ELECTROFORESIS La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular.1. Fundamento. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin.1.2 Mtodos electroforeticos zonales. Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican pequeas cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido, que se impregna con una solucin tampn. Los soportes son en general polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidn, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este mtodo tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequea de protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicacin. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los ms utilizados son:

1.2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

1.2.2 Electroforesis en geles de gradientes. El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.

1.2.4 Electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

1.2.5 Electroforesis capilar. La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin . La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

1.2.6 Isoelectroenfoque. Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

1.2.7 Electroforesis bidimensional. La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

1.3 Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras. ELECTROFORESIS DE GEL DE POLIACRILAMINA.La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida, comnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues se requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.Algunas caractersticas destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son: a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador el in persulfato (S2O8) que se aade en forma de persulfato amnico. En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectro enfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean riboflavina y TEMED. b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxgeno es un inhibidor de la polimerizacin. Adems, durante la polimerizacin se libera calor que podra provocar la formacin de burbujas en el seno del gel. c) La velocidad de polimerizacin viene determinada por la concentracin de persulfato (catalizador) y TEMED (iniciador). d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida se use. e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. As, la mayora de las protenas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.f) En funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electrofortico stas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes: 1) una electroforesis desnaturalizante, la ms comn, es la que somete a las protenas a migracin asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente. 2) una electroforesis nativa es la que somete a las protenas a migracin sin desnaturalizacin. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Adems se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos. Los sistemas tampn (buffer) empleados en estos caso son: tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).La electroforesis en geles de acrilamida se puede realizar empleando sistemas de uno o ms tampones, en estos casos se habla de sistemas tampn continuos o discontinuos. En los sistemas discontinuos el primer tampn asegura la migracin de todas las protenas en el frente de migracin, provocndose la acumulacin de todas las que se han cargado en el pocillo. La separacin realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migracin alcanza la frontera del segundo tampn. En el esquema se muestran secuencialmente la situacin en (a) al principio de la electroforesis, (b) durante el proceso de apilamiento ('stacking') y (c) durante la separacin en el gel resolutivo. El primer gel ('stacking') es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH ms cido que el segundo gel que es el que realmente separa las protenas. Este sistema es especialmente adecuado para analizar muestras diluidas sin perder resolucin.QU ES LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL? La electroforesis bidimensional es una tcnica de alta resolucin cuyo objetivo es la separacin de mezclas de protenas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolucin est precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las protenas son separadas secuencialmente por dos criterios fsicos. En primer lugar las protenas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoelctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separacin por carga las protenas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tincin del gel las protenas aparecen formando manchas circulares (spots).El estudio de protenas es de gran inters en el rea mdica. Muchos frmacos son de naturaleza proteica y muchas molculas diana son protenas. Dependiendo del pH del medio en el que se encuentre, una protena tendr carga positiva o negativa o no estar cargada. El valor de pH en el que una protena presenta carga neta 0 es conocido como punto isoelctrico y es caracterstico de cada protena. La electroforesis bidimensional es una tcnica que permite la separacin de mezclas complejas de protenas. La separacin se hace en dos etapas consecutivas. En la primera de ellas (primera dimensin) las protenas son separadas en funcin de su carga a lo largo de un gel con gradiente de pH. Cada protena avanza en el campo elctrico hasta alcanzar un valor de pH igual a su punto isoelctrico. En una segunda etapa (segunda dimensin), estas protenas son separadas entre s en funcin de su masa molecular. La visualizacin del resultado de estas dos electroforesis muestra el conjunto de protenas presentes en la mezcla inicial. La electroforesis bidimensional se emplea en estudios comparativos de patrones proteicos de diferentes individuos. Pueden compararse por ejemplo, los patrones de protenas de un individuo sano frente a un individuo enfermo o de un mismo individuo expuesto a diversas situaciones. Estas estrategias se utilizan para analizar los efectos de diferentes tratamientos con frmacos o la exposicin a sustancias txicas.ULTRACENTIFUGACION.La ultracentrfugacin fue ideada en 1923 por el bioqumico sueco Svedberg, puede alcanzar velocidades tan elevadas como 80.000 rpm, de modo que genera campos centrfugos que superan 600.000 g. La ultracentrifugacin se ha convertido en una herramienta indispensable para el aislamiento de protenas, cidos nucleicos y partculas subcelulares.Consiste en someter una mezcla homogeneizada a una velocidad de rotacin muy alta,de forma que, a velocidades ms lentas, sedimentan los componentes ms grandes, y a velocidades mayores, los componentes ms pequeos. Es decir, que aunque las masas de diferentes partculas sean muy similares, sedimentan en tiempos distintos. El instrumento utilizado es la ultracentrfuga.La centrifugacin diferencial es un procedimiento comn en microbiologa y citologa,usado para separar ciertos orgnulos de su respectiva clula para un anlisis posterior de partes especficas de las clulas. En el proceso, primero se homogeniza una muestra de tejido para romper las membranas celulares y mezclar los contenidos de las clulas. Luego, esta mezclahomognea es sometida a repetidas centrifugaciones,cada vez removiendo el precipitado, e incrementando la fuerza centrfuga. Finalmente, la purificacindebe ser hecha por la sedimentacin de equilibrio, y la capa deseada es extrada para un futuro anlisis.La separacin est basada en el tamao y la densidad, donde las partculas ms grandes y densas son precipitadas en centrifugaciones de poca fuerza. Por ejemplo, las clulas completas no homogenizadas sern precipitadas en centrifugaciones con poca fuerza y en cortos intervalos como 1,000g por 5 minutos. Los fragmentos ms pequeos de las clulas y los orgnulos permanecen en el lquido sobrenadante y requieren ms fuerza centrfuga y ms tiempo para precipitarse. En general, uno puede enriquecer (separar o concentrar) los siguientes componentes de la clula, en orden de separacin, con la presente aplicacin:Antes de que la centrifugacin diferencial pueda ser llevada a cabo para separar diferentes porciones de la clula de otras porciones, el tejido de muestra debe ser homogenizado. En este proceso, son usadas una licuadora y una pieza de porcelana porosa de la misma forma y dimensin que el contenedor. El contenedor es, en la mayora de los casos, un tubo de ebullicin de vidrio.Primero, el tejido de muestra es triturado y una solucin amortiguadora le es aadida, formando una suspensin lquida de tejido de muestra triturado. La solucin amortiguadora es una solucin acuosa, densa e inerte, que es diseada para suspender la muestra en un medio lquido sin daarla por reacciones qumicas u osmticas. En la mayora de los casos, la solucin usada es de sacarosa, en otros, es usada una solucin de salmuera. Luego, la licuadora, conectada a un rotor de alta velocidad, es insertada en el contenedor que lleva la muestra, presionando la muestra de tejido triturado contra las paredes del contenedor.Con el rotor encendido, la muestra de tejido es molida en pequeos fragmentos por los poros de la porcelana y las paredes del contenedor. Este proceso de molimiento romper las membranas celulares de las clulas en el tejido de muestra, dejando orgnulos individuales suspendidos en la solucin. Este proceso es llamado homogenizacin. Una porcin de clulas permanecern intactas despus de moler la muestra, y algunos orgnulos sern afectados, y de estos, se encargarn las prximas etapas de centrifugacin.

