50 2.25

MGT 496 31 85 2.74 116 26.72 2.28

MGT 722 73 180 2.47 253 28.85 2.28

MGT 342 44 115 2.61 159 27.67 2.29

MGT 494 55 140 2.55 195 28.21 2.31

MGT 322 33 90 2.73 123 26.83 2.34

MET 254 42 111 2.64 153 27.45 2.38

MET 308 77 123 1.60 200 38.50 2.40

MGT 235 45 118 2.62 163 27.61 2.40

MGT 97 73 181 2.48 254 28.74 2.41

MET 123 41 109 2.66 150 27.33 2.43

MGT 402 55 141 2.56 196 28.06 2.45

MET 102 34 93 2.74 127 26.77 2.46

MGT 354 37 100 2.70 137 27.01 2.47

MET 159 40 107 2.68 147 27.21 2.48

MGT 464 62 157 2.53 219 28.31 2.49

MET 442 57 146 2.56 203 28.08 2.52

MGT 450 60 153 2.55 213 28.17 2.56

MET 270 45 119 2.64 164 27.44 2.56

MET 380 35 96 2.74 131 26.72 2.58

MET 131 38 103 2.71 141 26.95 2.59

MGT 282 63 160 2.54 223 28.25 2.59

MGT 791 63 160 2.54 223 28.25 2.59

MET 530 113 271 2.40 384 29.43 2.64

MET 87 71 111 1.56 182 39.01 2.64

MET 510 64 163 2.55 227 28.19 2.70

MGT 46 39 106 2.72 145 26.90 2.70

MGT 416 52 136 2.62 188 27.66 2.72

MET 439 67 170 2.54 237 28.27 2.73

MGT 116 27 78 2.89 105 25.71 2.74

MGT 206 58 150 2.59 208 27.88 2.78

MGT 287 95 233 2.45 328 28.96 2.82 6MET 365 37 102 2.76 139 26.62 2.82

MET 247 40 109 2.73 149 26.85 2.82

MGT 682 36 100 2.78 136 26.47 2.88

MET 310 61 92 1.51 153 39.87 2.94

MGT 186 34 96 2.82 130 26.15 3.02

MGT 95 56 147 2.63 203 27.59 3.02

MGT 580 75 190 2.53 265 28.30 3.02

MET 264 26 77 2.96 103 25.24 3.03

MET 446 59 88 1.49 147 40.14 3.06

MET 60 33 94 2.85 127 25.98 3.09

MGT 471 44 120 2.73 164 26.83 3.12

MET 126 35 99 2.83 134 26.12 3.14

MGT 346 42 116 2.76 158 26.58 3.24

MGT 818 64 167 2.61 231 27.71 3.29

MET 412 105 259 2.47 364 28.85 3.30

MGT 343 46 126 2.74 172 26.74 3.36

MGT 615 32 93 2.91 125 25.60 3.36

MGT 618 40 112 2.80 152 26.32 3.37

MET 316 89 224 2.52 313 28.43 3.38

MGT 99 68 102 1.50 170 40.00 3.40

MGT 72 48 131 2.73 179 26.82 3.42

MGT 819 129 313 2.43 442 29.19 3.42

MGT 393 39 110 2.82 149 26.17 3.44

MGT 480 39 110 2.82 149 26.17 3.44

MGT 795 67 175 2.61 242 27.69 3.47

MET 523 112 276 2.46 388 28.87 3.48

MGT 398 56 150 2.68 206 27.18 3.50

MET 138 35 101 2.89 136 25.74 3.53

MGT 357 62 164 2.65 226 27.43 3.54

MET 479 69 180 2.61 249 27.71 3.54

MGT 468 76 115 1.51 191 39.79 3.58

MGT 827 75 194 2.59 269 27.88 3.60

MGT 449 34 99 2.91 133 25.56 3.61

MGT 362 36 104 2.89 140 25.71 3.66

MET 199 50 137 2.74 187 26.74 3.66

MET 345 100 156 1.56 256 39.06 3.78

MGT 443 75 112 1.49 187 40.11 3.86

3:1 OS OR total total

MET 54 21 63 3.00 84 25.00 0.00

MET 452 41 150 3.66 191 21.47 1.27

MET 520 69 207 3.00 276 25.00 0.00

MGT 259 8 24 3.00 32 25.00 0.00

MGT 321 27 81 3.00 108 25.00 0.00

MET 418 66 199 3.02 265 24.91 0.00

MGT 720 62 187 3.02 249 24.90 0.00

MGT 6 62 185 2.98 247 25.10 0.00

MET 307 55 164 2.98 219 25.11 0.00

MGT 586 53 158 2.98 211 25.12 0.00

MGT 74 43 130 3.02 173 24.86 0.00

MET 470 41 124 3.02 165 24.85 0.00

MET 165 39 116 2.97 155 25.16 0.00 7MGT 495 37 110 2.97 147 25.17 0.00

MGT 349 36 109 3.03 145 24.83 0.00

MGT 601 27 82 3.04 109 24.77 0.00

MET 400 65 197 3.03 262 24.81 0.01

MGT 276 58 176 3.03 234 24.79 0.01

MGT 467 57 169 2.96 226 25.22 0.01

MET 197 51 151 2.96 202 25.25 0.01

MGT 411 47 139 2.96 186 25.27 0.01

MET 10 10 31 3.10 41 24.39 0.01

MGT 793 39 115 2.95 154 25.32 0.01

MET 286 38 116 3.05 154 24.68 0.01

MGT 452 37 113 3.05 150 24.67 0.01

MGT 642 9 28 3.11 37 24.32 0.01

MGT 195 27 83 3.07 110 24.55 0.01

MET 403 107 317 2.96 424 25.24 0.01

MGT 405 51 150 2.94 201 25.37 0.01

MGT 710 43 126 2.93 169 25.44 0.02

MGT 68 41 126 3.07 167 24.55 0.02

MET 464 73 215 2.95 288 25.35 0.02

MET 213 70 206 2.94 276 25.36 0.02

MGT 624 38 117 3.08 155 24.52 0.02

MGT 579 35 108 3.09 143 24.48 0.02

MET 484 62 190 3.06 252 24.60 0.02

MGT 421 49 151 3.08 200 24.50 0.03

MET 340 27 84 3.11 111 24.32 0.03

MGT 106 27 84 3.11 111 24.32 0.03

MET 80 45 131 2.91 176 25.57 0.03

MGT 459 45 131 2.91 176 25.57 0.03

MGT 475 24 75 3.13 99 24.24 0.03

MET 363 23 72 3.13 95 24.21 0.03

MGT 528 23 72 3.13 95 24.21 0.03

MET 543 73 225 3.08 298 24.50 0.04

MET 529 67 195 2.91 262 25.57 0.05

MET 172 28 88 3.14 116 24.14 0.05

MGT 498 43 134 3.12 177 24.29 0.05

MGT 697 45 130 2.89 175 25.71 0.05

MET 294 15 48 3.20 63 23.81 0.05

MET 120 44 127 2.89 171 25.73 0.05

MET 468 75 218 2.91 293 25.60 0.06

MGT 2 52 150 2.88 202 25.74 0.06

MGT 364 32 101 3.16 133 24.06 0.06

MGT 798 87 253 2.91 340 25.59 0.06

MGT 564 11 36 3.27 47 23.40 0.06

MET 341 59 170 2.88 229 25.76 0.07

MET 370 52 149 2.87 201 25.87 0.08

MGT 249 51 146 2.86 197 25.89 0.08

MET 354 79 228 2.89 307 25.73 0.09

MGT 237 48 137 2.85 185 25.95 0.09

MGT 831 58 182 3.14 240 24.17 0.09

MGT 797 61 175 2.87 236 25.85 0.09

MET 209 60 172 2.87 232 25.86 0.09

MGT 202 31 99 3.19 130 23.85 0.09

MGT 412 44 125 2.84 169 26.04 0.10 8MGT 339 39 124 3.18 163 23.93 0.10

MET 216 42 119 2.83 161 26.09 0.10

MGT 848 50 158 3.16 208 24.04 0.10

MET 551 38 121 3.18 159 23.90 0.10

MGT 812 51 145 2.84 196 26.02 0.11

MGT 378 47 149 3.17 196 23.98 0.11

MGT 651 50 142 2.84 192 26.04 0.11

MET 178 46 146 3.17 192 23.96 0.11

MGT 335 34 109 3.21 143 23.78 0.11

*MET 8 138 428 3.10 566 24.38 0.12

MGT 417 54 171 3.17 225 24.00 0.12

MGT 358 32 103 3.22 135 23.70 0.12

MET 121 38 122 3.21 160 23.75 0.13

MET 364 28 91 3.25 119 23.53 0.14

MGT 390 51 144 2.82 195 26.15 0.14

MGT 808 65 206 3.17 271 23.99 0.15

MGT 789 76 240 3.16 316 24.05 0.15

MGT 702 40 129 3.23 169 23.67 0.16

MGT 503 54 152 2.81 206 26.21 0.16

MGT 355 38 123 3.24 161 23.60 0.17

MGT 657 28 92 3.29 120 23.33 0.18

MGT 648 32 105 3.28 137 23.36 0.20

MET 401 73 233 3.19 306 23.86 0.21

MGT 530 36 118 3.28 154 23.38 0.22

MGT 217 75 211 2.81 286 26.22 0.23

MGT 637 11 39 3.55 50 22.00 0.24

MGT 700 20 68 3.40 88 22.73 0.24

MGT 371 25 84 3.36 109 22.94 0.25

MET 494 68 190 2.79 258 26.36 0.25

MGT 52 19 65 3.42 84 22.62 0.25

MET 407 10 36 3.60 46 21.74 0.26

MGT 332 56 155 2.77 211 26.54 0.27

MGT 66 49 160 3.27 209 23.44 0.27

MET 417 93 262 2.82 355 26.20 0.27

MET 409 65 210 3.23 275 23.64 0.27

MET 589 13 46 3.54 59 22.03 0.28

MET 301 27 91 3.37 118 22.88 0.28

MGT 630 69 192 2.78 261 26.44 0.29

MGT 20 60 166 2.77 226 26.55 0.29

MGT 686 60 166 2.77 226 26.55 0.29

MET 162 36 120 3.33 156 23.08 0.31

MET 453 42 139 3.31 181 23.20 0.31

MGT 620 35 117 3.34 152 23.03 0.32

MGT 438 29 98 3.38 127 22.83 0.32

MGT 473 54 148 2.74 202 26.73 0.32

MET 567 69 224 3.25 293 23.55 0.33

MGT 715 75 208 2.77 283 26.50 0.34

MGT 369 37 124 3.35 161 22.98 0.35

MGT 400 37 124 3.35 161 22.98 0.35

MET 499 26 89 3.42 115 22.61 0.35

MGT 695 64 209 3.27 273 23.44 0.35

MGT 501 31 105 3.39 136 22.79 0.35

MET 458 98 274 2.80 372 26.34 0.36 9MGT 385 61 167 2.74 228 26.75 0.37

MGT 476 29 99 3.41 128 22.66 0.38

MET 160 19 67 3.53 86 22.09 0.39

MET 542 73 200 2.74 273 26.74 0.44

MET 461 96 266 2.77 362 26.52 0.45

MET 455 33 113 3.42 146 22.60 0.45

MGT 656 32 110 3.44 142 22.54 0.46

MGT 379 37 126 3.41 163 22.70 0.46

MGT 328 19 68 3.58 87 21.84 0.46

MGT 461 35 120 3.43 155 22.58 0.48

MGT 396 40 136 3.40 176 22.73 0.48

MET 98 30 104 3.47 134 22.39 0.49

MET 114 34 117 3.44 151 22.52 0.50

MET 433 72 196 2.72 268 26.87 0.50

MGT 814 69 187 2.71 256 26.95 0.52

MGT 799 73 198 2.71 271 26.94 0.54

MGT 240 45 154 3.42 199 22.61 0.60

MGT 315 40 138 3.45 178 22.47 0.61

MET 420 84 228 2.71 312 26.92 0.62

MET 553 48 164 3.42 212 22.64 0.63

MET 483 47 161 3.43 208 22.60 0.64

MET 539 78 210 2.69 288 27.08 0.67

MET 223 28 100 3.57 128 21.88 0.67

MGT 668 36 126 3.50 162 22.22 0.67

MGT 824 44 152 3.45 196 22.45 0.68

MET 297 20 74 3.70 94 21.28 0.70

MET 196 75 201 2.68 276 27.17 0.70

MGT 531 68 181 2.66 249 27.31 0.71

MGT 434 26 94 3.62 120 21.67 0.71

MET 419 84 226 2.69 310 27.10 0.73

MGT 308 71 239 3.37 310 22.90 0.73

MET 545 70 186 2.66 256 27.34 0.75

MGT 246 53 182 3.43 235 22.55 0.75

MET 258 35 124 3.54 159 22.01 0.76

MGT 661 34 121 3.56 155 21.94 0.78

MGT 382 33 118 3.58 151 21.85 0.80

MET 573 71 188 2.65 259 27.41 0.80

MGT 650 32 115 3.59 147 21.77 0.82

MET 577 74 196 2.65 270 27.41 0.83

MET 482 80 212 2.65 292 27.40 0.89

MET 441 78 206 2.64 284 27.46 0.92

MGT 813 64 220 3.44 284 22.54 0.92

MET 445 88 234 2.66 322 27.33 0.93

MGT 688 33 120 3.64 153 21.57 0.96

MET 68 36 130 3.61 166 21.69 0.97

MET 155 107 358 3.35 465 23.01 0.98

MGT 525 32 117 3.66 149 21.48 0.99

MET 116 34 124 3.65 158 21.52 1.02

MET 574 40 144 3.60 184 21.74 1.04

MET 149 24 91 3.79 115 20.87 1.05

MET 536 82 282 3.44 364 22.53 1.19

MGT 419 31 116 3.74 147 21.09 1.20

