ELECTROFORESIS

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ELECTROFORESIS Electroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico - + Cátodo Ánodo +-

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Electroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico. ELECTROFORESIS. Cátodo. -. +. -. +. Ánodo. ELECTROFORESIS. Cátodo. q. -. Velocidad = E. f. +. -. E: gradiente de potencial. E=V/d q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH) - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

Electroforesis: migración de

una partícula cargada

sometida a un campo

eléctrico

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

Page 2: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

qVelocidad = E

f

E: gradiente de potencial. E=V/d

q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH)

f: coeficiente de fricción tamañoforma

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

Page 3: ELECTROFORESIS

Criterios de separación electroforética

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Separación por tamaño

2. Separación por carga

3. Separación por tamaño y carga

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

Page 4: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Muestra

2. Tampón: mantenimiento de pH y conductividad

3. Soporte

4. Equipo electroforético:• Fuente de alimentación• Cubeta de electoforesis

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

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SOPORTES ELECTROFORÉTICOS

1. Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937)

En solución. Difusión, convección.

2. Electroforesis de zona

• Soportes no restrictivos• Papel, acetato de celulosa• Almidón, agar, agarosa

• Soportes restrictivos• Agarosa (ácidos nucleicos)• Poliacrilamida

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

Page 6: ELECTROFORESIS

EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS

--

++

CátodoCátodo

ÁnodoÁnodo

++ --

Page 7: ELECTROFORESIS

Carga eléctrica de la biomoléculas

1. Ácidos nucleicos

2. Proteínas

Page 8: ELECTROFORESIS

8

Lehninger. Principios de Bioquímica

Enlace fosfodiéster

Page 9: ELECTROFORESIS
Page 10: ELECTROFORESIS

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Page 11: ELECTROFORESIS

RNADNA genómicoDNA viral

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Page 12: ELECTROFORESIS

Lab-on-a-Chip: electroforesis miniaturizada y automatizada

ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))

Page 13: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))

Page 14: ELECTROFORESIS

RNADNA genómicoDNA viral

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Page 15: ELECTROFORESIS

Criterios de separación electroforética

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Separación por tamaño

2. Separación por carga

3. Separación por tamaño y carga

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

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1. DNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes• Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE)

• Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol

2. RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes• Tampón: MOPS + formaldehído

• Muestra: Formamida, Azul de bromofenol

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Page 17: ELECTROFORESIS

Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la calle 1.

a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA de cada banda?

b) A continuación se incubó el DNA con topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA corresponde cada banda?

c) Otra muestra se incubó durante 30 min con topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de encontrar más DNA de las formas de movilidad reducida?

Topología del DNA

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Electroforesis de DNA en geles de agarosa

SSCP: single-strand conformation polymorphism

Page 19: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamaño

pulsed field gel electrophoresis

• FIGE: field inversion gel electrophoresis

• TAFE: transverse alternating field electrophoresis

• RGE: rotating gel electrophoresis

• CHEF: Contour-clamped homogeneous electric field

Page 20: ELECTROFORESIS

Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA

Schizosaccharomyces pombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated

multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose

(Clontech), 10 C.

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE)

Page 21: ELECTROFORESIS

Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae

chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,

1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32

samples, a maximum of 72 are possible

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE)

Page 22: ELECTROFORESIS

gel Nitrocelulosa

Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot

Page 23: ELECTROFORESIS

Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot

Electroforesis DNA

Autoradiografía

1.Transferencia a nitrocelulosa o nylon

2. Hibridación con sonda específica radiactiva

3. Lavado y autoradiografía

Page 24: ELECTROFORESIS

Southern blot: RFLP Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de

Restricción

Electroforesis DNA genómico Autoradiografía

EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRISONDA

(A)

(B)

(A)(B)

Page 25: ELECTROFORESIS

Hibridación de ácidos nucleicos: Northern blot

Electroforesis RNA

Autoradiografía

Page 26: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL SUERO EN ACETATO DE CELULOSA

Soporte no restictivo: Separación por carga

Page 27: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN ACETATO DE CELULOSA

Anemia falciforme:

Mutación en hemoglobina A

• Mutación GAG -> GTG

• Glu -> Val

Page 28: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-

PAGE)

Page 29: ELECTROFORESIS
Page 30: ELECTROFORESIS

Soporte restrictivo: Separación por tamaño

Gel de empaquetamiento (3% PA)

Gel de separación (8-20% PA)

Page 31: ELECTROFORESIS
Page 32: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-

PAGE)• Concentración de poliacrilamida

• Homogénea

• Gradiente

• Tampón de muestra

• Reductor (2-mercaptoetanol)

• No reductor

• Detección de las proteínas separadas

• Tinción (Azul Coomassie, sales de plata)

• Fluorescencia

• Inmunodetección

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Page 34: ELECTROFORESIS

ISOELECTROENFOQUE

Page 35: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Page 36: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAR

Electroforesis capilar de alta resolución (HPCE)

• Soporte: capilar 7-100 cm, 20-200 micras de diámetro

• Voltaje: >500 V/cm

• Automatizada, gran resolución

• Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …

Page 37: ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAR• CZE: de zona. Medio líquido, homogéneo,

capilares con carga uniforme

• CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal, metilcelulosa.

• CIEF: Isoelectroenfoque capilar.

• Isotachophoresis (ITP).

• Electrokinetic Chromatography (EKC).

• Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC.

• Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC).

• Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE).

• Capillary Electrochromatography (CEC.

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Page 39: ELECTROFORESIS

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Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado

Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A

- DNA polimerasa- Nucleótidos

dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes

ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´5´--C T T A A G C G A T T A C -3´

5´--C T T A A G C G A T T A -3´

5´--C T T A A G C G A T T -3´

5´--C T T A A G C G A T -3´

5´--C T T A A G C G A -3´

5´--C T T A A G C G -3´

5´--C T T A A G C -3´

5´--C T T A A G -3´

Detector de fluorescencialáser

Separación de los

fragmentos de DNA

marcados, mediante

electroforesis

capilar

-

+

G C G A T T A C G . . .

Page 40: ELECTROFORESIS

¿A qué fuerza centrífuga relativa equivalen, en un rotor de 10 cm de radio, las siguientes velocidades de giro?

•1.000 rpm•10.000 rpm•30.000 rpm

•100.000 rpm

CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE FUERZA CENTRÍGA RELATIVA