La muestra homogeneizada ahora esta lista para la centrifugacin en una ultracentrifugadora. Una ultracentrifugadora consiste en una cmara al vaco y refrigerada que contiene un rotor, el cual es manejado por un motor elctrico capaz de girar a alta velocidad. Las muestras son ubicadas en tubos que se encuentran dentro del rotor o sujetos a este. La velocidad rotacional puede alcanzar ms de 100.000 rpm para el modelo floor, 150.000 rpm para el modelo bench-top (Beckman Optima Max-XP), generando fuerzas centrifugas entre 800.000g y 1.000.000g. Esta fuerza causa la sedimentacin de macromolculas e incluso puede causar una distribucin no uniforme de molculas pequeas. Como los diferentes fragmentos de la clula tienen diferentes tamaos y densidades, cada fragmento se va a depositar en un precipitado con diferentes fuerzas centrifugas mnimas. De esta manera, la separacin de la muestra en diferentes capas puede realizarse mediante un primer centrifugado de la muestra homognea original bajo fuerzas dbiles, removiendo el precipitado, y posteriormente exponiendo las subsecuentes fases sobrenadantes a campos centrfugos cada vez mayores. Cada vez, una porcin de diferente densidad es precipitada a la parte inferior del tubo y es extrada. La repetida aplicacin de este proceso produce un rango de capas que incluye diferentes partes de la muestra original. Algunos pasos adicionales pueden realizarse para refinar aun ms cada uno de los precipitados obtenidos. La sedimentacin depende de la masa, la forma y el volumen especfico parcial de una macromolcula, as como tambin de la densidad del solvente, el tamao del rotor y la tasa de rotacin. La velocidad de sedimentacin puede ser monitoreada durante el experimento para calcular la masa molecular, as como el coeficiente de sedimentacin. Valores grandes de S (mayor tasa de sedimentacin) corresponden a un mayor peso molecular. Partculas ms densas se sedimentan a mayor velocidad. Las protenas largas tienen mayores coeficientes de friccin y se sedimentan ms lentamente para asegurar mayor precisin.