MET 234 47 169 3.60 216 21.76 1.21 10MGT 843 77 199 2.58 276 27.90 1.24

MET 489 41 150 3.66 191 21.47 1.27

MGT 466 49 178 3.63 227 21.59 1.41

MET 129 25 98 3.92 123 20.33 1.43

MET 122 42 156 3.71 198 21.21 1.52

MGT 645 32 123 3.84 155 20.65 1.57

*MGT 224 204 552 2.71 756 26.98 1.59

MGT 380 50 184 3.68 234 21.37 1.65

MGT 853 38 144 3.79 182 20.88 1.65

MET 338 133 349 2.62 482 27.59 1.73

MET 490 73 261 3.58 334 21.86 1.76

MGT 397 48 179 3.73 227 21.15 1.80

MET 508 64 234 3.66 298 21.48 1.97

MET 214 41 161 3.93 202 20.30 2.38

MET 469 74 274 3.70 348 21.26 2.59

MET 383 51 200 3.92 251 20.32 2.93

MGT 828 131 327 2.50 458 28.60 3.17

3:1<x<15:1 OS OR ratio total

MET 16 13 52 4.00 65 20.00

MET 207 52 208 4.00 260 20.00

MGT 351 2 8 4.00 10 20.00

MGT 489 10 40 4.00 50 20.00

MGT 649 34 136 4.00 170 20.00

MET 374 16 65 4.06 81 19.75

MET 493 54 220 4.07 274 19.71

MET 585 13 53 4.08 66 19.70

MET 296 23 94 4.09 117 19.66

MGT 242 34 139 4.09 173 19.65

MGT 73 39 160 4.10 199 19.60

MGT 407 22 91 4.14 113 19.47

MET 173 24 100 4.17 124 19.35

MGT 675 22 92 4.18 114 19.30

MGT 360 16 67 4.19 83 19.28

MGT 646 41 172 4.20 213 19.25

MET 300 25 105 4.20 130 19.23

MGT 428 40 168 4.20 208 19.23

MET 517 36 152 4.22 188 19.15

MGT 404 48 204 4.25 252 19.05

MGT 665 19 81 4.26 100 19.00

MGT 692 34 145 4.26 179 18.99

MET 109 7 30 4.29 37 18.92

MGT 539 10 43 4.30 53 18.87

MGT 109 22 95 4.32 117 18.80

MET 515 46 199 4.33 245 18.78

MGT 219 25 109 4.36 134 18.66

MGT 672 25 109 4.36 134 18.66

MGT 546 27 118 4.37 145 18.62

MGT 796 54 236 4.37 290 18.62

MET 53 8 35 4.38 43 18.60

MGT 368 35 155 4.43 190 18.42

MGT 609 28 124 4.43 152 18.42

MET 562 23 102 4.43 125 18.40

MET 475 54 240 4.44 294 18.37 11MGT 103 38 169 4.45 207 18.36

MGT 605 20 89 4.45 109 18.35

MET 537 71 318 4.48 389 18.25

MET 544 24 108 4.50 132 18.18

MET 251 33 149 4.52 182 18.13

MGT 281 44 199 4.52 243 18.11

MET 117 24 109 4.54 133 18.05

MET 124 18 82 4.56 100 18.00

MGT 374 18 82 4.56 100 18.00

MGT 245 35 160 4.57 195 17.95

MGT 681 17 78 4.59 95 17.89

MGT 427 35 161 4.60 196 17.86

MET 1 8 37 4.63 45 17.78

MGT 248 38 176 4.63 214 17.76

MGT 399 25 116 4.64 141 17.73

MET 373 13 61 4.69 74 17.57

MET 497 46 218 4.74 264 17.42

MET 94 12 57 4.75 69 17.39

MGT 325 32 152 4.75 184 17.39

MGT 420 25 120 4.80 145 17.24

MET 488 53 257 4.85 310 17.10

MET 460 47 232 4.94 279 16.85

MGT 660 21 104 4.95 125 16.80

MET 268 29 145 5.00 174 16.67

MET 320 12 60 5.00 72 16.67

MGT 550 6 30 5.00 36 16.67

MGT 693 8 40 5.00 48 16.67

MGT 852 21 105 5.00 126 16.67

MGT 435 20 101 5.05 121 16.53

MGT 488 17 86 5.06 103 16.50

MET 538 44 224 5.09 268 16.42

MET 180 7 36 5.14 43 16.28

MGT 410 21 112 5.33 133 15.79

MGT 294 30 162 5.40 192 15.63

MGT 640 18 99 5.50 117 15.38

MGT 644 17 96 5.65 113 15.04

MET 486 53 303 5.72 356 14.89

MET 140 23 132 5.74 155 14.84

MET 534 48 276 5.75 324 14.81

MGT 187 16 92 5.75 108 14.81

MET 519 77 453 5.88 530 14.53

MET 157 20 118 5.90 138 14.49

MET 422 50 298 5.96 348 14.37

MGT 713 28 167 5.96 195 14.36

MET 221 1 6 6.00 7 14.29

MET 280 15 90 6.00 105 14.29

MGT 251 3 18 6.00 21 14.29

MGT 394 22 132 6.00 154 14.29

MGT 524 33 198 6.00 231 14.29

MET 42 13 80 6.15 93 13.98

MET 217 13 80 6.15 93 13.98

MGT 457 18 111 6.17 129 13.95

MET 560 22 136 6.18 158 13.92 12MGT 263 21 130 6.19 151 13.91

MET 302 26 162 6.23 188 13.83

MET 175 14 88 6.29 102 13.73

MGT 694 17 109 6.41 126 13.49

MGT 386 29 191 6.59 220 13.18

MGT 334 20 132 6.60 152 13.16

MGT 297 50 336 6.72 386 12.95

MET 141 15 101 6.73 116 12.93

MGT 557 5 34 6.80 39 12.82

MET 467 31 211 6.81 242 12.81

MET 219 16 109 6.81 125 12.80

MET 304 12 82 6.83 94 12.77

MGT 426 13 89 6.85 102 12.75

MGT 647 18 124 6.89 142 12.68

MET 394 37 255 6.89 292 12.67

MET 303 13 91 7.00 104 12.50

MGT 25 20 142 7.10 162 12.35

MET 478 45 325 7.22 370 12.16

MGT 389 13 94 7.23 107 12.15

MET 521 30 220 7.33 250 12.00

MET 498 29 213 7.34 242 11.98

MGT 256 11 81 7.36 92 11.96

MET 472 5 37 7.40 42 11.90

MET 21 7 52 7.43 59 11.86

MET 147 14 104 7.43 118 11.86

MET 492 23 174 7.57 197 11.68

MGT 280 14 106 7.57 120 11.67

MET 299 13 99 7.62 112 11.61

MGT 223 14 107 7.64 121 11.57

MGT 633 19 148 7.79 167 11.38

MET 506 61 486 7.97 547 11.15

MGT 483 24 193 8.04 217 11.06

MGT 833 21 169 8.05 190 11.05

MGT 444 10 81 8.10 91 10.99

MGT 582 25 205 8.20 230 10.87

MET 456 41 340 8.29 381 10.76

MGT 327 14 117 8.36 131 10.69

MGT 218 16 137 8.56 153 10.46

MET 232 16 139 8.69 155 10.32

MET 95 10 87 8.70 97 10.31

MGT 570 10 87 8.70 97 10.31

MGT 337 14 124 8.86 138 10.14

MET 256 12 108 9.00 120 10.00

MGT 336 14 128 9.14 142 9.86

MGT 677 12 110 9.17 122 9.84

MET 108 11 101 9.18 112 9.82

MET 546 10 93 9.30 103 9.71

MET 158 13 121 9.31 134 9.70

MET 119 13 122 9.38 135 9.63

MGT 699 13 122 9.38 135 9.63

MGT 458 18 172 9.56 190 9.47

MET 2 3 29 9.67 32 9.38

MGT 277 10 97 9.70 107 9.35 13MGT 571 16 157 9.81 173 9.25

MGT 598 11 108 9.82 119 9.24

MGT 698 13 130 10.00 143 9.09

MGT 456 15 154 10.27 169 8.88

MGT 194 7 73 10.43 80 8.75

MGT 363 13 139 10.69 152 8.55

MGT 387 13 139 10.69 152 8.55

MGT 373 11 119 10.82 130 8.46

MGT 406 12 133 11.08 145 8.28

MGT 221 15 168 11.20 183 8.20

MGT 497 10 118 11.80 128 7.81

MGT 47 8 95 11.88 103 7.77

MGT 602 8 95 11.88 103 7.77

MGT 804 21 250 11.90 271 7.75

MGT 639 12 147 12.25 159 7.55

MGT 725 12 153 12.75 165 7.27

MGT 262 9 117 13.00 126 7.14

MGT 825 15 200 13.33 215 6.98

MGT 821 16 214 13.38 230 6.96

MGT 424 9 121 13.44 130 6.92

MGT 320 17 230 13.53 247 6.88

MGT 801 16 221 13.81 237 6.75

MGT 802 16 224 14.00 240 6.67

MGT 422 8 113 14.13 121 6.61

MGT 215 7 100 14.29 107 6.54

MGT 350 7 100 14.29 107 6.54

MGT 788 14 200 14.29 214 6.54

MGT 261 6 86 14.33 92 6.52

MGT 331 9 130 14.44 139 6.47

MGT 663 10 146 14.60 156 6.41

MGT 505 7 104 14.86 111 6.31

15:1 OS OR total

MGT 634 7 105 15.00 112 6.25

MGT 701 1 15 15.00 16 6.25

MGT 88 10 157 15.70 167 5.99

MET 541 20 300 15.00 320 6.25

MET 305 8 123 15.38 131 6.11

MET 474 13 200 15.38 213 6.10

63:1 OS OR total

MET 3 190 63.33 193 1.55

OTROS

MET 127 11 110 10.00 121 9.09

MET 507 37 420 11.35 457 8.10

MET 182 28 330 11.79 358 7.82

MET 443 21 211 10.05 232 9.05

MET 596 21 226 10.76 247 8.50

MET 491 18 266 14.78 284 6.34

MET 278 15 154 10.27 169 8.88

MET 233 15 193 12.87 208 7.21

MET 185 14 196 14.00 210 6.67

MET 525 14 293 20.93 307 4.56

MET 231 13 145 11.15 158 8.23

MET 459 13 315 24.23 328 3.96 14MET 481 13 365 28.08 378 3.44

MET 226 12 131 10.92 143 8.39

MET 362 12 138 11.50 150 8.00

MET 471 11 118 10.73 129 8.53

MGT 430 11 177 16.09 188 5.85

MET 177 11 178 16.18 189 5.82

MET 578 11 182 16.55 193 5.70

MET 40 10 107 10.70 117 8.55

MGT 326 10 200 20.00 210 4.76

MET 115 9 126 14.00 135 6.67

MET 103 9 129 14.33 138 6.52

MGT 24 9 144 16.00 153 5.88

MET 465 9 162 18.00 171 5.26

MGT 401 9 167 18.56 176 5.11

MET 500 9 180 20.00 189 4.76

MGT 842 9 190 21.11 199 4.52

MET 205 9 199 22.11 208 4.33

MGT 98 9 200 22.22 209 4.31

MGT 4 8 128 16.00 136 5.88

MET 495 8 130 16.25 138 5.80

MGT 86 8 138 17.25 146 5.48

MGT 196 8 144 18.00 152 5.26

MET 568 8 150 18.75 158 5.06

MGT 197 8 156 19.50 164 4.88

MGT 54 8 164 20.50 172 4.65

MGT 299 8 236 29.50 244 3.28

MGT 361 7 113 16.14 120 5.83

MET 49 7 115 16.43 122 5.74

MET 261 7 120 17.14 127 5.51

MGT 584 7 121 17.29 128 5.47

MET 71 7 147 21.00 154 4.55

MGT 687 7 151 21.57 158 4.43

MGT 12 7 152 21.71 159 4.40

MET 425 7 196 28.00 203 3.45

MGT 83 7 204 29.14 211 3.32

MET 51 6 62 10.33 68 8.82

MGT 255 6 100 16.67 106 5.66

MET 111 6 112 18.67 118 5.08

MET 579 6 113 18.83 119 5.04

MGT 338 6 120 20.00 126 4.76

MGT 324 6 125 20.83 131 4.58

MGT 31 6 152 25.33 158 3.80

MET 252 6 156 26.00 162 3.70

MGT 205 6 181 30.17 187 3.21

MGT 540 6 221 36.83 227 2.64

MET 52 5 86 17.20 91 5.49

MET 253 5 90 18.00 95 5.26

MGT 115 5 91 18.20 96 5.21

MGT 199 5 106 21.20 111 4.50

MET 144 5 128 25.60 133 3.76

MGT 268 5 139 27.80 144 3.47

MET 110 5 139 27.80 144 3.47

MGT 409 5 149 29.80 154 3.25 15MGT 431 5 166 33.20 171 2.92

MET 200 5 209 41.80 214 2.34

MGT 19 5 222 44.40 227 2.20

MET 408 5 250 50.00 255 1.96

MET 533 5 267 53.40 272 1.84

MGT 619 4 92 23.00 96 4.17

MGT 53 4 97 24.25 101 3.96

MGT 104 4 118 29.50 122 3.28

MGT 91 4 120 30.00 124 3.23

MGT 792 4 120 30.00 124 3.23

MET 184 4 123 30.75 127 3.15

MET 238 4 143 35.75 147 2.72

MGT 61 4 190 47.50 194 2.06

MET 457 4 200 50.00 204 1.96

100%R

MET 22 3 33 11.00 36 8.33

MET 58 3 51 17.00 54 5.56

MGT 71 3 95 31.67 98 3.06

MGT 120 3 101 33.67 104 2.88

MET 125 3 109 36.33 112 2.68

MET 106 3 110 36.67 113 2.65

MGT 55 3 116 38.67 119 2.52

MET 139 3 122 40.67 125 2.40

MET 267 3 126 42.00 129 2.33

MGT 295 3 131 43.67 134 2.24

MET 586 3 134 44.67 137 2.19

MGT 94 3 143 47.67 146 2.05

MGT 225 3 150 50.00 153 1.96

MGT 75 3 154 51.33 157 1.91

MGT 182 3 161 53.67 164 1.83

MGT 436 3 162 54.00 165 1.82

MGT 96 3 164 54.67 167 1.80

MGT 62 3 170 56.67 173 1.73

MGT 587 3 192 64.00 195 1.54

MGT 33 3 202 67.33 205 1.46

MET 46 2 37 18.50 39 5.13

MET 112 2 37 18.50 39 5.13

MET 12 2 51 25.50 53 3.77

MGT 678 2 52 26.00 54 3.70

MGT 841 2 60 30.00 62 3.23

MET 203 2 87 43.50 89 2.25

MGT 323 2 108 54.00 110 1.82

MGT 227 2 120 60.00 122 1.64

MET 227 2 122 61.00 124 1.61

MGT 70 2 147 73.50 149 1.34

MGT 184 2 149 74.50 151 1.32

MGT 222 2 164 82.00 166 1.20

MGT 56 2 167 83.50 169 1.18

MGT 448 2 174 87.00 176 1.14

MGT 784 2 200 100.00 202 0.99

MET 222 1 32 32.00 33 3.03

MGT 572 1 51 51.00 52 1.92

MGT 670 1 84 84.00 85 1.18 16MGT 22 1 90 90.00 91 1.10

MGT 353 1 118 118.00 119 0.84

MGT 271 1 130 130.00 131 0.76

MGT 577 1 200 200.00 201 0.50

MET 271 2 139 69.50 141 1.42

MET 402 3 212 70.67 215 1.40

MET 395 3 251 83.67 254 1.18

MET 406 2 200 100.00 202 0.99

MET 561 1 100 100.00 101 0.99

MET 404 2 212 106.00 214 0.93

MET 136 1 118 118.00 119 0.84

MET 274 1 119 119.00 120 0.83

MET 295 1 120 120.00 121 0.83

MET 198 1 135 135.00 136 0.74

MET 194 1 137 137.00 138 0.72

MET 229 1 140 140.00 141 0.71

MET 511 1 200 200.00 201 0.50

MET 527 1 200 200.00 201 0.50

MET 5 1 100% 1.00 2 50.00

MET 505 1 250 250.00 251 0.40

MET 44 0 100% 100.00 1 0.00

MET 45 0 100% 100.00 1 0.00

MET 47 0 100% 100.00 1 0.00

MET 48 0 29 100.00 29 0.00

MET 66 0 100% 100.00 1 0.00

MET 69 0 100% 100.00 1 0.00

MET 73 0 100% 100.00 1 0.00

MET 74 0 100% 100.00 1 0.00

MET 101 0 100% 100.00 1 0.00

MET 113 0 100% 100.00 1 0.00

MET 142 0 100% 100.00 1 0.00

MET 146 0 100% 100.00 1 0.00

MET 166 0 100% 100.00 1 0.00

MET 204 0 100% 100.00 1 0.00

MET 208 0 100% 100.00 1 0.00

MET 220 0 100% 100.00 1 0.00

MET 224 0 100% 100.00 1 0.00

MET 230 0 100% 100.00 1 0.00

MET 235 0 100% 100.00 1 0.00

MET 245 0 100% 100.00 1 0.00

MET 246 0 100% 100.00 1 0.00

MET 249 0 100% 100.00 1 0.00

MET 255 0 100% 100.00 1 0.00

MET 259 0 100% 100.00 1 0.00

MET 260 0 100% 100.00 1 0.00

MET 262 0 100% 100.00 1 0.00

MET 263 0 91 100.00 91 0.00

MET 265 0 100% 100.00 1 0.00

MET 266 0 100% 100.00 1 0.00

MET 273 0 100% 100.00 1 0.00

MET 276 0 100% 100.00 1 0.00

MET 281 0 100% 100.00 1 0.00

MET 283 0 100% 100.00 1 0.00 17MET 314 0 100% 100.00 1 0.00

MET 315 0 100% 100.00 1 0.00

MET 343 0 100% 100.00 1 0.00

MET 352 0 100% 100.00 1 0.00

MET 366 0 100% 100.00 1 0.00

MET 392 0 100% 100.00 1 0.00

MET 393 0 100% 100.00 1 0.00

MET 396 0 100% 100.00 1 0.00

MET 397 0 100% 100.00 1 0.00

MET 398 0 100% 100.00 1 0.00

MET 399 0 100% 100.00 1 0.00

MET 405 0 100% 100.00 1 0.00

MET 411 0 100% 100.00 1 0.00

MET 413 0 100% 100.00 1 0.00

MET 416 0 100% 100.00 1 0.00

MET 426 0 100% 100.00 1 0.00

MET 435 0 100% 100.00 1 0.00

MET 438 0 100% 100.00 1 0.00

MET 444 0 100% 100.00 1 0.00

MET 447 0 100% 100.00 1 0.00

MET 448 0 100% 100.00 1 0.00

MET 451 0 100% 100.00 1 0.00

MET 454 0 100% 100.00 1 0.00

MET 463 0 100% 100.00 1 0.00

MET 466 0 100% 100.00 1 0.00

MET 473 0 100% 100.00 1 0.00

MET 477 0 100% 100.00 1 0.00

MET 480 0 100% 100.00 1 0.00

MET 485 0 100% 100.00 1 0.00

MET 487 0 100% 100.00 1 0.00

MET 496 0 100% 100.00 1 0.00

MET 502 0 100% 100.00 1 0.00

MET 504 0 100% 100.00 1 0.00

MET 509 0 100% 100.00 1 0.00

MET 513 0 100% 100.00 1 0.00

MET 514 0 100% 100.00 1 0.00

MET 516 0 100% 100.00 1 0.00

MET 518 0 100% 100.00 1 0.00

MET 526 0 100% 100.00 1 0.00

MET 528 0 100% 100.00 1 0.00

MET 531 0 100% 100.00 1 0.00

MET 532 0 100% 100.00 1 0.00

MET 548 0 100% 100.00 1 0.00

MET 550 0 100% 100.00 1 0.00

MET 555 0 100% 100.00 1 0.00

MET 558 0 100% 100.00 1 0.00

MET 563 0 100% 100.00 1 0.00

MET 570 0 100% 100.00 1 0.00

MET 572 0 100% 100.00 1 0.00

MET 580 0 100% 100.00 1 0.00

MET 583 0 100% 100.00 1 0.00

MET 584 0 100% 100.00 1 0.00

MET 588 0 100% 100.00 1 0.00 18MET 306 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 1 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 3 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 5 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 14 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 30 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 37 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 39 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 59 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 65 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 69 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 77 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 78 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 80 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 81 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 82 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 93 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 105 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 180 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 236 0 100% 100.00 1

MGT 241 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 247 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 260 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 264 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 266 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 275 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 278 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 283 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 284 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 285 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 288 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 289 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 300 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 302 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 314 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 316 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 318 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 319 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 376 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 403 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 414 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 415 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 418 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 423 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 425 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 429 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 432 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 433 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 440 0 100 100.00 100 0.00

MGT 441 0 100 100.00 100 0.00

MGT 445 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 447 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 470 0 100% 100.00 1 0.00 19MGT 477 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 478 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 479 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 484 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 485 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 499 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 504 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 514 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 527 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 545 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 547 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 548 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 549 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 568 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 569 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 573 0 11 100.00 11 0.00

MGT 581 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 583 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 585 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 596 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 599 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 606 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 612 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 613 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 616 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 617 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 627 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 635 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 641 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 643 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 652 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 664 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 696 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 703 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 704 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 708 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 711 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 714 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 716 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 724 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 726 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 787 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 803 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 806 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 807 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 809 0 100 100.00 100 0.00

MGT 810 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 811 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 816 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 820 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 822 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 823 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 826 0 100% 100.00 1 0.00 20MGT 832 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 834 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 836 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 838 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 839 0 100% 100.00 1 0.00

MGT 847 0 100% 100.00 1 0.00

ANEXO III Datos de segregación de la progenie de MGT 76

Segregación de 36 plantas heteocigotas, progenie de MGT76 para segregar las inserciones MGT76 F4

No. sensibles

No. resistentes

Ratio R:S

χ2

χ2<3.841(1) 0.05

MGT76-31 44 56 1:1 1.4400 MGT76-1 29 58 2:1 0.0000 MGT76-2 28 57 2:1 0.0059 MGT76-3 27 67 2:1 0.8989 MGT76-4 23 56 2:1 0.6329 MGT76-5 20 52 2:1 1.0000 MGT76-6 28 81 2:1 2.8670 MGT76-7 27 56 2:1 0.0241 MGT76-10 30 70 2:1 0.5000 MGT76-11 31 50 2:1 0.8889 MGT76-12 32 59 2:1 0.1374 MGT76-13 17 36 2:1 0.0377 MGT76-14 23 52 2:1 0.2400 MGT76-15 21 54 2:1 0.9600 MGT76-16 30 47 2:1 1.0974 MGT76-17 21 43 2:1 0.0078 MGT76-19 22 61 2:1 1.7410 MGT76-20 21 46 2:1 0.1194 MGT76-21 33 61 2:1 0.1330 MGT76-22 33 73 2:1 0.2311 MGT76-23 20 54 2:1 1.3243 MGT76-24 23 59 2:1 1.0305 MGT76-25 22 50 2:1 0.2500 MGT76-26 32 59 2:1 0.1374 MGT76-27 54 85 2:1 1.9029 MGT76-28 27 70 2:1 1.3196 MGT76-29 19 34 2:1 0.1509 MGT76-30 27 65 2:1 0.6576 MGT76-32 38 66 2:1 0.4808 MGT76-33 12 35 2:1 1.2872 MGT76-34 20 43 2:1 0.0714 MGT76-36 18 36 2:1 0.0000 MGT76-37 71 168 2:1 1.4142 MGT76-8 21 75 3:1 0.5000 MGT76-9 13 48 3:1 0.4426 MGT76-18 17 88 5:1 0.9524

The homeobox gene TEPITZIN1/WOX5 is required for

pollen tube growth in Arabidopsis.

Ana Elena Dorantes-Acosta and Jean-Philippe Vielle-Calzada*

Laboratory of Reproductive Development and Apomixis

Department of Genetic Engineering and

National Genomic Laboratory for Biodiversity – Langebio

Cinvestav- Campus Guanajuato

Km 9.6 Libramiento Norte Carretera Irapuato – León

Apartado Postal 629

CP 36500 Irapuato, Gto. México.

* Corresponding Author:

vielle@ira.cinvestav.mx

Tel. 52 462 623 96 34

Fax 52 462 624 58 49

2

Abstract

The WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) gene family of Arabidopsis thaliana transcription

factors is composed of at least 15 members encoding homeodomain proteins. We have

characterized TEPITZIN1 (also called WOX5), a homeobox gene required for pollen tube

growth. Heterozygous tpz1 individuals do not have defects in vegetative growth or female

reproductive development but exhibit aberrant pollen transmission, suggesting that this

loss-of-function mutation acts at the gametophytic level. Previous reports have indicated

that WOX5 is expressed in developing embryos and induced in seedlings after auxin

treatment. Here we show that WOX5 is abundantly expressed in mature pollen grains and

elongating pollen tubes. WOX5-deficient pollen grains did not show developmental

abnormalities and germinated at a frequency similar to wild-type pollen; however, in vitro

and in vivo germination of pollen from tpz1 heterozygous individuals produced pollen tubes

showing delayed germination and reduced length, confirming that the male gametophytic

expression of WOX5 is essential for pollen tube elongation. The reduction in average pollen

tube length produced by the absence of WOX5 activity is less severe when heterozygous

tpz1 individuals are in a homozygous qrt1 background, indicating that the absence of QRT1

activity partially compensates WOX5-deficient pollen tube elongation. Our findings suggest

that WOX5 identifies a new genetic pathway integrating homeobox transcription factors and

auxin-mediated signals with the progamic phase of plant reproduction.

Keywords: Arabidopsis, pollen development, WOX5, distorted segregation, gametogenesis

3

INTRODUCTION

Sexual reproduction in flowering plants requires the formation of male and female gametes

that develop in specialized reproductive organs within the flower. Unlike multicellular

animals where gamete differentiation occurs immediately following meiosis, haploid

gamete precursors undergo several rounds of mitotic divisions before differentiating into

male or female gametes (McCormick,1993; Chen and McCormick, 1996) . During male

gametogenesis, all four products of meiosis undergo two round of mitotic divisions and

give rise to a tricellular male gametophyte. In many species including Arabidopsis thaliana,

these mitotic divisions occur in the male reproductive organ (the anther) prior to

pollination, and result in the formation of a tricellular pollen grain composed of a

conspicuous vegetative cell and two smaller sperm cells (Lalanne and Twell, 2002; Twell et

al., 1998). After the pollen grain is released from the anther, it is eventually carried to the

stigma of a compatible pistil, where it germinates and extrudes a pollen tube that invades

the stigmatic tissue, penetrates the style through the transmitting tract an ultimately delivers

two sperm cells into the female gametophyte to undergo double fertilization (Pruitt, 1999;

Johnson and Preuss, 2002; Lord, 2003).

Pollen tube elongation is dependent on Golgi-derived vesicles that traffic between the

apoplast and the plasma membrane at the tip of the tube (Taylor and Hepler, 1997; Parton

et al., 2003, Cheung et al., 2002). Many of the cellular components found to regulate pollen

tube growth and guidance have been associated with mechanisms that act within the pistil

(Edlund et al., 2004). In addition to lipids (Preuss et al.,1993) and calmodulin binding

proteins (Golovkin and Reddy, 2003), other lipophilic molecules and pollen-coat proteins

(Lord and Russell, 2002; Mayfield et al., 2001) are important for pollen germination. The

oscillatory activity of ROP GTPases through actin-dependent processes has been also

shown to influence pollen tube growth (Hwang et al., 2005). Whereas pectins of the pollen

tube wall are presumed to be essential for controlling internal turgor pressure and support

polarized tip growth (Bosch and Hepler, 2005), pectin methylesterases represent important

regulators of tube elongation (Bosch et al., 2005). Some additional cellular factors acting at

the male gametophytic level have been also shown to be important for pollen tube growth.

4

A large-scale genetic screen in Arabidopsis identified at least 9 gametophytic mutants that

are defective in pollen functions during progamic development (Lalanne et al., 2004b).

SETH1 and SETH2 encode components of the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor

pathway shown to be essential for pollen germination and tube growth (Lalanne et al.,

2004). In maize, the aberrant pollen transmission 1 gene encodes a SABRE/KIP protein

that recently was shown to be essential for pollen tube elongation (Xu and Dooner, 2005).

The WUSCHEL HOMEOBOX (WOX) family of Arabidopsis genes is composed of at least

15 members that encode homeodomain proteins similar to WUSCHEL (WUS), a

transcription factor that controls cell fate in the shoot apical meristem by direct repression

of cytokinin-inducible growth regulators (Haecker and Laux, 2001; Leibfried et al., 2005).

Three additional WOX genes are important for meristem or floral development. STIMPY

(STIP or WOX9) is necessary for growth and maintenance of the vegetative shoot apical

meristem (SAM) by activating WUS expression (Wu et al., 2005). In contrast, mutations in

PRETTY FEW SEEDS2 (PFS2 or WOX6) cause morphological abnormalities in the

integuments that severely affect female fertility (Park et al., 2005), and homozygous

pressed flower (prs) individuals exhibit reduced lateral growth of the sepals, indicating that

PRS (WOX3) is important for lateral-axis dependent development of the flower (Matsumoto

and Okada, 2001). In addition, several WOX genes (including WOX2, WOX8, WOX9, and

WOX5) constitute reliable markers of cell fate during early embryogenesis, suggesting that

these WOX members might play important roles during early patterning of precursor cells

(Haecker et al., 2004). Recently, a chromosomal translocation affecting WOX5 was shown

to cause constitutive activation of indole acetic acid (IAA) conjugation, suggesting that

WOX5 negatively regulates auxin homeostasis in roots from Arabidopsis seedlings

(Gonzali et al., 2005)

Here we report the genetic and phenotypic analysis of tepitzin1 (tpz1), a transposon-based

insertional mutant disrupting the activity of WOX5, a gene encoding a WUSCHEL-like

homeodomain protein in Arabidopsis. Heterozygous tpz1 plants have no abnormalities in

sporophytic development but exhibit male gametophyte-specific defects that impede

normal transmission through pollen and do not allow recovery of homozygous mutant

5

individuals. WOX5-deficient pollen grains develop normally but show delayed germination

and reduced pollen tube elongation both in vitro and in vivo. Our results indicate that

WOX5 activity is necessary for pollen tube growth in Arabidopsis, and open new

possibilities for the identification of auxin-dependent pathways that regulate the progamic

phase of plant reproduction.

RESULTS

The tpz1 mutation is defective in Ds transmission.

From a genetic screen of 950 transposon-based gene trap lines for distortion of segregation

of a selection marker conferring resistance to kanamycin harbored by the insertional

element, we isolated 7 gametophytic mutations including MGT76, a line showing a

distorted segregation of kanamycin resistant to kanamycin sensitive (KanR:KanS) progeny

that we subsequently named tepiztin1 (tpz1; for “just a little” in nahuatl). Heterozygous

tpz1 plants had no defects on sporophytic development, and we could not identify a

homozygous tpz1 individual after segregation analysis of 103 plants derived from tpz1

heterozygotes. Self-pollination of heterozygous tpz1 individuals revealed that all segregated

1.5:1 for kanamycin resistance, sugesting reduced gametophytic transmission (Table 1).

Progeny testing showed that kanamycin resistance cosegregated strictly with reduced

genetic transmission in tpz1 heterozygotes. Reciprocal crosses between heterozygous tpz1

individuals and wild-type plants indicated that female transmission was normal, but that

male transmission was reduced to 47.6%, demonstrating that the tpz1 is a mutation

affecting the development or the function of the male gametophyte.

The tpz1 mutation is caused by a Ds insertion in WOX5.

A DNA gel blot analysis using a probe specific to the Ds transposon showed that a single

copy of the gene trap element was present in tpz1 heterozygotes (data not shown). A

genomic sequence flanking the 3’ end of the Ds element was rescued using thermal

asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR; Liu et al., 1995), and the sequence analysis of the

6

PCR products showed that the gene trap element was inserted in the regulatory region of

WOX5 (At3g11260), 327 bp upstream of its transcription initiation site (Fig. 1a). WOX5

encodes a transcription factor containing a homeodomain sharing 66% identity and 78%

similarity to the WUS homeodomain (Haecker et al., 2004; Fig. 1b). In WOX5, the WUS

box is TLQLFPVN rather than the conserved TLPLFPMH found in WUS and all its

putative orthologs from other plant species (Haecker et al., 2004; Fig. 1b). A detailed

analysis of the 5’ regulatory region of WOX5 revealed that a 5 nt element (TGTGG)

previously shown to be essential for pollen expression is located 647 bp upstream of the

tpz1-1 insertion site (Zabaleta et al.,1998). We further analysed the structure of the WOX5

genomic region using the PLACE scan database (Higo et al., 1999; Prestridge, 1991). Two

additional elements found in regulatory regions of genes that respond to auxins are located

at positions -273 and +15 with respect to the site of the transcriptional initiation of the

WOX5 mRNA. To determine if the Ds transposon insertion was causing the male

gametophytic defect found in tpz1, we genetically analyzed GT6264, a gene trap insertion

identified in the Cold Spring Harbor Laboratory collection and located 6 bp downstream of

the tpz1 insertion site (Fig. 1a). In both transposon insertions the transcriptional orientation

of the reporter gene is inverted with respect to the transcriptional orientation of WOX5,

impeding the identification of a gene trap expression pattern. Self-pollination of

heterozygous GT6264 individuals revealed that they also segregate an abnormal proportion

of KanR to KanS seedlings (Table 1), confirming that the disruption of WOX5 activity is

the cause of the gametophytic lethal mutation in tpz1. We subsequently named the original

MGT76 insertion tpz1-1 and the GT6264 insertion tpz1-2 (Fig. 1a).

WOX5 is expressed in mature pollen grains and growing pollen tubes.

Previous reports have shown that WOX5 is expressed in the hypophysis of early globular

embryos, the quiescent center of the root meristem in heart stage and bent cotyledonary

stage embryos, and in cells associated with the vascular primordium of the developing

cotyledons (Haecker et al., 2004); however, no expression studies had been conducted in

male developing reproductive organs. To determine a potential pattern of expression of

7

WOX5 during male gametogenesis and progamic development, we determined the

localization of WOX5 mRNA by in-situ hybridization in both sectioned and whole-mount

reproductive organs of wild-type plants. Sense and anti-sense digoxygenin-labeled probes

were generated using a portion of exon 2 that shows no homology to other WOX genes in

Arabidopsis. During male gametophytic development, the expression of WOX5 was not

found in developing stamens or anthers, neither in microsporocytes undergoing

microsporogenesis. Initial WOX5 mRNA localization was weakly observed in male

gametophytes undergoing the first mitotic division (Fig. 2a). WOX5 expression was

strongest in mature pollen grains prior to pollination (Fig. 2b and 2c), suggesting that

WOX5 transcription is initiated during male gametogenesis (microgametogenesis). At this

stage, WOX5 mRNA was also detected in the tapetum of fully differentiated anthers (Fig.

2b). To determine if WOX5 expression persisted during pollen germination in-vivo, we

examined WOX5 mRNA localization in self-pollinated wild-type pistils. At early stages of

pollen germination, WOX5 expression was found in the cytoplasm contained within the

pollen grain but also in the young pollen tube prior to penetration of the stigmatic papillae

(Fig. 2d). WOX5 mRNA was absent from pollen grains that had lost their cytoplasmic

content (Fig. 2e). To determine if WOX5 was expressed at subsequent stages of pollen tube

growth, we used the same probes to perform whole-mount in situ hybridization on pollen

tubes present in self-pollinated dissected pistils. Abundant WOX5 mRNA was localized in

elongating pollen tubes (Fig. 2g), indicating that WOX5 is expressed during the progamic

phase of pollen development. Hybridizations with a sense WOX5 control did not show a

detectable signal in mature pollen grains or pollen tubes (Fig. 2f and 2h). Overall, these

results demonstrate that WOX5 transcription occurs during the male gametophytic phase of

the life cycle, and that expression persists during pollen germination and pollen tube

growth.

WOX5 is differentially expressed in pollen of tpz1/+ heterozygous individuals.

The heterozygous nature of the tpz1 mutation, combined to the non-recovery of

homozygous tpz1 plants, did not allow for a molecular quantification of WOX5 activity by

8

RNA blot analysis or RT-PCR. To determine if the presence of the transposon insertion is

correlated with abnormal activity of WOX5, we performed in-situ hybridization in mature

anthers and self-pollinated stigmas of tpz1/+ heterozygous plants, and scored the presence

or absence of the digoxygenin-dependent signal that is associated with WOX5 mRNA

localization. In mature tpz1/+ anthers, a total of 30 pollen grains were unambiguously

analyzed, with 14 of them showing abundant WOX5 expression and 16 in which WOX5

mRNA localization was clearly absent (Fig. 3a). In self-pollinated tpz1/+ stigmas, a total of

19 germinating pollen tubes were scored, and only 9 of them showed WOX5 expression,

whereas 10 lacked WOX5 mRNA localization in both their cytoplasm and the germinating

pollen tube (Fig. 3b). These results indicate that a subsample of close to 50% of pollen

grains of tpz1/+ individuals lacks WOX5 expression, suggesting that the tpz1 insertion in

the upstream WOX5 regulatory region impedes normal WOX5 transcription.

tpz1 heterozygous individuals show slow and reduced pollen tube elongation.

Heterozygous tpz1 individuals did not exhibit abnormal frequencies of aborted ovules or

developing seeds following self-pollination or when outcrossed as males to wild-type

plants, indicating that tpz1 mutants do not have post-fertilization defects that could explain

its distorted segregation (data not shown). To determine if heterozygous tpz1 plants

produced defective pollen showing abnormal germination, we assessed pollen germination

efficiency using in-vitro germination assays. Wild-type and heterozygous tpz1 pollen from

mature flowers at anthesis was collected in microscope slides containing germination

medium (Derksen et al., 2002) and incubated at 24°C under 16 hours of light and 8 hours of

dark. At 2 hours after in vitro incubation (hai), pollen from wild-type plants showed a

germination efficiency of 93.4%. In contrast, the germination efficiency of pollen from

heterozygous tpz1 plants was only of 56.7%. To determine if this difference was due to a

reduced capacity of pollen germination or to a slower rate of mutant pollen germination, we

assessed the germination efficiency at later stages. At 24 hai, 95% of wild-type pollen

grains had germinated, and the germination efficiency of pollen from heterozygous tpz1

plants was 83.3%, indicating that pollen grains from tp1z heterozygous plants germinate at

a slower rate rather than being substantially affected in their germination capacity.

9

To determine if WOX5-deficient plants showed defects in pollen tube elongation, we

measured the length of germinated pollen tubes of wild-type and heterozygous tpz1 plants

at different times following in vitro incubation. These results are shown in Figure 4a and

4b. At 2 hai, the mean pollen tube length was 28.4 µm in the wild-type and 13.9 µm in

heterozygous tpz1 plants, representing a 51% reduction in mean tube length for the tpz1

mutation. This reduction was estimated at 64% 6 hai, and reached 45% at 24 hai.

Interestingly, whereas wild-type pollen tubes were able to grow until 24 hai and reached in

average 290± 17 µm in length, tpz1/+ pollen tubes did not grow significantly following 8

hai, and reached a maximum average length of 104 ± 11 µm. While the reduction in pollen

tube growth reached values slightly above 50% at 6 hai, the final length of pollen tubes in

tpz1/+ individuals was below 50%, which is the maximum reduction value expected for a

heterozygous gametophytic mutant. These data indicates that WOX5 is essential for pollen

tube growth in vitro.

The quartet1 (qrt1) mutants of Arabidopsis produce tetrads of pollen grains in which

microspores fails to separate during pollen development (Preuss et al., 1994). To determine

if possible defects associated with the tpz1 mutation had a gametophytic origin,

heterozygous tpz1 plants were crossed as females to individuals homozygous for the qrt1

mutation. In the F2 generation we obtained tpz1/+; qrt1/qrt1 plants that produced tetrads

containing two wild-type and two tpz1 mutant pollen grains. We analyzed pollen function

in tpz1/+ plants homozygous for the qrt1 mutation by measuring the length of pollen tubes

from tetrads producing at least three tubes, reasoning that at least one tube produced by

those tetrads carried a mutant tpz1 allele. At 24 hai, the mean pollen tube length was

320±14 µm in qrt1/qrt1, and 227±11 µm in tpz1/+; qrt1/qrt1 tetrads (Fig. 4a). The

difference represents a 29% reduction in mean tube length, indicating that the absence of

QRT1 activity partially rescues the tpz1 defect following pollination. We also plotted the

frequency distribution of pollen tube length in tpz1/+; qrt1/qrt1 and qrt1/qrt1 individuals

(Fig. 4c and 4d), and found that 21.9% of tpz1/+; qrt1/qrt1 tetrads produced pollen tubes of

less than 100 mm, whereas qrt1/qrt1 tetrads showed only 5.7% of tubes of less than 100

mm, confirming that tpz1 caused a reduction in pollen tube length. To determine if this

10

defect in pollen tube elongation was conserved during in vivo pollination, we hand-

pollinated wild-type pistils with a limited number of tetrads from tpz1/+;qrt1/qrt1

individuals. In tetrads in which at least three pollen grains had germinated we always found

at least one pollen tube growing at a slower rate than normal, indicating that the elongation

defect persists during in vivo pollination (Fig. 4e). These results demonstrate that WOX5 is

required for pollen tube elongation both in vitro and in vivo.

DISCUSSION

The WOX family of Arabidopsis genes is composed of at least 15 members encoding

homeodomain proteins that contain a short WUS-box motif of unknown function.

Functional analysis has indicated that these genes play important roles in determining cell

fate at different stages of plant development. We have identified and characterized an

insertional mutation that disrupts WOX5. Heterozygous mutations in WOX5 have no defects

during sporophytic development or female gametogenesis but exhibit abnormal

gametophytic male fertility, as the majority of mutant pollen grains appear to germinate

normally but fail during pollen tube growth. Our results suggest that WOX5 has an essential

male gametophytic role during the progamic phase of Arabidopsis thaliana.

Other genes have been shown to be required for pollen tube growth in Arabidopsis. In the

case of mutations in SETH1 and SETH2, two components of the GPI-anchor biosynthetic

pathway, pollen germination is also affected (Lalanne et al., 2004). In contrast to seth1 and

seth2 mutants, our assessment of germination efficiency in heterozygous tpz1 individuals

indicates that mutant pollen grains are slow at initiating germination but end up

germinating at frequencies similar to those of pollen in wild-type plants (83% vs 95%),

indicating that WOX5 acts at the onset of pollen tube growth but does not substantially

affect the capacity of pollen to germinate. Additionally, a detailed analysis of pollen tube

length demonstrates that WOX5 is mainly required for pollen tube elongation both in vivo

and in vitro. The dynamic assessment of average pollen tube length at several times

following in vitro incubation indicates that during the first 6 hours wild-type pollen tubes

11

grew on average significantly faster than mutant tpz1 pollen tubes (37 µm/hr vs 12 µm/hr),

suggesting that the competitive ability of mutant pollen tubes in heterozygotes is severely

compromised. In addition, the maximum length reached by tpz1 pollen tubes is shorter than

the wild-type, indicating that WOX5 is essential for normal tube elongation. As

transmission is not completely blocked in tpz1/+ individuals, a limited number of WOX5-

defective pollen tubes is still capable of competing with wild-type pollen and fertilize some

ovules. Nevertheless, we have not been able to recover homozygous tpz1 plants after

growing more than 100 heterozygous individuals, suggesting that homozygous tpz1 plants

might be defective in seed formation. WOX5 is known to be expressed in the embryo

hypophysis and the quiescent center. Although we were not able to identify defects in

female gametophyte development, we cannot discard the possibility that the sporophytic

activity of WOX5 is essential for seed viability and impedes the recovery of homozygous

tpz1-1 individuals. The elucidation of a functional role for WOX5 during seed formation

will require a detailed genetic and molecular characterization of early embryo and

endosperm development.

Pectin methylesterases have been also pointed as regulators of pollen tube growth. A

cytological analysis aiming at localizing the activity of pectin methylesterases (PME) in

growing pollen tubes of Nicotiana tabacum showed that the pollen tube pro-region acts as

an intercellular inhibitor of PME activity, preventing the deesterification of pectins and the

consequent increase in the rigidity of the pollen tube cell wall (Bosch et al., 2005). Our

results show that the reduction in average pollen tube length produced by the absence of

WOX5 activity is less severe when heterozygous tpz1 individuals are in a homozygous qrt1

genetic background, suggesting that the absence of QRT1 activity compensates WOX5-

deficient pollen tube elongation. In qrt1, a layer of exine is deposited on the group of four

meiotic products, resulting in tetrad pollen (Preuss et al., 1994). In contrast to flowering

plant species in which callose deposition is correlated with the adherence of all four pollen

grains following meiosis (Blackmore and Crane, 1988), tetrad pollen in qrt1 is associated

with the persistence of methylesterified pectic polysaccharides in the microspore mother

cell wall (Rhee and Sommerville, 1998). The molecular identity of QRT1 has yet to be

elucidated. An interesting possibility is that the persistence of methylesterified pectin in the

12

mature qrt1 pollen grain wall could facilitate growth and extension of WOX5-deficient

pollen tubes. A direct explanation of the effect of qrt1 on pollen tube elongation of the tpz1

mutant will require a detailed biochemical and cytological analysis,

High concentrations of free IAA presumably originating in the tapetum have been recently

found in mature pollen grains of Arabidopsis, leading to the suggestion that auxin could

stimulate pollen tube growth (Aloni et al., 2006). In germinating seedlings, the expression

of WOX5 is induced by auxin (Gonzali et al., 2005). In addition, roots having a

chromosomal translocation that disrupts the codifying sequence of WOX5 do not

accumulate auxin in response to the presence of turanose, a non-metabolizable sucrose

analogue (Gonzali et al., 2005). Our results indicate that, during the male gametophytic

phase of the Arabidopsis life cycle, the expression of WOX5 initiates at the 2-nucleate stage

of microgametogenesis. WOX5 mRNA is most abundant in mature pollen grains prior to

anthesis and persists during germination and pollen tube elongation, demonstrating that the

pattern of expression of WOX5 is similar to the pattern of accumulation of free auxin in

pollen grains. It is therefore likely to suggest that increasing concentrations of free IAA in

developing pollen grains could trigger the expression of WOX5 prior to pollination.

Although the molecular mechanisms that control WOX5 transcription during male

gametogenesis remain to be elucidated, we propose that the stimulating effect of WOX5

activity on Arabidopsis pollen tube elongation could be mediated by auxins.

In this study we show that the role of the homeobox gene WOX5 is required for pollen tube

growth in Arabidopsis thaliana. WOX5 is abundantly expressed in mature pollen grains at

anthesis, and in elongating pollen tubes after pollination. WOX5-deficient plants exhibit

short and slow growing pollen tubes both in vivo and in vitro. We also show that a lack of

QRT1 activity partially restores pollen tube elongation in WOX5-deficient plants,

suggesting that the altered composition of the pollen cell wall in the qrt1 mutant facilitates

pollen tube elongation in the absence of WOX5 activity. Taken together, our results show

that the predominant function of WOX5 in Arabidopsis is to regulate pollen tube growth

following pollen germination in the stigma, and that this function is controlled at the

gametophytic level by initiating WOX5 transcription during male gametogenesis. Future

13

studies need to address the mechanisms by which WOX5 interacts with target genes to

induce pollen tube growth during the progamic phase of Arabidopsis development.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material and Growth Conditions

A collection of enhancer detector and gene trap lines generated in our laboratory using the

system implemented by Sundaresan et.al., (1995) was screened for segregation distortion of

the kanamycin resistance harbored by a Ds transposable element. 200 to 250 seeds from

each insertional line were surfaced sterilized in 20% hypochlorite, washed in sterile water,

and plated on Murashige and Skoog (MS) medium 0.5% agar supplemented with

kanamycin (50 µg/µl). All plates were vernalized at 4ºC during 4 days and germinated in a

growth chamber with long day conditions. The number of kanamycin resistance and

kanamycin sensitive seedlings was determined 7 to 10 days after germination. Selected

lines were grown on 3:1:1: Mix3-Sunshine:vermiculite:perlite (vol/vol/vol ratio) containing

1.84 kg/m3 of 14-14-14 slow-release fertilizer (Osmocote) under greenhouse conditions, or

in a Percival incubator at 19ºC with a photoperiod of 16 hours of light and 8 hours of dark.

Genetic Analysis.

To determine gametophytic transmission of the transposon through the male and female

gametes, reciprocal test crosses were performed between wild type Landsberg erecta

Arabidopsis thaliana plants and selected transposant lines. The transmission efficiency of

the Ds transposon through each gamete was calculated according to Howden et.al., (1998).

In Situ Hybridization

Developing flower buds, mature flowers, anthers, and siliques from wild-type and tpz1

plants were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in Paraplast (Fisher Scientific,

14

FairLawn, NJ). Sections of 12-mm thickness were cut using a BROMA microtome and

mounted on ProbeOnPlus slides (Fischer Biotech, Pittsburgh). A fragment that included a

portion of the second exon of WOX5 was amplified using specific primers (sense MGT76-

S3: AAGCTTGCGAAGAAGATTGTCAAGAGG; antisense MGT76-AS3:

GATATCCGTGGTGGTCTCTCGAATATA). Amplified fragments were cloned in pCRII

TOPO vector (Invitrogen). This construct was linearized either with NotI and BamHI to

synthesize antisense and sense digoxygenin-labeled probes, respectively. Hybridization was

conducted as described by Vielle-Calzada et al., (1999). For whole mount in situ

hybridization, wild-type self-pollinated pistils were isolated and dissected to remove the

carpel wall and expose the pollen tubes that were present within the ovary. Fixation and

hybridization was performed as described in Garcia-Aguilar et.al., (2005).

Cytological and phenotypic analyses of pollen

For analysis of pollen integrity, mature pollen grains were incubated in 4_6-diamidino-2-

phenylindole staining solution and observed using light and epifluorescence microscopy as

described by Park et al., (1998). For observation of cleared pollen grains, developing

anthers were isolated and fixed in FAA (50% ethanol, 5% acetic acid, 10% formaldehyde)

during 4 hours at room temperature (25°C), cleared in Herr’s solution (phenol: chloral

hydrate: 85% lactic acid: xylene: clove oil [1:1:1:0.5:1]), and observed under Nomarsky

optics. Aniline blue staining of pollinated pistils was performed essentially as described

Martin (1959). Pistils were collected 24 hr after pollination and fixed in FAA for 1 hr at

room temperature. After overnight softening in 8 M KOH, the pistils were washed several

times with distilled water and incubated with aniline blue solution (0.1% aniline blue in 0.1

M K2HPO4-KOH buffer, pH 11) for 3-4 hr in complete darkness. The stained pistils were

mounted in slides with several drops of the same staining solution and observed in an

Olympus BX60 (Model BX60F5) (Olympus Optical, Japan) microscope equipped with an

epifluorescence UV filters set (excitation filter at 365 nm). Images were acquired using

Image Pro-Plus Software, version 4.0.

For in vitro germination assays, anthers of individual open flowers were collected and

15

tapped on a Petri dish containing slides with 50 µl drops of semisolid germination medium

(Derksen et.al., 2002). Plates were sealed and incubated to different time (4, 6, 8, 24 and 48

hrs) at 24°C under 16 hours of light and 8 hours of dark. At the end of incubation time,

slides were covered and sealed with a cover-slip for microscope observation; in vitro pollen

tubes were analyzed under Nomarski optics Leica microscope. A micrograph of all

germinated pollen grains was obtained with a digital camera (Leica DC300) and NIH

Image 1.6 was used to measure pollen tube lengths from captured images.

Acknowledgments.

We are particularly grateful to Gladys Cassab for critical comments on the manuscript, and

to Rob Martienssen and Joseph Simorowski for facilitating seed from GT6264. We also

thank Beatriz Jimenez, Guillermo Corona for help with sequencing. Santos García and

Jaime Mendiola provided help with plant care, and Javier Mendiola assisted in female

gametophyte observations. This work by supported by the Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACyT Grants B-34324 and Z-029) and Fondos Mixtos, CONCYTEG

Guanajuato. A.D.A is a recipient of a CONACyT graduate scholarship. JP.V.C is an

International Scholar of the Howard Hughes Medical Institute.

16

References.

Aloni R, Aloni E, Langhans M, Ullrich CI (2006) Role of auxin in regulating Arabidopsis

flower development. Planta 223: 315-28

Blackmore S, Crane PR (1988) The systematic implications of pollen and spore ontogeny.

In Ontogeny and Systematics (Humphries CJ, ed.) New Cork: Columbia University Press,

pp 83-115

Bosch M, Hepler PK (2005) Pectin methylesterases and pectin dynamics in pollen tubes.

Plant Cell 17: 3219-3226

Bosch M, Cheung AY, Hepler PK (2005) Pectin methylesterase, a regulator of pollen tube

growth. Plant Physiol 138: 1334-1346

Chen YC, McCormick S (1996) sidecar pollen, an Arabidopsis thaliana male gametophytic

mutant with aberrant cell divisions during pollen development. Development 122: 3243-

3253.

Cheung AY, Chen CY, Glaven RH, de Graaf BH, Vidali L, Hepler PK, Wu HM (2002)

Rab2 GTPase regulates vesicle trafficking between the endoplasmic reticulum and the

Golgi bodies and is important to pollen tube growth. Plant Cell 14: 945-962

Derksen J, Knuiman B, Hoedemaekers K, Guyon A, Bonhomme S, Pierson ES (2002)

Growth and cellular organization of Arabidopsis pollen tubes in vitro. Sex Plant Reprod 15:

133-139

Edlund AF, Swanson R, Preuss D (2004) Pollen and stigma structure and function: the role

of diversity in pollination. Plant Cell 16: S84–S97

17

García-Aguilar M, Dorantes-Acosta A, Pérez-España V, Vielle-Calzada JP (2005) Whole-

mount in situ mRNA localization in developing ovules and seeds of Arabidopsis. Plant

Mol. Biol. Reporter 23: 279-289

Golovkin M, Reddy A (2003) A calmodulin-binding protein from Arabidopsis has an

essential role in pollen germination. Proc Natl Acad Sci USA 100: 10558-10563

Gonzali S, Novi G, Loreti E, Paolicchi F, Poggi A, Alpi A, Perata P (2005) A turanose-

insensitive mutant suggests a role for WOX5 in auxin homeostasis in Arabidopsis thaliana.

Plant J 44: 633-45

Haecker A, Gross-Hardt R, Geiges B, Sarkar A, Breuninger H, Herrmann M, Laux T

(2004) Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic

patterning in Arabidopsis thaliana. Development 131 :657-668

Haecker A, Laux T (2001) Cell-cell signaling in the shoot meristem. Curr Opin Plant Biol 4

: 441-446

Higo K, Ugawa Y, Iwamoto M, Korenaga T (1999) Plant cis-acting regulatory DNA

elements (PLACE) database:1999. Nucleic Acids Res 27: 297-300

Hwang JU, Gu Y, Lee YJ, Yang Z (2005) Oscillatory ROP GTPase activation leads the

oscillatory polarized growth of pollen tubes. Mol Biol Cell 16:5385-399

Johnson MA, Preuss D (2002) Plotting a course: multiple signals guide pollen tubes to their

targets. Dev Cell 2: 273–281

Lalanne E, Honys D, Johnson A, Borner GH, Lilley KS, Dupree P, Grossniklaus U, Twell

D (2004) SETH1 and SETH2, two components of the glycosylphosphatidylinositol anchor

biosynthetic pathway, are required for pollen germination and tube growth in Arabidopsis.

Plant Cell 16: 229-240

18

Lalanne E, Michaelidis C, Moore JM, Gagliano W, Johnson A, Patel R, Howden R, Vielle-

Calzada JP, Grossniklaus U, Twell D (2004)b. Analysis of transposon insertion mutants

highlights the diversity of mechanisms underlying male progamic development in

Arabidopsis. Genetics 167:1975-1986

Lalanne E, Twell D (2002) Genetic control of male germ unit organization in Arabidopsis

Plant Physiol 129: 865-875

Lago C, Clerici E, Dreni L, Horlow C, Caporali E, Colombo L, Kater M (2005) The

Arabidopsis TFIID factor AtTAF6 controls pollen tube growth. Dev Biol 285: 91-100

Leibfried A, To JP, Busch W, Stehling S, Kehle A, Demar M, Kieber JJ, Lohmann JU

(2005) WUSCHEL controls meristem function by direct regulation of cytokinin-inducible

response regulators. Nature 438: 1172-1175

Liu YG, Mitsukawa N, Oosumi T, Whittier RF (1995) Efficient isolation and mapping of

Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR. Plant

J 8: 457-463

Lord EM (2003) Adhesion and guidance in compatible pollination. J Exp Bot 54: 47–54

Lord EM, Russell SD (2002) The mechanisms of pollination and fertilization in plants.

Annu Rev Cell Dev Biol 18: 81-105

Martin FW (1959) Staining and observing pollen tubes in the style by means of

fluorescence. Stain Tech 34:125–128

Matsumoto N, Okada K (2001) A homeobox gene, PRESSED FLOWER, regulates lateral

axis-dependent development of Arabidopsis flowers. Genes Dev 15: 3355-3364

19

Mayfield JA, Fiebig A, Johnstone S, Preuss D (2001) Gene families from the Arabidopsis

thaliana pollen coat proteome. Science 292: 2482- 2485

McCormick S (1993) Male gametophyte development. Plant Cell 5:1265– 1275

Parton RM, Fischer-Parton S, Trewavas AJ and Watahiki MK (2003) Pollen tubes exhibit

regular periodic membrane trafficking events in the absence of apical extension. J Cell Sci

116: 2707-2719

Park SO, Zheng Z, Oppenheimer DG, Hauser BA (2005) The PRETTY FEW SEEDS2 gene

encodes an Arabidopsis homeodomain protein that regulates ovule development.

Development 132: 841-849

Prestridge DS (1991) SIGNAL SCAN: A computer program that scans DNA sequences for

eukaryotic transcriptional elements. Comut Appl Biosci 7: 203-206

Preuss D, Lemieux B, Yen G, Davis RW (1993) A conditional sterile mutation eliminates

surface components from Arabidopsis pollen and disrupts cell signaling during fertilization.

Genes Dev 7: 974-985

Preuss D, Rhee SY, Davis RW (1994) Tetrad analysis possible in Arabidopsis with

mutation of the QUARTET (QRT) genes. Science 264: 1458-1460

Pruitt RE (1999) Complex sexual signals for the male gametophyte. Curr Opin Plant Biol.

2: 419–422

Rhee SY, Somerville CR (1998) Tetrad pollen formation in quartet mutants of Arabidopsis

thaliana is associated with persistence of pectic polysaccharides. Plant J 15: 79-88

20

Sundaresan V, Springer P, Volpe T, Haward S, Jones JD, Dean C, Ma H, Martienssen R

(1995) Patterns of gene action in plant development revealed by enhancer trap and gene

trap transposable elements. Genes Dev 9:1797-1810

Taylor L, Hepler P (1997) Pollen germination and tube growth. Annu Rev Plant Physiol

Plant Mol Biol 48:461–91

Twell D, Park SK, Lalanne E (1998) Asymmetric division and cell fate determination in

developing pollen. Trends Plant Sci 3: 305–310

Vielle-Calzada JP, Thomas J, Spillane C, Coluccio A, Hoeppner MA, Grossniklaus U

(1999) Maintenance of genomic imprinting at the Arabidopsis medea locus requires zygotic

DDM1 activity. Genes Dev 13:971-982

Wu X, Dabi T, Weigel D (2005) Requirement of homeobox gene STIMPY/WOX9 for

Arabidopsis meristem growth and maintenance. Curr Biol 15:436-40

Xu Z, Dooner HK (2005) The maize aberrant pollen transmission 1 (apt1) gene is a

SABRE/KIP homologue required for pollen tube growth. Genetics. November 19

doi:10.1534/ genetics.105.050237

Zabaleta E, Heiser V, Grohmann L, Brennicke A (1998) Promoters of nuclear-encoded

respiratory chain complex I genes from Arabidopsis thaliana contain a region essential for

anther/pollen-specific expression. Plant J 15: 49-59

21

FIGURES LEGENDS

Figure 1. WOX5 gene structure and protein alignment with other members of the WOX

family.

(a) Genomic structure of WOX5 showing the transposon insertion site in tpz1-1 and tpz1-2

alleles. In tpz1-1 the Ds transposon is inserted in the 5’ regulatory region at position -327

from the ATG start codon. The tpz1-2 allele is inserted 6 bp downstream the tpz1-1

insertion (position -322). The homeodomain motif is encoded in the first exon (light gray

region); the numbers indicate the first and last aminoacid belonging to the WOX motif.

Arrows show the transcriptional orientation of the uidA (GUS) gene harbored by the Ds

transposon. (b) Protein alignment of WOX5, WOX8, WUS, PFS (WOX6), PRS(WOX3)

and STIP(WOX9). The WUS box is underlined. The WOX5 acidic domain is indicated by

a gray box. Conserved amino acids are denoted with a dot while identical amino acids are

marked with an asterisk.

Figure 2. Expression pattern of WOX5 in developing pollen grains and germinating pollen

tubes.

(a) WOX5 expression in developing pollen grains at the binucleated stage. (b) WOX5

expression in the tapetum of anthers containing 3-nucleated pollen grains. (c) WOX5

expression in mature pollen grains at anthesis. (d) WOX5 expression during in vivo

germination of pollen tubes. (e) WOX5 expression in a pollen tube penetrating the stigmatic

papillae. (f) Mature pollen grains hybridized with a sense WOX5 control. (g) Whole mount

in-situ hybridization showing WOX5 expression in elongating pollen tubes in vivo.

(h)Whole-mount pollen tube hybridized with a sense WOX5 control. Bars in a-c, e-h 20µm

and d 10µm. mpg, mature pollen grain; n, nuclei; pt, pollen tube; sp, stigmatic papillae; t,

tapetum.

22

Figure 3. In-situ localization of WOX5 mRNA in mature pollen grains and germinating

pollen tubes of a tpz1/+ heterozygous individual.

In-situ hybridization with an anti-sense WOX5 probe was performed in sections of mature

tpz1/+ anthers and stigmas of self-pollinated tpz1/+ plants. The presence or absence of

WOX5 expression was scored in a sample of pollen grains and germinated pollen tubes.

(a) Mature pollen grains within a tpz1/+ anther showing a pollen grain with WOX5

expression (pg), and 2 pollen grains with absence of WOX5 expression (pg*). (b) Self

pollinated tpz1/+ stigma showing a germinated pollen grain (pg) with WOX5 expression in

the pollen tube (pt), and one pollen grain with absence of WOX5 expression (pg*). Bars 20

µm.

Figure 4. In vitro and in vivo germination of wild type, tpz1 and tpz1/+ ;qrt1/qrt1pollen

grains.

(a) Kinetics of in vitro germinated pollen from wild-type and mutant (tpz1/+,

tpz1/+;qrt1/qrt1, qrt1/qrt1) plants. (b) Elongating pollen tubes from wild-type (upper

micrographs) and heterozygous tpz1/+ (lower micrographs) plants at 2, 8 and 24 hours

following in vitro incubation. Bars 20µm. (c) Frequency of pollen tube lengths of tetrads

showing 3 or 4 tubes in qrt1/qrt1 (n=190 pollen tubes) and tpz1/+;qrt1/qrt1 (n=193 pollen

tubes) plants. (d) Micrograph of a single in vitro germinated tetrad (asterisk) 24 hours after

incubation; 2 short (orange) and 2 long (magenta) pollen tubes are visible. Bar 50 µm. (e)

Fluorescence micrograph of an aniline-blue-stained stigma showing germinated pollen

grains from a single tpz1/+;qrt1/qrt1 tetrad; 2 pollen tubes are reduced in length

(arrowheads) as compared to normally elongating tubes (asterisk); Bar 50µm.

23

TABLES

Numbers of self progeny producing wild type and mutant pollen are shown together with

the calculated transmission efficiency (TE) through male and female gametes. The

transmission efficiency represents the percentage of kanamycin resistance alleles

successfully transmitted through male or female gametes. Self and reciprocal crosses

between heterozygous mutants and the wild type are depicted. TE = (observed

KanR/observed KanS) x100

Table I. Distorted segregation of tpz1-1,tpz1-2 and genetic transmission efficiency

SelfingMutant as

male parent

Mutant as

female parent

Mutant KanS:KanRa Ratioc2b

KanS:KanR TE%c KanS:KanR TE%

tpz1-1 F3 173:200 1.5 1.95 168:80 47.6 121:140 115.7

tpz1-1F4 319:352 1.1 1.62

tpz1-2 F3 56:57 1.05 0.01tpz1-2 F4 121:141 1.17 1.52a KanS kanamycin sensitive, KanR kanamycin resistant. bc2<3.841(1) 0.05.cTE, transmission

efficiency

WOX5 TPZ1 --MSFSVKGRS-----------------------LRGNNNGGTGTKCG------------RWNPTVEQLKILTDLFR-AGLRTPTTDQIQKISTELSFYGKIESKNVFYWFQNHKARERQ 82WOX8 --MSSSNKNWPSMFKSKPCNNNHHHQHEIDTPSYMHYSNCNLSSSFSS----DRIPDPKPRWNPKPEQIRILESIFN-SGTINPPREEIQRIRIRLQEYGQIGDANVFYWFQNRKSRAKH 113 WUS --MEPPQHQHHHHQADQESG--------------NNNNKSGSGGYTCR--------QTSTRWTPTTEQIKILKELYYNNAIRSPTADQIQKITARLRQFGKIEGKNVFYWFQNHKARERQ 96WOX6PFS MGYISNNNLINYLPLSTTQPPLLLTHCDINGNDHHQLITASSGEHDIDERKNNIPAAATLRWNPTPEQITTLEELYR-SGTRTPTTEQIQQIASKLRKYGRIEGKNVFYWFQNHKARERL 119WOX3PRS ------------------------------------------MSPVAS-----------TRWCPTPEQLMILEEMYR-SGIRTPNAVQIQQITAHLAFYGRIEGKNVFYWFQNHKARDRQ 66WOX9STIP --MASSNRHWPSMFKSKPHP--HQWQHDINSP--LLPSASHRSSPFSSGCEVERSPEPKPRWNPKPEQIRILEAIFN-SGMVNPPREEIRRIRAQLQEYGQVGDANVFYWFQNRKSRSKH 113 ** *. **: * :: . . * :*::* .* :*:: . ********:*:* :

WOX5 TPZ1 KRRKISIDFDHHHHQP------------------------STRDVFEISEEDCQEEEKVIE-------TLQLFPVNSFED----SNSKVDKMRARG------------------------ 143WOX8 KLRVHHKSPKMSKKDKTVIP------------------STDADHCFGFVNQETGLYPVQNNELVVTEPAGFLFPVHND------PSAAQSAFGFGDFVV---PVVTEEGMAFSTVNNG-- 204 WUS KKRFNGTNMTTPSSSPNSVMMAANDHYHPLLHHHHGVPMQRPANSVNVKLNQDHHLYHHNKPYPSFNNGNLNHASSGTECGVVNASNGYMSSHVYGSMEQDCSMNYNNVGGGWANMDH-- 214WOX6 PFS KRRRREGGAIIKPHKDVKDS------------SSGGHRVDQTKLCPSFPHTNRPQPQHELDPASYNKDNNANNEDHGTTEESDQRASEVGKYATWRNLVTWSITQQPEEINIDENVNG-- 225 WOX3 PRS KLRKKLAKQLHQQQHQLQLQLQQIKPKPISSMISQPVNKNIIDHHNPYHHHHHNHHHNHHRPYDHMSFDCCSHPSPMCLP---HQGTGVGEAPSKVMNEYYCTKSGAEEILMQKSITG-- 181 WOX9 STIP KLRLLHNHSKHSLPQTQPQPQPQPSASSSSSSSSSSSKSTKPRKSKNKNNTNLSLGGSQMMGMFPPE-PAFLFPVSTVGGFEGITVSSQLGFLSGDMIEQQKPAPTCTGLLLSEIMNGSV 232 * * .

WOX5 TPZ1 -----------NNQYREYIRETT---------------TTSFSPYSSCG----------------AEMEHPPPLDLRLSFL--------------------------------------- 182WOX8 ----------VNLETNENFDKIP--------------AINLYGGDGNGG----------------GNCFPPLTVPLTINQ---------------------------------------S 245WUS --------HYSSAPYNFFDRAKPLFG------------LEGHQDEEECGG-----------DAYLEHRRTLPLFPMHGEDHINGGSG-----------------------------AIWK 274WOX6PFS ----------EEEETRDNR-------------TLNLFPVREYQEKTGRLIEK---------TKACNYCYYYEFMPLKN------------------------------------------ 271WOX3PRS ----------PNSSYGRDWMMMMDMG-----------PRPSYPSSSSSP------------ISCCNMMMSSPKIPLKTLELFP----------------------------------ISS 234WOX9STIP SYGTHHQQHLSEKEVEEMRMKMLQQPQTQICYATTNHQIASYNNNNNNNNIMLHIPPTTSTATTITTSHSLATVPSTSDQLQVQADARIRVFINEMELEVSSGPFNVRDAFGEEVVLINS 352 . .

WOX5 TPZ1 --------------------------WOX8 QGKLIISK------------------ 253 WUS YGQSEVRPCASLELRLN--------- 291WOX6PFS --------------------------WOX3PRS INSKQDSTK----------------- 243WOX9STIP AGQPIVTDEYGVALHPLQHGASYYLI 378

a

b

Fig. 1

uidA

18 WOX motif 84

+1

-327 -322

3’tpz1-15’

uidAtpz1-2 3’5’

5’UTR 3’UTR

Ana Elena Dorantes Acosta

Fig.2

Ana Elena Dorantes Acosta

Fig.3

Fig. 4.

b

c

d

e

22.28

25.39

17.10

12.44

6.224.66 4.66

21.9520.98

23.90

13.17

8.29

1.95 2.44 1.46

0-100 100-200 200-300 300-400 400-500 500-600 600-700 700-800

Pollen tube length µm

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

Fre

qu

ency

(%

)

5.70

tpz1/+;qrt1/qrt1qrt1/qrt1

Wt

tpz1

2 HRS 8 HRS 24 HRS

WtWt

tpz1 tpz1

a2 hrs 6hrs 8hrs 24hrs 24hrs

tpz1/+;qrt1/qrt1qrt1/qrt1

Wttpz1

50

100

150

200

250

300

350

Time after incubation

Pollen

tu

be len

gth

µm